CN106902040A - 一种用于细胞修复的植物提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于细胞修复的植物提取物及其制备方法和应用，所述的植物提取物通过采用稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液和燕麦肽提取液为原料并进行适合重量配比，制备得到的植物提取物能够有效促进细胞增殖，从而可以通过细胞的生长来达到修复细胞的功效；促进细胞迁移，从而修复受损细胞，同时还能有效促进胶原蛋白生成的功效，无副作用，可以作为护肤品的细胞修复的功能添加剂，具有广泛的应用前景。

Description

一种用于细胞修复的植物提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于护肤品技术领域，具体涉及一种用于细胞修复的植物提取物及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤组织的损伤常由机械性、物理性、化学性和生物性等因素引起，机体对形成的损伤进行修补的过程称为组织修复。传统理论上将组织损伤修复过程分为炎症期、肉芽组织形成期和组织塑型期；但随着分子生物学的发展，对组织损伤修复的认识逐步深入，有关组织修复过程目前又被看做是各种修复细胞的增殖、分化、迁移、调亡和消失的过程。同时，组织修复还是一系列不同类型的修复细胞、结构蛋白和生长因子等形成网络式交互作用的结果。由损伤周围的同种细胞进行结构和功能修复称为再生，若完全恢复伤前组织的结构和功能，称为完全再生；由纤维***来修复，称为纤维修复或瘢痕修复。
细胞因子对于创口愈合有重要的作用，这些细胞通过不同的机制对创口炎症反应、上皮再生、肉芽组织形成、血管形成和细胞外基质的产生有重要作用。组织损伤后的修复过程涉及多种生长因子复杂的相互作用，与组织损伤修复关系较为密切的有转化生长因子(TGF)-β、血小板衍生生长因子(PDGF)、***(IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等。这些生长因子在组织损伤修复过程中形成一个复杂的网络，它们在时间和空间上相互作用，并调节着细胞的增殖、分化和迁移以及血管生成、组织连接和相关基因的表达。皮肤组织损伤创面愈合是动态、有序的过程。
现有技术中的护肤品主要作用是保湿、美白、抗皱、祛斑等，具有细胞修复再生功能且效果显著的护肤品基本没有。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种用于细胞修复的植物提取物及其制备方法和应用。该植物提取物能够促进细胞增殖、促进细胞迁移、修复受损细胞、促进胶原蛋白生成的功效，无副作用，可以作为护肤品的细胞修复的功能添加剂，具有广泛的应用前景。
本发明所采用的技术方案为：
一种用于细胞修复的植物提取物，原料组分包括：
稻米发酵液，0.1-0.3重量份；
马鞭草叶提取液，0.4-0.6重量份；
仙人掌提取液，0.6-0.8重量份；
松藻提取液，0.6–0.8重量份；
燕麦肽提取液，0.4-0.6重量份。
所述稻米发酵液采用如下方法制备得到：
(A1)取稻米，加水浸泡后，蒸熟，得到熟制米饭；
(A2)向步骤(A1)中所述熟制米饭中接种米曲霉，所述米曲霉的接种质量占所述熟制米饭质量的1-3％，之后在温度为25-35℃、湿度为40-65％的条件下进行培育48-55h，经离心、过滤，即得所述稻米发酵液。
所述马鞭草叶提取液采用如下方法制备得到：
(B1)取马鞭草叶，经干燥、粉碎，得到马鞭草叶细粉；
(B2)向步骤(B1)中的马鞭草叶细粉中第一次加入乙醇，并在85-90℃进行回流提取1.5-2.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；向所述第一滤渣中第二次加入乙醇并在75-85℃进行回流提取2.5-3.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，浓缩除去乙醇后进行微孔过滤，即得所述马鞭草叶提取液。
步骤(B1)中，所述马鞭草叶细粉的粒径为90-110目；
