CN111166881B

CN111166881B - 一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111166881B
Application number: CN202010010061.1A
Authority: CN
Inventors: 李启明; 邵帅; 韩子泊; 张靖; 靳玉琴; 杜丽芳; 杨森森; 雷泽华; 马智静; 栗子谦; 郑凡; 梁宇
Original assignee: China National Biotec Research Institute Co ltd
Current assignee: China National Biotec Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2040-01-06
Also published as: CN111166881A

Abstract

本发明公开了一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗，所述疫苗主要靶抗原为一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和分别***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白C端、N端和免疫优势区的三个不同的所述重组呼吸道合胞病毒的抗原表位片段组成；其中，所述***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白C端、N端的抗原表位片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白免疫优势区的抗原表位片段的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明以蹄蝠肝炎病毒核心蛋白作为表位呈递载体，进行多个表位片段的非连续呈递，有效地在病毒样颗粒表面最大程度重复高密度的展示不同抗原表位，并且不影响病毒样颗粒的自主装配，较之单一位点呈递表位具有更高的免疫应答效果。

Description

一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)是世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体，感染后引发细支气管炎及间质性肺炎，造成全球范围内5岁以下儿童每年约有近20万人死亡^[1]，同时，老年人及免疫缺陷人群也是RSV感染的主要人群。目前，除人源化单克隆抗体—帕利珠抗体(Palivizumab)之外，无其他特效治疗药物及可用的预防及治疗性RSV疫苗[2]。RSV基因组全长15.2kb，共编码11种蛋白，包括3种核衣壳蛋白(N、P、L)、3种跨膜蛋白(F、G、SH)、3种基质蛋白(M、M2-1、M2-2)和2种非结构蛋白(NS1、NS2)。其中G蛋白和F蛋白分别介导病毒与细胞的黏附和融合，是目前疫苗研制的主要靶抗原。F蛋白相对于G蛋白，在A和B两个血清型之间同源性较高，由F蛋白研制的RSV疫苗对于A和B两个血清型都具有保护作用，是目前RSV疫苗研究的主要靶点。

F蛋白由F1、F2两个亚基组成，为Ⅰ型糖蛋白，以三聚体形式存在。F蛋白存在两种状态：亚稳定的融合前状态与较稳定的融合后状态；融合前状态的F蛋白具有较高的免疫原性。目前已发现F蛋白上有多个中和位点：Ⅰ、Ⅱ、ⅢⅣ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ及

均有相应中和单抗研制的报道。其中，抗原位点Ⅱ是RSV预防及治疗性单克隆抗体—帕利珠抗体及莫维珠抗体(Motavizumab)的结合位点，位于F蛋白F1亚基的254至277位氨基酸，是“α螺旋-环-α螺旋”二级结构的构象型表位，其在F蛋白融合前后构象状态保持不变^[3]抗原位点Ⅷ是近年发现的融合前F蛋白特异性位点，位于靠近“螺旋-环-螺旋”的163-181位氨基酸，并部分覆盖抗原位点Ⅱ和/>

识别该位点的中和性单克隆抗体hRSV90对A、B亚型均有较好的中和活性。

上世纪60年代，经甲醛灭活的RSV疫苗(Formalin-inactivated RSV,FI-RSV)不但不能预防婴幼儿RSV感染，而且造成严重的呼吸道疾病增强作用(Enhancedrespiratorydisease,ERD)，致使两名婴儿死亡，而造成ERD现象的具体靶点与机制至今尚未明确^[4]。因此，在RSV疫苗研发中如何规避ERD现象并提高疫苗的安全性和有效性成为首要考虑的问题。虽然以F蛋白为主要成分的疫苗在动物实验上表现出良好的免疫原性，然而，有研究显示，F蛋白仍存在一定程度的安全性风险，纯化后的F蛋白免疫棉鼠后曾出现ERD现象。近年以来以融合后F蛋白作为主要靶抗原的疫苗，在老年人群中进行的临床试验研究失败的案例，也为RSV疫苗的研发带来了巨大阻力。

相对F蛋白亚单位疫苗，表位嵌合VLP疫苗中有效抗原仅选取RSV F蛋白上的帕利珠抗体结合表位—抗原表位Ⅱ及抗原表位Ⅷ，理论上该研制策略对于RSV疫苗的研制更具安全性。该策略方案是选取RSV F蛋白上的不同中和性抗原表位，将其嵌合至具有自组特性的病毒样颗粒中，形成重组多表位嵌合病毒样颗粒。

人类乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)属于嗜肝DNA病毒科正肝病毒属，其核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)具有自组装特性、高密度展示、强免疫原性等特点，已成为一种高效安全且应用广泛的外源表位呈递载体^[5]。然而，人群中HBV预存抗体可能会影响基于HBcAg嵌合疫苗在人群中的免疫效果。由于嗜肝DNA病毒科的核心抗原具有相似的空间结构以及免疫原性，因此，该科的其他肝炎病毒核心抗原也可替代人类乙肝病毒作为表位展示载体进行表位呈递。

