CN1712529A

CN1712529A - 一种嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN1712529A
Application number: CN 200410049703
Authority: CN
Inventors: 王海平; 王全立; 甘慧; 周勇; 高明; 吕丽萍; 付秋霞; 王怡
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2004-06-24
Publication date: 2005-12-28
Anticipated expiration: 2024-06-24
Also published as: CN100537762C

Abstract

本发明公开了一种嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白及其制备方法与应用，目的是提供一种通用、高效的嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白以及以该载体蛋白为基础的疫苗。本发明所提供的载体蛋白，按如下方法得到：1)将包含酶切位点的连接子序列编码基因片段***到HBcAg的e1环区域的DNA序列中，得到嵌合基因；2)将嵌合基因克隆到表达载体中，表达后得到载体蛋白。将靶抗原表位连接到所述载体蛋白的连接子序列区域后融合而成的蛋白质，即为所需的病毒样颗粒疫苗。利用本发明构建的具有通用性的嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白，能够大大简化病毒样颗粒疫苗的设计和制备过程，具有广泛的应用前景。

Description

一种嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及病毒疫苗载体蛋白及其制备方法与应用，特别是涉及一种具有通用性的嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白及其制备方法以及应用该载体蛋白制备的病毒样颗粒疫苗。

背景技术

接种疫苗是预防传染病的有效手段。根据制备方法的不同，疫苗的类型主要分为灭活疫苗、减毒疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗。综合目前有效性和安全性比较分析，基因工程疫苗具有较多优势。由于传统的包含中和表位的可溶性基因工程疫苗只能诱导体液免疫，因此限制了它的应用范围。近年来的研究发现，病毒样颗粒，即：不含病毒基因组、但具有与病毒颗粒相似的结构和免疫原性的非传染性颗粒，具有强免疫原性，能够诱导产生包括体液和细胞的全面的机体免疫应答，从而使疫苗兼具预防和治疗作用，拓展了传统疫苗的概念。

病毒样颗粒疫苗是近年来新型疫苗研制的热点之一，其优点包括：(1)免疫原性强；(2)可诱导全面的免疫应答；(3)安全性好；(4)性质稳定，不易被降解；(5)便于免疫细胞、免疫分子对抗原表位的识别；(6)免疫时无需佐剂。HBV核心抗原(HBcAg)含有机体特异性细胞毒T细胞(CTL)的主要表位和多个辅助性T细胞(Th)、B细胞优势表位，在原核和真核***均可自组装成二十面体病毒样颗粒，直径约27nm，颗粒的基本结构单位为HBcAg蛋白二聚体，每个HBcAg由90或120个蛋白二聚体组成，每个单体的N末端第78-83位氨基酸区域在颗粒表面形成凸起结构，称为e1环区域。

目前，应用HBcAg制备病毒样颗粒疫苗，所采用的方法是直接在HBcAg的e1环区域连接上相应的靶抗原表位，需设计多条引物、经过多步聚合酶链式反应才能完成，操作步骤多，方法繁琐并可能引入突变。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用、高效的嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白及其制备方法。

本发明所提供的嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白，按下述方法得到：

1)将包含酶切位点的连接子序列编码基因片段***到HBcAg e1环区域的DNA序列中，得到嵌合基因；

2)将嵌合基因克隆到表达载体中，表达后得到载体蛋白。

步骤1)所述连接子序列通常是柔性的，为了不影响邻近表位的特性，常用包含1-18个GlyPro的氨基酸残基的多肽作为连接子，优选为包含2-10个GlyPro的氨基酸残基。

为了方便靶抗原表位的***，连接子上还包含有酶切位点，常用酶切位点为NgoMIV、XmaI和PspoMI中的任一两种。

所述HBcAg e1环是在HBcAg N末端的78-83位氨基酸处，可以在这些位置之间的任何地方***，优选在79-83、78-80或79-82的区域***，更优选的是在79-80位氨基酸之间。当***连接子时，可以保留e1序列；或者，可以缺失掉e1序列的全部或部分，且用连接子序列来取代。

由于HBcAg羧基端富含碱性氨基酸，可结合DNA，能干扰宿主染色体代谢，为了有利于疫苗纯化时去除杂DNA和在人体使用的安全性，所用HBcAg通常要经过羧基端部分缺失，可通过聚合酶链式反应获得。羧基端部分缺失可以为N末端第145氨基酸残基处至C-末端的氨基酸部分或全部缺失，缺失的氨基酸可以包括例如N末端第145氨基酸残基处至C-末端氨基酸、N末端第149氨基酸残基处至C-末端氨基酸、N末端第150氨基酸残基处至C-末端氨基酸、N末端第156氨基酸残基处至C-末端氨基酸等。

