CN108456686A - 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途 - Google Patents

一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108456686A
CN108456686A CN201810110910.3A CN201810110910A CN108456686A CN 108456686 A CN108456686 A CN 108456686A CN 201810110910 A CN201810110910 A CN 201810110910A CN 108456686 A CN108456686 A CN 108456686A
Authority
CN
China
Prior art keywords
epitope
amino acid
albumen
amino acids
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810110910.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108456686B (zh
Inventor
张天英
袁权
郭雪染
魏旻希
康晓圳
张军
夏宁邵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangshengtang Co., Ltd
Original Assignee
Xiamen University
Xiamen Innovax Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen University, Xiamen Innovax Biotech Co Ltd filed Critical Xiamen University
Publication of CN108456686A publication Critical patent/CN108456686A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108456686B publication Critical patent/CN108456686B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途。具体而言，本发明涉及一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列，且用于***编码目的多肽的核苷酸序列。此外，本发明还涉及包含所述多肽载体和目的多肽的重组蛋白。进一步，本发明还涉及，所述核酸分子和所述重组蛋白的用途。此外，本发明还特别涉及，可用于预防、减轻或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的疫苗或药物组合物，其包含含有本发明的多肽载体和来自HBV的表位的重组蛋白。

Description

一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途
技术领域
本发明涉及基因工程疫苗领域、分子病毒学领域和免疫学领域。此外，本发明还特别涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染治疗领域。具体而言，本发明涉及一种核酸分子，其包含编码多肽载体(peptide carrier)的核苷酸序列，且用于***编码目的多肽的核苷酸序列。特别地，本发明的所述核酸分子在***编码目的多肽的核苷酸序列且表达为重组蛋白后，所述多肽载体能够展示所述目的多肽(例如目的抗原或抗原中的目的表位)，和/或，所述重组蛋白能够形成病毒样颗粒并展示所述目的多肽。此外，本发明还涉及包含所述多肽载体以及目的多肽的重组蛋白。进一步，本发明还涉及，所述核酸分子和所述重组蛋白的用途。此外，本发明还特别涉及，可用于预防、减轻或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的疫苗或药物组合物，其包含含有本发明的多肽载体和来自HBV的表位的重组蛋白。
背景技术
疫苗是应对传染病的有效手段。根据适用人群的不同，疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要应用于预防病毒感染，包括减毒疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗，其主要通过诱导机体产生中和抗体来保护机体不被病毒感染。治疗性疫苗主要应用于治疗持续性病毒感染以及肿瘤等疾病。在这些疾病中，患者对于靶抗原通常表现为免疫耐受的状态，因此，研发人员尝试通过多种形式的疫苗来诱导机体产生针对靶抗原的有效免疫应答。治疗性疫苗主要包括核酸疫苗、病毒载体疫苗、基因工程疫苗等，其中基因工程疫苗具有明显的优势。
已上市的基因工程疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、人***瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)疫苗、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)疫苗，它们均为病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的形式。病毒样颗粒是指，由某种病毒的一个或多个结构蛋白构成的空心颗粒，其不包含病毒核酸，不能进行自主复制，但在形态上与真正的病毒粒子相同或相似。病毒样颗粒具有以下优点：免疫原性强、安全性好、不易失活、可展示外源肽段并诱导机体产生针对外源肽段的特异性免疫应答，因此，在疫苗领域具有重要的应用价值。
目前，全球约有20亿人感染过HBV，其中约有3.5亿的慢性HBV感染者，这些感染者最终死于HBV感染相关肝脏疾病的风险可达15％-25％。全球每年超过100万人死于乙肝导致的终末期肝病。我国是HBV感染的重灾区，目前约有9300万乙肝携带者。近年来，随着病例报告***不断健全，乙肝相关疾病的发生率，病死率不降反升。
当前针对慢性HBV感染的治疗药物主要可分为两类，即干扰素类(Interferon)和核苷/核苷酸类似物(NAs)。慢性HBV感染的治疗的最终目标是，阻止重症肝炎(肝衰竭)、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病的发生；其临床最佳治疗终点是，使患者达到乙型肝炎病毒表面抗原的血清学阴转或血清学转换，即完全清除HBV。但现有药物实现该目标的疗效十分有限。因此，针对慢性HBV感染者开发新的、能更有效地清除病毒、尤其是能有效清除HBsAg或大幅降低HBsAg水平的创新型治疗药物和方法是迫切而必要的，并且，研发治疗性疫苗是具有一定潜力的策略。
发明内容
本申请发明人基于三种蝙蝠来源的乙型肝炎病毒核心抗原蛋白(即，蹄蝠乙型肝炎病毒(roundleaf bat HBV，RBHBV)的核心抗原蛋白(RBHBcAg)；筑帐蝠乙型肝炎病毒(tent-making bat HBV，TBHBV)的核心抗原蛋白(TBHBcAg)；菊头蝠乙型肝炎病毒(horseshoe bat HBV，HBHBV)的核心抗原蛋白(HBHBcAg))，开发了一类新的用于展示目的多肽的多肽载体(peptide carrier)。由此，本发明提供了一种核酸分子，其含有编码多肽载体的核苷酸序列。此类核酸分子能够***编码目的多肽的核苷酸序列，并表达为含有多肽载体和目的多肽(例如目的抗原，或抗原中的目的表位)的重组蛋白。进一步，所产生的重组蛋白能够有效形成VLP，并能够在VLP表面展示***其中的目的多肽，从而所述目的多肽能够有效地被机体的免疫***识别，诱发机体产生针对目的多肽的特异性免疫应答。因此，本发明的多肽载体可用作疫苗载体，用于展示目的多肽，例如来自目的抗原的肽段(例如表位)；并且，包含本发明的多肽载体和目的多肽的重组蛋白可用作疫苗，用于诱发机体产生针对目的多肽的特异性免疫应答。
进一步，本申请的发明人还发现，RBHBcAg蛋白、TBHBcAg蛋白和HBHBcAg蛋白的C端均为富含精氨酸的区域，其对于VLP组装不是必须的。因此，本发明的多肽载体可以不包含RBHBcAg蛋白、TBHBcAg蛋白和HBHBcAg蛋白的C端区域。例如，本发明的RBHBcAg载体可以缺失RBHBcAg蛋白的第145-189位氨基酸的部分或全部(例如，缺失RBHBcAg蛋白的第150-189位氨基酸)；本发明的TBHBcAg载体可以缺失TBHBcAg蛋白的第149-188位氨基酸的部分或全部(例如，缺失TBHBcAg蛋白的第154-188位氨基酸)；本发明的HBHBcAg载体可以缺失HBHBcAg蛋白的第145-189位氨基酸的部分或全部(例如，缺失HBHBcAg蛋白的第150-189位氨基酸)。
进一步，本申请的发明人还发现，RBHBcAg蛋白、TBHBcAg蛋白和HBHBcAg蛋白中的部分氨基酸序列可被置换为人T细胞表位，而不影响VLP的组装。因此，为了加强人体对包含本发明多肽载体和目的多肽的重组蛋白的免疫应答，本申请的发明人还对本发明的多肽载体进行了进一步的改造，即，将所述多肽载体中的部分氨基酸序列置换为人T细胞表位，由此获得了优化的多肽载体(即，携带有人T细胞表位的多肽载体)。例如，本申请的发明人发现，RBHBcAg蛋白的第18-27位氨基酸残基、第50-69位氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基可被置换为人T细胞表位(例如MHC I限制性表位和/或MHC II限制性表位)，而不影响VLP的组装。TBHBcAg蛋白和HBHBcAg蛋白也有类似的性质。因此，可对多肽载体RBHBcAg、TBHBcAg和HBHBcAg进行相应的改造，从而获得携带有人T细胞表位的多肽载体RBHBcAg-T、TBHBcAg-T和HBHBcAg-T。
此外，本申请的发明人还出人意料地发现，本发明的多肽载体特别适合用于展示来自人乙肝病毒的抗原表位(例如来自人HBV的HBsAg中的表位)，能够在受试者中诱发特别强的清除HBsAg的特异性免疫应答，其功效显著优于现有的乙肝疫苗(例如，以人HBV的HBcAg为多肽载体构建的、含有相同表位的疫苗)。因此，本发明还提供了一种特别适合用于展示来自人乙肝病毒的抗原表位的多肽载体。
因此，在一个方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列或者其变体，所述变体与所述核苷酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的同一性，或者在严紧条件或者高严紧条件下，能够与所述核苷酸序列杂交，其中，所述多肽载体选自：
(1)RBHBcAg载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的区别包括：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；
(2)TBHBcAg载体，其与筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的区别包括：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个或5个氨基酸残基；例如，第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、或第80-82位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基)；
(3)HBHBcAg载体，其与菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的区别包括：(a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)。
RBHBcAg载体
在一个优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白是野生型RBHBcAg。在一个优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个优选的实施方案中，RBHBcAg载体与RBHBcAg蛋白的区别包括：RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体。例如，RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、第78-80位氨基酸残基、第78-79位氨基酸残基、第79-83位氨基酸残基、第79-82位氨基酸残基、第79-81位氨基酸残基、第79-80位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第78位氨基酸残基、第79位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、或第83位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
在一个优选的实施方案中，RBHBcAg载体与RBHBcAg蛋白的区别包括：(1)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体，如上文所定义的；和(2)RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸残基。
TBHBcAg载体
在一个优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白是野生型TBHBcAg。在一个优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个优选的实施方案中，TBHBcAg载体与TBHBcAg蛋白的区别包括：TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，或5个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体。例如，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-84位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-84位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第83-84位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、第83位氨基酸残基、或第84位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
在一个优选的实施方案中，TBHBcAg载体与TBHBcAg蛋白的区别包括：(1)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，或5个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体，如上文所定义的；和(2)TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35个氨基酸残基。
HBHBcAg载体
在一个优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白是野生型HBHBcAg。在一个优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一个优选的实施方案中，HBHBcAg载体与HBHBcAg蛋白的区别包括：HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体。例如，HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、第78-80位氨基酸残基、第78-79位氨基酸残基、第79-83位氨基酸残基、第79-82位氨基酸残基、第79-81位氨基酸残基、第79-80位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第78位氨基酸残基、第79位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、或第83位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
在一个优选的实施方案中，HBHBcAg载体与HBHBcAg蛋白的区别包括：(1)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体，如上文所定义的；和(2)HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述多肽载体还携带T细胞表位。在某些优选的实施方案中，所述T细胞表位为人T细胞表位。在某些优选的实施方案中，所述T细胞表位选自MHC I和MHC II限制性人T细胞表位。在某些优选的实施方案中，所述MHC I限制性人T细胞表位如SEQ ID NO:87所示。在某些优选的实施方案中，所述MHC II限制性人T细胞表位如SEQ IDNO:88或89所示。
在某些优选的实施方案中，所述多肽载体携带人T细胞表位，并且选自：
(1)RBHBcAg-T载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的区别包括：
(1a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；
(1b)RBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第50-69位中的一个或多个氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)；以及
(1c)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；
(2)TBHBcAg-T载体，其与筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的区别包括：
(2a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个或5个氨基酸残基；例如，第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、或第80-82位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ IDNO:43所示的连接体)；
(2b)TBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第54-73位中的一个或多个氨基酸残基和/或第124-144位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)；以及
(2c)任选地，TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基)；和
(3)HBHBcAg-T载体，其与菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的区别包括：
(3a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；
(3b)HBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第50-69位中的一个或多个氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)；以及
(3c)任选地，HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)。
RBHBcAg-T载体
在一个优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白是野生型RBHBcAg。在一个优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个优选的实施方案中，RBHBcAg-T载体与RBHBcAg蛋白的区别包括，(i)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体；(ii)RBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第50-69位中的一个或多个氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHCI或MHC II限制性人T细胞表位)；以及，(iii)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)。
关于区别(i)
在某些优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、第78-80位氨基酸残基、第78-79位氨基酸残基、第79-83位氨基酸残基、第79-82位氨基酸残基、第79-81位氨基酸残基、第79-80位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第78位氨基酸残基、第79位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、或第83位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
关于区别(ii)
在某些优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第18-27位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第18-26位、第18-25位、第18-24位、第18-23位、第18-22位、第18-21位、第18-20位、第18-19位、第19-27位、第19-26位、第19-25位、第19-24位、第19-23位、第19-22位、第19-21位、第19-20位、第20-27位、第20-26位、第20-25位、第20-24位、第20-23位、第20-22位、第20-21位、第21-27位、第21-26位、第21-25位、第21-24位、第21-23位、第21-22位、第第22-27位、第22-26位、第22-25位、第22-24位、第22-23位、第23-27位、第23-26位、第23-25位、第23-24位、第24-27位、第24-26位、第24-25位、第25-27位、第25-26位、第26-27位、第27位、第26位、第25位、第24位、第23位、第22位、第21位、第20位、第19位或第18位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第50-69位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，或20个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第50-69位、第50-68位、第50-67位、第50-66位、第50-65位、第50-64位、第50-63位、第50-62位、第50-61位、第50-60位、第50-59位、第50-58位、第50-57位、第50-56位、第50-55位、第50-54位、第50-53位、第50-52位、第50-51位、第51-69位、第51-68位、第51-67位、第51-66位、第51-65位、第51-64位、第51-63位、第51-62位、第51-61位、第51-60位、第51-59位、第51-58位、第51-57位、第51-56位。第51-55位、第51-54位、第51-53位、第51-52位、第52-69位、第52-68位、第52-67位、第52-66位、第52-65位、第52-64位、第52-63位、第52-62位、第52-61位、第52-60位、第52-59位、第52-58位、第52-57位、第52-56位、第52-55位、第52-54位、第52-53位、第53-69位、第53-68位、第53-67位、第53-66位、第53-65位、第53-64位、第53-63位、第53-62位、第53-61位、第53-60位、第53-59位、第53-58位、第53-57位、第53-56位、第53-55位、第53-54位、第54-69位、第54-68位、第54-67位、第54-66位、第54-65位、第54-64位、第54-63位、第54-62位、第54-61位、第54-60位、第54-59位、第54-58位、第54-57位、第54-56位、第54-57位、第54-56位、第54-55位、第55-69位、第55-68位、第55-67位、第55-66位、第55-65位、第55-64位、第55-63位、第55-62位、第55-61位、第55-60位、第55-59位、第55-58位、第55-57位、第55-56位、第56-69位、第56-68位、第56-67位、第56-66位、第56-65位、第56-64位、第56-63位、第56-62位、第56-61位、第56-60位、第56-59位、第56-58位、第56-57位、第57-69位、第57-68位、第57-67位、第57-66位、第57-65位、第57-64位、第57-63位、第57-62位、第57-61位、第57-60位、第57-59位、第57-58位、第58-69位、第58-68位、第58-67位、第58-66位、第58-65位、第58-64位、第58-63位、第58-62位、第58-61位、第58-60位、第58-59位、第59-69位、第59-68位、第59-67位、第59-66位、第59-65位、第59-64位、第59-63位、第59-62位、第59-61位、第59-60位、第60-69位、第60-68位、第60-67位、第60-66位、第60-65位、第60-64位、第60-63位、第60-62位、第60-61位、第61-69位、第61-68位、第61-67位、第61-66位、第61-65位、第61-64位、第61-63位、第61-62位、第62-69位、第62-68位、第62-67位、第62-66位、第62-65位、第62-64位、第62-63位、第63-69位、第63-68位、第63-67位、第63-66位、第63-65位、第63-64位、第64-69位、第64-68位、第64-67位、第64-66位、第64-65位、第65-69位、第65-68位、第65-67位、第65-66位、第66-69位、第66-68位、第66-67位、第67-69位、第67-68位、第68-69位、第69位、第68位、第67位、第66位、第65位、第64位、第63位、第62位、第61位、第60位、第59位、第58位、第57位、第56位、第55位、第54位、第53位、第52位、第51位或第50位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个或21个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第120-140位、第120-139位、第120-138位、第120-137位、第120-136位、第120-135位、第120-134位、第120-133位、第120-132位、第120-131位、第120-130位、第120-129位、第120-128位、第120-127位、第120-126位、第120-125位、第120-124位、第120-123位、第120-122位、第120-121位、121-140位、第121-139位、第121-138位、第121-137位、第121-136位、第121-135位、第121-134位、第121-133位、第121-132位、第121-131位、第121-130位、第121-129位、第121-128位、第121-127位、第121-126位、第121-125位、第121-124位、第121-123位、第121-122位、122-140位、第122-139位、第122-138位、第122-137位、第122-136位、第122-135位、第122-134位、第122-133位、第122-132位、第122-131位、第122-130位、第122-129位、第122-128位、第122-127位、第122-126位、第122-125位、第122-124位、第122-123位、123-140位、第123-139位、第123-138位、第123-137位、第123-136位、第123-135位、第123-134位、第123-133位、第123-132位、第123-131位、第123-130位、第123-129位、第123-128位、第123-127位、第123-126位、第123-125位、第123-124位、124-140位、第124-139位、第124-138位、第124-137位、第124-136位、第124-135位、第124-134位、第124-133位、第124-132位、第124-131位、第124-130位、第124-129位、第124-128位、第124-127位、第124-126位、第124-125位、125-140位、第125-139位、第125-138位、第125-137位、第125-136位、第125-135位、第125-134位、第125-133位、第125-132位、第125-131位、第125-130位、第125-129位、第125-128位、第125-127位、126-140位、第126-139位、第126-138位、第126-137位、第126-136位、第126-135位、第126-134位、第126-133位、第126-132位、第126-131位、第126-130位、第126-129位、第126-128位、第126-127位、127-140位、第127-139位、第127-138位、第127-137位、第127-136位、第127-135位、第127-134位、第127-133位、第127-132位、第127-131位、第127-130位、第127-129位、第127-128位、128-140位、第128-139位、第128-139位、第128-137位、第128-136位、第128-135位、第128-134位、第128-133位、第128-132位、第128-131位、第128-130位、第128-129位、129-140位、第129-139位、第129-138位、第129-137位、第129-136位、第129-135位、第129-134位、第129-133位、第129-132位、第129-131位、第129-130位、130-140位、第130-139位、第130-138位、第130-137位、第130-136位、第130-135位、第130-134位、第130-133位、第130-132位、第130-131位、131-140位、第131-139位、第131-138位、第131-137位、第131-136位、第131-135位、第131-134位、第131-133位、第131-132位、132-140位、第132-139位、第132-138位、第132-137位、第132-136位、第132-135位、第132-134位、第132-133位、133-140位、第133-139位、第133-138位、第133-137位、第133-136位、第133-135位、第133-134位、134-140位、第134-139位、第134-138位、第134-137位、第134-136位、第134-135位、135-140位、第135-139位、第135-138位、第135-137位、第135-136位、136-140位、第136-139位、第136-138位、第136-137位、137-140位、第137-139位、第137-138位、138-140位、第138-139位、139-140位、第140位、第139位、第138位、第137位、第136位、第135位、第134位、第133位、第132位、第131位第130位、第129位、第128位、第127位、第126位、第125位、第124位、第123位、第122位、第121位或第120位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，RBHBcAg-T载体包含上述三种置换中的任一种或两种置换。在某些优选的实施方案中，RBHBcAg-T载体包含上述三种置换(此类多肽载体在下文中也被简称为RBHBcAg-T3载体)。例如，在某些示例性实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第18-27位和第50-69位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第18-27位和第120-140位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第50-69位和第120-140位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第50-69位以及第120-140位氨基酸残基均被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，RBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第50-69位以及第120-140位氨基酸残基分别被置换为如SEQID NO:87、88和89所示的人T细胞表位。
关于区别(iii)
区别(iii)并非是必须的。换言之，在RBHBcAg-T载体中，可以存在或者不存在RBHBcAg蛋白的C端缺失。在某些示例性实施方案中，RBHBcAg-T载体不存在RBHBcAg蛋白的C端缺失。在某些示例性实施方案中，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基。在某些示例性实施方案中，RBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸残基。
TBHBcAg-T载体
在一个优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白是野生型TBHBcAg。在一个优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个优选的实施方案中，TBHBcAg-T载体与TBHBcAg蛋白的区别包括，(i)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，或5个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体；(ii)TBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第54-73位中的一个或多个氨基酸残基和/或第124-144位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)；以及(iii)任选地，TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基)
关于区别(i)
在某些优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-84位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-84位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第83-84位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、第83位氨基酸残基、或第84位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
关于区别(ii)