对于RSV疫苗研制，2015年，Jeanne H^[6]等人使用土拨鼠肝炎病毒核心抗原(Woodchuck hepadnavirus core antigen,WHcAg)作为表位展示载体，进行了RSV F蛋白抗原表位Ⅱ单表位的嵌合展示，获得了一定的免疫效果，证实了嵌合病毒样颗粒(Virus likeparticle，VLP)表位展示思路对于RSV疫苗研发的可行性。然而，为了达到一定的免疫效果，免疫小鼠使用的抗原剂量明显高于常规剂量(100μg/剂)，嵌合表位展示技术的疫苗有效性尚待加强。

针对上面问题进行了表位嵌合VLP(Chimeric virus like particle，cVLP)疫苗的研发，在专利申请号为201710111683.1中，将抗原表位Ⅱ单一表位***到蹄蝠肝炎病毒(Roundleaf bat hepatitis B virus，RBHV)核心抗原的主要免疫优势区(MajorImmunodominant region，MIR)区内，构建的cVLP对RSV具有一定程度的免疫学活性。但是，该专利的技术方案免疫应答弱，因此本发明人在原有研究基础之上，在蹄蝠肝炎病毒多个表位***位点，如MIR区***抗原表位Ⅱ，N末端和C末端***抗原位点Ⅷ，在不影响颗粒组装提前下，提高了抗原表位在VLP表面展示密度和种类，很大程度上提高了蛋白免疫学活性。因此，创造性发明了一种新的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗制备方案，从而有效提高免疫效果。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有技术中RSV表位嵌合VLP疫苗的免疫应答弱的问题，提供了一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用。

本发明提供的技术方案为：

一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗包含重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和分别***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白C端、N端和免疫优势区的三个不同的所述重组呼吸道合胞病毒的抗原表位片段组成；

其中，所述***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白C端、N端的抗原表位片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白免疫优势区的抗原表位片段的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明中所述的蹄蝠肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科，其宿主为蝙蝠、蹄蝠等，在***发育树上与人乙肝病毒、土拨鼠肝炎病毒及地松鼠肝炎病毒关系较近，且RBHV核心蛋白与人乙肝病毒核心抗原结构类似，可由240个或180个RBHV核心蛋白自主装配成病毒样颗粒(T＝4或T＝3)。本发明人在充分借鉴已有成果的基础上，创造性地发明了基于RBHV为载体、包含三个非连续呼吸道合胞病毒抗原表位的重组多表位嵌合疫苗，可刺激产生较强的免疫应答，用于预防RSV的感染，具有重要的科学和应用价值。

在本发明中，所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列与野生型蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列不同，为了提高蛋白表达量及蛋白稳定性，作为优选，本发明人创造性地截短了野生型病毒核心抗原(参考序列：NCBI ReferenceSequence:YP_009045994.1)N端28个氨基酸，从而形成了如SEQ ID No.1所示的载体序列。即，所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明中，发明人发现当多个相同或不同的特定表位片段同时***在蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的N端、MIR区以及C端时，且在第78位和第79位氨基酸之间通过适当的氨基酸连接臂连接后，其不同组合可以不同程度地影响表位展示效果。其中部分组合可使该表位片段最大程度展现在病毒样颗粒的表面，提高cVLP的免疫学活性。

病毒样颗粒是由病毒结构蛋白自行装配而成的蛋白颗粒，缺失病毒核酸，无感染性，在结构蛋白适当位置***外源表位后，能够使抗原表位高密度重复的展示在VLP表面。因此，利用嵌合VLP技术制备疫苗具有安全高效的特点。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白装配成病毒样颗粒。

更优选地，在本发明的另一个实施方式中，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白在表达***中形成病毒样颗粒。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白在汉逊酵母中表达形成病毒样颗粒。

更优选地，在本发明的另一个实施方式中，所述由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的N端、C端的抗原表位序列如SEQ IDNo.2所示的氨基酸片段，以及***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白MIR区的抗原表位序列如SEQ ID No.3所示的氨基酸片段。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗原表位序列如SEQ ID No.3所示的表位片段通过其N末端的GILE氨基酸连接臂和C末端的L氨基酸连接臂与所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的免疫优势区的氨基酸连接，其他两个所述抗原表位序列如SEQ ID No.2所示的抗原表位片段直接与所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的N端、C端的氨基酸连接。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

更优选地，上述SEQ ID No.4所示的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白装配成病毒样颗粒。