嵌合基因克隆的表达载体有多种选择，如质粒或病毒载体等，它们可包含一个复制起始点、一个用于所述嵌合基因表达的启动子、一个如增强子的启动子调控元件、一个转录终止信号、一个翻译起始信号和/或一个翻译终止信号；所述表达载体也可以包含一种或更多种选择标记基因，如氨苄青霉素抗性基因或新霉素抗性基因等。表达所用的生物体可以为大肠杆菌、酵母菌或真核细胞等。

应用本发明的优选方案，得到的嵌合基因具有序列表中的SEQ ID №：1核苷酸序列；所得载体蛋白为具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

本发明的第二个目的是提供应用本发明所得嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白制备的病毒样颗粒疫苗。

采用常规的融合蛋白技术将靶抗原表位***到所得载体蛋白的连接子区域，例如将靶抗原表位的编码基因通过酶切反应等分子生物学技术***载体蛋白的连接子区域相应的DNA序列中，经过蛋白表达、纯化后即可获得所需的病毒样颗粒疫苗。

靶抗原表位的选择取决于所要预防、治疗或诊断的疾病，可以是T细胞表位或B细胞表位；或者不同类型表位的组合，如Th表位和B细胞表位或CTL表位；或者一种表位多个拷贝的串联。

应用本发明可以很方便地在载体蛋白中引入HBVpreS1或HBVpreS1+preS2，得到两种乙肝疫苗CS1和CS1S2。

本发明将一段柔性连接子***HBcAg的e1环区域，得到一种具有通用性的嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白，在制备病毒样颗粒疫苗时，只需将相应的靶抗原表位***到连接子区域，即可得到所需疫苗，疫苗制备方法简便、快捷。所得疫苗蛋白抗原表位展示于颗粒表面，便于免疫细胞和免疫分子的识别，可以作为相应抗体的检测抗原；在无佐剂的情况下，可以诱导高效、全面的免疫反应，达到预防病原体感染和治疗感染性疾病(特别是细胞内病原体感染性)、肿瘤和自身免疫性疾病。利用本发明构建的具有通用性的嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白，能够大大简化病毒样颗粒疫苗的设计和制备过程，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白克隆方案示意图

图2为蛋白SDS-PSGE电泳图

图3为蛋白C144Tong的电镜照片

图4为蛋白CS1的电镜照片

图5为蛋白CS1S2的电镜照片

图6为蛋白的Western blot照片

具体实施方式

实施例1、嵌合型病毒样颗粒疫苗载体的构建

1、扩增嵌合基因，构建pTC144Tong载体

采用重叠延伸剪切术(SOE)，经三轮PCR扩增获得目的基因片段。

第一轮PCR：以含HBV的人血清为模板，以

P1：5’-GCGCGGATCCATGGACATTGACCCATATAA-3’和

P4：5’-AAAACTGCAGCTACGGAAGTGTTGATAAGA-3’为引物，进行PCR扩增，反应参数为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30个，72℃再延伸5min，保存在4℃。采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，得到C144基因。按照常规方法在C144基因的3’端连接上A尾后与质粒pGEMT(购自Promega公司)连接，得到质粒pTC144。采用常规CaCl₂转化法将质粒pTC144导入大肠杆菌，按照常规的蓝-白斑筛选方法筛选阳性克隆菌株，采用质粒提取试剂盒(购白Promega公司)从中提取质粒pTC144。

第二轮PCR：以质粒pTC144为模板，以

P1：5’-GCGCGGATCCATGGACATTGACCCATATAA-3’和

P2：5’-CGGACCCGGGCCTGCCGGCGGATCTTCCAAATTA-3’为引物，进行PCR扩增，回收得到PC144-1基因片段；以质粒pTC144为模板，以

P3：5’-GCAGGCCCGGGTCCGGGCCCGGCATCCAGGGAATTA-3’和

P4：5’-AAAACTGCAGCTACGGAAGTGTTGATAAGA-3’为引物，进行PCR扩增，回收得到PC144-2基因片段。

第三轮PCR：以PC144-1和PC144-2为模板，以

P1：5’-GCGCGGATCCATGGACATTGACCCATATAA-3’和

P4：5’-AAAACTGCAGCTACGGAAGTGTTGATAAGA-3’为引物，进行PCR扩增，回收得到嵌合基因C144Tong，按照常规方法克隆测序，序列为序列表中SEQ ID№：1。按照常规方法将C144Tong连接到质粒pGEMT(购自Promega公司)上，得到质粒pTC144Tong。采用常规CaCl₂转化法将质粒pTC144Tong导入大肠杆菌，按照常规的蓝一白斑筛选方法筛选阳性克隆菌株，采用质粒提取试剂盒(购自Promega公司)从中提取质粒pTC144Tong。

