CN104745492A - 一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用 - Google Patents

一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用，其目的是提供一种遗传较稳定的汉逊酵母突变体，及其专属的表达载体在重组蛋白表达方面的应用。本发明所提供的汉逊酵母为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(UPA3)被阻断表达的突变体稳定菌株，其专属表达载体含有汉逊酵母自主复制序列及多种筛选标记，能够以高拷贝数稳定整合到菌株当中。本发明的突变体菌株及表达载体能够高效表达重组乙肝表面抗原，且能正确组装成VLP，工艺简单，非常适合于工业化生产表达蛋白，具有较大的实际应用价值。

Description

一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用
【技术领域】
本发明涉及一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用。
【背景技术】
全世界约有3.5亿人是HBV携带者，其中50％～70％为慢性乙肝，研究表明约有80％的肝癌患者与乙肝有关。中国是乙肝高发区，约有1.2亿HBV携带者，约25％～40％最终将死于肝硬化或合并肝癌，目前全球尚无根治药物。由于存在携带HIV等病毒及产量有限等问题，血源性乙肝疫苗已经被世界卫生组织取缔，取而代之的是重组乙肝疫苗。目前在国内流通的重组乙肝疫苗主要由中华地鼠卵巢细胞(CHO)、酿酒酵母菌及汉逊酵母菌作为生产宿主细胞。由于酵母菌来源的细胞具有高表达量、低产本等优势，目前在疫苗市场上已取得主导地位。
与酿酒酵母菌相比，甲醇营养型的汉逊酵母表现出更高的表达量，此前有报道其产量高达200～700mg/L蛋白，没有过度糖基化的现象，并且能够耐受高温，最佳生长温度为37℃-43℃，生长速率快，能够用廉价的培养基进行高密度发酵，因此适于大规模发酵生产目的蛋白。尽管已经有多家企业使用了该菌株用于生产重组乙肝疫苗，但在原始菌株选择上，不同厂家还有较大差异，菌株发酵时生物量偏低；此外配套表达载体的差异，造成宿主整合的拷贝数不高，不容易筛选到高拷贝菌株，整合进入宿主基因组的基因稳定性差等问题，最终影响目的蛋白表达量，增加了生产成本。
现有的各种酵母来源重组乙肝表面抗原均属于胞内表达，生产厂家的纯化工艺各有不同，主流纯化工艺中包括超速离心等步骤，但此工艺操作过程繁琐，耗费人力物力较多，产物回收率低，严重制约生产规模。因此，还有待于开发新的菌株和配套载体，以及更加有效、低成本的纯化工艺。
【发明内容】
本发明涉及一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用。
本发明所提供的汉逊酵母突变体为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(URA3)被阻断的汉逊酵母营养型突变体。命名为尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)。经过分子鉴定、遗传稳定、生物量分析，证明该突变体被阻断的位点明确，机制清楚，遗传稳定且生物量高，保证了疫苗生产的安全性。
本发明所提供的构建上述汉逊酵母菌的方法，包括以下步骤：
1)构建用于致突变5’UTR-HPURA3Δ40-3’UTR的基因片段；
2)将步骤1)中的基因片段转化入野生型汉逊酵母中，利用5-FOA筛选尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)。
其中致突变片段包含部分终止序列，用于阻断乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(URA3)的读码框。
所述野生型汉逊酵母菌株优选ATCC26012。
本发明的第二个目的是提供一种与上述突变体菌株配套的表达载体。
本发明所提供的配套表达载体含有如下基因序列原件；所述序列原件依次包括酿酒酵母URA3表达框、G418表达框、汉逊酵母自主复制序列(ARS)、原核细胞自主复制序列(ori)、甲醇氧化酶基因启动子、转录终止子等序列。
本发明提供的表达载体具有正方向筛选标记，既具有G418表达框，同时具有URA3表达框，可同时利用两种标记进行筛选，筛选步骤操作简单、减少假阳性克隆产生、容易筛选出高拷贝数、遗传稳定的生产菌株。
本发明的第三个目的是利用上述尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)及配套表达载体pMOXUR(S.C)KARS1生产和纯化重组乙肝表面抗原。
本发明所提供的生产和纯化重组乙肝表面抗原的方法简单，操作时间周期短、回收率和纯度高，包括以下步骤：
1)构建用于表达重组乙肝表面抗原的载体；
2)将步骤1)中的载体转化入尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)中，筛选出高拷贝、稳定的生产菌株。
3)经常规工艺发酵后，菌体经破菌、澄清、硅胶吸附、离子交换、超滤浓缩和分子筛层析等步骤后获得高纯度、高回收率的重组乙肝表面抗原。
本发明的尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)和配套表达载体pMOXUR(S.C)KARS1可应用于生产多种外源蛋白，并不仅限于上述重组乙肝表面抗原的表达。
本发明通过基因工程手段，构建了生物量高、遗传稳定的尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)及其配套表达载体pMOXUR(S.C)KARS1。配套载体具有正方向筛选标记基因，与国内外所用的表达载体相比，更容易筛选出高拷贝数、遗传稳定的生产菌株，筛选操作更简单。利用该菌株和配套载体能够高效生产重组乙肝表面抗原，经简单纯化工艺之后，即可获得高回收率、高纯度的重组乙肝表面抗原，具有较高的工业应用价值。