在某些优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第18-27位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第18-26位、第18-25位、第18-24位、第18-23位、第18-22位、第18-21位、第18-20位、第18-19位、第19-27位、第19-26位、第19-25位、第19-24位、第19-23位、第19-22位、第19-21位、第19-20位、第20-27位、第20-26位、第20-25位、第20-24位、第20-23位、第20-22位、第20-21位、第21-27位、第21-26位、第21-25位、第21-24位、第21-23位、第21-22位、第第22-27位、第22-26位、第22-25位、第22-24位、第22-23位、第23-27位、第23-26位、第23-25位、第23-24位、第24-27位、第24-26位、第24-25位、第25-27位、第25-26位、第26-27位、第27位、第26位、第25位、第24位、第23位、第22位、第21位、第20位、第19位或第18位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第54-73位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，或20个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第54-73位、第54-72位、第54-71位、第54-70位、第54-69位、第54-68位、第54-67位、第54-66位、第54-65位、第54-64位、第54-63位、第54-62位、第54-61位、第54-60位、第54-59位、第54-58位、第54-57位、第54-56位、第54-55位、55-73位、第55-72位、第55-71位、第55-70位、第55-69位、第55-68位、第55-67位、第55-66位、第55-65位、第55-64位、第55-63位、第55-62位、第55-61位、第55-60位、第55-59位、第55-58位、第55-57位、第55-56位、56-73位、第56-72位、第56-71位、第56-70位、第56-69位、第56-68位、第56-67位、第56-66位、第56-65位、第56-64位、第56-63位、第56-62位、第56-61位、第56-60位、第56-59位、第56-58位、第56-57位、57-73位、第57-72位、第57-71位、第57-70位、第57-69位、第57-68位、第57-67位、第57-66位、第57-65位、第57-64位、第57-63位、第57-62位、第57-61位、第57-60位、第57-59位、第57-58位、58-73位、第58-72位、第58-71位、第58-70位、第58-69位、第58-68位、第58-67位、第58-66位、第58-65位、第58-64位、第58-63位、第58-62位、第58-61位、第58-60位、第58-59位、59-73位、第59-72位、第59-71位、第59-70位、第59-69位、第59-68位、第59-67位、第59-66位、第59-65位、第59-64位、第59-63位、第59-62位、第59-61位、第59-60位、60-73位、第60-72位、第60-71位、第60-70位、第60-69位、第60-68位、第60-67位、第60-66位、第60-65位、第60-64位、第60-63位、第60-62位、第60-61位、第61-73位、第61-72位、第61-71位、第61-70位、第61-69位、第61-68位、第61-67位、第61-66位、第61-65位、第61-64位、第61-63位、第61-62位、第62-73位、第62-72位、第62-71位、第62-70位、第62-69位、第62-68位、第62-67位、第62-66位、第62-65位、第62-64位、第62-63位、第63-73位、第63-72位、第63-71位、第63-70位、第63-69位、第63-68位、第63-67位、第63-66位、第63-65位、第63-64位、第64-73位、第64-72位、第64-71位、第64-70位、第64-69位、第64-68位、第64-67位、第64-66位、第64-65位、第65-73位、第65-72位、第65-71位、第65-70位、第65-69位、第65-68位、第65-67位、第65-66位、第66-73位、第66-72位、第66-71位、第66-70位、第66-69位、第66-68位、第66-67位、第67-73位、第67-72位、第67-71位、第67-70位、第67-69位、第67-68位、第68-73位、第68-72位、第68-71位、第68-70位、第68-69位、第69-73位、第69-72位、第69-71位、第69-70位、第70-73位、第70-72位、第70-71位、第71-73位、第71-72位、第72-73位、第73位、第72位、第71位、第70位、第69位、第68位、第67位、第66位、第65位、第64位、第63位、第62位、第61位、第60位、第59位、第58位、第57位、第56位、第55位或第54位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第124-144位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个或21个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第124-144位、第124-143位、第124-142位、第124-141位、第124-140位、第124-139位、第124-138位、第124-137位、第124-136位、第124-135位、第124-134位、第124-133位、第124-132位、第124-131位、第124-130位、第124-129位、第124-128位、第124-127位、第124-126位、第124-125位、第125-144位、第125-143位、第125-142位、第125-141位、第125-140位、第125-139位、第125-138位、第125-137位、第125-136位、第125-135位、第125-134位、第125-133位、第125-132位、第125-131位、第125-130位、第125-129位、第125-128位、第125-127位、第125-126位、第126-144位、第126-143位、第126-142位、第126-141位、第126-140位、第126-139位、第126-138位、第126-137位、第126-136位、第126-135位、第126-134位、第126-133位、第126-132位、第126-131位、第126-130位、第126-129位、第126-128位、第126-127位、第127-144位、第127-143位、第127-142位、第127-141位、第127-140位、第127-139位、第127-138位、第127-137位、第127-136位、第127-135位、第127-134位、第127-133位、第127-132位、第127-131位、第127-130位、第127-129位、第127-128位、第128-144位、第128-143位、第128-142位、第128-141位、第128-140位、第128-139位、第128-138位、第128-137位、第128-136位、第128-135位、第128-134位、第128-133位、第128-132位、第128-131位、第128-130位、第128-129位、第129-144位、第129-143位、第129-142位、第129-141位、第129-140位、第129-139位、第129-138位、第129-137位、第129-136位、第129-135位、第129-134位、第129-133位、第129-132位、第129-131位、第129-130位、第130-144位、第130-143位、第130-142位、第130-141位、第130-140位、第130-139位、第130-138位、第130-137位、第130-136位、第130-135位、第130-134位、第130-133位、第130-132位、第130-131位、第131-144位、第131-143位、第131-142位、第131-141位、第131-140位、第131-139位、第131-138位、第131-137位、第131-136位、第131-135位、第131-134位、第131-133位、第131-132位、第132-144位、第132-143位、第132-142位、第132-141位、第132-140位、第132-139位、第132-138位、第132-137位、第132-136位、第132-135位、第132-134位、第132-133位、第133-144位、第133-143位、第133-142位、第133-141位、第133-140位、第133-139位、第133-138位、第133-137位、第133-136位、第133-135位、第133-134位、第134-144位、第134-143位、第134-142位、第134-141位、第134-140位、第134-139位、第134-138位、第134-137位、第134-136位、第134-135位、第135-144位、第135-143位、第135-142位、第135-141位、第135-140位、第135-139位、第135-138位、第135-137位、第135-136位、第136-144位、第136-143位、第136-142位、第136-141位、第136-140位、第136-139位、第136-138位、第136-137位、第137-144位、第137-143位、第137-142位、第137-141位、第137-140位、第137-139位、第137-138位、第138-144位、第138-143位、第138-142位、第138-141位、第138-140位、第138-139位、第139-144位、第139-143位、第139-142位、第139-141位、第139-140位、第140-144位、第140-143位、第140-142位、第140-141位、第141-144位、第141-143位、第141-142位、第142-144位、第142-143位、第143-144位、第144位、第143位、第142位、第141位、第140位、第139位、第138位、第137位、第136位、第135位、第134位、第133位、第132位、第131位、第130位、第129位、第128位、第127位、第126位、第125位或第124位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，TBHBcAg-T载体包含上述三种置换中的任一种或两种置换。在某些优选的实施方案中，TBHBcAg-T载体包含上述三种置换(此类多肽载体在下文中也被简称为TBHBcAg-T3载体)。例如，在某些示例性实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第18-27位和第54-73位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第18-27位和第124-144位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第54-73位和第124-144位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第54-73位以及第124-144位氨基酸残基均被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，TBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第54-73位以及第124-144位氨基酸残基分别被置换为如SEQID NO:87、88和89所示的人T细胞表位。
关于区别(iii)
区别(iii)并非是必须的。换言之，在TBHBcAg-T载体中，可以存在或者不存在TBHBcAg蛋白的C端缺失。在某些示例性实施方案中，TBHBcAg-T载体不存在TBHBcAg蛋白的C端缺失。在某些示例性实施方案中，TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基。在某些示例性实施方案中，TBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35个氨基酸残基。
HBHBcAg-T载体
在一个优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白是野生型HBHBcAg。在一个优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一个优选的实施方案中，HBHBcAg-T载体与HBHBcAg蛋白的区别包括，(i)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体；(ii)HBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第50-69位中的一个或多个氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHCI或MHC II限制性人T细胞表位)；以及，(iii)任选地，HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)。
关于区别(i)
在某些优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、第78-80位氨基酸残基、第78-79位氨基酸残基、第79-83位氨基酸残基、第79-82位氨基酸残基、第79-81位氨基酸残基、第79-80位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第78位氨基酸残基、第79位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、或第83位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
关于区别(ii)
在某些优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第18-27位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第18-26位、第18-25位、第18-24位、第18-23位、第18-22位、第18-21位、第18-20位、第18-19位、第19-27位、第19-26位、第19-25位、第19-24位、第19-23位、第19-22位、第19-21位、第19-20位、第20-27位、第20-26位、第20-25位、第20-24位、第20-23位、第20-22位、第20-21位、第21-27位、第21-26位、第21-25位、第21-24位、第21-23位、第21-22位、第第22-27位、第22-26位、第22-25位、第22-24位、第22-23位、第23-27位、第23-26位、第23-25位、第23-24位、第24-27位、第24-26位、第24-25位、第25-27位、第25-26位、第26-27位、第27位、第26位、第25位、第24位、第23位、第22位、第21位、第20位、第19位或第18位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第50-69位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，或20个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第50-69位、第50-68位、第50-67位、第50-66位、第50-65位、第50-64位、第50-63位、第50-62位、第50-61位、第50-60位、第50-59位、第50-58位、第50-57位、第50-56位、第50-55位、第50-54位、第50-53位、第50-52位、第50-51位、第51-69位、第51-68位、第51-67位、第51-66位、第51-65位、第51-64位、第51-63位、第51-62位、第51-61位、第51-60位、第51-59位、第51-58位、第51-57位、第51-56位。第51-55位、第51-54位、第51-53位、第51-52位、第52-69位、第52-68位、第52-67位、第52-66位、第52-65位、第52-64位、第52-63位、第52-62位、第52-61位、第52-60位、第52-59位、第52-58位、第52-57位、第52-56位、第52-55位、第52-54位、第52-53位、第53-69位、第53-68位、第53-67位、第53-66位、第53-65位、第53-64位、第53-63位、第53-62位、第53-61位、第53-60位、第53-59位、第53-58位、第53-57位、第53-56位、第53-55位、第53-54位、第54-69位、第54-68位、第54-67位、第54-66位、第54-65位、第54-64位、第54-63位、第54-62位、第54-61位、第54-60位、第54-59位、第54-58位、第54-57位、第54-56位、第54-57位、第54-56位、第54-55位、第55-69位、第55-68位、第55-67位、第55-66位、第55-65位、第55-64位、第55-63位、第55-62位、第55-61位、第55-60位、第55-59位、第55-58位、第55-57位、第55-56位、第56-69位、第56-68位、第56-67位、第56-66位、第56-65位、第56-64位、第56-63位、第56-62位、第56-61位、第56-60位、第56-59位、第56-58位、第56-57位、第57-69位、第57-68位、第57-67位、第57-66位、第57-65位、第57-64位、第57-63位、第57-62位、第57-61位、第57-60位、第57-59位、第57-58位、第58-69位、第58-68位、第58-67位、第58-66位、第58-65位、第58-64位、第58-63位、第58-62位、第58-61位、第58-60位、第58-59位、第59-69位、第59-68位、第59-67位、第59-66位、第59-65位、第59-64位、第59-63位、第59-62位、第59-61位、第59-60位、第60-69位、第60-68位、第60-67位、第60-66位、第60-65位、第60-64位、第60-63位、第60-62位、第60-61位、第61-69位、第61-68位、第61-67位、第61-66位、第61-65位、第61-64位、第61-63位、第61-62位、第62-69位、第62-68位、第62-67位、第62-66位、第62-65位、第62-64位、第62-63位、第63-69位、第63-68位、第63-67位、第63-66位、第63-65位、第63-64位、第64-69位、第64-68位、第64-67位、第64-66位、第64-65位、第65-69位、第65-68位、第65-67位、第65-66位、第66-69位、第66-68位、第66-67位、第67-69位、第67-68位、第68-69位、第69位、第68位、第67位、第66位、第65位、第64位、第63位、第62位、第61位、第60位、第59位、第58位、第57位、第56位、第55位、第54位、第53位、第52位、第51位或第50位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个或21个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第120-140位、第120-139位、第120-138位、第120-137位、第120-136位、第120-135位、第120-134位、第120-133位、第120-132位、第120-131位、第120-130位、第120-129位、第120-128位、第120-127位、第120-126位、第120-125位、第120-124位、第120-123位、第120-122位、第120-121位、121-140位、第121-139位、第121-138位、第121-137位、第121-136位、第121-135位、第121-134位、第121-133位、第121-132位、第121-131位、第121-130位、第121-129位、第121-128位、第121-127位、第121-126位、第121-125位、第121-124位、第121-123位、第121-122位、122-140位、第122-139位、第122-138位、第122-137位、第122-136位、第122-135位、第122-134位、第122-133位、第122-132位、第122-131位、第122-130位、第122-129位、第122-128位、第122-127位、第122-126位、第122-125位、第122-124位、第122-123位、123-140位、第123-139位、第123-138位、第123-137位、第123-136位、第123-135位、第123-134位、第123-133位、第123-132位、第123-131位、第123-130位、第123-129位、第123-128位、第123-127位、第123-126位、第123-125位、第123-124位、124-140位、第124-139位、第124-138位、第124-137位、第124-136位、第124-135位、第124-134位、第124-133位、第124-132位、第124-131位、第124-130位、第124-129位、第124-128位、第124-127位、第124-126位、第124-125位、125-140位、第125-139位、第125-138位、第125-137位、第125-136位、第125-135位、第125-134位、第125-133位、第125-132位、第125-131位、第125-130位、第125-129位、第125-128位、第125-127位、126-140位、第126-139位、第126-138位、第126-137位、第126-136位、第126-135位、第126-134位、第126-133位、第126-132位、第126-131位、第126-130位、第126-129位、第126-128位、第126-127位、127-140位、第127-139位、第127-138位、第127-137位、第127-136位、第127-135位、第127-134位、第127-133位、第127-132位、第127-131位、第127-130位、第127-129位、第127-128位、128-140位、第128-139位、第128-139位、第128-137位、第128-136位、第128-135位、第128-134位、第128-133位、第128-132位、第128-131位、第128-130位、第128-129位、129-140位、第129-139位、第129-138位、第129-137位、第129-136位、第129-135位、第129-134位、第129-133位、第129-132位、第129-131位、第129-130位、130-140位、第130-139位、第130-138位、第130-137位、第130-136位、第130-135位、第130-134位、第130-133位、第130-132位、第130-131位、131-140位、第131-139位、第131-138位、第131-137位、第131-136位、第131-135位、第131-134位、第131-133位、第131-132位、132-140位、第132-139位、第132-138位、第132-137位、第132-136位、第132-135位、第132-134位、第132-133位、133-140位、第133-139位、第133-138位、第133-137位、第133-136位、第133-135位、第133-134位、134-140位、第134-139位、第134-138位、第134-137位、第134-136位、第134-135位、135-140位、第135-139位、第135-138位、第135-137位、第135-136位、136-140位、第136-139位、第136-138位、第136-137位、137-140位、第137-139位、第137-138位、138-140位、第138-139位、139-140位、第140位、第139位、第138位、第137位、第136位、第135位、第134位、第133位、第132位、第131位第130位、第129位、第128位、第127位、第126位、第125位、第124位、第123位、第122位、第121位或第120位氨基酸残基被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位；例如，如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)。
在某些优选的实施方案中，HBHBcAg-T载体包含上述三种置换中的任一种或两种置换。在某些优选的实施方案中，HBHBcAg-T载体包含上述三种置换(此类多肽载体在下文中也被简称为HBHBcAg-T3载体)。例如，在某些示例性实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第18-27位和第50-69位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第18-27位和第120-140位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第50-69位和第120-140位氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第50-69位以及第120-140位氨基酸残基均被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)。在某些示例性实施方案中，HBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第50-69位以及第120-140位氨基酸残基分别被置换为如SEQID NO:87、88和89所示的人T细胞表位。
关于区别(iii)
区别(i i i)并非是必须的。换言之，在HBHBcAg-T载体中，可以存在或者不存在HBHBcAg蛋白的C端缺失。在某些示例性实施方案中，HBHBcAg-T载体不存在HBHBcAg蛋白的C端缺失。在某些示例性实施方案中，HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基。在某些示例性实施方案中，HBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸残基。
如本领域技术人员已知的，限制性酶切位点的引入是特别有利的。因此，在一个优选的实施方案中，在本发明的核酸分子中，在编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基(例如RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基和HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基)的位置处引入限制性酶切位点。在一个优选的实施方案中，在本发明的核酸分子中，在编码所述连接体的核苷酸序列中和/或其一端或两端引入限制性酶切位点。在一个优选的实施方案中，在本发明的核酸分子中和/或其一端或两端引入一个或多个限制性酶切位点。各种限制性酶切位点是本领域技术人员已知的，其包括但不限于，EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等限制性内切酶识别的酶切位点。
在一个优选的实施方案中，所述变体与所述编码多肽载体的核苷酸序列具有至少90％的同一性，例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
在一个优选的实施方案中，所述变体能够在严紧条件下与所述编码多肽载体的核苷酸序列杂交。在一个优选的实施方案中，所述变体能够在高严紧条件下与所述编码多肽载体的核苷酸序列杂交。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4-9和75-80。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:12-17和81-86的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子用于***编码目的多肽的核苷酸序列。例如，所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基(例如RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基和HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基)的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端。在一个优选的实施方案中，以符合读框的方式将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。在一个优选的实施方案中，利用限制性酶切位点，将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子还包含，编码目的多肽的核苷酸序列，其中，所述目的多肽相对于所述多肽载体而言是异源的，并且所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基(例如RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基和HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基)的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端。在一个优选的实施方案中，以符合读框的方式将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。在一个优选的实施方案中，利用限制性酶切位点，将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者是抗原或者含有抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体或RBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体或TBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体或HBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含或者由编码选自SEQ ID NO:23-40、69-74和90-96的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及，含有如上所定义的本发明核酸分子的载体(vector)。
可用于***目的多核苷酸(例如，本发明的核酸分子)的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体可以是真核表达载体或原核表达载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，或噬菌体等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种展示目的多肽的方法，其包括:
(1)将编码所述目的多肽的核苷酸序列***至本发明的核酸分子中(特别是，***至编码多肽载体的核苷酸序列中)，从而获得编码重组蛋白的核酸分子；和
(2)将步骤(1)中的编码重组蛋白的核酸分子表达为重组蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽相对于所述多肽载体而言是异源的。在一个优选的实施方案中，所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基(例如RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基和HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基)的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端。在一个优选的实施方案中，以符合读框的方式将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。在一个优选的实施方案中，利用限制性酶切位点，将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者是抗原或者含有抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体或RBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体或TBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体或HBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述编码重组蛋白的核酸分子包含或者由编码选自SEQID NO:23-40、69-74和90-96的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及一种重组蛋白，其包含多肽载体和目的多肽，其中，所述多肽载体如上文所定义，并且，所述目的多肽被***至所述多肽载体中。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽被***至所述被缺失的一个或多个氨基酸残基(例如RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基和HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基)的位置处，或者被***至所述连接体中或其一端或两端。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者是抗原或者含有抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体或RBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体或TBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体或HBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4-9和75-80。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:23-40、69-74和90-96的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及一种病毒样颗粒，其包含或者由本发明的重组蛋白组成。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物(例如疫苗)，其包含本发明的重组蛋白或本发明的病毒样颗粒，和任选地，一种或多种药学上可接受的载体(vehicle)或赋形剂(例如佐剂)。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白或本发明的病毒样颗粒以有效量存在于药物组合物中。例如，本发明的药物组合物可包含有效预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)的量的重组蛋白或病毒样颗粒。
在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其中所述目的多肽包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体或RBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体或TBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体或HBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:35-40、69-74和90-96的氨基酸序列组成。
在一个优选的实施方案中，以有效预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)的量施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)，其中所述目的多肽包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体或RBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体或TBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体或HBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:35-40、69-74和90-96的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)，其中所述目的多肽包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体或RBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体或TBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体或HBHBcAg-T载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:35-40、69-74和90-96的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病(例如，AIDS)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其中所述目的多肽包含来自HIV的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HIV的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列组成。
在一个优选的实施方案中，以有效预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病(例如，AIDS)的量施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病(例如，AIDS)，其中所述目的多肽包含来自HIV的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HIV的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病(例如，AIDS)，其中所述目的多肽包含来自HIV的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HIV的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗癌症(例如，非小细胞肺癌)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其中所述目的多肽包含人PD-L1蛋白的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含人PD-L1蛋白的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:29-34的氨基酸序列组成。
在一个优选的实施方案中，以有效预防或治疗癌症(例如，非小细胞肺癌)的量施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗癌症(例如，非小细胞肺癌)，其中所述目的多肽包含人PD-L1蛋白的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含人PD-L1蛋白的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:29-34的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其用于预防或治疗癌症(例如，非小细胞肺癌)，其中所述目的多肽包含人PD-L1蛋白的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含人PD-L1蛋白的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:29-34的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及编码上述重组蛋白的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
可用于***目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体可以是真核表达载体或原核表达载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，或噬菌体等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明还涉及制备上述重组蛋白的方法，其包括，在适合表达所述重组蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，和，回收所述重组蛋白。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg)”和“RBHBcAg蛋白”是指，来自蹄蝠乙型肝炎病毒(roundleaf bat HBV，RBHBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：KC790373.1)。
如本文中所使用的，当提及RBHBcAg蛋白的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基”是指，SEQ IDNO：1所示的多肽的第78-83位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在RBHBcAg蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的RBHBcAg蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“RBHBcAg蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：1所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述RBHBcAg蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第78-83位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“野生型RBHBcAg”是指，天然存在于蹄蝠乙型肝炎病毒中的核心抗原蛋白。
如本文中所使用的，术语“RBHBcAg载体”和“RBHBcAg-T载体”是指，衍生自RBHBcAg蛋白的多肽载体。如上文所详细描述的，RBHBcAg载体与RBHBcAg蛋白的差异包括：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；以及(b)任选地，RBHBcAg蛋白的C端被缺失1-40个氨基酸残基。RBHBcAg-T载体与RBHBcAg蛋白的差异包括：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；(b)RBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第50-69位中的一个或多个氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位；以及(c)任选地，RBHBcAg蛋白的C端被缺失1-40个氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg)”和“TBHBcAg蛋白”是指，来自筑帐蝠乙型肝炎病毒(tent-making bat HBV，TBHBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：KC790378.1)。