2、嵌合型病毒样颗粒疫苗载体pQE-C144Tong

以BamHI和PstI双酶切质粒pTC144Tong，回收C144Tong基因片段后，与用相同酶切处理的原核表达载体pQE30a(购自Qiagen公司)连接，得到质粒pQE-C144Tong，然后采用常规CaCl₂转化法转化大肠杆菌JM109，采用PCR法筛选阳性克隆，采用质粒提取试剂盒(购自Promega公司)从中提取质粒，经酶切分析证明所得质粒正确。

将pQE-C144Tong质粒采用常规CaCl₂转化法转化大肠杆菌M15，采用PCR法筛选阳性克隆。按1：50接种量挑阳性克隆菌株在LB双抗性(硫酸卡那霉素和氨苄青霉素)培养基中，培养至OD_600nm＝0.4后加入1mM诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，4小时后收获细菌进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图2所示，图中1道为蛋白C144Tong，2道为实施例2所得蛋白CS1，3道为实施例3所得蛋白CS1S2，M道为中低分子量蛋白标准。从图中可以看出，重组蛋白C144Tong分子量为16KDa。

应用Ni²⁺螯合的亲和层析柱分离、纯化得到重组蛋白C144Tong，磷钨酸负染后进行透射电镜观察，照片如图3所示。从图中可以看出，重组蛋白C144Tong为大小均一、直径约27nm的颗粒。

测定重组蛋白C144Tong氨基酸序列，结果为序列表中SEQ ID№：2。

图1为嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白克隆方案示意图，图中C144-1为HBcAg N末端的第1-79氨基酸残基片段；C144-2为HBcAg N末端的第80-144氨基酸残基片段；连接子为***的连接子序列片段；P1、P2、P3、P4为PCR所用引物。

实施例2、乙肝病毒嵌合型病毒样颗粒疫苗CS1的构建

以质粒pGEMT-preS1(生物技术通讯，2004，15(2)：105)为模板，以

P5：5’-AAAAGCCGGCACCTCTGGGATTCTTTCCCGA-3’和

P6：5’-AAAAGGGCCCGGGTTGAAGTCCCAATCTGGATT-3’为引物，进行PCR扩增得到HBVpreS1(2.1～47AA.)表位的基因S1。回收基因片段并以NgoMIV和PspoMI双酶切后，将其连接到用相同酶切处理的通用性嵌合型病毒样颗粒疫苗载体pQE-C144Tong，得到质粒pQE-CS1。转化到大肠杆菌JM109，采用PCR法筛选阳性克隆，采用质粒提取试剂盒(购自Promega公司)从中提取质粒，经酶切分析证明所得质粒正确。

将pQE-CS1质粒采用常规CaCl₂转化法转化大肠杆菌M15，采用PCR法筛选阳性克隆。按1∶50接种量挑阳性克隆菌株在LB双抗性(硫酸卡那霉素和氨苄青霉素)培养基中，培养至OD_600nm＝0.4后加入1mM诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，4小时后收获细菌进行SDS-PAGE凝胶电泳(图2)，重组蛋白CS1分子量为20KDa。

应用Ni²⁺螯合的亲和层析纯化重组蛋白CS1，磷钨酸负染后进行透射电镜观察，照片如图4所示。从图中可以看出，重组蛋白CS1为大小均一、直径约30nm的颗粒。

实施例3、乙肝病毒嵌合型病毒样颗粒疫苗CS1S2的构建

以质粒pGEMT-CS1S2(军事医学科学院院刊，2003，27(1)：40)为模板，以

P5：5’-AAAAGCCGGCACCTCTGGGATTCTTTCCCGA-3’和

P7：5’-AAAAGGGCCCGGGCCACCAGCAGGAAAATATAG-3’为引物，进行PCR扩增得到HBVpreS1(21～47AA.)+preS2(133～145AA.)表位的基因S1S2，回收基因片段并以NgoMIV和PspoMI双酶切后，将其连接到用相同酶切处理的载体pQEC144Tong上，得到质粒pQE-CS1S2。转化到大肠杆菌JM109，采用PCR法筛选阳性克隆，采用质粒提取试剂盒(购自Promega公司)从中提取质粒，经酶切分析证明所得质粒正确。

将pQE-CS1S2质粒采用常规CaCl₂转化法转化大肠杆菌M15，采用PCR法筛选阳性克隆。按1∶50接种量挑阳性克隆菌株在LB双抗性(硫酸卡那霉素和氨苄青霉素)培养基中，培养至OD_600nm＝0.4后加入1mM诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，4小时后收获细菌进行SDS-PAGE凝胶电泳(图2)，所得重组蛋白CS1S2分子量为23KDa。