【附图说明】
图1为本发明中致突变基因片段5’UTR-HPURA3Δ40-3’UTR片段的模式图；
图2为本发明中尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)的分子鉴定；
图3为本发明中尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)稳定性验证结果；
图4为本发明中尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)的配套表达载体；
图5为本发明中实施例3纯化产品的SDS-PAGE图谱；
图6为本发明中实施例3纯化产品的HPLC-SEC图谱；
图7为本发明中实施例3纯化产品的透射电镜图谱。
【具体实施方式】
下述实施例中所有涉及含量的百分数均为质量百分数。
下述实施例中所用限制性内切酶及连接酶均购自Takara公司。
下述实施例中所用DNA聚合酶均购自Toyobo公司。
实施例1、汉逊酵母突变体ATCC26012(ura3-)的构建及其稳定性和生物量的测定。
一、构建致突变基因片段5’UTR-HPURA3Δ40-3’UTR片段
如图1所示，用于电转汉逊酵母的致突变基因片段包括URA3基因上游UTR 1036bp，下游UTR 1000bp，和带有部分缺失的URA3基因片段，其构建过程如下：
1、5’UTR-HPURA3-3’UTR野生型基因片段Homo-HPURA3的获得
根据已报道的汉逊酵母的URA3的核苷酸序列(GenBank：X69461.1)设计引物如下：
引物1：5’-AGAACGTGGACGATAATGACGCAGA-3’
引物2：5’-GCCGTCTCGATTTGACTACCTCAC-3’
以汉逊酵母(Hansenula Polymorpha)ATCC26012的总基因组DNA为模板，用引物1和引物2进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl基因组模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃3分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。
将PCR产物回收并纯化，目的片段约2.8kb，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，测序正确的克隆提取质粒以备后续实验使用。
2、致突变上游片段5’UTR-ΔHPURA3序列的获取
引物3：5’-AGAACGTGGACGATAATGAC GCAGA-3’
引物4：5’-CGTAGTCGAG TCACTTAGTTACATTCGTGA TATCGGCCCA-3’
以上述5’UTR-HPURA3-3’UTR野生型基因片段Homo-HPURA3为模板，用引物3和引物4进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃3分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。
将PCR产物回收并纯化，目的片段约1.4kb，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，测序正确的克隆提取质粒以备后续实验使用。
3、致突变下游片段ΔHPURA3-3’UTR序列的获取
引物5：5’-TAACTAAGTGACTCGACTACGACAGGCAGCAGAAGAAAGT-3’
引物6：5’-GCCGTCTCGATTTGACTACCTCAC-3’
以上述5’UTR-HPURA3-3’UTR野生型基因片段Homo-HPURA3为模板，用引物5和引物6进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃3分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。
将PCR产物回收并纯化，目的片段约1.4kb回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，测序正确的克隆提取质粒以备后续实验使用。
4.致突变5’UTR-HPURA3A40-3’UTR片段的获取
引物7：5’-AGAACGTGGACGATAATGACGCAGA-3’
引物8：5’-GCCGTCTCGATTTGACTACCTCAC-3’
以上述5’UTR-HPURA3-3’UTR野生型基因片段Homo-HPURA3为模板，用引物5和引物6进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃3分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。
将PCR产物回收并纯化，目的片段约2.8kb，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，测序正确的克隆提取质粒以备后续实验使用。
二、致突变5’UTR-HPURA3A40-3’UTR片段转化ATCC26012，筛选尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)菌株。
1、致突变片段转化汉逊酵母ATCC26012(DL-1)菌株
参考Faber K N，Haima P，Harder W，et al.Highly-efficient electro-transformation of the yeastHansenula polymorpha[J].Current genetics，1994，25(4)：305-310中的电转化方法进行感受态细胞制备和电转条件设置。