如本文中所使用的，当提及TBHBcAg蛋白的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：2所示的序列来进行描述。例如，表述“TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基”是指，SEQ IDNO：2所示的多肽的第80-84位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在TBHBcAg蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的TBHBcAg蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“TBHBcAg蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：2所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述TBHBcAg蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：2的第80-84位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“野生型TBHBcAg”是指，天然存在于筑帐蝠乙型肝炎病毒中的核心抗原蛋白。
如本文中所使用的，术语“TBHBcAg载体”和“TBHBcAg-T载体”是指，衍生自TBHBcAg蛋白的多肽载体。如上文所详细描述的，TBHBcAg载体与TBHBcAg蛋白的差异包括：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；以及(b)任选地，TBHBcAg蛋白的C端被缺失1-35个氨基酸残基。TBHBcAg-T载体与TBHBcAg蛋白的差异包括：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；(b)TBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第54-73位中的一个或多个氨基酸残基和/或第124-144位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位；以及(c)任选地，TBHBcAg蛋白的C端被缺失1-35个氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg)”和“HBHBcAg蛋白”是指，来自菊头蝠乙型肝炎病毒(horseshoe bat HBV，HBHBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：KC790377.1)。
如本文中所使用的，当提及HBHBcAg蛋白的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：3所示的序列来进行描述。例如，表述“HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基”是指，SEQ IDNO：3所示的多肽的第78-83位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBHBcAg蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBHBcAg蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBHBcAg蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：3所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBHBcAg蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：3的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：3的第78-83位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“野生型HBHBcAg”是指，天然存在于菊头蝠乙型肝炎病毒中的核心抗原蛋白。
如本文中所使用的，术语“HBHBcAg载体”和“HBHBcAg-T载体”是指，衍生自HBHBcAg蛋白的多肽载体。如上文所详细描述的，HBHBcAg载体与HBHBcAg蛋白的差异包括：(a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；以及(b)任选地，HBHBcAg蛋白的C端被缺失1-40个氨基酸残基。HBHBcAg-T载体与HBHBcAg蛋白的差异包括：(a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；(b)HBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第50-69位中的一个或多个氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位；以及(c)任选地，HBHBcAg蛋白的C端被缺失1-40个氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“人HBV的HBcAg”和“Hu-HBcAg”是指，人乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：AAO63517.1)。如本文中所使用的，当提及人HBV的HBcAg的氨基酸序列时，其使用NCBIGENBANK数据库登录号：AAO63517.1所示的序列来进行描述。
如本文中所使用的，术语“人HBV的HBsAg”和“Hu-HBsAg”是指，人乙型肝炎病毒的表面抗原主蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：AAF24729.1)。
如本文中所使用的，当提及人HBV的HBsAg的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：44所示的序列(即，NCBI GENBANK数据库登录号：AAF24729.1)来进行描述。例如，表述“HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：44所示的多肽的第113-135位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBsAg蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBsAg蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBsAg蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：44所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBsAg蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：44的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：44的第113-135位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，表述“X蛋白的C端缺失Y个氨基酸残基”是指，X蛋白的C端最后Y个氨基酸残基全部被去除。例如，表述“RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基”是指，RBHBcAg蛋白的C端最后1-40个氨基酸残基全部被去除。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Al ign程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Mi l ler(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中所使用的，术语“杂交”是指，相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。核酸杂交可以在DNA-DNA之间，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。关于核酸杂交的进一步详细描述，可参见例如，Henegariu O等人，(1999).“Custom fluorescent-nucleotide synthesis as an alternative methodfor nucleic acid label ing”,Nature Biotechnology 18:345-348；Ezaki T等人，1989.Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridizationin Microdilut ion Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization inwhich Radioisotopes Are Used To Determine Genetic Relatedness among BacterialStrains.Int.J.of Systemic Bacteriology 29(3):224-229；和Herrington C等人，1998.PCR 3:PCR in situ hybridization:a practical approach,Volume 3.Oxford:Oxford University Press。
为了保证核酸杂交的特异性，通常使用严紧条件或者高严紧条件。严紧条件和高严紧条件在分子生物学领域中是熟知的。例如，严紧条件可以是指，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、于约45℃下进行杂交，随后在0.2×SSC/0.1％SDS中、于约50－65℃下进行一次或多次洗涤。高严紧条件可以是指，在6×SSC中、于约45℃下进行杂交，随后在0.1×SSC/0.2％SDS中、于约68℃下进行一次或多次洗涤。关于本领域技术人员已知的其它严紧条件或高严紧条件，可参见例如Ausubel,F.M.等编,1989,Current Protocols in MolecularBiology,第1卷,Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&Sons,Inc.,纽约，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页。
如本文中所使用的，术语“连接体”是指，用于连接两个分子(例如蛋白)的短肽。此类连接体是本领域技术人员公知的，包括但不限于柔性连接体，例如(Gly)4，(Gly)4-Ser，((Gly)4-Ser)3等等。
在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“限制性酶切位点”是指，限制性内切酶识别的酶切位点。此类限制性酶切位点是本领域技术人员已知的，其包括但不限于，EcoR I、BamH I、HindⅡ、HindⅢ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等限制性内切酶识别的酶切位点。
如本文中所使用的，术语“抗原表位”和“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“T细胞表位”是指，能够被T细胞受体(TCR)识别的表位。相应地，人T细胞表位是指，能够被人T细胞受体(TCR)识别的表位。如本领域技术人员通常理解的，TCR一般不识别构象表位，而只识别由连续的氨基酸残基组成的线性表位(例如，约10-20个氨基酸的小分子多肽)。并且，此类表位需要与MHC分子结合后才能被TCR识别。因此，根据所结合的MHC分子的类型，可将人T细胞表位分类为MHC I和MHC II限制性人T细胞表位，其分别结合MHC I类分子和MHC II类分子。在本文中，示例性的MHC I限制性人T细胞表位如SEQ ID NO:87所示(参见Zhang H P,Yan H P,Zhang Y H,et al.Detection ofantigen-epitope-specific cytotoxic T lymphocytes in patients with hepatitis Bvirus infection by enzyme linked immunospot assay[J].Zhonghua yu fang yi xueza zhi[Chinese journal of preventive medicine],2009,43(8):690-694)；示例性的MHC II限制性人T细胞表位如SEQ ID NO:88-89所示(参见J Immunol.2000Feb 1；164(3):1625-33和Proc.Nati.Acad.Sci.USA Vol.85,pp.1610-1614,March 1988)。然而，易于理解的是，由于线性表位与空间结构、构型和构象无关，因此，本领域技术人员也可以选择其他人T细胞表位，并将其用于实施本发明。本发明不受特定的人T细胞表位限制。
如本文中所使用的，术语“HBsAg的表位”是指，存在于HBsAg中的、能够被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。已对人HBV的HBsAg的结构和功能进行了深入的研究。并且，已有许多文献报道了人HBV的HBsAg上的表位。参见例如，WO 97/39029A2；WO 85/04103A1；Xiaoxing Qiu等，The Journal of Immunology，1996，第156卷，第3350-3356页；WO 2013/185558A1等。
如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够形成表位/用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与多肽载体融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。表位肽所包含的表位可以是线性表位，也可以是构象表位。当表位肽包含线性表位时，其可以包含或者是抗原中构成该表位的连续氨基酸区段(即，肽片段)。当表位肽包含构象表位时，其可以包含或者是抗原中横跨该构象表位所涉及的所有氨基酸残基的连续氨基酸区段(即，肽片段)。在本发明的某些实施方案中，表位肽优选地具有不超过500个氨基酸残基的长度，例如不超过400个氨基酸残基的长度，不超过300个氨基酸残基的长度，不超过200个氨基酸残基的长度，不超过100个氨基酸残基的长度，不超过90个氨基酸残基的长度，不超过80个氨基酸残基的长度，不超过70个氨基酸残基的长度，不超过60个氨基酸残基的长度，不超过50个氨基酸残基的长度，不超过40个氨基酸残基的长度，不超过30个氨基酸残基的长度，或不超过25个氨基酸残基的长度。
如本文中所使用的，术语“多肽载体”是指这样的载体蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处(例如蛋白内部，N端或C端)***表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫***识别。之前的文献已报道了此类载体蛋白，包括例如，HPV L1蛋白(可以将表位肽***在所述蛋白的第130-131位氨基酸之间或在第426-427位氨基酸之间，参见Slupetzky,K.等Chimeric papillomavirus-like particlesexpressing a foreign epitope on capsid surface loops[J].J Gen Virol,2001,82:2799-2804；Varsani,A.等Chimeric human papillomavirus type 16(HPV-16)L1particles presenting the common neutralizing epitope for the L2minor capsidprotein of HPV-6and HPV-16[J].J Virol,2003,77:8386-8393)，CRM197蛋白(可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端)等。如上文所论述的，本发明提供了一类新的多肽载体，其用于展示目的多肽，并且特别适合用于展示含有来自人乙肝病毒的抗原表位(例如来自人HBV的HBsAg中的表位)的表位肽。在本发明的实施方案中，可以在表位肽与多肽载体之间使用连接体(例如柔性或刚性连接体)，以促进二者各自的折叠。
如本文中所使用的，术语“重组蛋白”仅表示，所描述的蛋白不是天然存在的，而不意欲限定该蛋白的产生/获得方式。本发明的重组蛋白可以通过任何已知的方法来产生，包括但不限于，基因工程方法和人工合成方法。
如本文中所使用的，术语“病毒样颗粒”是指，由某种病毒的一个或多个结构蛋白构成的空心颗粒，其不包含病毒核酸，不能进行自主复制，但在形态和结构上与真正的病毒粒子相同或相似。
如本文中所使用的，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达***”是指由大肠杆菌(菌株)与载体(vector)组成的表达***，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种新的多肽载体，其具有广泛的通用性，能够用于高效展示各种目的多肽(例如，抗原表位/抗原肽段)，并诱发宿主免疫***产生针对目的多肽的特异性免疫应答。此类目的多肽(例如，抗原表位/抗原肽段)包括但不限于，来源于HIV的抗原表位/抗原肽段(例如，来源于HIV的GP120蛋白的抗原表位/抗原肽段；例如含有GP120蛋白的第361-375位氨基酸的多肽)，来源于人PD-L1蛋白的抗原表位/抗原肽段(例如，含有人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸的多肽)，和来源于人HBV的抗原表位/抗原肽段(例如，来源于人HBV的HBsAg蛋白的抗原表位/抗原肽段；例如含有HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸的多肽)。
(2)本发明的多肽载体特别适合用于展示来自人乙肝病毒的抗原表位(例如来自人HBV的HBsAg中的表位)，能够在受试者中诱发特别强的清除HBsAg的特异性免疫应答，其功效显著优于现有的乙肝疫苗(例如，以人HBV的HBcAg为多肽载体构建的、含有相同表位的疫苗)。
(3)本发明的携带人T细胞表位的多肽载体能够在人体内诱发增强的免疫应答，例如刺激人免疫细胞分泌IFNγ，从而是特别有利的。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1展示了，将目的多肽(靶抗原肽段)***本发明的RBHBcAg载体、TBHBcAg载体和HBHBcAg载体以构建重组蛋白的克隆方案的示意图。
图2展示了，实施例2中所构建的18种重组蛋白的SDS-PAGE结果，以及由所述重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。
图3展示了，用实施例2中构建的18种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠后，小鼠血清中抗重组蛋白中的目的多肽的抗体滴度随时间的变化情况。纵轴：抗体滴度(log10)；横轴：时间(周)。图3A：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:20，且检测抗GP120抗体的滴度；图3B：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:21，且检测抗PD-L1抗体的滴度；图3C：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:22，且检测抗HBsAg抗体的滴度。
图4展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图4A)和雌性(图4B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况。纵轴：HBsAg的水平(IU/ml)；横轴：时间(周)。箭头指示，给小鼠施用病毒样颗粒的时间点。
图5展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性小鼠后，小鼠血清中HBV DNA的水平随时间的变化情况。纵轴：HBV DNA的水平(Log10IU/ml)；横轴：时间(周)。箭头指示，给小鼠施用病毒样颗粒的时间点。
图6展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图6A)和雌性(图6B)小鼠后，小鼠血清中抗HBsAg抗体的滴度随时间的变化情况。纵轴：抗HBsAg抗体的滴度；横轴：时间(周)。
图7显示了，由实施例5中构建的6种重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。
图8展示了，用8种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠3周后，小鼠血清中抗相应靶多肽(SEQ ID NO：60，22，61，62)的抗体滴度；其中，用来自HBV基因型A的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO：60)来检测用RBHBcAg149-SEQ60和TBHBcAg153-SEQ60免疫的小鼠血清的抗体滴度；用来自HBV基因型B的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:SEQ22)来检测用RBHBcAg149-SEQ22和TBHBcAg153-SEQ22免疫的小鼠血清的抗体滴度；用来自HBV基因型C的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:61)来检测用RBHBcAg149-SEQ61和TBHBcAg153-SEQ61免疫的小鼠血清的抗体滴度；并且，使用来自HBV基因型D的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:62)来检测用RBHBcAg149-SEQ62和TBHBcAg153-SEQ62免疫的小鼠血清的抗体滴度。结果显示，8种重组蛋白形成的病毒样颗粒均具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度的特异性结合靶抗原的抗体。
图9展示了，用4种重组蛋白(SEQ ID NO：36，69，70，71)形成的病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图9A)和雌性(图9B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况，其中，纵轴：HBsAg的水平(IU/ml)；横轴：时间(周)。
图10展示了，将目的多肽(靶抗原肽段)***本发明的RBHBcAg-T3载体、TBHBcAg-T3载体和HBHBcAg-T3载体以构建重组蛋白的克隆方案的示意图。
图11展示了实施例7构建的2种重组蛋白(RBHBcAg189-T3-SEQ22和RBHBcAg149-T3-SEQ22)的SDS-PAGE结果，以及由所述重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。
图12展示了，用实施例7的重组蛋白RBHBcAg189-T3-SEQ22和RBHBcAg149-T3-SEQ22形成的病毒样颗粒以及实施例2的重组蛋白RBHBcAg189-SEQ22和RBHBcAg149-SEQ22形成的病毒样颗粒分别免疫BALB/C小鼠后，小鼠血清中抗重组蛋白中的目的多肽HBsAg的抗体滴度随时间的变化情况。纵轴：抗HBsAg抗体滴度(log10)；横轴：时间(周)；箭头指示，给小鼠施用病毒样颗粒的时间点(疫苗注射)。结果显示，4种病毒样颗粒均具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度的特异性结合靶抗原HBsAg的抗体。
图13展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的2种不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图13A)和雌性(图13B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况。纵轴：HBsAg的水平(IU/ml)；横轴：时间(周)。箭头指示，给小鼠施用病毒样颗粒的时间点(疫苗注射)。结果显示，在施用给HBV转基因小鼠后，2种病毒样颗粒都可以引起小鼠血清中HBsAg水平的降低，且两种VLP效果相当。
图14展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的2种病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图14A)和雌性(图14B)小鼠后，小鼠血清中HBV DNA的水平随时间的变化情况。纵轴：HBV DNA的水平(Log10IU/ml)；横轴：时间(周)；箭头指示，给小鼠施用病毒样颗粒的时间点(疫苗注射)。结果显示，在施用给HBV转基因小鼠后，2种病毒样颗粒都可以引起小鼠血清中HBV DNA水平的降低，且两种VLP效果相当。
图15展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的2种病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图15A)和雌性(图15B)小鼠后，小鼠血清中抗HBsAg抗体的滴度随时间的变化情况。纵轴：抗HBsAg抗体的滴度；横轴：时间(周)。结果显示，在施用给HBV转基因小鼠后，2种病毒样颗粒都可以诱发小鼠产生高滴度的抗-HBsAg抗体，且两种VLP效果相当。
图16展示了，用病毒样颗粒RBHBcAg149-T3-SEQ22或病毒样颗粒RBHBcAg149-SEQ22孵育获自乙肝患者的全血后，全血中分泌的IFNγ的水平。结果显示，用RBHBcAg149-T3-SEQ22孵育的全血中的IFNγ水平显著高于用RBHBcAg149-SEQ22(p＝0.0021)或PBS(p＝0.0037)孵育的全血中的IFNγ水平。
图17显示了，经纯化的重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22的SDS-PAGE结果，以及由所述重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。
序列信息
本发明涉及的部分序列(SEQ ID NO:1-44和75-96)的信息提供于下面的表1中。
表1：SEQ ID NO:1-44和75-96的序列信息
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.编码多肽载体的质粒的构建
在本实施例中，我们构建了编码多肽载体的质粒。
1.1编码多肽载体的核苷酸序列的制备
基于三种蝙蝠来源的乙型肝炎病毒核心抗原蛋白(即，RBHBcAg蛋白，TBHBcAg蛋白，HBHBcAg蛋白)，设计了下述多肽载体：
RBHBcAg189载体，其与RBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:1)的区别在于，RBHBcAg蛋白的第78-81位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；RBHBcAg189载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
TBHBcAg188载体，其与TBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:2)的区别在于，RBHBcAg蛋白的第80-83位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；TBHBcAg188载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
HBHBcAg189载体，其与HBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:3)的区别在于，RBHBcAg蛋白的第78-81位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；HBHBcAg189载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
另外，还基于人HBV的HBcAg蛋白，设计了HBcAg183载体，用作对照。HBcAg183载体与人HBV的HBcAg蛋白的区别在于，人HBV的HBcAg蛋白的第79-81位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；HBcAg183载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
上述四种载体的核苷酸序列均委托生工生物工程上海(股份)有限公司进行全基因合成。
1.2编码多肽载体的质粒的制备
以上述合成的核苷酸序列为模板，使用表2中的引物，通过PCR分别扩增上述4种载体的全长基因以及其截短体(即，C端截短的基因片段)。一共获得8种PCR产物，分别是：编码RBHBcAg189载体的基因(SEQ ID NO:12；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4)、编码RBHBcAg149载体的基因(SEQ ID NO:13；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:5)、编码TBHBcAg188载体的基因(SEQ ID NO:14；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:6)、编码TBHBcAg153载体的基因(SEQ ID NO:15；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:7)、编码HBHBcAg189载体的基因(SEQ ID NO:16；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:8)、编码HBHBcAg149载体的基因(SEQ ID NO:17；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:9)、编码HBcAg183载体的基因(SEQ ID NO:18；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:10)、和编码HBcAg149载体的基因(SEQ ID NO:19；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:11)。
用NdeI和HindIII将pTO-T7载体(罗文新,张军,杨海杰,等.一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J].生物工程学报,2000,16(5):578-581)双酶切，获得线性化载体。利用Gibson assembly克隆方法(New England Biolabs(UK)Ltd)，将获得的8种PCR产物与线性化载体连接，并转化入DH5a感受态细菌中。将经转化的细菌涂板培养，然后挑取单克隆菌落，提取质粒并进行测序。经测序验证，获得8种含有编码多肽载体的核苷酸序列的质粒。
上述PCR过程涉及的引物示于表2中。
表2：引物序列
实施例2.重组蛋白的制备
在本实施例中，我们将编码目的多肽的核苷酸序列***实施例1构建的质粒中，并获得了含有目的多肽和多肽载体的重组蛋白。将目的多肽(靶抗原肽段)***本发明的RBHBcAg载体、TBHBcAg载体和HBHBcAg载体以构建重组蛋白的克隆方案的示意图如图1所示。
2.1编码含有目的多肽和多肽载体的重组蛋白的表达质粒的构建
本实施例利用3种目的多肽来验证本发明的多肽载体用于展示肽段的通用性。这3种目的多肽为：多肽HIV-GP120-aa361-375(即，来源于HIV GP120蛋白的第361-375位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)；多肽hPDL1-aa147-160(即，来源于人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示)；多肽HBsAg-aa113-135(即，来源于人HBV表面抗原主蛋白(HBsAg)的第113-135位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示)。
直接合成所述3种目的多肽的正义和反义编码序列(如表3所示)，并进行退火，从而获得具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段。
表3：3种目的多肽的正义和反义编码序列
将实施例1中获得的6种质粒(RBHBcAg189、RBHBcAg149、TBHBcAg188、TBHBcAg153、HBHBcAg189和HBHBcAg149)分别用BamHI和EcoRI双酶切，获得6种线性化的载体。然后，将如上制备的3种具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段分别连接入各个线性化载体中，获得编码重组蛋白的表达质粒(一共18种：RBHBcAg189-SEQ20，RBHBcAg149-SEQ20，TBHBcAg188-SEQ20，TBHBcAg153-SEQ20，HBHBcAg189-SEQ20，HBHBcAg149-SEQ20，RBHBcAg189-SEQ21，RBHBcAg149-SEQ21，TBHBcAg188-SEQ21，TBHBcAg153-SEQ21，HBHBcAg189-SEQ21，HBHBcAg149-SEQ21，RBHBcAg189-SEQ22，RBHBcAg149-SEQ22，TBHBcAg188-SEQ22，TBHBcAg153-SEQ22，HBHBcAg189-SEQ22，和HBHBcAg149-SEQ22)。
2.2重组蛋白的表达、纯化和组装
使用前一步骤构建的18种表达质粒，通过相同的方法来表达和纯化所述表达质粒编码的重组蛋白。下面以RBHBcAg149-SEQX(SEQX表示SEQ20、SEQ21或SEQ22)为例，阐述这些重组蛋白的表达和纯化过程。
(2.2.1)用于表达重组蛋白的菌株的制备：将2.1中获得的表达质粒RBHBcAg149-SEQX转化入大肠杆菌ER2566菌株，从而获得表达菌株。
(2.2.2)重组蛋白RBHBcAg149-SEQX的表达：将表达菌株接种至500mL三角瓶中，于37℃定温摇床培养至OD＝1.0左右；随后加入异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM，并于25℃继续表达6小时。
(2.2.3)重组蛋白RBHBcAg149-SEQX的纯化：
(2.2.3.1)菌体超声破碎：离心收取2.2.2中的菌体，并进行超声破碎。超声缓冲液为：20mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)+300mM NaCl。
(2.2.3.2)重组蛋白的初步纯化：将超声破碎后的混合物于65℃水浴中温育30分钟，随后离心收取上清；按1:1的体积比向上清中加入饱和硫酸铵，离心收取沉淀；加入适当体积的缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)+150mM NaCl)将沉淀重悬，从而获得初步纯化的重组蛋白RBHBcAg149-SEQX。
(2.2.3.3)重组蛋白的层析纯化：按照制造商的说明书，利用Sepharose 4FF(GE)分子筛柱层析进一步纯化2.2.3.2中获得的蛋白，从而获得经纯化的重组蛋白。对经纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE检测，并用透射电镜观察由重组蛋白形成的VLP的状态。
图2显示了，所构建的18种重组蛋白的SDS-PAGE结果，以及由所述重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。结果显示，所获得的18种重组蛋白的纯度均大于85％，并且均能够组装成直径约30nm病毒样颗粒。这些结果表明，本发明所构建的多肽载体具有广泛的通用性，能够用于展示各种目的多肽，并且能够形成VLP。
实施例3.病毒样颗粒的免疫原性的评估
在本实施例中，我们验证了由实施例2制备的重组蛋白形成的病毒样颗粒的免疫原性。此类病毒样颗粒均能够诱导机体产生特异性结合靶抗原的抗体。
3.1小鼠免疫
用实施例2制备的18种病毒样颗粒分别免疫BALB/C小鼠。免疫方案如下：免疫佐剂为氢氧化铝佐剂；免疫剂量为3ug/dose；免疫方式为后肢大腿外侧肌肉注射；免疫程序为，初次免疫+2周后的加强免疫，共免疫2次。
3.2血清中特异性结合靶抗原的抗体的滴度的检测
3.2.1反应板的制备
反应板的包被抗原是，分别与上述3种目的多肽对应的靶抗原，即：HIV-1的gp120蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司，目录号11233-V08H)，人PD-L1蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)，CHO细胞重组表达的人乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白(HBsAg，购自北京万泰生物药业股份有限公司)。
将3种重组蛋白分别用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为2μg/mL，以获得包被液。在96孔酶标板的各个孔中加入100μL的包被液，并在2-8℃包被16-24小时，然后在37℃继续包被2小时。然后，用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤孔1次；随后每孔加入200μL的封闭液(含20％小牛血清及1％酪蛋白的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液，pH值为7.4)，并在37℃封闭2小时。弃去封闭液。然后，将酶标板干燥，并装入铝箔袋，于2-8℃保存备用。
3.2.2血清中Anti-HBsAg抗体滴度的ELISA检测
血清样品的收集：在0、2、4周采集小鼠眼眶血，分离血清并冻存于-20℃，直至检测。
样品稀释：用含20％新生牛血清的PBS溶液将小鼠血清稀释成1:100、1:500、1:2500、1:12500、1:62500、1:312500、1:1562500共7个稀释梯度。
ELISA检测：向经包被的酶标板的各孔中加入100μL已稀释的血清样品，于37℃孵育30分钟。然后，用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)将酶标板洗涤5遍。洗涤后，向酶标板的各孔中加入100μL GAM-HRP反应液，于37℃孵育30分钟。然后，用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)将酶标板洗涤5遍。洗涤后，向酶标板的各孔中加入50μL TMB显色剂(由北京万泰生物药业股份有限公司提供)，于37℃孵育15分钟。孵育完成后，向酶标板的各孔中加入50μL终止液(由北京万泰生物药业股份有限公司提供)，并在酶标仪上读取各孔的OD450/630值。