应用Ni²⁺螯合的亲和层析纯化重组蛋白CS1S2，磷钨酸负染后进行透射电镜观察，照片如图5所示。从图中可以看出，重组蛋白CS1S2为大小均一、直径约30nm的颗粒。

实施例4、疫苗CS1和CS1S2的抗原性鉴定

按照常规的免疫印迹(Western-blot)方法检测蛋白的表位抗原性，结果如图6所示，图中M道为中低分子量蛋白标准；1道为对照(空载体pQE30a转化M15菌)；2道为蛋白C144Tong；3道为蛋白CS1；4道为蛋白CS1S2。结果表明疫苗各表位均具有抗原性，且展示于颗粒表面。

采用常规的酶联免疫吸附(ELISA)方法检测蛋白的表位抗原性，也得到同样的结论。

实施例5、疫苗CS1和CS1S2的动物免疫

将重组蛋白C144Tong、CS1和CS1S2以生理盐水溶解，配制成1μg/μl浓度，无菌过滤备用。取雌性Balb/c小鼠24只，随机分为C144Tong组、CS1组、CS1S2组和对照组，采用腹腔注射方式，每次向小鼠注射C144Tong、CS1、CS1S2溶液0.1ml，对照注射生理盐水溶液0.1ml，每两周注射1次，注射3次后，采用常规方法检测小鼠抗体、细胞因子和CTL水平。结果表明：两种疫苗CS1和CS1S2的各表位均能诱导抗体的产生，并能诱导CTL和诱生IFN-γ。

序列表

<160>2

<210>1

<211>459

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggacattg acccatataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60

tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120

gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180

tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agatccgccg 240

gcaggcccgg gtccgggccc ggcatccagg gaattagtag tcagctatgt caatgttaat 300

atgggcctaa aaatcagaca actattgtgg tttcacattt cctgtcttac ttttggaaga 360

gaaactgttc ttgagtattt ggtgtctttc ggagtgtgga ttcgcactcc tcccgcttac 420

agaccaccaa atgcccctat cttatcaaca cttccgtag 459

<210>2

<211>152

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Pro

65 70 75 80

Ala Gly Pro Gly Pro Gly Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr

85 90 95

Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His

100 105 110

Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val

115 120 125

Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn

130 135 140

Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

145 150

Claims

1、一种嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白，按如下方法得到：1)将包含酶切位点的连接子序列编码基因片段***到HBcAg的e1环区域的DNA序列中，得到嵌合基因；2)将嵌合基因克隆到表达载体中，表达后得到载体蛋白。

2、根据权利要求1所述的载体蛋白，其特征在于：步骤1)所述连接子为包含1-18个重复GlyPro的氨基酸残基，优选为包含2-10个重复GlyPro的氨基酸残基；所述酶切位点为NgoMIV、XmaI和PspoMI中的任一两种；所述HBcAg的e1环区域为HBcAgN末端的第79-83氨基酸残基或第78-80氨基酸残基或第79-82氨基酸残基，优选为HBcAgN末端的第79-80氨基酸残基。

3、根据权利要求1或2所述的载体蛋白，其特征在于：步骤1)所述HBcAg的N末端第145氨基酸残基处至C-末端的氨基酸部分或全部缺失。

4、根据权利要求1或2所述的载体蛋白，其特征在于：步骤1)所述嵌合基因具有序列表中的SEQ ID №：1核苷酸序列；步骤2)所述载体蛋白具有序列表中SEQ ID№：2的氨基酸残基序列。

5、一种嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白的制备方法，包括如下步骤：1)将包含酶切位点的连接子序列编码基因片段***到HBcAg的e1环区域的DNA序列中，得到嵌合基因；2)将嵌合基因克隆到表达载体中，表达后得到载体蛋白。

6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述连接子序列为包含1-18个重复GlyPro的氨基酸残基，优选为包含2-10个重复GlyPro的氨基酸残基；所述酶切位点为NgoMIV、XmaI和PspoMI中的任一两种；所述HBcAg e1环区域为HBcAg N末端的第79-83氨基酸残基或78-80氨基酸残基或79-82氨基酸残基，优选为HBcAg N末端的第79-80氨基酸残基。

7、根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述HBcAg的N末端第145氨基酸残基处至C-末端的氨基酸部分或全部缺失。

8、根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述嵌合基因具有序列表中的SEQ ID №：1核苷酸序列；步骤2)所述载体蛋白具有序列表中SEQ ID№：2的氨基酸残基序列。

9、应用权利要求4所述的嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白制备的病毒样颗粒疫苗，是将靶抗原表位与所述载体蛋白融合而成的蛋白质。

10、根据权利要求9所述的病毒样颗粒疫苗，其特征在于：所述靶抗原表位为HBVpreS1或HBVpreS1+preS2。