感受态细胞制备：挑单克隆于10ml非选择性YPD培养基中37℃培养过夜。取2ml培养物，接种至含100mlYPD培养基的摇瓶，37℃培养至OD600＝1.3-1.5。4℃，3000g离心10min收集细胞，用0.2倍体积预冷的50mM磷酸盐缓冲液悬浮细胞，37℃孵育15min。如上离心，用1倍体积预冷的STM缓冲液悬浮清洗细胞。如上离心，用0.5倍体积的预冷的STM缓冲液悬浮清洗细胞。如上离心，用0.005倍体积的预冷的STM缓冲液悬浮细胞，至终体积约0.4ml。
电转化条件设置：取100ul上述细胞与10-20ug线性化DNA混合，转入预冷的2mm电转杯中。同时设置阴性对照组：只取100ul上述细胞转入预冷的2mm电转杯中。在冰上放置5min。设置电极参数：1.5kV，50uF，150Ω，进行电转。电转后立即加入1ml预冷的YPD至电转杯中，将悬浮液转移至灭菌离心管中。于37℃培养箱中静置培养1h。取菌悬液涂布含1g/L 5-FOA，105μg/ml Ura的MD平板，置于37℃恒温培养箱培养3-5天，筛选转化子。
2.筛选转化子中的尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)
挑取在步骤5中生长的转化子，分别在MD+Ura(105μg/ml)和MD固体培养基平板上划线，置于37℃恒温培养箱培养1-2天进行表型鉴定结果，挑取在MD+Ura(105μg/ml)平板上生长，而在MD平板上不生长的菌株，分别转入MD+Ura(105μg/ml)和MD液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。结果表明菌株在含有Ura的培养基中能顺利生长啊，而在未添加Ura的MD培养基中不上长，证明该菌株为尿嘧啶营养缺陷，命名该菌株为DL-1.ura3-。
3.尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)的分子鉴定
引物9：5’-CCTGTCGTAGTCGAGTCACTTAGTTA-3’
引物10：5’-TAGATGAAGAACAGTTGGAGAAAAC-3’
引物11：5’-GACCTTCAACAATTCCTGCGCCAGTCACTCC-3’
以上述尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)基因组DNA为模板，用引物9和引物10进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。如图2左所示，突变体菌株能够扩增出～1.5kb左右的目的片段，野生型对照菌株未扩出。而用引物10和引物11进行PCR反应，反应体系及条件同上，如图2左所示，野生型菌株扩出相应片段，突变体菌株未能扩出。结果表明突变体中的URA3基因表达框确实被破坏。
4.尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)互补表型验证
引物12：同引物1
引物13：同引物2
以汉逊酵母(Hansenula Polymorpha)ATCC26012的总基因组DNA为模板，用引物1和引物2进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl基因组模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃3分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，直接电转尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)，并涂MD平板，37℃，倒置培养3～5天，具体汉逊制备酵母感受态制备方法和电转方法同上。挑选能够在MD平板上生长的阳性克隆，该结果表明汉逊酵母URA3ORF能够互补突变体表型，该突变体确实为尿嘧啶营养缺陷型菌株。
三、鉴定尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)遗传稳定性、生物量测定及互补鉴定
1、尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)遗传稳定性验证
用接种环将尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)在MD+5FOA(1g/L)+Ura(105mg/L)平板上划线，挑取单克隆菌接种于MD+Ura(105mg/L)液体培养基中，37℃，220rpm，震荡培养16小时左右，此后依次将每天按10％体积比，将菌种传代，供传代转接6次以上。最后将MD+Ura(105mg/L)培养基置换为MD培养基后，37℃，220rpm，饥饿培养4小时以上，然后吸取1μl菌液，分别点板于MD和MD+Ura(105mg/L)固体培养基平板，于37℃倒置培养1～2天。如图3所示，经过多次传代之后，单菌落能在MD+Ura(105mg/L)平板上生长，而在没有添加Ura的MD平板上不能生长，并且没有发生回复突变现象，证明本发明构建的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)遗传特性稳定。
2、尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)生物量测定
用接种环分别将野生型汉逊酵母(DL-1)和尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)在YPD(+105mg/L Ura)固体平板上划线，于37℃倒置培养1～2天。分别挑取单克隆接种到10mlYPD(+105mg/L Ura)液体培养基中，37℃，220rpm，震荡培养16小时左右。再按10％的接种量转接到100ml YPD(+105mg/L Ura)液体培养基中，于37℃，220rpm，震荡培养。每隔2小时取样，测OD600值，虽然在起始阶段，突变体生长稍微慢于野生型，也许是需要适应培养基，但到生长后期，野生型OD600为17.728，突变体OD600为17.928，详细测量数据见表1。证明尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)与野生型菌株在生物量上无明显差异，生长比较稳定。