抗体滴度的计算：取读值在0.2-2.0之间的样品孔进行分析，对样品的稀释倍数与读值作回归曲线，计算出读值等于2倍本底值时的样品稀释倍数，并将该样品稀释倍数作为血清中的特异性抗体的滴度。
图3展示了，用18种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠后，小鼠血清中抗靶抗原的抗体滴度随时间的变化情况。图3A：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:20，且检测抗GP120抗体的滴度；图3B：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:21，且检测抗PD-L1抗体的滴度；图3C：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:22，且检测抗HBsAg抗体的滴度。结果显示，18种重组蛋白形成的病毒样颗粒均具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度的特异性结合靶抗原的抗体。
实施例4.展示HBsAg表位(SEQ ID NO:22)的病毒样颗粒的抗HBV治疗效果的评估
在本实施例中，我们评估了基于不同多肽载体构建的、展示相同表位肽(SEQ IDNO:22)的病毒样颗粒的抗HBV治疗效果。
4.1小鼠免疫
按照实施例1-2描述的方案，制备了基于人HBV的HBcAg构建的、展示HBsAg表位(SEQ ID NO:22)的2种重组蛋白(即，HBcAg183-SEQ22，其氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示；和HBcAg149-SEQ22，其氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示)，并制备了由这2种重组蛋白形成的病毒样颗粒。
随后，利用HBV转基因小鼠模型来评价实施例2中制备的5种展示HBsAg表位(SEQID NO:22)的病毒样颗粒以及本实施例制备的2种病毒样颗粒的抗HBV治疗效果。
免疫方案如下：免疫佐剂为氢氧化铝佐剂；免疫剂量为12μg/dose；免疫方式为后肢大腿外侧肌肉注射；免疫程序为，0、2、3、4、5、6周各免疫一次，共免疫6次。
4.2血清抗体滴度与病毒学指标的检测
按实施例3.2中描述的方法进行血清中Anti-HBsAg抗体滴度的检测，并检测小鼠血清中的病毒学指标，即，HBV DNA和HBsAg的水平。
4.3重组蛋白的治疗效果分析
检测结果示于图4-6中。图4展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图4A)和雌性(图4B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况。图5展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性小鼠后，小鼠血清中HBV DNA的水平随时间的变化情况。图6展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图6A)和雌性(图6B)小鼠后，小鼠血清中抗HBsAg抗体的滴度随时间的变化情况。
结果显示，在用VLP进行免疫治疗的组中，在免疫后，小鼠血清中均可检出Anti-HBsAg抗体，并且小鼠血清中的HBV DNA和HBsAg的水平均出现了不同程度的下降。相比之下，对照组小鼠(未用VLP进行免疫)的血清中均没有产生Anti-HBsAg抗体，并且血清中的HBV DNA和HBsAg的水平均未出现下降。
这些结果显示，基于蝙蝠乙型肝炎病毒核心蛋白所构建的6种多肽载体均可以用于高效展示来自人HBV的HBsAg的表位肽(例如，HBsAg-aa113-135)，其能够形成VLP，并在宿主体内诱导机体产生高滴度的anti-HBsAg抗体，并由此抑制小鼠体内的HBV DNA和HBsAg的水平(即，HBV DNA和HBsAg显著下降)。此外，图4-6的实验数据还显示，基于本发明的多肽载体(例如RBHBcAg149和TBHBcAg153)的病毒样颗粒具有特别显著的抗HBV治疗效果，其优于基于人HBV的HBcAg构建的病毒样颗粒。
因此，本实施例的实验结果表明：(1)本发明的多肽载体能够形成VLP，适合于展示各种目的多肽，并能够诱导机体产生高滴度的针对目的多肽的抗体；(2)本发明的多肽载体特别适合于展示人HBV的表位(例如，人HBV的HBsAg的表位)，其能够诱导机体产生高滴度的针对HBsAg的抗体，清除或抑制体内的HBV DNA和HBsAg的水平，并且其效果优于基于人HBV的HBcAg构建的多肽载体。因此，本发明的展示人HBV的表位的重组蛋白具有治疗HBV感染的潜力，特别适合用于诱发有效的、特异的、治疗性的抗HBV免疫。
实施例5.展示来自不同基因型的HBV的HBsAg表位的病毒样颗粒的制备和评估
实施例2-4中所使用的HBsAg表位(SEQ ID NO:22)来自HBV基因型B。为了证实本发明的多肽载体对各种基因型的HBV的广泛适应性，我们还以RBHBcAg149和TBHBcAg153为示例性多肽载体，构建了展示来自不同基因型(基因型A、C和D)的HBV的HBsAg表位的重组蛋白，并评估了所构建的重组蛋白组装成病毒样颗粒的能力，以及所产生的病毒样颗粒的免疫原性和抗HBV感染的治疗效果。
5.1编码含有目的多肽和多肽载体的重组蛋白的表达质粒的构建
在本实施例中，除了实施例2-4中所使用的HBsAg表位(来自HBV基因型B，SEQ IDNO:22)之外，目的多肽还包括来自HBV基因型A、C和D的HBsAg蛋白表位(第113-135位氨基酸)，其分别被命名为：HBsAg-aa113-135-A，HBsAg-aa113-135-C和HBsAg-aa113-135-D，并且其序列(SEQ ID NO:60-62)示于表4中。
表4：来自HBV基因型A、C和D的HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸的序列
SEQ ID NO 名称 序列信息
60 HBsAg-aa113-135-A STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
61 HBsAg-aa113-135-C TSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFP
62 HBsAg-aa113-135-D SSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYP
直接合成所述3种目的多肽的正义和反义编码序列(如表5所示)，并进行退火，从而获得具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段。
表5：3种目的多肽的正义和反义编码序列
如实施例2中所述，将如上制备的3种具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段分别连接入线性化载体RBHBcAg149和TBHBcAg153中，从而获得编码重组蛋白的表达质粒(共6种：RBHBcAg149-SEQ60，RBHBcAg149-SEQ61，RBHBcAg149-SEQ62，TBHBcAg153-SEQ60，TBHBcAg153-SEQ61，TBHBcAg153-SEQ62)。这些表达质粒所编码的重组蛋白的氨基酸序列如表6所示。
表6：6种重组蛋白的氨基酸序列
5.2重组蛋白的表达、纯化和组装
如实施例2中所述，使用前一步骤构建的6种表达质粒，表达和纯化了所述表达质粒编码的重组蛋白。随后，使用透射电镜观察由这些重组蛋白形成的VLP的状态。
图7显示了，由所构建的6种重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。结果显示，所获得的6种重组蛋白均能够组装成直径约30nm病毒样颗粒。这些结果表明，本发明所构建的多肽载体具有广泛的通用性，能够用于展示来自各种基因型的HBV的表位肽(例如HBsAg蛋白的aa113-135)，并且能够形成良好的VLP。
5.3病毒样颗粒的免疫原性的评估
使用实施例3中描述的方法，评估了如上构建的6个重组蛋白以及实施例2中的重组蛋白RBHBcAg149-SEQ22和TBHBcAg153-SEQ22形成的病毒样颗粒的免疫原性。实验结果示于图8中。
图8展示了，用8种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠3周后，小鼠血清中抗相应靶多肽(SEQ ID NO：60，22，61，62)的抗体滴度；其中，用来自HBV基因型A的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO：60)来检测用RBHBcAg149-SEQ60和TBHBcAg153-SEQ60免疫的小鼠血清的抗体滴度；用来自HBV基因型B的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:SEQ22)来检测用RBHBcAg149-SEQ22和TBHBcAg153-SEQ22免疫的小鼠血清的抗体滴度；用来自HBV基因型C的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:61)来检测用RBHBcAg149-SEQ61和TBHBcAg153-SEQ61免疫的小鼠血清的抗体滴度；并且，使用来自HBV基因型D的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:62)来检测用RBHBcAg149-SEQ62和TBHBcAg153-SEQ62免疫的小鼠血清的抗体滴度。结果显示，8种重组蛋白形成的病毒样颗粒均具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度的特异性结合靶表位的抗体。
5.4病毒样颗粒的抗HBV治疗效果的评估
使用实施例4中描述的方法，评估了4种重组蛋白(SEQ ID NO：36，69，70，71)形成的病毒样颗粒的抗HBV治疗效果。实验结果示于图9中。
图9展示了，用如上构建的4种重组蛋白(RBHBcAg149-SEQ22，RBHBcAg149-SEQ60，RBHBcAg149-SEQ61，RBHBcAg149-SEQ62；其序列分别SEQ ID NO：36，69，70，71)形成的病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图9A)和雌性(图9B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况，其中，纵轴：HBsAg的水平(IU/ml)；横轴：时间(周)。结果显示，在用VLP进行免疫治疗的小鼠中，在免疫后，小鼠血清中的HBsAg的水平均出现了显著的下降。
这些实验结果显示，本发明的多肽载体(例如RBHBcAg149和TBHBcAg153)可用于高效展示来自不同基因型(例如基因型A、B、C和D)的人HBV的HBsAg的表位肽(例如，HBsAg-aa113-135)。基于本发明的多肽载体和HBsAg的表位肽所构建的重组蛋白能够形成VLP，并且能够在宿主体内诱导机体产生高滴度的ant i-HBsAg抗体，并由此抑制小鼠体内的HBsAg的水平(即，HBsAg的水平显著下降)。这表明，含有本发明的多肽载体和HBsAg的表位肽的重组蛋白能够用于预防和治疗各种基因型的HBV的感染，从而可用于开发新的抗HBV疫苗和药物。
实施例6.编码携带T细胞表位的多肽载体的质粒的构建
在本实施例中，我们构建了编码携带T细胞表位的多肽载体的质粒。
6.1编码携带T细胞表位的多肽载体的核苷酸序列的制备
基于三种蝙蝠来源的乙型肝炎病毒核心抗原蛋白(即，RBHBcAg蛋白蛋白，TBHBcAg蛋白，HBHBcAg蛋白)，设计了下述多肽载体：
RBHBcAg189-T3载体，其与RBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:1)的区别在于：RBHBcAg蛋白的第78-81位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；RBHBcAg蛋白的第18-27位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:87所示的序列,RBHBcAg蛋白的第50-69位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:88所示的序列,RBHBcAg蛋白的第120-140位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:89所示的序列。RBHBcAg189-T3载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示。
TBHBcAg188-T3载体，其与TBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:2)的区别在于：TBHBcAg蛋白的第80-83位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；TBHBcAg蛋白的第18-27位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:87所示的序列,TBHBcAg蛋白的第54-73位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:88所示的序列,TBHBcAg蛋白的第124-144位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:89所示的序列。TBHBcAg188-T3载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示。
HBHBcAg189-T3载体，其与HBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:3)的区别在于：HBHBcAg蛋白的第78-81位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；HBHBcAg蛋白的第18-27位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:87所示的序列,HBHBcAg蛋白的第50-69位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:88所示的序列,HBHBcAg蛋白的第120-140位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:89所示的序列。HBHBcAg189-T3载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示。
上述3种载体的核苷酸序列均委托生工生物工程上海(股份)有限公司进行全基因合成。
6.2编码多肽载体的质粒的制备
以上述合成的核苷酸序列(例如RBHBcAg189-T3载体)为模板，使用如SEQ ID NO:45-47所示的引物，通过PCR扩增RBHBcAg189-T3载体的全长基因以及其截短体(即，C端截短的基因片段)。一共获得2种PCR产物，分别是：编码RBHBcAg189-T3载体的基因(SEQ ID NO:81，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:75)；以及，编码RBHBcAg149-T3载体的基因(SEQ IDNO:84，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:78)。
通过类似的方法，可获得下列PCR产物：编码TBHBcAg188-T3载体的基因(SEQ IDNO:82，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:76)；编码HBHBcAg189-T3载体的基因(SEQ IDNO:83，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:77)；编码TBHBcAg153-T3载体的基因(SEQ IDNO:85，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:79)；以及，编码HBHBcAg149-T3载体的基因(SEQID NO:86，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:80)。
用NdeI和HindIII将pTO-T7载体(罗文新,张军,杨海杰,等.一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J].生物工程学报,2000,16(5):578-581)双酶切，获得线性化载体。利用Gibson assembly克隆方法(New England Biolabs(UK)Ltd)，将获得的PCR产物分别与线性化载体连接，并转化入DH5a感受态细菌中。将经转化的细菌涂板培养，然后挑取单克隆菌落，提取质粒并进行测序。经测序验证，获得6种含有编码多肽载体的核苷酸序列的质粒。
实施例7.重组蛋白的制备
在本实施例中，我们将编码目的多肽的核苷酸序列***实施例6构建的质粒中，并获得了含有目的多肽和多肽载体的重组蛋白。将目的多肽(靶抗原肽段)***本发明的RBHBcAg-T3载体、TBHBcAg-T3载体和HBHBcAg-T3载体以构建重组蛋白的克隆方案的示意图如图10所示。
7.1编码含有目的多肽和多肽载体的重组蛋白的表达质粒的构建
本实施例证实，本发明的携带人T细胞表位的多肽载体可用于展示目的多肽。所使用的示例性目的多肽为HBsAg-aa113-135(即，来源于人HBV表面抗原主蛋白(HBsAg)的第113-135位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示)。
具有粘性末端的、编码目的多肽HBsAg-aa113-135的基因片段如实施例2所述制备。将实施例6中获得的质粒RBHBcAg189-T3和RBHBcAg149-T3分别用BamHI和EcoRI双酶切，获得2种线性化的载体。然后，将如上制备的具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段分别连接入各个线性化载体中，获得编码下述重组蛋白的表达质粒：RBHBcAg189-T3-SEQ22(SEQ ID NO:90)和RBHBcAg149-T3-SEQ22(SEQ ID NO:91)。
通过类似的方法，获得编码下述重组蛋白的表达质粒：TBHBcAg188-T3-SEQ22(SEQID NO:92)、TBHBcAg153-T3-SEQ22(SEQ ID NO:93)、HBHBcAg189-T3-SEQ22(SEQ ID NO:94)和HBHBcAg149-T3-SEQ22(SEQ ID NO:95)。
7.2重组蛋白的表达、纯化和组装
使用实施例2.2中描述的方法来表达和纯化如上制备的表达质粒编码的重组蛋白，并将其用于组装VLP。
图11显示了，所构建的2种重组蛋白(RBHBcAg189-T3-SEQ22和RBHBcAg149-T3-SEQ22)的SDS-PAGE结果，以及由所述重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。结果显示，所获得的重组蛋白的纯度均大于85％，并且均能够组装成直径约30nm的病毒样颗粒。
另外，通过上述方法可证实，重组蛋白TBHBcAg188-T3-SEQ22、TBHBcAg153-T3-SEQ22、HBHBcAg189-T3-SEQ22、HBHBcAg149-T3-SEQ22也能够组装成形态良好的病毒样颗粒。
这些结果表明，本发明所构建的携带T细胞表位的多肽载体均能够用于展示目的多肽，并且能够形成VLP。
实施例8.病毒样颗粒的免疫原性的评估
在本实施例中，我们验证了由实施例7制备的重组蛋白形成的病毒样颗粒的免疫原性。此类病毒样颗粒均能够诱导机体产生特异性结合靶抗原的抗体。
8.1小鼠免疫
用实施例7制备的2种病毒样颗粒(RBHBcAg189-T3-SEQ22和RBHBcAg149-T3-SEQ22)以及实施例2制备的2种病毒样颗粒(RBHBcAg189-SEQ22和RBHBcAg149-SEQ22)分别免疫BALB/C小鼠。免疫方案如下：免疫佐剂为氢氧化铝佐剂；免疫剂量为3ug/dose；免疫方式为后肢大腿外侧肌肉注射；免疫程序为，0、2、3、4、5、6周各免疫一次，共免疫6次。
8.2血清中特异性结合靶抗原的抗体的滴度的检测
8.2.1反应板的制备
反应板的包被抗原是，与目的多肽SEQ22对应的靶抗原，即：CHO细胞重组表达的人乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白(HBsAg，购自北京万泰生物药业股份有限公司)。
将HBsAg蛋白用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为2μg/mL，以获得包被液。在96孔酶标板的各个孔中加入100μL的包被液，并在2-8℃包被16-24小时，然后在37℃继续包被2小时。然后，用PBST洗涤液(20mMPB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤孔1次；随后每孔加入200μL的封闭液(含20％小牛血清及1％酪蛋白的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液，pH值为7.4)，并在37℃封闭2小时。弃去封闭液。然后，将酶标板干燥，并装入铝箔袋，于2-8℃保存备用。
8.2.2血清中Anti-HBsAg抗体滴度的ELISA检测
血清样品的收集：在0、2、3、4、5、6、7周采集小鼠眼眶血，分离血清并冻存于-20℃，直至检测。
样品稀释：用含20％新生牛血清的PBS溶液将小鼠血清稀释成1:100、1:500、1:2500、1:12500、1:62500、1:312500、1:1562500共7个稀释梯度。
ELISA检测：向经包被的酶标板的各孔中加入100μL已稀释的血清样品，于37℃孵育30分钟。然后，用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)将酶标板洗涤5遍。洗涤后，向酶标板的各孔中加入100μL GAM-HRP反应液，于37℃孵育30分钟。然后，用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)将酶标板洗涤5遍。洗涤后，向酶标板的各孔中加入50μL TMB显色剂(由北京万泰生物药业股份有限公司提供)，于37℃孵育15分钟。孵育完成后，向酶标板的各孔中加入50μL终止液(由北京万泰生物药业股份有限公司提供)，并在酶标仪上读取各孔的OD450/630值。
抗体滴度的计算：取读值在0.2-2.0之间的样品孔进行分析，对样品的稀释倍数与读值作回归曲线，计算出读值等于2倍本底值时的样品稀释倍数，并将该样品稀释倍数作为血清中的特异性抗体的滴度。
图12展示了，用所述4种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠后，小鼠血清中抗靶抗原HBsAg的抗体滴度随时间的变化情况。结果显示，由所述4种重组蛋白形成的病毒样颗粒均具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度的特异性结合靶抗原HBsAg的抗体。此外，结果还显示，实施例7制备的病毒样颗粒RBHBcAg189-T3-SEQ22和RBHBcAg149-T3-SEQ22在小鼠体内的免疫原性与实施例2制备的病毒样颗粒RBHBcAg189-SEQ22和RBHBcAg149-SEQ22的免疫原性相当。
通过类似的方法可证实，病毒样颗粒TBHBcAg188-T3-SEQ22、TBHBcAg153-T3-SEQ22、HBHBcAg189-T3-SEQ22、HBHBcAg149-T3-SEQ22均具有良好的免疫原性。
这些结果表明，本发明的携带T细胞表位的多肽载体可用于展示目的多肽，且能够组装成VLP；并且，由包含携带T细胞表位的多肽载体和目的多肽的重组蛋白形成的病毒样颗粒能够在体内诱导产生高滴度的特异性结合目的多肽的抗体。
实施例9.展示HBsAg表位(SEQ ID NO:22)的病毒样颗粒的抗HBV治疗效果的评估
在本实施例中，我们评估了基于不同多肽载体构建的、展示相同表位肽(SEQ IDNO:22)的病毒样颗粒的抗HBV治疗效果。
9.1小鼠免疫
如实施例4中所述，利用HBV转基因小鼠模型来评价实施例7制备的病毒样颗粒RBHBcAg149-T3-SEQ22以及实施例2制备的病毒样颗粒RBHBcAg149-SEQ22(展示HBsAg表位(SEQ ID NO:22)的2种病毒样颗粒)的抗HBV治疗效果。
免疫方案如下：免疫佐剂为氢氧化铝佐剂；免疫剂量为12μg/dose；免疫方式为后肢大腿外侧肌肉注射；免疫程序为，0、2、3、4、5、6周各免疫一次，共免疫6次。
9.2血清抗体滴度与病毒学指标的检测
按实施例3.2中描述的方法进行血清中Anti-HBsAg抗体滴度的检测，并检测小鼠血清中的病毒学指标，即，HBV DNA和HBsAg的水平。
9.3重组蛋白的治疗效果分析
检测结果示于图13-15中。图13展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图13A)和雌性(图13B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况。图14展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图14A)和雌性(图14B)小鼠后，小鼠血清中HBV DNA的水平随时间的变化情况。图15展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图15A)和雌性(图15B)小鼠后，小鼠血清中抗HBsAg抗体的滴度随时间的变化情况。
结果显示，在用病毒样颗粒RBHBcAg149-T3-SEQ22或病毒样颗粒RBHBcAg149-SEQ22进行免疫治疗的组中，在免疫后，小鼠血清中均可检出显著水平的Ant i-HBsAg抗体，同时小鼠血清中的HBV DNA和HBsAg的水平均出现了显著程度的下降，并且两种病毒样颗粒的功效相当。相比之下，对照组小鼠(未用VLP进行免疫)的血清中均没有产生Anti-HBsAg抗体，并且血清中的HBV DNA和HBsAg的水平均未出现下降。
通过类似的方法可证实，病毒样颗粒RBHBcAg189-T3-SEQ22、TBHBcAg188-T3-SEQ22、TBHBcAg153-T3-SEQ22、HBHBcAg189-T3-SEQ22和HBHBcAg149-T3-SEQ22均具有良好的免疫原性。
这些结果显示，基于蝙蝠乙型肝炎病毒核心蛋白所构建的携带T细胞表位的多肽载体均可以用于高效展示来自人HBV的HBsAg的表位肽(例如，HBsAg-aa113-135)，其能够形成VLP，并在宿主体内诱导机体产生高滴度的anti-HBsAg抗体，并由此抑制小鼠体内的HBVDNA和HBsAg的水平(即，HBV DNA和HBsAg显著下降)。此外，图13-15的实验数据还显示，病毒样颗粒RBHBcAg149-T3-SEQ22和病毒样颗粒RBHBcAg149-SEQ22具有相当的抗HBV治疗效果。结合实施例4中图4-6的实验结果可知，基于本发明的携带T细胞表位的多肽载体(例如RBHBcAg149-T3)的病毒样颗粒具有特别显著的抗HBV治疗效果，其优于基于人HBV的HBcAg构建的病毒样颗粒。
因此，本实施例的实验结果表明：(1)本发明的携带T细胞表位的多肽载体能够形成VLP，适合于展示目的多肽，并能够诱导机体产生高滴度的针对目的多肽的抗体；(2)本发明的携带T细胞表位的多肽载体特别适合于展示人HBV的表位(例如人HBV的HBsAg的表位)，其能够诱导机体产生高滴度的针对HBsAg的抗体，清除或抑制体内的HBV DNA和HBsAg的水平，并且其效果优于基于人HBV的HBcAg构建的多肽载体。因此，本发明的展示人HBV的表位的重组蛋白具有治疗HBV感染的潜力，特别适合用于诱发有效的、特异的、治疗性的抗HBV免疫。
实施例10.基于携带T细胞表位的多肽载体的病毒样颗粒刺激免疫细胞分泌IFNγ的能力的评估
在本实施案例中，我们评估了基于携带T细胞表位的多肽载体的病毒样颗粒刺激免疫细胞分泌IFNγ的能力。简言之，在体外将实施例7制备的病毒样颗粒RBHBcAg149-T3-SEQ22和实施例2制备的病毒样颗粒RBHBcAg149-SEQ22分别与获自乙肝患者的全血孵育，随后检测全血样品中的IFNγ的水平，从而评估所述病毒样颗粒刺激乙肝患者全血中的免疫细胞分泌IFNγ的能力。
10.1病毒样颗粒与全血的共培养
采集乙肝患者(26个)的全血样品，将其分装至3个1.5mL EP管(每管500μL)中，并分别与病毒样颗粒RBHBcAg149-T3-SEQ22、RBHBcAg149-SEQ22和PBS(用作阴性对照，无类毒素)于37℃下孵育24小时(蛋白的终浓度为2μg/mL)。孵育后，以4000rpm离心全血样品5分钟，收集上清，用于下一步的检测。
10.2IFNγ的检测
根据制造商的说明书，使用购自Millipore公司的人细胞因子检测试剂盒MILLIPLEX MAP-Human Cell Signaling Portfolio，测定上清样品中的IFNγ水平。测定结果示于图16中。
图16展示了，用病毒样颗粒RBHBcAg149-T3-SEQ22或病毒样颗粒RBHBcAg149-SEQ22孵育获自乙肝患者的全血后，全血中分泌的IFNγ的水平。结果显示，用RBHBcAg149-T3-SEQ22孵育的全血中的IFNγ水平显著高于用RBHBcAg149-SEQ22(p＝0.0021)或PBS(p＝0.0037)孵育的全血中的IFNγ水平。
通过类似的方法可证实，病毒样颗粒RBHBcAg189-T3-SEQ22、TBHBcAg188-T3-SEQ22、TBHBcAg153-T3-SEQ22、HBHBcAg189-T3-SEQ22和HBHBcAg149-T3-SEQ22也能够刺激获自乙肝患者的全血中的免疫细胞分泌IFNγ。
这些结果表明，本发明的携带人T细胞表位的多肽载体以及基于其构建的重组蛋白/病毒样颗粒能够刺激人免疫细胞分泌IFNγ，从而能够增强人体对包含所述多肽载体和目的多肽的重组蛋白/病毒样颗粒的免疫应答。本发明的携带人T细胞表位的多肽载体在增强人T细胞应答方面有显著优势。
实施例11.基于不含连接体的多肽载体构建的重组蛋白的制备、表达、纯化和组装
在本实施例中，我们利用不含连接体的多肽载体来展示目的多肽，由此获得了包含目的多肽和所述不含连接体的多肽载体的重组蛋白。进一步，我们还研究了所获得的重组蛋白组装成VLP的能力。
简言之，以实施例7获得的编码重组蛋白RBHBcAg149-T3-SEQ22的表达质粒为基础，构建了表达重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22(其氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示)的表达质粒，其中，所述重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22与重组蛋白RBHBcAg149-T3-SEQ22的区别在于，缺失了位于目的多肽SEQ22两端的柔性连接体。编码重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22的表达质粒的构建方法如下。
以编码重组蛋白RBHBcAg149-T3-SEQ22的表达质粒为模板，使用第一引物对RBc149nF1(SEQ ID NO:97)和RBc149nR1(SEQ ID NO:98)进行PCR，从而获得第一扩增产物，并且，使用第二引物对RBc149nF2(SEQ ID NO:99)和RBc149nR2(SEQ ID NO:100)进行PCR，从而获得第二扩增产物。随后，以第一扩增产物和第二扩增产物共同作为模板，使用引物RBc149nF1(SEQ ID NO:97)和RBc149nR2(SEQ ID NO:100)进行PCR，从而获得第三扩增产物，即，编码重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22的核酸片段。
表7：引物序列
用NdeI和HindIII将pTO-T7载体双酶切，获得线性化载体。利用Gibson assembly克隆方法(New England Biolabs(UK)Ltd)，将获得的第三扩增产物与线性化载体连接，并转化入ER2566感受态细菌中。将经转化的细菌涂板培养，然后挑取单克隆菌落，提取质粒并进行测序。经测序验证，获得携带编码重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22的核苷酸片段的表达质粒。
随后，按照实施例2第2.2小节中描述的方法，表达和纯化重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22，并且，对经纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE检测，并用透射电镜观察由所述重组蛋白形成的VLP的状态。实验结果如图17所示。
图17显示了，经纯化的重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22的SDS-PAGE结果，以及由所述重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。结果显示，所获得的重组蛋白的纯度大于85％，并且能够组装成直径约30nm的病毒样颗粒。这些结果表明，本发明所构建的不含连接体的多肽载体可用于展示目的多肽，并且能够形成VLP。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 厦门大学，厦门万泰沧海生物技术有限公司
<120> 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途
<130> IDC170042
<150> CN 201710085194.3
<151> 2017-02-17
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 189
<212> PRT
<213> roundleaf bat HBV
<400> 1
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Pro Leu
65 70 75 80
Ile Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg
85 90 95
Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
100 105 110
Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Thr Arg Ser
145 150 155 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
165 170 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys
180 185
<210> 2
<211> 188
<212> PRT
<213> tent-making bat HBV
<400> 2
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Leu Ser Pro Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys
85 90 95
Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu
100 105 110
Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr
115 120 125
Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu
130 135 140
Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg Arg Pro Ala Ser Arg
145 150 155 160
Arg Ser Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg
165 170 175
Arg Arg Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn Cys
180 185
<210> 3
<211> 189
<212> PRT
<213> horseshoe bat HBV
<400> 3
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gln Pro
65 70 75 80
Val Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr Val Gly Leu Arg
85 90 95
Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
100 105 110
Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Met Arg Thr
115 120 125
Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro Arg Ala Pro Arg Ser
145 150 155 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
165 170 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Asn Cys
180 185
<210> 4
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> RBHBcAg189 多肽载体
<400> 4
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala
100 105 110
Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser
165 170 175
Arg Ala Thr Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg
180 185 190
Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Asn Cys
210
<210> 5
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> RBHBcAg149 多肽载体
<400> 5
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala
100 105 110
Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile Val
165 170
<210> 6
<211> 209
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> TBHBcAg188 多肽载体
<400> 6
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly
100 105 110
Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr
115 120 125
His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu
130 135 140
Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val
145 150 155 160
Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg
165 170 175
Arg Pro Ala Ser Arg Arg Ser Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
180 185 190
Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn
195 200 205
Cys
<210> 7
<211> 174
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> TBHBcAg153 多肽载体
<400> 7
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly
100 105 110
Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr
115 120 125
His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu
130 135 140
Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val
145 150 155 160
Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile
165 170
<210> 8
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBHBcAg189 多肽载体
<400> 8
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr
100 105 110
Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Thr Trp Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro
165 170 175
Arg Ala Pro Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg
180 185 190
Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser
195 200 205
Asn Cys
210
<210> 9
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBHBcAg149 多肽载体
<400> 9
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr
100 105 110
Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Thr Trp Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile
165 170
<210> 10
<211> 204
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBcAg183 多肽载体
<400> 10
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val
100 105 110
Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Gln Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
180 185 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
195 200
<210> 11
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBcAg149 多肽载体
<400> 11
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val
100 105 110
Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Gln Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
165 170
<210> 12
<211> 633
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码RBHBcAg189多肽载体的核苷酸序列
<400> 12
atggacattg atccttataa agaatttgga gcttcatctc aactgatctc tttcttgcct 60
gaggactttt tcccaaacct tgcagaattg gtcgagacca ccacagctct ctatgaagaa 120
gaattagtag gtaaggagca ttgctcccct caccatactg ctttacgatc cttgctaaat 180
tgctggggag agactgttag attaataact tgggtcagga actctgtgga gggaggtgga 240
ggtggttctg gaggtggtgg tactggatcc gaattcggtg gtggaggttc aggaggaggt 300
ggttcccaag atgccattgt ccagcaagtt caggcctcgg tgggcctgcg catgagacag 360
ttaatgtggt tccatctctc atgcctaaca tttggacagc ccactgtcat agaatttctg 420
gtctcttttg gaacatggat cagaaccccg caagcttaca gaccccctaa tgcacccatt 480
ctctcgactc ttccggagca tacaatcgtt aggagaagag gaggttcacg cgctactagg 540
tccccccgaa ggcgcactcc ctctcctcgc cgacgcagat ctcaatcgcc gcgtcgccgc 600
agatctcagt ctccagcttc ctccaactgc taa 633
<210> 13
<211> 510
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码RBHBcAg149多肽载体的核苷酸序列
<400> 13
atggacattg atccttataa agaatttgga gcttcatctc aactgatctc tttcttgcct 60
gaggactttt tcccaaacct tgcagaattg gtcgagacca ccacagctct ctatgaagaa 120
gaattagtag gtaaggagca ttgctcccct caccatactg ctttacgatc cttgctaaat 180
tgctggggag agactgttag attaataact tgggtcagga actctgtgga gggaggtgga 240
ggtggttctg gaggtggtgg tactggatcc gaattcggtg gtggaggttc aggaggaggt 300
ggttcccaag atgccattgt ccagcaagtt caggcctcgg tgggcctgcg catgagacag 360
ttaatgtggt tccatctctc atgcctaaca tttggacagc ccactgtcat agaatttctg 420
gtctcttttg gaacatggat cagaaccccg caagcttaca gaccccctaa tgcacccatt 480
ctctcgactc ttccggagca tacaatcgtt 510
<210> 14
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码TBHBcAg188多肽载体的核苷酸序列
<400> 14
atggaaaacc ttgaaagact tgacatctat aaagaatttg gagtctctga tgtcttggtg 60
tctttcttac ctgatgattt ctttccaact ttacagcaac ttttggaatc agtgaatgcc 120
ctatatgagg atgaactcac tgggcctaat cactgttctc cccatcatac tgccttaagg 180
cacttgatta tgtgtggggt agaattaaga gattttattg attggatgca tgaacagggg 240
ggtggaggtg gttctggagg tggtggtact ggatccgaat tcggtggtgg aggttcagga 300
ggaggtggtt ccgatgcaga cgctcttttg gctggttacc ttcgatccaa atatcttaaa 360
catattacca aggctatttg gtatcattta agctgtttga cctttggtaa gcaaacagtg 420
catgaatacc tggtatcctt tggcacctgg atcagaaccc cagctgcata tagaccagtg 480
aatgcaccca ttctcaccac tcttccggaa acttcagtta tcagaagaag gcctgcctcc 540
agaagatcta ctccctctcc tcgcagacgc cgatctcaat caccgcgccg ccgccgctct 600
ccatctccaa gaccagcaag caattgctga 630
<210> 15
<211> 522
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码TBHBcAg153多肽载体的核苷酸序列
<400> 15
atggaaaacc ttgaaagact tgacatctat aaagaatttg gagtctctga tgtcttggtg 60
tctttcttac ctgatgattt ctttccaact ttacagcaac ttttggaatc agtgaatgcc 120
ctatatgagg atgaactcac tgggcctaat cactgttctc cccatcatac tgccttaagg 180
cacttgatta tgtgtggggt agaattaaga gattttattg attggatgca tgaacagggg 240
ggtggaggtg gttctggagg tggtggtact ggatccgaat tcggtggtgg aggttcagga 300
ggaggtggtt ccgatgcaga cgctcttttg gctggttacc ttcgatccaa atatcttaaa 360
catattacca aggctatttg gtatcattta agctgtttga cctttggtaa gcaaacagtg 420
catgaatacc tggtatcctt tggcacctgg atcagaaccc cagctgcata tagaccagtg 480
aatgcaccca ttctcaccac tcttccggaa acttcagtta tc 522
<210> 16
<211> 633
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码HBHBcAg189多肽载体的核苷酸序列
<400> 16
atggacattg atccttataa agagttcggt gcttcatctc aacttgtctc ctttttgcct 60
gctgacttct ttcccgcctt gaacgacctg gtggaaactt cggtggcctt atatgaggaa 120
gaccttgtag gtaaggagca ttgctcccct catcatgcag ccttaagggc cctacttaat 180
tgctgggagg aaacagtcag actgattacc tgggtccgtg ccacagtaga gggaggtgga 240
ggtggttctg gaggtggtgg tactggatcc gaattcggtg gtggaggttc aggaggaggt 300
ggttcccagg atgccatcat cggttatgtc cagactacgg tgggcctacg catgagacaa 360
cagatctggt tccatctctc atgccttact tttgggcagc agactgtgat agagttcctg 420
gtctcatttg ggacatggat gagaactcca gccgcctata gaccccccaa tgcacccatt 480
ttatcaactc ttccagagca cacagtcatt aggagaagag gaaatccgcg tgctcctagg 540
tcccccagaa ggcgcactcc ctctcctcgc cgacgcagat ctcaatctcc gcgtcgccgg 600
agatctcaat ctccagctcc ctccaactgc taa 633
<210> 17
<211> 510
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码HBHBcAg149多肽载体的核苷酸序列
<400> 17
atggacattg atccttataa agagttcggt gcttcatctc aacttgtctc ctttttgcct 60
gctgacttct ttcccgcctt gaacgacctg gtggaaactt cggtggcctt atatgaggaa 120
gaccttgtag gtaaggagca ttgctcccct catcatgcag ccttaagggc cctacttaat 180
tgctgggagg aaacagtcag actgattacc tgggtccgtg ccacagtaga gggaggtgga 240
ggtggttctg gaggtggtgg tactggatcc gaattcggtg gtggaggttc aggaggaggt 300
ggttcccagg atgccatcat cggttatgtc cagactacgg tgggcctacg catgagacaa 360
cagatctggt tccatctctc atgccttact tttgggcagc agactgtgat agagttcctg 420
gtctcatttg ggacatggat gagaactcca gccgcctata gaccccccaa tgcacccatt 480
ttatcaactc ttccagagca cacagtcatt 510
<210> 18
<211> 615
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码HBcAg183多肽载体的核苷酸序列
<400> 18
atggacattg atccatataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60
tccgacttct ttccttctat ccgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120
gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacgg cactcaggca agctattctg 180
tgttggggtg agttgatgaa tctagccacc tgggtgggaa gtaatttgga agatggtgga 240
ggtggttctg gaggtggtgg tactggatcc gaattcggtg gtggaggttc aggaggaggt 300
ggttccaggg aactagtagt cagctatgtc aacgttaata tgggcctaaa aatcagacaa 360
ctattgtggt ttcacatttc ctgtcttact tttgggagag aaactgttct tgaatatttg 420
gtgtcttttg gagtgtggat tcgcactcct cctgcatata gaccacaaaa tgcccctatc 480
ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt cgtcgccgag gccgtagccc gcgacgacgt 540
accccgagcc cgcgtcgacg tcgcagccag agcccgcgcc gtcgtcgcag ccagagccgt 600
gaaagccagt gctaa 615
<210> 19
<211> 510
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码HBcAg149多肽载体的核苷酸序列
<400> 19
atggacattg atccatataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60
tccgacttct ttccttctat ccgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120
gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacgg cactcaggca agctattctg 180
tgttggggtg agttgatgaa tctagccacc tgggtgggaa gtaatttgga agatggtgga 240
ggtggttctg gaggtggtgg tactggatcc gaattcggtg gtggaggttc aggaggaggt 300
ggttccaggg aactagtagt cagctatgtc aacgttaata tgggcctaaa aatcagacaa 360
ctattgtggt ttcacatttc ctgtcttact tttgggagag aaactgttct tgaatatttg 420
gtgtcttttg gagtgtggat tcgcactcct cctgcatata gaccacaaaa tgcccctatc 480
ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 510
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> HIV
<400> 20
Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro
1 5 10
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> HBV
<400> 22
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 23
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg189-SEQ20
<400> 23
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Phe Lys Gln Ser Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser
115 120 125
Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu
130 135 140
Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr
145 150 155 160
Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
165 170 175
Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg
180 185 190
Ala Thr Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg
195 200 205
Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn
210 215 220
Cys
225
<210> 24
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg149-SEQ20
<400> 24
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Phe Lys Gln Ser Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser
115 120 125
Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu
130 135 140
Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr
145 150 155 160
Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
165 170 175
Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile Val
180 185
<210> 25
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg188-SEQ20
<400> 25
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Phe Lys Gln Ser
85 90 95
Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Glu Phe Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr
115 120 125
Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His
130 135 140
Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val
145 150 155 160
Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn
165 170 175
Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg Arg
180 185 190
Pro Ala Ser Arg Arg Ser Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln
195 200 205
Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn Cys
210 215 220
<210> 26
<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg153-SEQ20
<400> 26
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Phe Lys Gln Ser
85 90 95
Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Glu Phe Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr
115 120 125
Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His
130 135 140
Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val
145 150 155 160
Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn
165 170 175
Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile
180 185
<210> 27
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBHBcAg189-SEQ20
<400> 27
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Phe Lys Gln Ser Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr
115 120 125
Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu
130 135 140
Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr
145 150 155 160
Trp Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
165 170 175
Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro Arg
180 185 190
Ala Pro Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg
195 200 205
Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Asn
210 215 220
Cys
225
<210> 28
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBHBcAg149-SEQ20
<400> 28
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Phe Lys Gln Ser Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr
115 120 125
Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu
130 135 140
Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr
145 150 155 160
Trp Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
165 170 175
Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile
180 185
<210> 29
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg189-SEQ21
<400> 29
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu His Glu Leu
85 90 95
Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val
115 120 125
Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr
130 135 140
Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp
145 150 155 160
Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
165 170 175
Thr Leu Pro Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala
180 185 190
Thr Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
195 200 205
Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys
210 215 220
<210> 30
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg149-SEQ21
<400> 30
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu His Glu Leu
85 90 95
Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val
115 120 125
Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr
130 135 140
Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp
145 150 155 160
Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
165 170 175
Thr Leu Pro Glu His Thr Ile Val
180
<210> 31
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg188-SEQ21
<400> 31
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu His
85 90 95
Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu
115 120 125
Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu
130 135 140
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser
145 150 155 160
Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala
165 170 175
Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg Arg Pro
180 185 190
Ala Ser Arg Arg Ser Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser
195 200 205
Pro Arg Arg Arg Arg Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn Cys
210 215 220
<210> 32
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg153-SEQ21
<400> 32
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu His
85 90 95
Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu
115 120 125
Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu
130 135 140
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser
145 150 155 160
Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala
165 170 175
Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile
180 185
<210> 33
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBHBcAg189-SEQ21
<400> 33
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu His Glu Leu
85 90 95
Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr Val
115 120 125
Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr
130 135 140
Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp
145 150 155 160
Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
165 170 175
Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
195 200 205
Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Asn Cys
210 215 220
<210> 34
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBHBcAg149-SEQ21
<400> 34
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu His Glu Leu
85 90 95
Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr Val
115 120 125
Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr
130 135 140
Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp
145 150 155 160
Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
165 170 175
Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile
180
<210> 35
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg189-SEQ22
<400> 35
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu
130 135 140
Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile
180 185 190
Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Thr Arg Ser Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg
210 215 220
Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys
225 230
<210> 36
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg149-SEQ22
<400> 36
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu
130 135 140
Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile
180 185 190
Val
<210> 37
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg188-SEQ22
<400> 37
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Met Phe Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His
130 135 140
Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys
145 150 155 160
Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr
165 170 175
Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro
180 185 190
Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg Arg Pro Ala Ser Arg Arg Ser Thr Pro
195 200 205
Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Pro
210 215 220
Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn Cys
225 230
<210> 38
<211> 197
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg153-SEQ22
<400> 38
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Met Phe Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His
130 135 140
Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys
145 150 155 160
Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr
165 170 175
Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro
180 185 190
Glu Thr Ser Val Ile
195
<210> 39
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBHBcAg189-SEQ22
<400> 39
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln
130 135 140
Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val
180 185 190
Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro Arg Ala Pro Arg Ser Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg
210 215 220
Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Asn Cys
225 230
<210> 40
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBHBcAg149-SEQ22
<400> 40
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln
130 135 140
Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val
180 185 190
Ile
<210> 41
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBcAg183-SEQ22
<400> 41
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Leu
115 120 125
Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu
130 135 140
Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Gln Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val
180 185 190
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
195 200 205
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu
210 215 220
Ser Gln Cys
225
<210> 42
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBcAg149-SEQ22
<400> 42
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Leu
115 120 125
Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu
130 135 140
Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Gln Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val
180 185 190
Val
<210> 43
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 连接体
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 44
<211> 226
<212> PRT
<213> HBV
<400> 44
Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys
35 40 45
Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys
50 55 60
Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Val Ile Trp Met Met Trp Phe Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile
195 200 205
Leu Ser Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
<210> 45
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 45
actttaagaa ggagatatac atatgatgga cattgatcct tataaag 47
<210> 46
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 46
gtggtgctcg aggcggccgc aagcttttaa acgattgtat gctccggaag agtcga 56
<210> 47
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 47
gtggtgctcg aggcggccgc aagcttttag cagttggagg aagctggaga ctgagatctg 60
cggcgac 67
<210> 48
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 48
actttaagaa ggagatatac atatgatgga aaaccttgaa agacttg 47
<210> 49
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 49
gtggtgctcg aggcggccgc aagcttttag ataactgaag tttccggaag agtg 54
<210> 50
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 50
gtggtgctcg aggcggccgc aagcttttag caattgcttg ctggtcttg 49
<210> 51
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 51
actttaagaa ggagatatac atatgatgga cattgatcct tataaag 47
<210> 52
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 52
gtggtgctcg aggcggccgc aagcttttaa atgactgtgt gctctggaag agttga 56
<210> 53
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 53
gtggtgctcg aggcggccgc aagcttttag cagttggagg gagctggaga ttgagatctc 60
cggcgac 67
<210> 54
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 54
gatccacctc tgaacatgaa ctgacatgtc aggctgaggg ctaccccg 48
<210> 55
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 55
aattcggggt agccctcagc ctgacatgtc agttcatgtt cagaggtg 48
<210> 56
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 56
gatccttcaa acagtcttct ggtggtgacc cggaaatcgt tacccactct g 51
<210> 57
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 57
aattcagagt gggtaacgat ttccgggtca ccaccagaag actgtttgaa g 51
<210> 58
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 58
gatcctcatc aacaaccagc accggaccat gcaaaacctg cacaactcct gctcaaggaa 60
cctctatgtt tcccg 75
<210> 59
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 59
aattcgggaa acatagaggt tccttgagca ggagttgtgc aggttttgca tggtccggtg 60
ctggttgttg atgag 75
<210> 60
<211> 23
<212> PRT
<213> HBV
<400> 60
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro
20
<210> 61
<211> 23
<212> PRT
<213> HBV
<400> 61
Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 62
<211> 23
<212> PRT
<213> HBV
<400> 62
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro
20
<210> 63
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 63
gatcctctac caccacctct accggtccgt gcaaaacctg caccaccccg gctcagggta 60
actctatgtt cccgg 75
<210> 64
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 64
aattccggga acatagagtt accctgagcc ggggtggtgc aggttttgca cggaccggta 60
gaggtggtgg tagag 75
<210> 65
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 65
gatccacctc taccacctct accggtccgt gcaaaacctg caccatcccg gctcagggta 60
cctctatgtt cccgg 75
<210> 66
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 66
aattccggga acatagaggt accctgagcc gggatggtgc aggttttgca cggaccggta 60
gaggtggtag aggtg 75
<210> 67
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 67
gatcctcttc taccacctct accggtccgt gccgtacctg caccaccccg gctcagggta 60
cctctatgta cccgg 75
<210> 68
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 68
aattccgggt acatagaggt accctgagcc ggggtggtgc aggtacggca cggaccggta 60
gaggtggtag aagag 75
<210> 69
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg149-SEQ60
<400> 69
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu
130 135 140
Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile
180 185 190
Val
<210> 70
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg149-SEQ61
<400> 70
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu
130 135 140
Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile
180 185 190
Val
<210> 71
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg149-SEQ62
<400> 71
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu
130 135 140
Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile
180 185 190
Val
<210> 72
<211> 197
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg153-SEQ60
<400> 72
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Thr Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser
100 105 110
Met Phe Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His
130 135 140
Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys
145 150 155 160
Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr
165 170 175
Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro
180 185 190
Glu Thr Ser Val Ile
195
<210> 73
<211> 197
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg153-SEQ61
<400> 73
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Met Phe Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His
130 135 140
Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys
145 150 155 160
Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr
165 170 175
Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro
180 185 190
Glu Thr Ser Val Ile
195
<210> 74
<211> 197
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg153-SEQ62
<400> 74
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met
50 55 60
Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Met Tyr Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His
130 135 140
Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys
145 150 155 160
Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr
165 170 175
Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro
180 185 190
Glu Thr Ser Val Ile
195
<210> 75
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> RBHBcAg189-T3多肽载体
<400> 75
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala
100 105 110
Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser
165 170 175
Arg Ala Thr Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg
180 185 190
Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Asn Cys
210
<210> 76
<211> 209
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> TBHBcAg188-T3多肽载体
<400> 76
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
50 55 60
Cys Trp Gly Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly
100 105 110
Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr
115 120 125
His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu
130 135 140
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
145 150 155 160
Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg
165 170 175
Arg Pro Ala Ser Arg Arg Ser Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
180 185 190
Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn
195 200 205
Cys
<210> 77
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBHBcAg189-T3多肽载体
<400> 77
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr
100 105 110
Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro
165 170 175
Arg Ala Pro Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg
180 185 190
Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser
195 200 205
Asn Cys
210
<210> 78
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> RBHBcAg149-T3多肽载体
<400> 78
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala
100 105 110
Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile
165 170
<210> 79
<211> 174
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> TBHBcAg153-T3多肽载体
<400> 79
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
50 55 60
Cys Trp Gly Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly
100 105 110
Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr
115 120 125
His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu
130 135 140
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
145 150 155 160
Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile
165 170
<210> 80
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBHBcAg149-T3多肽载体
<400> 80
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr
100 105 110
Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly
130 135 140
Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile
165 170
<210> 81
<211> 633
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码RBHBcAg189-T3多肽载体的核苷酸序列
<400> 81
atggacatcg acccgtacaa agaattcggt gcttcttctc agctgatctc tttcctgccg 60
tctgacttct tcccgtctgt tgctgaactg gttgaaacca ccaccgctct gtacgaagaa 120
gaactggttg gtaaagaaca ctgctctccg caccacaccg ctctgcgtca ggctatcctg 180
tgctggggtg aactgatgac cctggctacc tgggttcgta actctgttga aggtggtggt 240
ggtggttctg gtggtggtgg taccggttct gaattcggtg gtggtggttc tggtggtggt 300
ggttctcagg acgctatcgt tcagcaggtt caggcttctg ttggtctgcg tatgcgtcag 360
ctgatgtggt tccacctgtc ttgcctgacc ttcggtcagc cgaccgttat cgaattcctg 420
gtttctttcg gtgtttggat ccgtaccccg ccggcttacc gtccgccgaa cgctccgatc 480
ctgtctaccc tgccggaaca caccgttatc cgtcgtcgtg gtaacccgcg tgctccgcgt 540
tctccgcgtc gtcgtacccc gtctccgcgt cgtcgtcgtt ctcagtctcc gcgtcgtcgt 600
cgttctcagt ctccggctcc gtctaactgc taa 633
<210> 82
<211> 627
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码TBHBcAg188-T3多肽载体的核苷酸序列
<400> 82
atggaaaacc tggaacgtct ggacatctac aaagaattcg gtgtttctga cttcctgccg 60
tctgacttct tcccgtctgt tttcccgacc ctgcagcagc tgctggaatc tgttaacgct 120
ctgtacgaag acgaactgac cggtccgaac cactgctctc cgcaccacac cgctctgcgt 180
caggctatcc tgtgctgggg tgaactgcgt gacttcatcg actggatgca cgaacagggt 240
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggtacc ggttctgaat tcggtggtgg tggttctggt 300
ggtggtggtt ctgacgctga cgctctgctg gctggttacc tgcgttctaa atacctgaaa 360
cacatcacca aagctatctg gtaccacctg tcttgcctga ccttcggtaa acagaccgtt 420
cacgaatacc tggtttcttt cggtgtttgg atccgtaccc cgccggctta ccgtccgccg 480
aacgctccga tcctgaccac cctgccggaa acctctgtta tccgtcgtcg tccggcttct 540
cgtcgttcta ccccgtctcc gcgtcgtcgt cgttctcagt ctccgcgtcg tcgtcgttct 600
ccgtctccgc gtccggcttc taactgc 627
<210> 83
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码HBHBcAg189-T3多肽载体的核苷酸序列
<400> 83
atggacatcg acccgtacaa agaattcggt gcttcttctc agctggtttc tttcctgccg 60
tctgacttct tcccgtctgt taacgacctg gttgaaacct ctgttgctct gtacgaagaa 120
gacctggttg gtaaagaaca ctgctctccg caccacaccg ctctgcgtca ggctatcctg 180
tgctggggtg aactgatgac cctggctacc tgggttcgtg ctaccgttga aggtggtggt 240
ggtggttctg gtggtggtgg taccggttct gaattcggtg gtggtggttc tggtggtggt 300
ggttctcagg acgctatcat cggttacgtt cagaccaccg ttggtctgcg tatgcgtcag 360
cagatctggt tccacctgtc ttgcctgacc ttcggtcagc agaccgttat cgaattcctg 420
gtttctttcg gtgtttggat ccgtaccccg ccggcttacc gtccgccgaa cgctccgatc 480
ctgtctaccc tgccggaaca caccgttatc cgtcgtcgtg gtaacccgcg tgctccgcgt 540
tctccgcgtc gtcgtacccc gtctccgcgt cgtcgtcgtt ctcagtctcc gcgtcgtcgt 600
cgttctcagt ctccggctcc gtctaactgc 630
<210> 84
<211> 513
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码RBHBcAg149-T3多肽载体的核苷酸序列
<400> 84
atggacatcg acccgtacaa agaattcggt gcttcttctc agctgatctc tttcctgccg 60
tctgacttct tcccgtctgt tgctgaactg gttgaaacca ccaccgctct gtacgaagaa 120
gaactggttg gtaaagaaca ctgctctccg caccacaccg ctctgcgtca ggctatcctg 180
tgctggggtg aactgatgac cctggctacc tgggttcgta actctgttga aggtggtggt 240
ggtggttctg gtggtggtgg taccggttct gaattcggtg gtggtggttc tggtggtggt 300
ggttctcagg acgctatcgt tcagcaggtt caggcttctg ttggtctgcg tatgcgtcag 360
ctgatgtggt tccacctgtc ttgcctgacc ttcggtcagc cgaccgttat cgaattcctg 420
gtttctttcg gtgtttggat ccgtaccccg ccggcttacc gtccgccgaa cgctccgatc 480
ctgtctaccc tgccggaaca caccgttatc taa 513
<210> 85
<211> 522
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码TBHBcAg153-T3多肽载体的核苷酸序列
<400> 85
atggaaaacc tggaacgtct ggacatctac aaagaattcg gtgtttctga cttcctgccg 60
tctgacttct tcccgtctgt tttcccgacc ctgcagcagc tgctggaatc tgttaacgct 120
ctgtacgaag acgaactgac cggtccgaac cactgctctc cgcaccacac cgctctgcgt 180
caggctatcc tgtgctgggg tgaactgcgt gacttcatcg actggatgca cgaacagggt 240
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggtacc ggttctgaat tcggtggtgg tggttctggt 300
ggtggtggtt ctgacgctga cgctctgctg gctggttacc tgcgttctaa atacctgaaa 360
cacatcacca aagctatctg gtaccacctg tcttgcctga ccttcggtaa acagaccgtt 420
cacgaatacc tggtttcttt cggtgtttgg atccgtaccc cgccggctta ccgtccgccg 480
aacgctccga tcctgaccac cctgccggaa acctctgtta tc 522
<210> 86
<211> 510
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码HBHBcAg149-T3多肽载体的核苷酸序列
<400> 86
atggacatcg acccgtacaa agaattcggt gcttcttctc agctggtttc tttcctgccg 60
tctgacttct tcccgtctgt taacgacctg gttgaaacct ctgttgctct gtacgaagaa 120
gacctggttg gtaaagaaca ctgctctccg caccacaccg ctctgcgtca ggctatcctg 180
tgctggggtg aactgatgac cctggctacc tgggttcgtg ctaccgttga aggtggtggt 240
ggtggttctg gtggtggtgg taccggttct gaattcggtg gtggtggttc tggtggtggt 300
ggttctcagg acgctatcat cggttacgtt cagaccaccg ttggtctgcg tatgcgtcag 360
cagatctggt tccacctgtc ttgcctgacc ttcggtcagc agaccgttat cgaattcctg 420
gtttctttcg gtgtttggat ccgtaccccg ccggcttacc gtccgccgaa cgctccgatc 480
ctgtctaccc tgccggaaca caccgttatc 510
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210> 88
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
1 5 10 15
Met Thr Leu Ala
20
<210> 89
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Ala Pro Ile Leu
20
<210> 90
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg189-T3-SEQ22
<400> 90
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu
130 135 140
Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val
180 185 190
Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro Arg Ala Pro Arg Ser Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg
210 215 220
Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Asn Cys
225 230
<210> 91
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg149-T3-SEQ22
<400> 91
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu
130 135 140
Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val
180 185 190
Ile
<210> 92
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg188-T3-SEQ22
<400> 92
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
50 55 60
Cys Trp Gly Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Met Phe Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His
130 135 140
Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys
145 150 155 160
Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
165 170 175
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro
180 185 190
Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg Arg Pro Ala Ser Arg Arg Ser Thr Pro
195 200 205
Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Pro
210 215 220
Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn Cys
225 230
<210> 93
<211> 197
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白TBHBcAg153-T3-SEQ22
<400> 93
Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser
1 5 10 15
Asp Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Phe Pro Thr Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
50 55 60
Cys Trp Gly Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Met Phe Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His
130 135 140
Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys
145 150 155 160
Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
165 170 175
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro
180 185 190
Glu Thr Ser Val Ile
195
<210> 94
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBHBcAg189-T3-SEQ22
<400> 94
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln
130 135 140
Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val
180 185 190
Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro Arg Ala Pro Arg Ser Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg
210 215 220
Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Asn Cys
225 230
<210> 95
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白HBHBcAg149-T3-SEQ22
<400> 95
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Asn Asp Leu Val Glu
20 25 30
Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe
100 105 110
Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln
130 135 140
Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile
145 150 155 160
Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr
165 170 175
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val
180 185 190
Ile
<210> 96
<211> 169
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重组蛋白RBHBcAg149n-T3-SEQ22
<400> 96
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Ser Ser
65 70 75 80
Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly
85 90 95
Thr Ser Met Phe Pro Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser
100 105 110
Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val
130 135 140
Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
145 150 155 160
Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile
165
<210> 97
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 97
aactttaaga aggagatata catatggaca tcgacccgta caaagaattc 50
<210> 98
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 98
gagttgtgca ggttttgcat ggtccggtgc tggttgttga tgaaccttca acagagttac 60
<210> 99
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 99
caaaacctgc acaactcctg ctcaaggaac ctctatgttt ccccaggacg ctatcgttca 60
<210> 100
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 100
tggtgctcga gtgcggccgc aagcttagat aacggtgtgt tccggcaggg tag 53