步骤(B2)中，两次添加乙醇的体积浓度均为70-90％；所述马鞭草叶细粉的质量与第一次添加乙醇的体积之比为1:15-1:20g/ml，所述第一滤渣的质量与第二次添加乙醇的体积之比为1:15-1:20g/ml；
所述浓缩为水浴浓缩，所述浓缩的温度为35-45℃，进行所述微孔过滤的滤膜孔径为0.4-0.5μm。
所述仙人掌提取液采用如下方法制备得到：
(C1)取仙人掌，去皮后打碎成浆，得到仙人掌浆液；
(C2)向步骤(C1)中的仙人掌浆液中加入乙醇，浸泡1-1.5h后，离心、过滤，得到固形物；向所述固形物中第一次加入蒸馏水，浸泡20-40min后，在85-95℃进行回流提取1-1.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并在85-95℃进行回流提取1-1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，浓缩除去蒸馏水后进行微孔过滤，即得所述仙人掌提取液。
步骤(C2)中，所述乙醇与所述仙人掌浆液的质量比为0.5:1-1.5:1，所述乙醇的体积浓度为70-90％；
所述固形物与第一次添加蒸馏水的质量比为1:12-1:18；所述第一滤渣与第二次添加蒸馏水的质量比为1:12-1:18；
所述浓缩为水浴浓缩，所述浓缩的温度为85-95℃，进行所述微孔过滤的滤膜孔径为0.4-0.5μm。
所述松藻提取液采用如下方法制备得到：
(D1)取松藻，经干燥、粉碎，得到松藻细粉；
(D2)向步骤(D1)中的松藻细粉中第一次加入蒸馏水，并在85-95℃进行回流提取2-3h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并在85-95℃进行回流提取1-1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液；
(D3)将步骤(D2)所述混合滤液浓缩至原体积的1/2-1/3后，加入2-3倍体积的无水乙醇，搅拌，静置过夜，抽滤，滤液进行微孔过滤，即得所述松藻提取液；
所述燕麦肽提取液采用如下方法制备得到：
(E1)取燕麦籽，经粉碎、脱脂、干燥后，得到燕麦籽细粉；
(E2)向步骤(E1)所述的燕麦籽细粉中第一次加入Tris-HCl缓冲液，在25-35℃进行提取0.5–1.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；向所述第一滤渣中第二次加入Tris-HCl缓冲液并在25-35℃进行提取1–1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液，向所述混合滤液中加入三氯乙酸，充分混合均匀后，在3-8℃进行离心，收集上清液即得所述燕麦肽提取液。
步骤步骤(D1)中，所述松藻细粉的粒径为90-110目；
步骤(D2)中，所述松藻细粉的质量与第一次添加蒸馏水的体积之比为1:20-1:30g/ml，所述第一滤渣的质量与第二次添加蒸馏水的体积之比为1:20-1:30g/ml；
步骤(D3)中，所述浓缩为水浴浓缩，所述浓缩的温度为85-95℃，进行所述微孔过滤的滤膜孔径为0.4-0.5μm。
步骤(E1)中，采用正己烷进行所述脱脂处理，所述正己烷与所述燕麦籽的质量比为1:1-2:1；所述燕麦籽细粉的粒径为35-45目；
步骤(E2)中，所述燕麦籽细粉与第一次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:15-1:20g/ml；所述第一滤渣与第二次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:15-1:20g/ml；
所述三氯乙酸与所述混合滤液的体积比为1:1-2:1。
所述的用于细胞修复的植物提取物的制备方法，具体步骤为：
分别取所述稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液和燕麦肽提取液，充分混合均匀，即得所述植物提取物。