表1：生物量测定
Time(h) 野生型OD600 突变体OD600 剩余量(ml)
0 0.272 0.2732 100
2 0.4046 0.3135 97.5
4 1.0978 0.7508 96.5
6 3.3372 2.1455 95.9
8 7.1676 4.6992 95.6
10 10.8625 7.68 91.4
12 12.028 9.948 92.2
14 12.525 9.864 92.1
16 12.232 10.62 92
20 14.04 10.244 91.8
24 16.152 11.32 91.7
26 16.2 12.156 91.6
28 16.148 13.484 91.5
30 16.892 13.44 91.4
32 17.548 15.232 91.15
38 17.6 17.276 91.05
48 17.508 18.952 90.95
56 17.728 17.928 90.75
3、尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)的互补鉴定
以实施例1中的野生型基因片段Homo-HPURA3为互补片段，转化尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)。感受态制备方法和电转方法同上，之后涂MD固体培养基平板，经37℃恒温培养培养3-5天后，平板上长出大量单克隆菌株，而未转化Homo-HPURA3互补片段的对照组则在MD平板上不能生长，表明该发面获得的确实为尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)。
实施例2、尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)配套表达载体pMOXUR(S.C)KARS1的构建
1、PCR扩增获取甲醇氧化酶基因MOX启动子序列
引物14：5’-AGATCTTCGACGCGGA GAACGATCTC-3’
引物15：5’-GAATTCGGTG TGTTGTACTT TAGATT-3’
使用酵母基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号DP307-02)，提取汉逊酵母基因组DNA。以此基因组DNA为模板，用引物14和引物15进行PCR反应，划线部分分别为Bgl II和EcoR I酶切位点，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约1500bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
2、PCR扩增获取甲醇氧化酶基因MOX TT序列
引物16：5’-GGGCCCGGAG ACGTGGAAGGACATAC-3’
引物17：5’-GGATCCCTGT TCTTGGATGG CCAGGA-3’
以上述步骤基因组DNA为模板，用引物16和引物17进行PCR反应，划线部分分别为Apa I和BamH I酶切位点，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约400bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
3、PCR扩增获取pTFEl+pEM7启动子序列
引物18：5’-GGATCCCCCA CACACCATAG CTTCA-3’
引物19：5’-ACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTTTAGTTCCTCAC CTTGTCGTAT-3’
以上述pPIC6A载体为模板，用引物18和引物19进行PCR反应，划线部分为BamH 1酶切位点，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约480bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
4、PCR扩增获取Kanamycin序列
引物20：5’-ATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGAGCCATA TTCAACGGGAAACGT-3’
引物21：5’-CACGAAGTGC TTAGAAAAAC TCATC-3’
以上述pPIC6A载体为模板，用引物20和引物21进行PCR反应，划线部分为Dra III酶切位点，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约820bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
5、PCR扩增获取pTFE1+pEM7+Kanamycin序列
引物22：同引物18
引物23：同引物21
以上述步骤3和4的测序正确质粒为模板，用引物17和引物18进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl10×Buffer，5μl dNTP，2μl25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，两种模板各1μl，32μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约1300bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
6、PCR扩增获取CYCTT+PUC ori序列
引物24：5’-CACTTCGTGG CCGAGGAGCA GGACT-3’
引物25：5’-TGAACGCCGA GTCGCGGGAG TCGACGATCT CATGACCAAAATCCCTTAAC-3’