在本发明的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗中，佐剂的选择对疫苗最终的免疫应答效果也起到至关重要的作用。理论上来说，任意合适的药用疫苗佐剂均可以实现本发明的目的。但作为优选，在本发明的实施方式中，所述佐剂包括铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、百日咳毒素(PT)、百日咳毒素B亚单位(PTB)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、皂角素QS-21、α-生育酚、角鲨烯、类脂体、脂质体(liposomes)、单磷酸类脂A(MPL-A)、MF59、类病毒颗粒脂蛋白体(Virosomes)、聚乙交酯(PLA)微球、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)微球、脂质-胆固醇(DC-Chol)、二甲基双十八基季铵溴化物(DDA)、免疫刺激复合物(ISCOM)、Montanide ISA50、MontanideISA51、MontanideISA206、Montanide ISA720、Montanide ISA系列佐剂、AS01、AS02、AS03、AS04、AS系列佐剂、胞壁酰二肽(MDP)、细菌脂多糖(OM-174)、大肠杆菌不耐热毒素(LT)、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、GM-CSF、CpG寡核苷酸、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、含有聚次黄嘌呤核苷酸(Poly I)和/或聚胞嘧啶核苷酸(Poly C)的皮卡佐剂的物质中的至少一种。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述佐剂为MF59佐剂。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗的制备方法，其特征在于，首先制备所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白经过指标检测后，与所述佐剂配伍，即得到所述疫苗。

作为优选，所述制备优选为在汉逊酵母表达***中制备。

具体地，上述制备方法可进一步包括以下步骤：

步骤A)基因的优化与合成

将同时含有氨基酸连接臂和呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白片段基因序列的蹄蝠肝炎病毒核心蛋白基因序列，按照汉逊酵母密码子的偏好性及tRNA丰度进行优化与基因合成；

步骤B)重组质粒的构建

将步骤A)中得到的基因序列替换载体PUC25-SU中的S基因序列，获得PUC25-RBRUⅡ重组质粒；

步骤C)重组多表位嵌合蛋白的表达和纯化

将步骤B)中得到的重组多表位嵌合蛋白的重组质粒，进行EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，线性化处理，电转化入NVSI-H.P-105(△URA3△LEU2)汉逊酵母菌中，获得重组体，通过ELISA方法筛选获得重组多表位嵌合蛋白高表达量的阳性菌株，发酵诱导表达，收获菌体，高压破碎，离心取上清，凝胶过滤层析纯化，即得重组多表位嵌合蛋白。

其中，步骤A)中所涉及的基因是根据嵌合蛋白的氨基酸序列设计、优化并合成的。

本发明所述疫苗可以通过任何合适的方式使用，例如皮内(i.d.)，腹膜内(i.p.)，肌肉内(i.m.)，鼻内，口服，皮下(s.c.)等及在任何合适的投递装置^[8]中使用。作为优选，本发明所述疫苗在皮内，皮下或肌肉内使用。

本发明的另一个方面，是提供了上述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗在制备预防和/或治疗由呼吸道合胞病毒感染所致疾病的药物中的用途。

作为优选，所述由呼吸道合胞病毒感染所致疾病优选为肺炎、支气管炎或哮喘。

本发明的另一个方面，是提供了上述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗在预防和/或治疗由呼吸道合胞病毒感染所致疾病中的用途。

本发明的另一个方面，是提供了一种抗体，所述抗体由上述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗免疫个体后得到。

本发明的另一个方面，是提供了一种包含编码上述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的菌株。所述菌株优选为酵母菌株。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗，疫苗中重组多表位嵌合蛋白以蹄蝠肝炎病毒核心蛋白作为外源表位呈递载体，首次进行多个呼吸道合胞病毒表位片段的非连续呈递，使抗原表位在VLP表面最大程度有效展示，使外源表位在VLP表面重复高密度的分布，并且不影响VLP的自主装配，较之单一表位的呈递具有更高的免疫效果。本发明中重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗有可作为RSV预防性疫苗的潜力。

参考文献：

[1]Groothuis J R,Gutierrez K M,Lauer B A.Respiratory syncytialvirusinfection in children with bronchopulmonary dysplasia.[J].Pediatrics,1988,82(2):199-203.

[2]Null D,Bimle C,Weisman L,et al.Palivizumab,a humanizedrespiratorysyncytial virus monoclonal antibody,reduces hospitalization fromrespiratorysyncytial virus infection in high-risk infants.The IMpact-RSVStudy Group.[J].Pediatrics,1998,102(3Pt 1):531-537.

[3]金奇.医学分子病毒学[M].科学出版社,2001.

[4]Kim H W,Canchola J G,Brandt C D,et al.Respiratory syncytialvirusdisease in infants despite prior administration of antigenic inactivatedvaccine.[J].American Journal of Epidemiology,1969,89(4):422-34.

[5]Salfeld J,Pfaff E,Noah M,et al.Antigenic determinants andfunctionaldomains in core antigen and e antigen from hepatitis B virus.[J].Journal of Virology,1989,63(2):798-808.

[6]Schickli J H,Whitacre D C,Tang R S,et al.Palivizumab epitope-displayingvirus-like particles protect rodents from RSV challenge.[J].Journalof ClinicalInvestigation,2015,125(4):1637-47.

[7]Prince G A,Curtis S J,Yim K C,et al.Vaccine-EnhancedRespiratorySyncytial Virus Disease in Cotton Rats Following Immunization withLot 100or aNewly Prepared Reference Vaccine[J].Journal of General Virology,2001,82(12):2881-8.