所述植物提取物在制备用于细胞修复的护肤品中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明所述的用于细胞修复的植物提取物，通过采用稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液和燕麦肽提取液为原料并进行适合重量配比，制备得到的植物提取物能够有效促进细胞增殖，从而可以通过细胞的生长来达到修复细胞的功效；促进细胞迁移，从而修复受损细胞，同时还能有效促进胶原蛋白生成的功效，无副作用，可以作为护肤品的细胞修复的功能添加剂，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面实施例中以1重量份代表1mg。
实施例1
本实施例提供一种用于细胞修复的植物提取物，原料组分包括：
稻米发酵液，0.1重量份；
马鞭草叶提取液，0.6重量份；
仙人掌提取液，0.6重量份；
松藻提取液，0.8重量份；
燕麦肽提取液，0.4重量份。
进一步，所述用于细胞修复的植物提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备稻米发酵液
(A1)取稻米，加入1倍质量水进行浸泡12h后，蒸熟，得到熟制米饭；
(A2)向步骤(A1)中所述熟制米饭中接种米曲霉(日本酿造工业株式会社提供)，所述米曲霉的接种质量占所述熟制米饭质量的1％，之后在温度为25℃、湿度为40％的条件下进行培育48h，经离心、过滤，即得所述稻米发酵液；
(2)制备马鞭草叶提取液
(B1)取马鞭草叶，经干燥、粉碎，得到粒径为90目马鞭草叶细粉；
(B2)向步骤(B1)中的马鞭草叶细粉中第一次加入体积浓度为70％乙醇，并控制所述马鞭草叶细粉的质量与添加乙醇的体积之比为1:15g/ml，之后在85℃进行回流提取2.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入体积浓度为70％乙醇，并控制所述第一滤渣的质量与第二次添加乙醇的体积之比为1:15g/ml，之后在75℃进行回流提取3.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，35℃水浴条件下进行浓缩除去乙醇浓缩，之后用孔径为0.4μm滤膜进行微孔过滤，即得所述马鞭草叶提取液；
(3)制备仙人掌提取液
(C1)取仙人掌，去皮后紫外杀菌，并打碎成浆，得到仙人掌浆液；
(C2)向步骤(C1)中的仙人掌浆液中加入体积浓度为70％乙醇，并控制所述乙醇与所述仙人掌浆液的质量比为0.5:1，浸泡1h后，离心、过滤，得到固形物；
向所述固形物中第一次加入蒸馏水并控制所述固形物与添加蒸馏水的质量比为1:12，浸泡20min后，在85℃进行回流提取1.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并控制所述第一滤渣与第二次添加蒸馏水的质量比为1:12，之后在85℃进行回流提取1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，85℃水浴条件下进行浓缩除去蒸馏水，之后用孔径为0.4μm滤膜进行微孔过滤，即得所述仙人掌提取液；
(4)制备松藻提取液
(D1)取松藻，经干燥、粉碎，得到粒径为90目的松藻细粉；
(D2)向步骤(D1)中的松藻细粉中第一次加入蒸馏水并控制所述松藻细粉与第一次添加蒸馏水的质量比为1:20g/ml，之后在85℃进行回流提取3h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并控制所述第一滤渣与第二次添加蒸馏水的质量比为1:20g/ml，之后在85℃进行回流提取1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液；
(D3)将步骤(D2)所述混合滤液在85℃水浴条件下进行浓缩至原体积的1/2后，加入2倍体积的无水乙醇，搅拌，静置过夜，抽滤，滤液采用孔径为0.4μm滤膜进行微孔过滤，即得所述松藻提取液；
(5)所述燕麦肽提取液采用如下方法制备得到：
(E1)取燕麦籽，经粉碎、正己烷脱脂、干燥后，得到粒径为35目燕麦籽细粉；其中，进行所述脱脂处理时，所述正己烷与所述燕麦籽的质量比为1:1；
(E2)向步骤(E1)所述的燕麦籽细粉中第一次加入Tris-HCl缓冲液并控制所述燕麦籽细粉与第一次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:15g/ml，之后在25℃进行提取1.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入Tris-HCl缓冲液并控制所述第一滤渣与第二次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:15g/ml，之后在25℃进行提取1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液，向所述混合滤液中加入三氯乙酸，所述三氯乙酸与所述混合滤液的体积比为1:1，充分混合均匀后，在3℃进行离心，收集上清液即得所述燕麦肽提取液。
(6)分别取所述稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液和燕麦肽提取液，充分混合均匀，即得所述植物提取物。
实施例2
本实施例提供一种用于细胞修复的植物提取物，原料组分包括：
稻米发酵液，0.3重量份；
马鞭草叶提取液，0.4重量份；
仙人掌提取液，0.8重量份；
松藻提取液，0.6重量份；
燕麦肽提取液，0.6重量份。
进一步，所述用于细胞修复的植物提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备稻米发酵液
(A1)取稻米，加入2倍质量水进行浸泡14h后，蒸熟，得到熟制米饭；
(A2)向步骤(A1)中所述熟制米饭中接种米曲霉(日本酿造工业株式会社提供)，所述米曲霉的接种质量占所述熟制米饭质量的3％，之后在温度为35℃、湿度为60％的条件下进行培育55h，经离心、过滤，即得所述稻米发酵液；
(2)制备马鞭草叶提取液
(B1)取马鞭草叶，经干燥、粉碎，得到粒径为110目马鞭草叶细粉；
(B2)向步骤(B1)中的马鞭草叶细粉中第一次加入体积浓度为90％乙醇，并控制所述马鞭草叶细粉的质量与添加乙醇的体积之比为1:20g/ml，之后在90℃进行回流提取1.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入体积浓度为90％乙醇，并控制所述第一滤渣的质量与第二次添加乙醇的体积之比为1:20g/ml，之后在85℃进行回流提取2.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，45℃水浴条件下进行浓缩除去乙醇浓缩，之后用孔径为0.5μm滤膜进行微孔过滤，即得所述马鞭草叶提取液；
(3)制备仙人掌提取液
(C1)取仙人掌，去皮后紫外杀菌，并打碎成浆，得到仙人掌浆液；
(C2)向步骤(C1)中的仙人掌浆液中加入体积浓度为90％乙醇，并控制所述乙醇与所述仙人掌浆液的质量比为1.5:1，浸泡1.5h后，离心、过滤，得到固形物；
向所述固形物中第一次加入蒸馏水并控制所述固形物与添加蒸馏水的质量比为1:18，浸泡40min后，在95℃进行回流提取1h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并控制所述第一滤渣与第二次添加蒸馏水的质量比为1:18，之后在95℃进行回流提取1h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，95℃水浴条件下进行浓缩除去蒸馏水，之后用孔径为0.5μm滤膜进行微孔过滤，即得所述仙人掌提取液；
(4)制备松藻提取液
(D1)取松藻，经干燥、粉碎，得到粒径为110目的松藻细粉；
(D2)向步骤(D1)中的松藻细粉中第一次加入蒸馏水并控制所述松藻细粉与第一次添加蒸馏水的质量比为1:30g/ml，之后在95℃进行回流提取2h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并控制所述第一滤渣与第二次添加蒸馏水的质量比为1:30g/ml，之后在95℃进行回流提取1h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液；
