CN115651899A - 一种分离制备脂肪源干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离制备脂肪源干细胞的方法，包括以下步骤，首先进行脂肪清洗，取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净，随后进行离心分离，将胶原酶溶液加入离心机；本发明专利通过在细胞完成离心后，采用刺激液对细胞进行刺激，利用丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13‑乙酸酯刺激细胞产生反应，从而促使细胞释放蛋白质、酶和因子，利用蛋白质、酶和因子修复受损组织与生长新的组织，从而实现对受损脂肪源干细胞进行修复目的，通过采用该方法培养出的脂肪源干细胞受损情况得到修复，可以大大增强细胞的活性，并最大程度的降低了细胞的死亡率，分离制备出的细胞，将具有活性强、死亡率低效果。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪源干细胞分离制备技术领域，具体为一种分离制备脂肪源干细胞的方法。
背景技术
脂肪源干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种多向分化潜能的干细胞。该细胞增殖能力强，体外培养能保持稳定的生长增殖活性，且具有多项分化潜能，脂肪源干细胞未来有望成为修复受损组织和器官的重要来源；
在现有脂肪源干细胞的分离制备技术中，采用营养液直接培养脂肪源干细胞的方式进行制备，然而在分离脂肪源干细胞过程中，由于在离心机高速离心作用下，脂肪源干细胞快速旋转，在快速离心过程中会造成细胞损伤，而采用直接培养的方式，细胞将无法得到修复十分容易出现细胞死亡情况，进而导致脂肪源干细胞的分离制备完成后，细胞存活率低、活力低等情况，为此提出一种分离制备脂肪源干细胞的方法，来解决此问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离制备脂肪源干细胞的方法，解决了目前分离制备脂肪源干细胞过程中采用营养液直接培养方式，未对受损细胞进行修复会导致细胞在制备后出现存活率低、活力低等问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种分离制备脂肪源干细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1：脂肪清洗：取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净；
步骤2：离心分离：将胶原酶溶液加入离心机，并将清洗干净后的脂肪一并同步至离心机，通过启动离心机进行离心分离，离心分离完成后得到脂肪组织层；
步骤3：离心沉淀：将获取的脂肪组织层投入离心机，并加入生理盐水再次进行离心分离，离心分离完成后进行沉淀，待完成后，过滤即可获得脂肪源干细胞；
步骤4：制备培养：将获取的脂肪源干细胞投入刺激液及营养液中进行刺激培养，其中刺激液由丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯经过混合制备而成，待脂肪源干细胞在刺激液和营养液中培养时间达到2-3日后，观察脂肪源干细胞受损情况是否得到修复，若是修复继续培养至脂肪源干细胞成熟，若干细胞受损未修复则在进行24h培养，直至受损脂肪源干细胞得到修复。
优选的，在步骤1中，脂肪清洗干净的标准为脂肪上不存在血液，需要反复清洗至血药消失。
优选的，在步骤1中，对脂肪清洗干净不存在血液后，使用纱布将脂肪进行擦干，确保脂肪表面干净，不残留清洗液。
优选的，在步骤1中，脂肪组织取新鲜组织，使用前检查脂肪组织内部细胞是否存活。
优选的，在步骤2中，脂肪组织层和胶原酶溶液的体积比为1:0.5，胶原酶溶的浓度为100Units/mL。
优选的，在步骤2中，离心机的离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min。
优选的，在步骤3中，生理盐水和脂肪组织层的体积比例为1-1.5，离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min，脂肪源干细胞采用100目的细胞筛筛选过滤。
优选的，在步骤4中，脂肪源干细胞的培养温度为37℃，CO2体积浓度为5%，刺激液和营养液每隔12h进行一次换液，换液过程中取小部分脂肪源干细胞进行观察，查看脂肪源干细胞受损修复情况。
优选的，在步骤4中，观察脂肪源干细胞修复后，取消刺激液的使用，使用营养液继续培养10-20天完成一周期的培养制备。