[8]O"Hagan D T,Valiante N M.Recent advances in the discovery anddeliveryof vaccine adjuvants[J].Nature Reviews Drug Discovery,2003,2(9):727-735.

附图说明

图1为本发明实施例中PUC25-RBRUⅠ重组质粒构建示意图；

图2为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的SDS-PAGE分析结果图，其中，M为Marker，1、2为重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的目的条带；

图3为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白cVLP的动态光散射结果图；

图4为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白经磷钨酸负染后的cVLP透射电镜图；

图5为利用本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白与帕利珠抗体结合试验结果图；

图6为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白与帕利珠抗体竞争试验结果图；

图7为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白小鼠免疫血清蛋白特异性抗体滴度结果图；

图8为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白小鼠免疫血清F蛋白特异性抗体滴度结果图；

图9为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白小鼠免疫血清中和抗体滴度结果图；

图10为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白小鼠免疫血清和甲醛灭活的RSV疫苗中和抗体滴度结果图；

图11为本发明实施例中得到的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白小鼠免疫血清和甲醛灭活的RSV疫苗亚型特异性抗体滴度结果图。

序列说明

SEQ ID No.1为本发明中蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID No.2为本发明中***在蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的C端、N端的重组呼吸道合胞病毒的表位片段的氨基酸序列；

SEQ ID No.3为本发明中***在蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的免疫优势区的重组呼吸道合胞病毒的表位片段的氨基酸序列；

SEQ ID No.4为本发明中重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件和操作过程。

实验材料：

EcoRⅠ、HindⅢ限制性内切酶以及PCR反应试剂均来自TaKaRa公司；

RSV F蛋白来自北京义翘神州生物技术有限公司，为昆虫细胞重组表达产物，冻干剂；

Super Block封闭液来自Thermo公司；

帕利珠单克隆抗体来自Medimmune公司；

山羊抗人IgG-HRP来自北京中杉金桥生物技术有限公司；

MF59佐剂来自国药中生生物技术研究院有限公司；

显色液A液、B液，终止液C液来自北京万泰生物药业股份有限公司；

BALB/c雌性小鼠来自北京维通利华实验动物技术有限公司；

PUC25-SU酵母表达质粒来自国药中生生物技术研究院有限公司；

NVSI-H.P-105(△URA3△LEU2)汉逊酵母菌种来自国药中生生物技术研究院有限公司；

RSV A2株(ATCC VR1540)来自美国菌种保藏中心(ATCC)；

Hep2细胞(ATCC CCL-23)来自美国菌种保藏中心(ATCC)；

DMEM培养基来自美国GIBCO公司；

胎牛血清来自美国GIBCO公司；

青-链霉素双抗来自美国GIBCO公司；

下述实施例中所有有关基因测序及引物合成均委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成；

下述实施例中所有有关基因合成和基因操作均委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。

下述培养基配方中的百分比均为质量体积比：

MD液体培养基：1.34％无氨基酸酵母氮源，2％葡萄糖；

MM液体培养基：1.34％无氨基酸酵母氮源，0.8％无水甲醇；

SM-leu液体培养基：1.34％无氨基酸酵母氮源，2％葡萄糖，0.01％亮氨酸；

MM-leu液体培养基：1.34％无氨基酸酵母氮源，0.8％无水甲醇，0.01％亮氨酸；

YPD液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

固体培养基为上述液体培养基中加入1.5％琼脂，高温高压灭菌，低温保存。

统计学分析方法采用SPSS 18.0版本进行。

实施例1：重组多表位嵌合蛋白酵母表达质粒的构建和鉴定

1、重组多表位嵌合蛋白的设计

以蹄蝠肝炎病毒核心蛋白氨基序列(NCBI Reference Sequence:YP_009045994.1)为参考序列，截掉参考序列的N端28个氨基酸形成如SEQ IDNO.1所示的载体序列，在SEQ ID NO.1序列的MIR区***呼吸道合胞病毒融合蛋白(Genebank:ACO83301.1)的表位(SEQ ID NO.3所示)，该表位即呼吸道合胞病毒融合蛋白第254-277位氨基酸表位，即帕利珠抗体的结合位置，通过“GILE”和“L”氨基酸连接臂串联而成，同时，分别在蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的N端、C端同时***与之不同的表位(SEQ ID NO.2所示)，即呼吸道合胞病毒嵌合蛋白第163-181位氨基酸表位，形成如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

2、基因优化和合成

根据SEQ ID NO.4所示的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的氨基酸序列，按照汉逊酵母密码子的偏好性及tRNA丰度进行基因序列的优化，形成基因序列，将该序列进行全基因合成。

3、表达质粒的构建

利用基因重组技术将基因序列替换表达载体PUC25-SU酵母表达质粒中S基因，形成酵母表达质粒，质粒以汉逊酵母基因组上25S rDNA为同源重组整合臂，以URA3基因为标记基因，以MOX启动子高效启动目的蛋白表达，质粒构建图如图1所示。