以上述pPIC6A载体为模板，用引物19和引物20进行PCR反应，划线部分为Dra III酶切位点，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约1000bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
7、PCR扩增获取ARS序列
引物26：5’-GT TAAGGGATTTTGGTCATGAGATCGTCGACTCCCGCGACTCGGCGTTCA-3’
引物27：5’-AGATCTGTCG ACAAACCCGC GTTTGA-3’
以上述汉逊酵母基因组为模板，用引物26和引物27进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约500bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
8、PCR扩增获取CYCTT+PUC ori+ARS序列
引物28：同引物24
引物29：同引物27
以上述步骤7和8中测序正确的质粒为模板，用引物23和引物24进行PCR反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，两种模板各1μl，32μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约500bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
9、URA3ORF序列的PCR扩增
引物30：5’CGCGGATCCGCTTATCATCGATAAGCTTT-3’
引物31：5’-AGATCTTCTT CCCAATTTTT TTTTTTCGTC-3’
以YEP24质粒为模板，用引物25和引物26进行PCR反应，划线部分分别为BamH I和Bgl II酶切位点具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，模板各1μl，33μlddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约1200bp，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
10、从pPIC6A载体出发，用Dra III和BamH I分布酶切，回收载体骨架片段约2500bp。将上述步骤5中测序正确的载体同时用Dra III和BamH I分布酶切，在T4-DNA连接酶的作用下，将PTEFl+PEM7+Kanamycin序列与载体骨架进行连接，并转化TOP10感受态细胞，涂含有Kana抗性的LB平板，对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，并提取相应质粒备用。
11、将上述步骤10的载体用Bgl II和Dra III分别酶切，回收载体骨架片段约2700bp。将上述步骤8中测序正确的载体同时用Bgl II和Dra III分别酶切，在T4-DNA连接酶的作用下，将CYCTT-PUCori-ARS序列与载体骨架进行连接，并转化TOP10感受态细胞，涂含有kana抗性的LB平板，对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，并提取相应质粒备用。
11、将上述步骤11的载体用Apa I和BamH I酶切，回收载体骨架片段。将上述步骤2中测序正确的载体同时用Apa I和BamH I酶切，在T4-DNA连接酶的作用下，将MOX TT序列与载体骨架进行连接，并转化TOP10感受态细胞，涂含有kana抗性的LB平板，对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，并提取相应质粒备用。
12、将上述步骤12的载体用Bgl II和EcoR I酶切，回收载体骨架片段。将上述步骤1中测序正确的载体同时用Bgl II和EcoR I酶切，在T4-DNA连接酶的作用下，将MOXpromoter序列与载体骨架进行连接，并转化TOP10感受态细胞，涂含有kana抗性的LB平板，对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，并提取相应质粒备用。
13.将上述步骤12的载体用BamH I酶切，并用CAIP去磷酸化，回收载体骨架片段。将上述步骤9中测序正确的载体同时用BamH I和Bgl II酶切酶切，在T4-DNA连接酶的作用下，将MOX promoter序列与载体骨架进行连接，并转化TOP10感受态细胞，涂含有kana抗性的LB平板，对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，并提取相应质粒备用，至此pMOXUR(S.C)KARS1构建完成(图3)。
实施例3、尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)表达重组乙肝表面抗原
1、重组表达乙肝表面载体的构建
从GenBank上调取乙肝表面抗原(HBsAg)氨基酸序列SEQ ID No.1，按照汉逊酵母密码子偏好性，由苏州金唯智生物科技有限公司全基因合成，得到序列：SEQ ID No.2，具体序列可参见所附的序列表。
引物32：5’-GAATTCATGGAGAACATCACCTCGGG-3’
引物33：5’-GCGGCCGCTTAGATGTACACCCACAGGCAGA-3’
以金唯智合成乙肝表面抗原(HBsAg)基因序列为模板，用引物32和引物33进行PCR反应，划线部分分别为EcoR I和Not I酶切位点具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的KOD-Plus聚合酶，5μl 10×Buffer，5μl dNTP，2μl 25mM MgSO4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，模板1μl，33μl ddH2O。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化，目的片段约700bp，回收后产物用EcoR I和Not I双酶切，将表达载体pMOXUR(S.C)KARS1用EcoR I和Not I双酶切。回收载体骨架片段和PCR产物片段。在T4-DNA连接酶的作用下，将HBsAg序列与载体骨架进行连接，并转化TOP10感受态细胞，涂含有kana抗性的LB平板，对阳性克隆进行菌落PCR鉴定、测序正确的阳性克隆命名为pMOXUR(S.C)KARS1-SVH，并用Qiagen质粒大量提取试剂盒提取质粒备用