Claims (18)

1.一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列或者其变体，所述变体与所述核苷酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的同一性，或者在严紧条件或者高严紧条件下，能够与所述核苷酸序列杂交，其中，所述多肽载体选自，携带T细胞表位(例如人T细胞表位)的下述多肽载体：
(1)RBHBcAg载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的区别包括：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；
(2)TBHBcAg载体，其与筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的区别包括：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个或5个氨基酸残基；例如，第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、或第80-82位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基)；
(3)HBHBcAg载体，其与菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的区别包括：(a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；
优选地，所述T细胞表位选自MHC I和MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87所示的MHC I限制性人T细胞表位，以及如SEQ ID NO:88或89所示的MHC II限制性人T细胞表位。
2.权利要求1的核酸分子，其中，所述多肽载体选自下述多肽载体：
(1)RBHBcAg-T载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的区别包括：
(1a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；
(1b)RBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第50-69位中的一个或多个氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)；以及(1c)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；
(2)TBHBcAg-T载体，其与筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的区别包括：
(2a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个或5个氨基酸残基；例如，第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、或第80-82位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；
(2b)TBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第54-73位中的一个或多个氨基酸残基和/或第124-144位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)；以及
(2c)任选地，TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基)；和
(3)HBHBcAg-T载体，其与菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的区别包括：
(3a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；
(3b)HBHBcAg蛋白的N端第18-27位中的一个或多个氨基酸残基、第50-69位中的一个或多个氨基酸残基和/或第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基各自独立地被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位)；以及
(3c)任选地，HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)。
3.权利要求2的核酸分子，其中，所述多肽载体为RBHBcAg-T载体；
优选地，在RBHBcAg-T载体中，RBHBcAg蛋白的N端第18-27位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；和/或，RBHBcAg蛋白的N端第50-69位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，或20个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；和/或，RBHBcAg蛋白的N端第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个或21个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；
优选地，在RBHBcAg-T载体中，RBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第50-69位以及第120-140位氨基酸残基分别被置换为如SEQ ID NO:87、88和89所示的人T细胞表位。
4.权利要求2的核酸分子，其中，所述多肽载体为TBHBcAg-T载体；
优选地，在TBHBcAg-T载体中，TBHBcAg蛋白的N端第18-27位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；和/或，TBHBcAg蛋白的N端第54-73位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，或20个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；和/或，TBHBcAg蛋白的N端第124-144位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个或21个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；
优选地，在TBHBcAg-T载体中，TBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第54-73位以及第124-144位氨基酸残基分别被置换为如SEQ ID NO:87、88和89所示的人T细胞表位。
5.权利要求2的核酸分子，其中，所述多肽载体为HBHBcAg-T载体；
优选地，在HBHBcAg-T载体中，HBHBcAg蛋白的N端第18-27位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；和/或，HBHBcAg蛋白的N端第50-69位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，或20个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；和/或，HBHBcAg蛋白的N端第120-140位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个或21个氨基酸残基)被置换为人T细胞表位(例如MHC I或MHC II限制性人T细胞表位，例如如SEQ ID NO:87-89所示的人T细胞表位)；
优选地，在HBHBcAg-T载体中，HBHBcAg蛋白的N端第18-27位、第50-69位以及第120-140位氨基酸残基分别被置换为如SEQ ID NO:87、88和89所示的人T细胞表位。
6.权利要求1-5任一项的核酸分子，其中，在编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基(例如RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基和HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基)的位置处引入限制性酶切位点；
优选地，在编码所述连接体的核苷酸序列中和/或其一端或两端引入限制性酶切位点；
优选地，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:75-80；
优选地，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:81-86的核苷酸序列；
优选地，所述核酸分子用于***编码目的多肽的核苷酸序列，例如所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端(例如，通过限制性酶切位点)；
优选地，所述核酸分子还包含，编码目的多肽的核苷酸序列，其中，所述目的多肽相对于所述多肽载体而言是异源的，并且所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端(例如，通过限制性酶切位点)；优选地，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽；优选地，所述表位肽包含：人HBV(例如HBV基因型A、B、C或D)的HBsAg的表位(例如线性表位，例如HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸)，HIV的GP120蛋白的表位(例如线性表位，例如GP120蛋白的第361-375位氨基酸)，或人PD-L1的表位(例如线性表位，例如人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸)；优选地，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62；优选地，所述核酸分子包含或者由编码选自SEQ ID NO:90-96的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
7.一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含权利要求1-6任一项的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求1-6任一项的核酸分子或权利要求7的载体。
9.一种展示目的多肽的方法，其包括:
(1)将编码所述目的多肽的核苷酸序列***至权利要求1-6任一项的核酸分子中，从而获得编码重组蛋白的核酸分子；优选地，所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端(例如，通过限制性酶切位点)；和
(2)将步骤(1)中的编码重组蛋白的核酸分子表达为重组蛋白；
优选地，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽；优选地，所述表位肽包含：人HBV(例如HBV基因型A、B、C或D)的HBsAg的表位(例如线性表位，例如HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸)，HIV的GP120蛋白的表位(例如线性表位，例如GP120蛋白的第361-375位氨基酸)，或人PD-L1的表位(例如线性表位，例如人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸)；优选地，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62；优选地，所述编码重组蛋白的核酸分子包含或者由编码选自SEQ ID NO:90-96的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
10.一种重组蛋白，其包含多肽载体和目的多肽，其中，所述多肽载体如权利要求1-6任一项所定义，并且，所述目的多肽被***至所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被***至所述连接体中或其一端或两端；
优选地，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:75-80；
优选地，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽；优选地，所述表位肽包含：人HBV(例如HBV基因型A、B、C或D)的HBsAg的表位(例如线性表位，例如HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸)，HIV的GP120蛋白的表位(例如线性表位，例如GP120蛋白的第361-375位氨基酸)，或人PD-L1的表位(例如线性表位，例如人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸)；优选地，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62；
优选地，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:90-96的氨基酸序列组成。
11.一种病毒样颗粒，其包含或者由权利要求10的重组蛋白组成。
12.一种药物组合物(例如疫苗)，其包含权利要求10的重组蛋白或权利要求11的病毒样颗粒，和任选地，一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂(例如佐剂)。
13.一种预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用权利要求10的重组蛋白或权利要求11的病毒样颗粒或权利要求12的药物组合物，其中所述目的多肽是包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽；优选地，所述表位肽包含：人HBV(例如HBV基因型A、B、C或D)的HBsAg的表位(例如线性表位，例如HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸)；优选地，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQID NO:22和60-62；优选地，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:90-96的氨基酸序列组成。
14.权利要求10的重组蛋白或权利要求11的病毒样颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)，其中所述目的多肽是包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽；优选地，所述表位肽包含：人HBV(例如HBV基因型A、B、C或D)的HBsAg的表位(例如线性表位，例如HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸)；优选地，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62；优选地，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:90-96的氨基酸序列组成。
15.一种多核苷酸，其编码权利要求10的重组蛋白。
16.一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含权利要求15的多核苷酸。
17.一种宿主细胞，其包含权利要求15的多核苷酸或权利要求16的载体。
18.制备权利要求10的重组蛋白的方法，其包括，在适合表达所述重组蛋白的条件下培养权利要求17的宿主细胞，和，回收所述重组蛋白。
CN201810110910.3A 2017-02-17 2018-02-05 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途 Active CN108456686B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2017100851943 2017-02-17
CN201710085194 2017-02-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108456686A true CN108456686A (zh) 2018-08-28
CN108456686B CN108456686B (zh) 2021-03-05