优选的，在步骤4中，脂肪源干细胞的受损培养时间并不局限于2-3天，根据脂肪源干细胞的受损情况，具体以脂肪源干细胞完成修复为准。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明专利通过在细胞完成离心后，采用刺激液对细胞进行刺激，利用丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯刺激细胞产生反应，从而促使细胞释放蛋白质、酶和因子，利用蛋白质、 酶和因子修复受损组织与生长新的组织，从而实现对受损脂肪源干细胞进行修复目的，通过采用该方法培养出的脂肪源干细胞受损情况得到修复，可以大大增强细胞的活性，并最大程度的降低了细胞的死亡率，分离制备出的细胞，将具有活性强、死亡率低效果。
具体实施方式
下面将通过实施例的方式对本发明作更详细的描述，这些实施例仅是举例说明性的而没有任何对本发明范围的限制。
本发明提供一种技术方案：一种分离制备脂肪源干细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1：脂肪清洗：取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净；
步骤2：离心分离：将胶原酶溶液加入离心机，并将清洗干净后的脂肪一并同步至离心机，通过启动离心机进行离心分离，离心分离完成后得到脂肪组织层；
步骤3：离心沉淀：将获取的脂肪组织层投入离心机，并加入生理盐水再次进行离心分离，离心分离完成后进行沉淀，待完成后，过滤即可获得脂肪源干细胞；
步骤4：制备培养：将获取的脂肪源干细胞投入刺激液和营养液中进行刺激培养，其中刺激液由丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯经过混合制备而成，待脂肪源干细胞在刺激液和营养液中培养时间达到2-3日后，观察脂肪源干细胞受损情况是否得到修复，若修复继续培养至脂肪源干细胞成熟，若干细胞受损未修复则在进行24h培养，直至受损脂肪源干细胞得到修复。
实施例一：
首先进行脂肪清洗，取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净，随后进行离心分离，将胶原酶溶液加入离心机，并将清洗干净后的脂肪一并同步至离心机，通过启动离心机进行离心分离，离心分离完成后得到脂肪组织层，之后进行离心沉淀，将获取的脂肪组织层投入离心机，并加入生理盐水再次进行离心分离，离心分离完成后进行沉淀，待完成后，过滤即可获得脂肪源干细胞，最后进行制备培养，将获取的脂肪源干细胞投入刺激液和营养液中进行刺激培养，其中刺激液由丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯经过混合制备而成，待脂肪源干细胞在刺激液和营养液中培养时间达到2-3日后，观察脂肪源干细胞受损情况是否得到修复，若修复继续培养至脂肪源干细胞成熟，若干细胞受损未修复则在进行24h培养，直至受损脂肪源干细胞得到修复。
实施例二，
在实施例一中，再加上下述工序，
在步骤1中，脂肪清洗干净的标准为脂肪上不存在血液，需要反复清洗至血药消失，对脂肪清洗干净不存在血液后，使用纱布将脂肪进行擦干，确保脂肪表面干净，不残留清洗液，脂肪组织取新鲜组织，使用前检查脂肪组织内部细胞是否存活。
首先进行脂肪清洗，取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净，脂肪清洗干净的标准为脂肪上不存在血液，需要反复清洗至血药消失，对脂肪清洗干净不存在血液后，使用纱布将脂肪进行擦干，确保脂肪表面干净，不残留清洗液，脂肪组织取新鲜组织，使用前检查脂肪组织内部细胞是否存活，随后进行离心分离，将胶原酶溶液加入离心机，并将清洗干净后的脂肪一并同步至离心机，通过启动离心机进行离心分离，离心分离完成后得到脂肪组织层，之后进行离心沉淀，将获取的脂肪组织层投入离心机，并加入生理盐水再次进行离心分离，离心分离完成后进行沉淀，待完成后，过滤即可获得脂肪源干细胞，最后进行制备培养，将获取的脂肪源干细胞投入刺激液和营养液中进行刺激培养，其中刺激液由丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯经过混合制备而成，待脂肪源干细胞在刺激液和营养液中培养时间达到2-3日后，观察脂肪源干细胞受损情况是否得到修复，若是修复继续培养至脂肪源干细胞成熟，若干细胞受损未修复则在进行24h培养，直至受损脂肪源干细胞得到修复。
实施例三，
在实施例二中，再加上下述工序，
在步骤2中，脂肪组织层和胶原酶溶液的体积比为1:0.5，胶原酶溶的浓度为100Units/mL，离心机的离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min。
首先进行脂肪清洗，取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净，脂肪清洗干净的标准为脂肪上不存在血液，需要反复清洗至血药消失，对脂肪清洗干净不存在血液后，使用纱布将脂肪进行擦干，确保脂肪表面干净，不残留清洗液，脂肪组织取新鲜组织，使用前检查脂肪组织内部细胞是否存活，随后进行离心分离，将胶原酶溶液加入离心机，并将清洗干净后的脂肪一并同步至离心机，通过启动离心机进行离心分离，离心分离完成后得到脂肪组织层，脂肪组织层和胶原酶溶液的体积比为1:0.5，胶原酶溶的浓度为100Units/mL，离心机的离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min，之后进行离心沉淀，将获取的脂肪组织层投入离心机，并加入生理盐水再次进行离心分离，离心分离完成后进行沉淀，待完成后，过滤即可获得脂肪源干细胞，最后进行制备培养，将获取的脂肪源干细胞投入刺激液和营养液中进行刺激培养，其中刺激液由丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯经过混合制备而成，待脂肪源干细胞在刺激液和营养液中培养时间达到2-3日后，观察脂肪源干细胞受损情况是否得到修复，若是修复继续培养至脂肪源干细胞成熟，若干细胞受损未修复则在进行24h培养，直至受损脂肪源干细胞得到修复。
实施例四，
在实施例三中，再加上下述工序，
在步骤3中，生理盐水和脂肪组织层的体积比例为1-1.5，离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min，脂肪源干细胞采用100目的细胞筛筛选过滤。
首先进行脂肪清洗，取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净，脂肪清洗干净的标准为脂肪上不存在血液，需要反复清洗至血药消失，对脂肪清洗干净不存在血液后，使用纱布将脂肪进行擦干，确保脂肪表面干净，不残留清洗液，脂肪组织取新鲜组织，使用前检查脂肪组织内部细胞是否存活，随后进行离心分离，将胶原酶溶液加入离心机，并将清洗干净后的脂肪一并同步至离心机，通过启动离心机进行离心分离，离心分离完成后得到脂肪组织层，脂肪组织层和胶原酶溶液的体积比为1:0.5，胶原酶溶的浓度为100Units/mL，离心机的离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min，之后进行离心沉淀，将获取的脂肪组织层投入离心机，并加入生理盐水再次进行离心分离，离心分离完成后进行沉淀，待完成后，过滤即可获得脂肪源干细胞，生理盐水和脂肪组织层的体积比例为1-1.5，离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min，脂肪源干细胞采用100目的细胞筛筛选过滤，最后进行制备培养，将获取的脂肪源干细胞投入刺激液和营养液中进行刺激培养，其中刺激液由丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯经过混合制备而成，待脂肪源干细胞在刺激液和营养液中培养时间达到2-3日后，观察脂肪源干细胞受损情况是否得到修复，若修复继续培养至脂肪源干细胞成熟，若干细胞受损未修复则在进行24h培养，直至受损脂肪源干细胞得到修复。
实施例五，
在实施例四中，再加上下述工序，
在步骤4中，脂肪源干细胞的培养温度为37℃，CO2体积浓度为5%，刺激液和营养液每隔12h进行一次换液，换液过程中取小部分脂肪源干细胞进行观察，查看脂肪源干细胞受损修复情况，观察脂肪源干细胞修复后，取消刺激液的使用，使用营养液继续培养10-20天完成一周期的培养制备，脂肪源干细胞的受损培养时间并不局限于2-3天，根据脂肪源干细胞的受损情况，具体以脂肪源完成修复为准。
首先进行脂肪清洗，取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净，脂肪清洗干净的标准为脂肪上不存在血液，需要反复清洗至血药消失，对脂肪清洗干净不存在血液后，使用纱布将脂肪进行擦干，确保脂肪表面干净，不残留清洗液，脂肪组织取新鲜组织，使用前检查脂肪组织内部细胞是否存活，随后进行离心分离，将胶原酶溶液加入离心机，并将清洗干净后的脂肪一并同步至离心机，通过启动离心机进行离心分离，离心分离完成后得到脂肪组织层，脂肪组织层和胶原酶溶液的体积比为1:0.5，胶原酶溶的浓度为100Units/mL，离心机的离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min，之后进行离心沉淀，将获取的脂肪组织层投入离心机，并加入生理盐水再次进行离心分离，离心分离完成后进行沉淀，待完成后，过滤即可获得脂肪源干细胞，生理盐水和脂肪组织层的体积比例为1-1.5，离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min，脂肪源干细胞采用100目的细胞筛筛选过滤，最后进行制备培养，将获取的脂肪源干细胞投入刺激液及营养液中进行刺激培养，其中刺激液由丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯经过混合制备而成，待脂肪源干细胞在刺激液和营养液中培养时间达到2-3日后，观察脂肪源干细胞受损情况是否得到修复，若是修复继续培养至脂肪源干细胞成熟，若干细胞受损未修复则在进行24h培养，直至受损脂肪源干细胞得到修复，脂肪源干细胞的培养温度为37℃，CO2体积浓度为5%，刺激液和营养液每隔12h进行一次换液，换液过程中取小部分脂肪源干细胞进行观察，查看脂肪源干细胞受损修复情况，观察脂肪源干细胞修复后，取消刺激液的使用，使用营养液继续培养10-20天完成一周期的培养制备，脂肪源干细胞的受损培养时间并不局限于2-3天，根据脂肪源干细胞的受损情况，具体以脂肪源完成修复为准。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：脂肪清洗：取脂肪组织进行反复清洗，直至脂肪完全清洗干净；
步骤2：离心分离：将胶原酶溶液加入离心机，并将清洗干净后的脂肪一并同步至离心机，通过启动离心机进行离心分离，离心分离完成后得到脂肪组织层；
步骤3：离心沉淀：将获取的脂肪组织层投入离心机，并加入生理盐水再次进行离心分离，离心分离完成后进行沉淀，待完成后，过滤即可获得脂肪源干细胞；
步骤4：制备培养：将获取的脂肪源干细胞投入刺激液及营养液中进行刺激培养，其中刺激液由丝裂原、离子霉素、脂多糖、白细胞介素和13-乙酸酯经过混合制备而成，待脂肪源干细胞在刺激液和营养液中培养时间达到2-3日后，观察脂肪源干细胞受损情况是否得到修复，若是修复继续培养至脂肪源干细胞成熟，若干细胞受损未修复则在进行24h培养，直至受损脂肪源干细胞得到修复。
2.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤1中，脂肪清洗干净的标准为脂肪上不存在血液，需要反复清洗至血药消失。
3.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤1中，对脂肪清洗干净不存在血液后，使用纱布将脂肪进行擦干，确保脂肪表面干净，不残留清洗液。
4.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤1中，脂肪组织取新鲜组织，使用前检查脂肪组织内部细胞是否存活。
5.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤2中，脂肪组织层和胶原酶溶液的体积比为1:0.5，胶原酶溶的浓度为100Units/mL。
6.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤2中，离心机的离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min。
7.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤3中，生理盐水和脂肪组织层的体积比例为1-1.5，离心时间为10min，离心机的离心转速为1000r/min，脂肪源干细胞采用100目的细胞筛筛选过滤。
8.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤4中，脂肪源干细胞的培养温度为37℃，CO2体积浓度为5%，刺激液和营养液每隔12h进行一次换液，换液过程中取小部分脂肪源干细胞进行观察，查看脂肪源干细胞受损修复情况。
9.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤4中，观察脂肪源干细胞修复后，取消刺激液的使用，使用营养液继续培养10-20天完成一周期的培养制备。
10.根据权利要求1所述的一种分离制备脂肪源干细胞的方法，其特征在于：在步骤4中，脂肪源干细胞的修复培养时间并不局限于2-3天，根据脂肪源干细胞的受损情况，具体以脂肪源干细胞完成修复为准。
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| CN202211330756.3A CN115651899A (zh) | 2022-10-28 | 2022-10-28 | 一种分离制备脂肪源干细胞的方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114288276A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-04-08 | 成都清科生物科技有限公司 | 一种抗炎羊膜敷贴及其制备方法 |
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2022
- 2022-10-28 CN CN202211330756.3A patent/CN115651899A/zh active Pending
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