4、表达质粒的酶切鉴定和基因序列测定

对包含重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的酵母表达质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，37℃，酶切1小时，酶切体系如表1所示，将酶切后的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见该质粒可酶切出两条基因片段，分别约为4kb的大片段和1.5kb的小片段，大片段即为包含有重组多表位嵌合蛋白目的基因的酵母表达框，将该质粒进行基因序列测定，结果显示与预期结果一致，无目的基因改变。

表1酶切体系

实施例2：高表达阳性酵母菌株的筛选和鉴定

1、转化

将NVSI-H.P-105(△URA3△LEU2)汉逊酵母菌培养于YPD液体培养基中，菌体密度(OD₆₀₀)达到1.0时，进行酵母感受态的制备，将经过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的重组多表位嵌合蛋白酵母表达质粒中大片段基因通过电转化方式转化入NVSI-H.P-105酵母菌内，最终将转化菌液涂布于SM-leu固体培养基上，37℃培养3天，获得转化重组体。

2、ELISA筛选

挑取SM-leu固体培养基上生长的单克隆菌落于2ml SM-leu液体培养基中，进行菌体培养，37℃，220rpm振荡培养24小时。取200μl菌液转接于4ml SM-leu液体培养基中继续培养，待菌体密度(OD₆₀₀)达到10以上后，3000rpm离心收获菌体，弃掉培养上清，将菌体重悬于4ml MM-leu培养基中进行菌体培养，此阶段每隔6小时加入1％无水甲醇，诱导目的蛋白的表达，诱导24小时；离心收获菌体并加入200μl酵母菌体破碎缓冲液(20mM PB，pH7.2)及200mg玻璃珠，高频低温振荡破碎，利用包被液(Na₂CO₃-NaHCO₃溶液，pH9.6)将蛋白上清液稀释500倍包被于酶标板上，100μl/孔，4℃包被8小时；加入含有1％BSA的PBS，100μl/孔，37℃封闭3小时；将帕利珠抗体稀释至1μg/ml，100μl/孔，37℃，1小时；将山羊抗人IgG-HRP稀释10000倍，100μl/孔，37℃，1小时；加入50μl显色液A和50μl显色液B，室温显色10分钟，加入50μl终止液C；在波长为450nm和630nm波长下读取OD值，选择OD值最高的菌株作为重组多表位嵌合蛋白高表达酵母菌株。由于筛选到的酵母菌株仅补充了URA3基因，仅能在补充有亮氨酸的培养基中生长，因此将LEU2基因转化入筛选到的酵母菌内，使该菌株可在MD基础培养基中生长。

3、菌种目的基因鉴定

提取重组多表位嵌合蛋白高表达酵母菌株基因组，对目的基因进行序列测定，目的基因无改变。

实施例3：cVLP的制备和鉴定

1、酵母发酵及菌体破碎

将实施例2中筛选得到的重组多表位嵌合蛋白高表达酵母菌种接种于10ml的MD液体培养基中振荡培养24小时，再转接于100mlMD液体培养基中扩大培养24小时，制备发酵种子，接种于5L发酵罐内进行酵母菌发酵培养，并利用甲醇进行目的蛋白的诱导表达。发酵结束后，利用生理盐水洗涤菌体2次，最终将菌体重悬于破碎缓冲液(20mM PB,50mM NaCl,pH7.2)中进行高压破碎，离心取蛋白上清液。

2、目的蛋白纯化及SDS-PAGE检测

采用AKTA色谱纯化仪(GE AKTA explorer)进行凝胶过滤层析纯化，介质选择Sephacryl S500-HR，柱体积为900ml。以3倍柱体积的平衡缓冲液(50mMPB，0.2M Nacl，pH7.3)平衡层析柱后，将100ml蛋白粗纯液按照5ml/min泵速泵入层析柱中，上样结束后，平衡缓冲液继续流穿层析柱。待缓冲液到2/3柱体积时(约为550ml处)出现第二个吸收峰，收集此吸收峰蛋白，即为目的蛋白。

将纯化后的目的蛋白进行12％SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示，目的蛋白带分子量大小约为30kD，与预期大小基本一致。

3、cVLP的动态光散射及透射电镜观察

将纯化后的蛋白进行动态光散射(Malvern，NANO-ZS90)分析，结果如图3所示，结果显示重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白cVLP大小均一性良好，平均水合粒径约为50nm。将目的蛋白滴于300目的镀炭铜网膜上，吸附5分钟，磷钨酸负染1分钟，透射电镜(HITACHI,JEM-1400)观察样品的颗粒形态，结果如图4所示，可见cVLP大小在30-40nm之间，大小均一，形态良好。