Family

ID=63170076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810110910.3A Active CN108456686B (zh) 2017-02-17 2018-02-05 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10987418B2 (zh)
EP (1) EP3617317A4 (zh)
JP (1) JP6955020B2 (zh)
KR (1) KR102358577B1 (zh)
CN (1) CN108456686B (zh)
AU (1) AU2018222857B2 (zh)
CA (1) CA3053591C (zh)
TW (1) TWI728228B (zh)
WO (1) WO2018149315A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111138550A (zh) * 2020-01-06 2020-05-12 国药中生生物技术研究院有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒嵌合疫苗及其制备方法和应用
CN111166881A (zh) * 2020-01-06 2020-05-19 国药中生生物技术研究院有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用
WO2020233715A1 (zh) * 2019-05-23 2020-11-26 厦门大学 抗乙肝病毒抗体及其用途
CN112912393A (zh) * 2018-10-25 2021-06-04 蜂鸟生物科技控股私人有限公司 工程化的fc

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1389268A (zh) * 2001-06-06 2003-01-08 中国人民解放军第二军医大学 一种乙型肝炎dna疫苗
CN1850855A (zh) * 2006-05-26 2006-10-25 厦门大学 用于免疫或制备单克隆抗体的方法和组合物
CN104341506A (zh) * 2013-07-30 2015-02-11 复旦大学 一种重组融合蛋白及其用途
CN106480070A (zh) * 2015-08-25 2017-03-08 厦门大学 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途
CN106905434A (zh) * 2017-02-28 2017-06-30 国药中生生物技术研究院有限公司 一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN106986943A (zh) * 2017-02-28 2017-07-28 国药中生生物技术研究院有限公司 一种包含北极地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU579148B2 (en) 1984-03-09 1988-11-17 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants
JP2000514643A (ja) 1996-04-18 2000-11-07 アボツト・ラボラトリーズ Ｂ型肝炎表面抗原のａ―決定基の抗原エピトープ及びその利用法
US20060094017A1 (en) 2003-02-14 2006-05-04 Conley Anthony J Immunogens for hiv vaccine
US7144712B2 (en) * 2003-07-30 2006-12-05 Vaccine Research Institute Of San Diego Human hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof
CN102127554B (zh) 2010-12-22 2012-07-25 南京农业大学 一种日本脑炎颗粒疫苗及其制备方法和应用
KR101944263B1 (ko) 2012-06-11 2019-02-01 시아먼 유니버시티 에이치비브이 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 폴리펩타이드 및 항체
CN104211784B (zh) 2013-06-04 2018-05-22 厦门大学 用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1389268A (zh) * 2001-06-06 2003-01-08 中国人民解放军第二军医大学 一种乙型肝炎dna疫苗
CN1850855A (zh) * 2006-05-26 2006-10-25 厦门大学 用于免疫或制备单克隆抗体的方法和组合物
CN104341506A (zh) * 2013-07-30 2015-02-11 复旦大学 一种重组融合蛋白及其用途
CN106480070A (zh) * 2015-08-25 2017-03-08 厦门大学 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途
CN106905434A (zh) * 2017-02-28 2017-06-30 国药中生生物技术研究院有限公司 一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN106986943A (zh) * 2017-02-28 2017-07-28 国药中生生物技术研究院有限公司 一种包含北极地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERIK DEPLA等: ""Rational Design of a Multiepitope Vaccine Encoding T-Lymphocyte Epitopes for Treatment of Chronic Hepatitis B Virus Infections"", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
JAN FELIX DREXLER等: ""Bats carry pathogenic hepadnaviruses antigenically related to hepatitis B virus and capable of infecting human hepatocytes"", 《PNAS》 *
TIAN-YING ZHANG等: ""A unique B cell epitope-based particulate vaccine shows effective suppression of hepatitis B surface antigen in mice"", 《HEPATOLOGY》 *
徐万祥: ""发展含B-和T-细胞表位嵌合肽疫苗的新趋势"", 《国外医学计划生育分册》 *
杨海杰等: ""基于乙型肝炎病毒核心蛋白的颗粒性肽展示载体的构建"", 《厦门大学学报（自然科学版）》 *
花艳红等: ""以乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒为载体的流感通用疫苗的构建"", 《中国生物质制品学杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112912393A (zh) * 2018-10-25 2021-06-04 蜂鸟生物科技控股私人有限公司 工程化的fc
WO2020233715A1 (zh) * 2019-05-23 2020-11-26 厦门大学 抗乙肝病毒抗体及其用途
CN111138550A (zh) * 2020-01-06 2020-05-12 国药中生生物技术研究院有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒嵌合疫苗及其制备方法和应用
CN111166881A (zh) * 2020-01-06 2020-05-19 国药中生生物技术研究院有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用
CN111138550B (zh) * 2020-01-06 2022-12-13 国药中生生物技术研究院有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒嵌合疫苗及其制备方法和应用
CN111166881B (zh) * 2020-01-06 2023-03-24 国药中生生物技术研究院有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190102065A (ko) 2019-09-02
JP6955020B2 (ja) 2021-10-27
CA3053591C (en) 2023-03-21
TW201831689A (zh) 2018-09-01
TWI728228B (zh) 2021-05-21
CA3053591A1 (en) 2018-08-23
AU2018222857B2 (en) 2021-04-29
CN108456686B (zh) 2021-03-05
JP2020515241A (ja) 2020-05-28
US10987418B2 (en) 2021-04-27
WO2018149315A1 (zh) 2018-08-23
KR102358577B1 (ko) 2022-02-04
EP3617317A4 (en) 2021-01-13
AU2018222857A1 (en) 2019-08-22
US20200147205A1 (en) 2020-05-14
EP3617317A1 (en) 2020-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6957580B2 (ja) 新規多価ナノ粒子に基づくワクチン
CN108456686A (zh) 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途
Neirynck et al. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein
CN103483421B (zh) 用于治疗hbv感染及相关疾病的多肽及抗体
Sharma et al. A self-adjuvanted, modular, antigenic VLP for rapid response to influenza virus variability
Stepanova et al. Flagellin-fused protein targeting M2e and HA2 induces potent humoral and T-cell responses and protects mice against various influenza viruses a subtypes
JP2000513922A (ja) インフルエンザ血球凝集素多価ワクチンの製造方法
JP7009625B2 (ja) Ｈ３ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体及びその使用
CN104211784B (zh) 用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法
US10548973B2 (en) Polypeptide carrier for presenting target polypeptide and uses thereof
CN105384815B (zh) 一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
KR20120129893A (ko) 고령자에 보호 면역을 제공하기 위한 방법 및 조성물
RU2777404C1 (ru) Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса и способ его применения для экстренной профилактики и профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 (варианты)
KR102326037B1 (ko) H5 인플루엔자를 치료 또는 예방하기 위한 펩타이드 및 이를 암호화하는 코돈 최적화 서열, 및 이를 이용한 백신
CN117693359A (zh) 作为免疫原的广泛反应性病毒抗原、其组合物和使用方法
Chang et al. Cloning and analysis of the Epstein-Barr virus glycoprotein 350 genes
LV15006B (lv) Daudzziedu airenes raibuma vīrusam līdzīgo daļiņu iegūšana
LV15007B (lv) Kartupeļu vīrusam PVM līdzīgo daļiņu iegūšana

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181108

Address after: 361005 422 Siming Road, Siming District, Xiamen, Fujian

Applicant after: Xiamen University

Applicant after: Yangshengtang Co., Ltd

Address before: 361005 422 Siming Road, Siming District, Xiamen, Fujian

Applicant before: Xiamen University

Applicant before: Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant