CN109182261A - 一种培养羊膜间充质干细胞的方法 - Google Patents

一种培养羊膜间充质干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种培养羊膜间充质干细胞的方法，包括以下步骤：制作人羊膜间充质干细胞专用培养基；取人胎盘羊膜组织；处理羊膜组织；获得间充质干细胞；进行体外培养，与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：通过特殊的培养基以及培养方法可促进细胞的增殖，提高羊膜间充质干细胞的表达率和细胞纯度，并在较短的时间内获得足够的干细胞数量，适用于羊膜间充质干细胞的二维或三维培养，满足研发需求。

Description

一种培养羊膜间充质干细胞的方法
技术领域
本发明是一种培养羊膜间充质干细胞的方法，属于干细胞提取培养领域。
背景技术
糖尿病是一种常见的由内分泌***代谢障碍引起的慢性终身疾病，长期患病可导致神经***、心血管***、泌尿***等多种***的慢性损害。
随着我国经济的发展以及人民生活水平的提高，糖尿病患病率逐年增加，严重危害人们的健康，给家庭和社会带来沉重的经济负担。最新大样本流行病学调查显示，中国成人糖尿病患病率为11.6％，其中男性患病率为12.1％，女性患病率为11％，城市居民为14.3％，农村居民为10.3％；调查结果还显示糖尿病前期率为50.1％。目前主要是使用口服降糖药及胰岛素替代治疗，不能根治，且存在很多不足。
人羊膜来源干细胞包括人羊膜上皮细胞、人羊膜间充质干细胞。人羊膜干细胞可在体内及体外向外胚层来源的神经细胞、神经胶质细胞，内胚层来源的胰腺细胞、肝脏细胞以及中胚层来源的心肌样细胞、肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞方向分化，并且具有无性集落形成能力和抗炎性。作为很多细胞的前体，羊膜干细胞又能抑制细胞免疫。不同的抗血管生成和抗炎症的蛋白都在羊膜干细胞中表达，这也解释了羊膜的抗血管生成和抗炎症的作用。这些性质使得羊膜干细胞已在很多治疗起到辅佐作用，而且大多数效果显著。人羊膜干细胞在具有类似胚胎干细胞性质的同时，因其无致瘤性、低免疫排斥性、含量丰富、容易获取、不引起伦理争议，极有潜力成为临床应用的干细胞来源之一。
近年来，随着干细胞技术的发展，羊膜干细胞移植已经成为新的疾病治疗的发展方向。在临床应用上，羊膜干细胞在结膜损伤修复、重建眼表、防治睑球粘连与视网膜移植等眼科临床已开展了大量工作，而且在糖尿病难愈性皮肤溃疡、烧伤等创面修复愈合方面也有积极的疗效。而且，已经有实验证据证明羊膜干细胞能够分化在一定条件下能够分化为胰岛细胞。同时，也有学者报道了人羊膜间充质干细胞治疗糖尿病的病例，并取得了良好的效果。
虽然现在羊膜干细胞的应用研究上已经取得了一定的成果，并已经开始利用人羊膜间充质干细胞进行糖尿病治疗的研究。然而，现有的人羊膜间充质干细胞的提取和培养的方法仍比较复杂，且无法得到具有较高纯度和活性的人羊膜间充质干细胞。
因此，开发一种便捷高效且能够产业化、规模化提取和培养人羊膜间充质干细胞的方法，就成了目前亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种培养羊膜间充质干细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种培养羊膜间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
制作人羊膜间充质干细胞专用培养基；
取人胎盘羊膜组织；
处理羊膜组织；
获得间充质干细胞；
进行体外培养。
进一步地，所述人羊膜间充质干细胞专用培养基由α-MEM培养基、人血白蛋白、珠子参皂苷、香菇多糖、胎牛血清、双抗、表皮生长因子构成。
进一步地，取人胎盘羊膜组织的具体步骤为：在无菌的环境下，取健康产妇的羊膜组织，浸在胎盘保存液中，维持在 2-8°C的环境中保存。
进一步地，处理羊膜组织的具体步骤为：在羊膜组织保存在胎盘保存液中36h内，取出羊膜组织，用氯化钠溶液清洗，再依次放置在含有青霉素钠和硫酸链霉素氯化钠溶液和含两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，然后用剪刀将羊膜剪成 1-3mm3小块，加入胰酶处理，然后加入胶原酶I消化处理，在35-40°C的环境下，150-200rpm 震荡消化8-30min，然后用α-MEM培养基稀释。
进一步地，获得间充质干细胞的具体步骤为：将稀释后的羊膜经筛网过滤，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经三次梯度离心后，取离心得到的沉淀加入血清培养基重悬，得到分离的间充质干细胞悬液。
进一步地，进行体外培养的具体步骤为：将分离的干细胞接种于培养基内，然后放入培养箱内培养，培养后细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得到人羊膜间充质干细胞。
本发明的有益效果：本发明的一种培养羊膜间充质干细胞的方法，通过特殊的培养基以及培养方法可促进细胞的增殖，提高羊膜间充质干细胞的表达率和细胞纯度，并在较短的时间内获得足够的干细胞数量，适用于羊膜间充质干细胞的二维或三维培养，满足研发需求。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本发明提供一种技术方案：一种培养羊膜间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
制作人羊膜间充质干细胞专用培养基；
取人胎盘羊膜组织；
处理羊膜组织；
获得间充质干细胞；
进行体外培养。
人羊膜间充质干细胞专用培养基由α-MEM培养基、人血白蛋白、珠子参皂苷、香菇多糖、胎牛血清、双抗、表皮生长因子构成。
取人胎盘羊膜组织的具体步骤为：在无菌的环境下，取健康产妇的羊膜组织，浸在胎盘保存液中，维持在 2-8°C的环境中保存。
处理羊膜组织的具体步骤为：在羊膜组织保存在胎盘保存液中36h内，取出羊膜组织，用氯化钠溶液清洗，再依次放置在含有青霉素钠和硫酸链霉素氯化钠溶液和含两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，然后用剪刀将羊膜剪成 1-3mm3小块，加入胰酶处理，然后加入胶原酶I消化处理，在35-40°C的环境下，150-200rpm 震荡消化8-30min，然后用α-MEM培养基稀释。
获得间充质干细胞的具体步骤为：将稀释后的羊膜经筛网过滤，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经三次梯度离心后，取离心得到的沉淀加入血清培养基重悬，得到分离的间充质干细胞悬液。
进行体外培养的具体步骤为：将分离的干细胞接种于培养基内，然后放入培养箱内培养，培养后细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得到人羊膜间充质干细胞。
作为本发明的一个实施例：本发明的一种培养羊膜间充质干细胞的方法，通过特殊的培养基以及培养方法可促进细胞的增殖，提高羊膜间充质干细胞的表达率和细胞纯度，并在较短的时间内获得足够的干细胞数量，适用于羊膜间充质干细胞的二维或三维培养，满足研发需求。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种培养羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
制作人羊膜间充质干细胞专用培养基；
取人胎盘羊膜组织；
处理羊膜组织；
获得间充质干细胞；
进行体外培养。
2.根据权利要求1所述的一种培养羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：所述人羊膜间充质干细胞专用培养基由α-MEM培养基、人血白蛋白、珠子参皂苷、香菇多糖、胎牛血清、双抗、表皮生长因子构成。
3.根据权利要求1所述的一种培养羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：取人胎盘羊膜组织的具体步骤为：在无菌的环境下，取健康产妇的羊膜组织，浸在胎盘保存液中，维持在 2-8°C的环境中保存。
4.根据权利要求1所述的一种培养羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：处理羊膜组织的具体步骤为：在羊膜组织保存在胎盘保存液中36h内，取出羊膜组织，用氯化钠溶液清洗，再依次放置在含有青霉素钠和硫酸链霉素氯化钠溶液和含两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，然后用剪刀将羊膜剪成 1-3mm3小块，加入胰酶处理，然后加入胶原酶I消化处理，在35-40°C的环境下，150-200rpm 震荡消化8-30min，然后用α-MEM培养基稀释。
5.根据权利要求1所述的一种培养羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：获得间充质干细胞的具体步骤为：将稀释后的羊膜经筛网过滤，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经三次梯度离心后，取离心得到的沉淀加入血清培养基重悬，得到分离的间充质干细胞悬液。
6.根据权利要求1所述的一种培养羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：进行体外培养的具体步骤为：将分离的干细胞接种于培养基内，然后放入培养箱内培养，培养后细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得到人羊膜间充质干细胞。
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