实施例4：重组多表位嵌合蛋白与帕利珠抗体的结合试验和竞争试验

1、帕利珠抗体结合试验

以0.5μg/ml的纯化后重组多表位嵌合蛋白、RBHV载体蛋白和F蛋白作为包被原，测定重组多表位嵌合蛋白与帕利珠抗体的结合能力。

使用包被液将纯化后的重组多表位嵌合蛋白、RBHV载体蛋白和F蛋白稀释至0.5μg/ml，100μl/孔包被酶标板，4℃，8h。使用Super Block溶液进行封闭，37℃封闭3h，将帕利珠抗体作为一抗，以0.1μg/ml初始浓度进行2倍梯度稀释，37℃孵育1.5h，1：10000比例稀释的山羊抗人IgG-HRP抗体作为二抗，37℃孵育1h，显色，在波长为450nm和630nm下读取吸光度(Optical Density,OD)值。结果如图5所示，重组多表位嵌合蛋白显示出较好的帕利珠抗体结合能力，且同等剂量下较F蛋白稍强，提示重组多表位嵌合蛋白具有较好的表位展示效果。

2、与RSV F蛋白帕利珠抗体竞争试验

以0.5μg/ml的F蛋白作为包被原，测定重组多表位嵌合蛋白与F蛋白竞争结合帕利珠抗体的能力。

使用包被液将RSV F蛋白稀释至0.5μg/ml，100μl/孔包被酶标板，4℃，8h。使用Super Block溶液封闭酶标板，37℃封闭3h。利用Super Block溶液将重组多表位嵌合蛋白以及相应载体RBHV蛋白稀释至80μg/ml，然后进行2倍梯度稀释，与等体积的含有0.1μg/ml帕利珠抗体稀释液混合，100μl/孔，每个稀释度做3个复孔，37℃，1.5h。将1：10000比例稀释的山羊抗人IgG-HRP抗体作为二抗，37℃，1h，显色，在波长为450nm和630nm下读取OD值。计算重组多表位嵌合蛋白以及相应载体RBHV蛋白的帕利珠抗体抑制率(Inhibition index)，抑制率＝[(帕利珠抗体OD值－样品OD值)/帕利珠抗体OD值]×100％，即抑制率＝(1—样品OD值/帕利珠抗体OD值)×100％。结果如图6所示，重组多表位嵌合蛋白显示出与F蛋白的帕利珠抗体竞争活性，且呈现一定的剂量关系，随着蛋白浓度的降低，F蛋白竞争抑制率降低。

实施例5：重组多表位嵌合疫苗制备与免疫

1、疫苗制备

重组多表位嵌合蛋白经0.22μm过滤除菌后测定原液蛋白浓度。将重组多表位嵌合蛋白稀释至200μg/ml，按免疫用量取一定体积的重组多表位嵌合蛋白与等体积的MF59佐剂混合制备疫苗，避光室温缓慢颠倒混合20min。

2、疫苗免疫

取6-8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠24只，随机分成A、B、C 3组，每组8只。分别按下列设计方案免疫接种：A组注射重组多表位嵌合疫苗，0.3ml/只；B组注射0.5μg F蛋白(150μl)与等体积MF59佐剂混合物作为阳性对照，0.3ml/只；C组注射生理盐水(150μl)与等体积的MF59佐剂混合物作为佐剂对照，0.3ml/只。采取腹腔途径免疫，各组均免疫3次，间隔2周。末次免疫结束后两周，断锥采血并分离血清。

实施例6：重组多表位嵌合疫苗的免疫学评价

1、蛋白特异性抗体检测

以重组多表位嵌合蛋白作为包被原，利用间接ELISA法检测小鼠免疫血清中蛋白特异性抗体。

使用包被液将重组多表位嵌合蛋白和F蛋白稀释至0.1μg/ml，100μl/孔包被于酶标板中，4℃，8h。使用Super Block溶液进行封闭，37℃封闭3h，使用SuperBlock将待检血清3倍梯度稀释，37℃孵育1.5h，1：10000比例稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP抗体作为二抗，37℃孵育1h，显色。在波长为450nm和630nm下读取OD值，以高于Cut-off值(阴性对照OD均值+2倍标准差(StandardDeviation，SD))的血清最大稀释倍数为血清cVLP特异性抗体滴度，结果用抗体几何平均滴度(Geometric Mean Titer,GMT)和95％置信区间(ConfidenceInterval，CI)表示，采用双侧独立样本t检验进行组间差异检验。结果如图7所示，重组多表位嵌合疫苗免疫血清的蛋白特异性抗体几何平均滴度为5.66Log10，F蛋白MF59免疫血清的蛋白特异性抗体几何平均滴度为5.34Log10，结果显示重组多表位嵌合疫苗免疫小鼠后产生较高水平的蛋白特异性抗体。