(D3)将步骤(D2)所述混合滤液在95℃水浴条件下进行浓缩至原体积的1/3后，加入3倍体积的无水乙醇，搅拌，静置过夜，抽滤，滤液采用孔径为0.5μm滤膜进行微孔过滤，即得所述松藻提取液；
(5)所述燕麦肽提取液采用如下方法制备得到：
(E1)取燕麦籽，经粉碎、正己烷脱脂、干燥后，得到粒径为45目燕麦籽细粉；其中，进行所述脱脂处理时，所述正己烷与所述燕麦籽的质量比为2:1；
(E2)向步骤(E1)所述的燕麦籽细粉中第一次加入Tris-HCl缓冲液并控制所述燕麦籽细粉与第一次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:20g/ml，之后在35℃进行提取0.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入Tris-HCl缓冲液并控制所述第一滤渣与第二次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:20g/ml，之后在35℃进行提取1h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液，向所述混合滤液中加入三氯乙酸，所述三氯乙酸与所述混合滤液的体积比为2:1，充分混合均匀后，在8℃进行离心，收集上清液即得所述燕麦肽提取液。
(6)分别取所述稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液和燕麦肽提取液，充分混合均匀，即得所述植物提取物。
实施例3
本实施例提供一种用于细胞修复的植物提取物，原料组分包括：
稻米发酵液，0.2重量份；
马鞭草叶提取液，0.5重量份；
仙人掌提取液，0.7重量份；
松藻提取液，0.7重量份；
燕麦肽提取液，0.5重量份。
进一步，所述用于细胞修复的植物提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备稻米发酵液
(A1)取稻米，加入1.5倍质量水进行浸泡13h后，蒸熟，得到熟制米饭；
(A2)向步骤(A1)中所述熟制米饭中接种米曲霉(日本酿造工业株式会社提供)，所述米曲霉的接种质量占所述熟制米饭质量的2％，之后在温度为30℃、湿度为50％的条件下进行培育52h，经离心、过滤，即得所述稻米发酵液；
(2)制备马鞭草叶提取液
(B1)取马鞭草叶，经干燥、粉碎，得到粒径为100目马鞭草叶细粉；
(B2)向步骤(B1)中的马鞭草叶细粉中第一次加入体积浓度为80％乙醇，并控制所述马鞭草叶细粉的质量与添加乙醇的体积之比为1:18g/ml，之后在87℃进行回流提取2h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入体积浓度为80％乙醇，并控制所述第一滤渣的质量与第二次添加乙醇的体积之比为1:18g/ml，之后在80℃进行回流提取3h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，40℃水浴条件下进行浓缩除去乙醇浓缩，之后用孔径为0.45μm滤膜进行微孔过滤，即得所述马鞭草叶提取液；
(3)制备仙人掌提取液
(C1)取仙人掌，去皮后紫外杀菌，并打碎成浆，得到仙人掌浆液；
(C2)向步骤(C1)中的仙人掌浆液中加入体积浓度为80％乙醇，并控制所述乙醇与所述仙人掌浆液的质量比为1:1，浸泡1.2h后，离心、过滤，得到固形物；
向所述固形物中第一次加入蒸馏水并控制所述固形物与添加蒸馏水的质量比为1:15，浸泡30min后，在90℃进行回流提取1.2h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并控制所述第一滤渣与第二次添加蒸馏水的质量比为1:15，之后在90℃进行回流提取1.2h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，90℃水浴条件下进行浓缩除去蒸馏水，之后用孔径为0.45μm滤膜进行微孔过滤，即得所述仙人掌提取液；
(4)制备松藻提取液
(D1)取松藻，经干燥、粉碎，得到粒径为100目的松藻细粉；