2、重组表达乙肝表面载体的转化与筛选
制备尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株(DL-1.ura3-)感受态细胞，用Bgl II线性化10μg上述pMOXKUR(S.C)KARS1-SVH质粒，电转化感受态细胞，并涂MD平板，于37℃倒置培养3-5天。感受态制备方法和电转化方法与实施例1相同。选取在MD平板上生长较大的克隆并进行菌落PCR鉴定，挑取其中8～10株阳性克隆进行发酵培养。具体步骤为挑选单克隆接种于10mlYPD液体培养基中，37℃培养过夜；取上述过夜培养菌液7m1分别接种至200mlBMGY液体培养基中37℃培养24h左右，剩余菌液进行保菌。按1％的甲醇添加量进行诱导，每24h添加一次，诱导约48h。于4℃，5000g离心10min收集菌体，PBS清洗一次后，分别取2g菌用PBS重悬成20％的菌悬液，设置相应破菌条件后，对匀浆及上清进行Western Blot检测是否含有重组乙肝表面抗原表达。Western Blot结果显示所有检测菌株均有抗原表达。
3、重组表达乙肝表面载体的纯化
取10克常规工艺发酵得到的含有重组乙肝表面抗原的汉逊酵母菌体，用PBS溶液按质量体积比为10％的比例进行重悬，加入0.3～1％的tween20和终浓度为1mM的PMSF，用高压匀浆机进行破菌，反复破碎3～6次，直至破菌率达到85％以上。4℃，5000g，离心30min，去除匀浆中的沉淀。将上清液加入到事先溶胀号的硅胶当中，于4℃低速搅拌吸附4小时，再于37℃解吸附1小时。15000g离心，37℃，30min，留上清。
调整上述上清样品pH调至7.5～8.5，过DEAE SepharoseFast Flow或Q SepharoseFast Flow离子交换树脂(GE healthcare)，以线性梯度提高NaCl浓度洗脱目的蛋白。对离子交换层析洗脱的各蛋白峰进行SDS-PAGE分析，合并所有含有目的蛋白组分的洗脱液。用截留分子量为300KD的TFF切向流超滤膜包(Millpore)进行浓缩换液体。浓缩后的样品过Sepharose 6FF或Sepharose 4FF凝胶过滤柱(GE healthcare)，进行分子筛纯化，流动相为20mM PBS，pH 7.2，分别检测洗脱峰组分的蛋白质含量和活性。图4为最终产品的SDS-PAGE检测结果，可以清晰的显示出乙肝表面抗原单体、二聚体及其他多聚体，无明显杂蛋白条带。
对最终样品进行高效分子排阻色谱(HPLC-SEC，TSK G5000PW色谱柱，300mm×7.8mm)分析。实验结果如图5所示，本发明表达和纯化后的产品杂蛋白含量极低，重组乙肝表面抗原纯度达到99％以上。透射电镜(Hitachi，HT7700)结果显示，上述最终产品能够形成结果稳定、均一的VLP结构。

Claims (14)

1.一种汉逊酵母突变体为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(URA3)被阻断表达的突变体稳定菌株。
2.根据权利要求1所述的汉逊酵母突变体，其特征在于：所述突变体稳定菌株为尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)。
3.一种构建权利要求2所述汉逊酵母突变体的方法，包括以下步骤：
1)构建用于致突变5’UTR-HPURA3Δ40-3’UTR的基因片段；
2)将步骤1)中的基因片段转化入野生型汉逊酵母中，利用5-FOA筛选尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)。
4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于所述野生型汉逊酵母菌株为ATCC26012。
5.一种重组表达载体，是含有酿酒酵母URA3表达框、G418表达框、汉逊酵母自主复制序列(ARS)、原核细胞自主复制序列(ori)、甲醇氧化酶基因启动子、转录终止子序列。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体具有正反向筛选标记，既具有G418表达框，同时具有酿酒酵母URA3表达框。
7.根据权利要求5或6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pMOXUR(S.C)KARS1。
8.一种表达重组乙肝表面抗原的表达载体，其特征在于：所述乙肝表面抗原核苷酸序列是编码氨基酸序列为SEQ ID No：1的序列。
9.根据权利要求8所述的重组乙肝表面抗原的表达载体，其特征在于：所述乙肝表面抗原核苷酸序列是为SEQ ID No：2的DNA序列。
10.一种生产重组乙肝表面抗原的汉逊酵母菌，是利用权利要求5-9所述的重组表达载体导入权利要求2-4所述的尿嘧啶营养缺陷型菌株(DL-1.ura3-)菌株。
11.根据权利要求1-10所述汉逊酵母突变体和重组表达载体在生产外源蛋白方面的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述外源蛋白为重组乙肝表面抗原。
13.一种分离纯化汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原的方法。
14.根据权利要求13所述方法，其特征在于：具体步骤包括菌体破菌、澄清、硅胶吸附、离子交换、超滤浓缩和分子筛层析步骤。
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