2、RSV F蛋白特异性抗体检测

以0.1μg/ml的F蛋白作为包被原，利用间接ELISA法检测小鼠免疫血清中RSV F蛋白特异性抗体。

使用包被液将F蛋白稀释至0.1μg/ml，100μl/孔包被酶标板，4℃，8h。使用SuperBlock溶液进行封闭，37℃封闭3h，使用Super Block将待检血清3倍梯度稀释，37℃孵育1.5h，1：10000比例稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP抗体作为二抗，37℃孵育1h，显色。在波长为450nm和630nm下读取OD值，以高于Cut-off值(阴性对照OD均值+2SD)的血清最大稀释倍数为血清F蛋白特异性抗体滴度，结果用GMT和95％CI表示，采用双侧独立样本t检验进行组间差异检验。结果如图8所示，重组多表位嵌合疫苗免疫血清的F蛋白特异性抗体几何平均滴度为2.94Log10，结果显示重组多表位嵌合疫苗免疫Balb/c小鼠后可产生一定水平的F蛋白特异性抗体。

3、免疫血清的中和抗体滴度检测

利用微量中和试验方法检测免疫血清中RSV A2株特异性中和抗体滴度，结果如图9所示，重组多表位嵌合疫苗免疫血清的中和抗体滴度为9.875Log2，说明疫苗免疫Balb/c小鼠后可产生高水平的RSV特异性中和抗体，提示本发明重组多表位嵌合疫苗有可作为RSV预防性疫苗的潜力。

实施例7：重组多表位嵌合疫苗与甲醛灭活疫苗比较

1、甲醛灭活疫苗、重组多表位嵌合疫苗制备与免疫

使用Hep2细胞培养RSV A2株，37℃培养3天后收获病毒。依据Lot100方法^[7]制备甲醛灭活RSV疫苗(Formalin-inactivated RSV,FI-RSV)，制备完成后，4℃留存待用。按照实施例5所述的方法制备重组多表位嵌合疫苗。

取6-8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠24只，随机分成A、B、C 3组，每组8只。分别按下列设计方案免疫接种：A组注射重组多表位嵌合疫苗，0.3ml/只；B组注射FI-RSV，0.1ml/只；C组注射生理盐水(150μl)与等体积的MF59佐剂混合物作为佐剂对照，0.3ml/只。采取腹腔途径免疫，各组均免疫3次，间隔2周。末次免疫结束后两周，断锥采血并分离血清。

2、免疫血清的中和抗体滴度检测

按照实施例6中所述的方法检测RSV A2株特异性中和抗体滴度，结果如图10所示，重组多表位嵌合疫苗免疫血清的中和抗体滴度为10.00Log2，FI-RSV免疫血清的中和抗体滴度为6.0Log2，具有显著性差异(P＜0.001)，说明相较甲醛灭活疫苗，重组蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠产生高水平的RSV特异性中和抗体。

3、免疫血清的IgG1和IgG2a抗体亚型分析

以F蛋白作为包被原，利用间接ELISA法检测小鼠免疫血清中RSV F蛋白特异性IgG、IgG2a抗体。

使用包被液将F蛋白稀释至0.1μg/ml，100μl/孔包被酶标板，4℃，8h。使用SuperBlock溶液进行封闭，37℃封闭3h，使用Super Block将待检血清3倍梯度稀释，37℃孵育1.5h，1：10000比例稀释的山羊抗小鼠IgG1-HRP、山羊抗小鼠IgG2a-HRP抗体分别作为二抗，37℃孵育1h，显色。在450nm/630nm双波长下读取OD值，以高于Cut-off值(阴性对照OD均值+2SD)的血清最大稀释倍数为血清F蛋白特异性IgG1和IgG2a抗体滴度，结果用GMT和95％置信区间CI表示。结果如图11所示，重组多表位嵌合疫苗免疫血清中IgG1及IgG2a亚型抗体滴度水平较FI-RSV疫苗而言较为均衡，提示疫苗免疫后产生了较为平衡的Th1和Th2细胞免疫反应，一定程度上可以规避免疫病理风险，具有较好的安全性。

对比例1：本发明重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗(非连续多表位)与专利(申请号201710111683.1)中cVLP免疫学活性比较分析

1、帕利珠抗体结合试验

按照实施例1的设计方案，按照实施例2和3所述的方法制备单表位嵌合蛋白RBHV-cVLP，按照实施例4中的帕利珠抗体结合试验方法，使用包被液将纯化后的RBHV-cVLP稀释至0.5μg/ml，100μl/孔包被酶标板，4℃，8h。使用Super Block溶液进行封闭，37℃封闭3h，将帕利珠抗体作为一抗，以0.1μg/ml初始浓度进行2倍梯度稀释，37℃孵育1.5h，1：10000比例稀释的山羊抗人IgG-HRP抗体作为二抗，37℃孵育1h，显色。结果如图5所示，与单表位嵌合蛋白RBHV-cVLP一样，重组多表位嵌合蛋白显示出良好的帕利珠抗体结合能力，提示N端、C端外源表位的嵌入不影响颗粒的组装特性。