(D2)向步骤(D1)中的松藻细粉中第一次加入蒸馏水并控制所述松藻细粉与第一次添加蒸馏水的质量比为1:25g/ml，之后在90℃进行回流提取2.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并控制所述第一滤渣与第二次添加蒸馏水的质量比为1:25g/ml，之后在90℃进行回流提取1.2h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液；
(D3)将步骤(D2)所述混合滤液在90℃水浴条件下进行浓缩至原体积的1/2后，加入2倍体积的无水乙醇，搅拌，静置过夜，抽滤，滤液采用孔径为0.45μm滤膜进行微孔过滤，即得所述松藻提取液；
(5)所述燕麦肽提取液采用如下方法制备得到：
(E1)取燕麦籽，经粉碎、正己烷脱脂、干燥后，得到粒径为40目燕麦籽细粉；其中，进行所述脱脂处理时，所述正己烷与所述燕麦籽的质量比为1.5:1；
(E2)向步骤(E1)所述的燕麦籽细粉中第一次加入Tris-HCl缓冲液并控制所述燕麦籽细粉与第一次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:18g/ml，之后在30℃进行提取1h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；
向所述第一滤渣中第二次加入Tris-HCl缓冲液并控制所述第一滤渣与第二次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:18g/ml，之后在30℃进行提取1.2h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液，向所述混合滤液中加入三氯乙酸，所述三氯乙酸与所述混合滤液的体积比为1.5:1，充分混合均匀后，在5℃进行离心，收集上清液即得所述燕麦肽提取液。
(6)分别取所述稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液和燕麦肽提取液，充分混合均匀，即得所述植物提取物。
实验例
1、实验样品制备
分别将稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液、燕麦肽提取液以及实施例3所述的植物提取物作为样品液，并依次编号为样品液A、样品液B、样品液C、样品液D、样品液E、样品液F，之后分别进行细胞增殖活性试验、细胞划痕损伤测试、促进胶原蛋白形成的试验。
2、细胞增殖活性试验
将大鼠胸主动脉平滑肌细胞接种于DMEM培养基(含20％胎牛血清)，置于含5％CO2、95％空气培养箱，培养温度为37℃，培养2-3天后更换培养液，待细胞长满培养品，取出弃去培养液，加入0.25％胰蛋白酶消化液，制成细胞悬液。用20％胎牛血清DMEM培养基调整细胞密度为1×105/ml，每孔200μl，接种于三个96孔板上，静置培养48小时。换用无血清DMEM培养基，CO2孵箱培养24小时，使细胞同步。更换无血清DMEM培养基，并分别加入样品液A-F各50μl，放入CO2孵箱，37℃培养。另外，设置空白对照组为不加任何样品液。24h后各取出一块培养板，每孔加入噻唑蓝(MTT)20μl，继续培养4h。弃去培养液，每孔加入二甲亚砜(DMSO)150μl，震荡10min后，上机检测其吸光度OD值。并根据下面公式计算细胞增殖率：
细胞增殖率(％)＝(样品液处理组吸光值-对照组吸光值)/对照组吸光值×100％
测量结果如表1所示。
表1-不同样品液对细胞增殖活性的影响
从表1中可以看出，虽然稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液、燕麦肽提取液(样品液A-E)也能一定程度上对大鼠胸主动脉平滑肌细胞(VSMC)的生成有影响，即可以促进VSMC的生成，但样品液F与上述样品液A-E相比，样品液F能够明显促进VSMC生长，显示样品液F中各提取物组分之间产生明显的协同效应；数据表明，从0h到48h，样品液F能够使得VSMC的生长呈递增状态，从而样品液F能够通过促进细胞的生长来达到修复细胞的功效。
3、细胞划痕损伤测试