2、与RSV F蛋白帕利珠抗体竞争试验

按照实施例1的设计方案，按照实施例1、2和3所述的方法制备，按照实施例最终得到单表位嵌合蛋白RBHV-cVLP，按照实施例4中的帕利珠抗体竞争试验方法，使用包被液将RSV F蛋白稀释至0.5μg/ml，100μl/孔包被酶标板，4℃，8h。使用Super Block溶液封闭酶标板，37℃封闭3h。利用Super Block溶液将RBHV-cVLP稀释至80μg/ml，然后进行2倍梯度稀释，与等体积的含有0.1μg/ml帕利珠抗体稀释液混合，100μl/孔，每个稀释度做3个复孔，37℃，1.5h。将1：10000比例稀释的山羊抗人IgG-HRP抗体作为二抗，37℃，1h，显色。计算RBHV-cVLP的帕利珠抗体抑制率。结果如图6所示，与单表位嵌合蛋白RBHV-cVLP一样，重组多表位嵌合蛋白显示出良好的与F蛋白帕利珠抗体竞争活性。

3、免疫血清的中和抗体滴度检测

按照实施例1的设计方案，按照实施例1、2和3所述的方法分别制备，最终得到单表位嵌合蛋白RBHV-cVLP，按照实施例5中的疫苗制备及动物免疫方法，增加D组注射30μg(150μL)的RBHV-cVLP与等体积的MF59佐剂的混合物，采取腹腔途径免疫，各组均免疫3次，间隔2周。各组小鼠免疫后每日观察小鼠状态和体重变化。免疫后两周，断锥采血并分离血清，利用病毒微量中和试验方法检测血清中RSV特异性中和抗体滴度水平。结果如图9所示，本发明重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的RSV特异性中和抗体滴度约为9.875Log2，而RBHV-cVLP的RSV特异性中和抗体滴度约为8.0Log2，本发明重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白吸附MF59佐剂后产生的中和抗体水平较RBHV-cVLP提高了3倍。

以上结果提示本发明重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗在免疫效果上具有明显优势，本发明的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗有可作为RSV预防性疫苗的潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 国药中生生物技术研究院有限公司

<120> 一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用

<130> None

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 189

<212> PRT

<213> Virus

<400> 1

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu

20 25 30

Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Pro Leu

65 70 75 80

Ile Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg

85 90 95

Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln

100 105 110

Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Thr Arg Ser

145 150 155 160

Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro

165 170 175

Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys

180 185

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> Virus

<400> 2

Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val

1 5 10 15

Val Ser Leu

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> Virus

<400> 3

Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp

1 5 10 15

Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn

20

<210> 4

<211> 256

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 4

Met Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala

1 5 10 15

Val Val Ser Leu Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser

20 25 30

Gln Leu Ile Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu

35 40 45

Leu Val Glu Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys

50 55 60

Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys

65 70 75 80

Trp Gly Glu Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu

85 90 95

Gly Gly Ile Leu Glu Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met

100 105 110

Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Leu Pro Leu

115 120 125

Ile Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg

130 135 140

Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln

145 150 155 160

Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr

165 170 175

Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

180 185 190

Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Thr Arg Ser

195 200 205

Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro

210 215 220

Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys Glu Val Asn

225 230 235 240

Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu

245 250 255

Claims

1.一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗包含重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白，其特征在于，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗，其特征在于，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白装配成病毒样颗粒。

3.根据权利要求1所述的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗，其特征在于，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗还包括佐剂。

4.根据权利要求3所述的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗，其特征在于，所述佐剂为选自铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、百日咳毒素(PT)、百日咳毒素B亚单位(PTB)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、皂角素QS-21、α-生育酚、角鲨烯、类脂体、脂质体(liposomes)、单磷酸类脂A(MPL-A)、MF59、类病毒颗粒脂蛋白体(Virosomes)、聚乙交酯(PLA)微球、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)微球、脂质-胆固醇(DC-Chol)、二甲基双十八基季铵溴化物(DDA)、免疫刺激复合物(ISCOM)、Montanide ISA50、MontanideISA51、Montanide ISA206、Montanide ISA720、Montanide ISA系列佐剂、AS01、AS02、AS03、AS04、AS系列佐剂、胞壁酰二肽(MDP)、细菌脂多糖(OM-174)、大肠杆菌不耐热毒素(LT)、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、GM-CSF、CpG寡核苷酸、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、含有聚次黄嘌呤核苷酸(Poly I)和/或聚胞嘧啶核苷酸(Poly C)的皮卡佐剂的物质中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗，其特征在于，所述佐剂为MF59佐剂。

6.一种如权利要求1-5中任意一项所述的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗的制备方法，其特征在于，首先制备所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白，所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白经过指标检测后，与佐剂配伍，即得到所述疫苗。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备所述重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白为在汉逊酵母表达***中制备。

8.如权利要求1-5中任意一项所述的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗在制备预防和/或治疗由呼吸道合胞病毒感染所致疾病的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述由呼吸道合胞病毒感染所致疾病为肺炎、支气管炎或哮喘。

10.一种包含编码如权利要求1-5中的任意一项所述的重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合蛋白的菌株。