取生长期细胞(进行“细胞增殖活性试验”培养的细胞)，以每孔2×105×(200μl)-1密度接种于6孔培养板，待长成单细胞层后，用橡皮刮匙轻刮单细胞层，产生2mm2的缺损区，立即更换培养液，并加入不同的样品液A-F，对照组加入等量的PBS，每组设3个复孔，分别于加药后0h、12h、24h倒置显微镜下拍照，观察细胞移行情况，并采用图像分析仪对缺损区随时间的变化予以定量。并根据公式计算迁移率。
迁移率(％)＝(样品液处理组迁移距离-对照组迁移距离)/对照组迁移距离×100％
表2-不同样品液对细胞迁移的影响
由表2可以看出，样品液A-F均对细胞迁移有影响，均可缩小缺损区面积，其中，样品液F对细胞缺损区的修复效果明显高于样品液A-E，从而证明样品液F可对细胞损伤修复具有直接作用，显示样品液F中各植物提取液之间产生明显的协同效应。
4、促进胶原蛋白形成的试验
取10周裸鼠，雄性，体重20g左右。
在裸鼠右侧耳背分别涂抹样品液A-F，每日早晚各一次涂抹，用药0.5g。左侧不涂抹作为对照组。在清洁、通风、干燥、室温22士2℃条件下，相同饲料喂养。用药30天后各取5只，处死，剪下双耳耳廓。
用天平称组织湿重45mg放入洁净试管中，加入轻脯氨酸测定试剂盒中水解液lml，混匀。加盖沸水浴水解20min，每隔10min混匀一次，目的让水解更加充分。取出试管，冷却后往各管加入试剂盒的指示剂一滴，摇匀。再加入试剂盒中甲液1.0ml调pH，摇匀。然后采用加样器吸取调pH的乙液，逐滴加入各试管中，直至看到各管中的指示剂变成黄绿色。加入蒸馏水至10mL后混匀。取3mL的水解液加入20-30mg活性炭后混匀，3500r/min，离心10min，取上清lml。
取干净试管加入5μg/ml标准应用液lml作为标准管。往各管中加入试剂1后混匀，静置10min，再加入试剂2，混匀静置5min，加入试剂3，混匀60℃水浴15min，冷却后3500转/min，离心10min，取上清于550nm，1cm光径，测吸光值。
羟脯氨酸是胶原蛋白的一种氨基酸，通常以羟脯氨酸的含量换算胶原蛋白含量，本试验中，按胶原蛋白中14％的羟脯氨酸换算小鼠皮肤中的胶原蛋白含量。
测量结果如表3所示。
表3-不同样品液对小鼠皮肤中胶原蛋白生成的影响
由表3可以看出，相较于单一植物提取物(样品液A-E)，复合样品液F对细胞胶原蛋白的生成具有更明显的促进作用，从而说明样品液F中各植物提取物之间产生明显的协同作用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种用于细胞修复的植物提取物，其特征在于，原料组分包括：
稻米发酵液，0.1-0.3重量份；
马鞭草叶提取液，0.4-0.6重量份；
仙人掌提取液，0.6-0.8重量份；
松藻提取液，0.6–0.8重量份；
燕麦肽提取液，0.4-0.6重量份。
2.根据权利要求1所述的用于细胞修复的植物提取物，其特征在于，所述稻米发酵液采用如下方法制备得到：
(A1)取稻米，加水浸泡后，蒸熟，得到熟制米饭；
(A2)向步骤(A1)中所述熟制米饭中接种米曲霉，所述米曲霉的接种质量占所述熟制米饭质量的1-3％，之后在温度为25-35℃、湿度为40-65％的条件下进行培育48-55h，经离心、过滤，即得所述稻米发酵液。
3.根据权利要求1所述的用于细胞修复的植物提取物，其特征在于，所述马鞭草叶提取液采用如下方法制备得到：
(B1)取马鞭草叶，经干燥、粉碎，得到马鞭草叶细粉；
(B2)向步骤(B1)中的马鞭草叶细粉中第一次加入乙醇，并在85-90℃进行回流提取1.5-2.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；向所述第一滤渣中第二次加入乙醇并在75-85℃进行回流提取2.5-3.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，浓缩除去乙醇后进行微孔过滤，即得所述马鞭草叶提取液。
4.根据权利要求3所述的用于细胞修复的植物提取物，其特征在于，步骤(B1)中，所述马鞭草叶细粉的粒径为90-110目；
步骤(B2)中，两次添加乙醇的体积浓度均为70-90％；所述马鞭草叶细粉的质量与第一次添加乙醇的体积之比为1:15-1:20g/ml，所述第一滤渣的质量与第二次添加乙醇的体积之比为1:15-1:20g/ml；
所述浓缩为水浴浓缩，所述浓缩的温度为35-45℃，进行所述微孔过滤的滤膜孔径为0.4-0.5μm。
5.根据权利要求1所述的用于细胞修复的植物提取物，其特征在于，所述仙人掌提取液采用如下方法制备得到：
(C1)取仙人掌，去皮后打碎成浆，得到仙人掌浆液；
(C2)向步骤(C1)中的仙人掌浆液中加入乙醇，浸泡1-1.5h后，离心、过滤，得到固形物；向所述固形物中第一次加入蒸馏水，浸泡20-40min后，在85-95℃进行回流提取1-1.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并在85-95℃进行回流提取1-1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，浓缩除去蒸馏水后进行微孔过滤，即得所述仙人掌提取液。
6.根据权利要求5所述的用于细胞修复的植物提取物，其特征在于，步骤(C2)中，所述乙醇与所述仙人掌浆液的质量比为0.5:1-1.5:1，所述乙醇的体积浓度为70-90％；
所述固形物与第一次添加蒸馏水的质量比为1:12-1:18；所述第一滤渣与第二次添加蒸馏水的质量比为1:12-1:18；
所述浓缩为水浴浓缩，所述浓缩的温度为85-95℃，进行所述微孔过滤的滤膜孔径为0.4-0.5μm。
7.根据权利要求1所述的用于细胞修复的植物提取物，其特征在于，所述松藻提取液采用如下方法制备得到：
(D1)取松藻，经干燥、粉碎，得到松藻细粉；
(D2)向步骤(D1)中的松藻细粉中第一次加入蒸馏水，并在85-95℃进行回流提取2-3h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；向所述第一滤渣中第二次加入蒸馏水并在85-95℃进行回流提取1-1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液；
(D3)将步骤(D2)所述混合滤液浓缩至原体积的1/2-1/3后，加入2-3倍体积的无水乙醇，搅拌，静置过夜，抽滤，滤液进行微孔过滤，即得所述松藻提取液；
所述燕麦肽提取液采用如下方法制备得到：
(E1)取燕麦籽，经粉碎、脱脂、干燥后，得到燕麦籽细粉；
(E2)向步骤(E1)所述的燕麦籽细粉中第一次加入Tris-HCl缓冲液，在25-35℃进行提取0.5-1.5h，离心、过滤，得到第一滤液和第一滤渣；向所述第一滤渣中第二次加入Tris-HCl缓冲液并在25-35℃进行提取1-1.5h，离心、过滤，得到第二滤液和第二滤渣；
将所述第一滤液与第二滤液合并，得到混合滤液，向所述混合滤液中加入三氯乙酸，充分混合均匀后，在3-8℃进行离心，收集上清液即得所述燕麦肽提取液。
8.根据权利要求7所述的用于细胞修复的植物提取物，其特征在于，步骤步骤(D1)中，所述松藻细粉的粒径为90-110目；
步骤(D2)中，所述松藻细粉的质量与第一次添加蒸馏水的体积之比为1:20-1:30g/ml，所述第一滤渣的质量与第二次添加蒸馏水的体积之比为1:20-1:30g/ml；
步骤(D3)中，所述浓缩为水浴浓缩，所述浓缩的温度为85-95℃，进行所述微孔过滤的滤膜孔径为0.4-0.5μm。
步骤(E1)中，采用正己烷进行所述脱脂处理，所述正己烷与所述燕麦籽的质量比为1:1-2:1；所述燕麦籽细粉的粒径为35-45目；
步骤(E2)中，所述燕麦籽细粉与第一次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:15-1:20g/ml；所述第一滤渣与第二次添加Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:15-1:20g/ml；
所述三氯乙酸与所述混合滤液的体积比为1:1-2:1。
9.一种权利要求1-8任一项所述的用于细胞修复的植物提取物的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
分别取所述稻米发酵液、马鞭草叶提取液、仙人掌提取液、松藻提取液和燕麦肽提取液，充分混合均匀，即得所述植物提取物。
10.权利要求1-8任一项所述植物提取物在制备用于细胞修复的护肤品中的应用。
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