CN106244521A - 一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途 - Google Patents

一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途。本发明方法中，通过将羊膜上皮细胞从胎盘上提取分离并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到羊膜上皮细胞。同时，本发明培养得到的人羊膜上皮细胞纯度高，还能够用于糖尿病等疾病的治疗中，并能够有效控制控制患者的血糖水平。

Description

一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途
技术领域
本发明涉及细胞分离培养领域，具体而言，涉及一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途。
背景技术
糖尿病是一种常见的由内分泌***代谢障碍引起的慢性终身疾病，长期患病可导致神经***、心血管***、泌尿***等多种***的慢性损害。
随着我国经济的发展以及人民生活水平的提高，糖尿病患病率逐年增加，严重危害人们的健康，给家庭和社会带来沉重的经济负担。最新大样本流行病学调查显示，中国成人糖尿病患病率为11.6％，其中男性患病率为12.1％，女性患病率为11％，城市居民为14.3％，农村居民为10.3％；调查结果还显示糖尿病前期率为50.1％。目前主要是使用口服降糖药及胰岛素替代治疗，不能根治，且存在很多不足。
人羊膜来源干细胞包括人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，hAEC)、人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)。人羊膜干细胞可在体内及体外向外胚层来源的神经细胞、神经胶质细胞，内胚层来源的胰腺细胞、肝脏细胞以及中胚层来源的心肌样细胞、肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞方向分化，并且具有无性集落形成能力和抗炎性。作为很多细胞的前体，羊膜干细胞又能抑制细胞免疫。不同的抗血管生成和抗炎症的蛋白都在羊膜干细胞中表达，这也解释了羊膜的抗血管生成和抗炎症的作用。这些性质使得羊膜干细胞已在很多治疗起到辅佐作用，而且大多数效果显著。人羊膜干细胞在具有类似胚胎干细胞性质的同时，因其无致瘤性、低免疫排斥性、含量丰富、容易获取、不引起伦理争议，极有潜力成为临床应用的干细胞来源之一。
近年来，随着干细胞技术的发展，羊膜干细胞移植已经成为新的疾病治疗的发展方向。在临床应用上，羊膜干细胞在结膜损伤修复、重建眼表、防治睑球粘连与视网膜移植等眼科临床已开展了大量工作，而且在糖尿病难愈性皮肤溃疡、烧伤等创面修复愈合方面也有积极的疗效。而且，已经有实验证据证明羊膜干细胞能够分化在一定条件下能够分化为胰岛细胞。同时，也有学者报道了人羊膜间充质干细胞治疗糖尿病的病例，并取得了良好的效果。
虽然现在在羊膜干细胞的应用研究上已经取得了一定的成果，但实际上，对于羊膜上皮细胞的功能开发和利用还并不充分；同时，现有的羊膜上皮细胞的提取和细胞培养仍较为困难，不仅提取和培养的操作复杂而且成本较高，难以实现产业化制备。
因此，开发一种便捷高效且能够产业化、规模化提取和培养羊膜上皮细胞的方法，并进一步对膜上皮细胞开发和利用就成了目前亟待解决的技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种人羊膜上皮细胞分离培养方法，所述方法中，通过将羊膜上皮细胞从胎盘上提取分离并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到羊膜上皮细胞，进而能够解决现有技术无法产业化制备高纯度羊膜上皮细胞的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种人羊膜上皮细胞，所述人羊膜上皮细胞是由本发明方法提取纯化并增殖培养得到的，具有能够产业化制备，且培养得到的人羊膜上皮细胞纯度高等优点。
本发明的第三个目的在于提供所述人羊膜上皮细胞的用途，本发明人羊膜上皮细胞能够用于糖尿病等疾病的治疗中，并能够有效控制患者的血糖水平。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种人羊膜上皮细胞分离培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将羊膜从胎盘组织上剥离后清洗；
(2)将清洗后的羊膜剪碎，并用胰酶消化处理；
(3)将消化处理后得到的消化液过筛后，收集细胞滤液，并离心处理；
(4)将离心处理得到的细胞用培养基悬浮后接种，并培养；
(5)当培养的细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得人羊膜上皮细胞。
本发明中，通过将羊膜上皮细胞从胎盘上提取分离并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到羊膜上皮细胞；同时，本发明方法培养得到的羊膜上皮细胞性状稳定，在多代培养后，仍然能够保持稳定的形状。
可选的，本发明中，步骤(1)中所述剥离是在无菌条件下进行的。
可选的，本发明中，步骤(1)中所述剥离是采用机械的方法进行剥离。
可选的，本发明中，步骤(2)中所述胰酶消化处理为在水浴条件下的消化处理。
可选的，本发明中，步骤(4)中所述培养基为DMEM培养基或低糖DMEM培养基；优选的，本发明中步骤(4)中所述培养基为低糖DMEM培养基。
可选的，本发明中，步骤(4)中所述培养为按照1×106细胞密度接种于10cm培养基中进行培养。
可选的，本发明中，步骤(4)中所述培养为在37℃的CO2培养箱中进行培养，并在培养48h后更换培养液。
可选的，本发明中，步骤(5)中所述培养基为DMEM培养基或低糖DMEM培养基；优选的，本发明中步骤(4)中所述培养基为低糖DMEM培养基。
可选的，本发明中，步骤(5)中所述传代培养是按照1:3的比例进行传代培养。
可选的，本发明中，步骤(1)中所述清洗是以含2～5％双抗的HBSS缓冲溶液进行清洗；优选的，本发明中，步骤(1)中所述清洗是以含3～4％双抗的HBSS缓冲溶液进行清洗。
本发明中，通过对所用清洗液的选择和调整，并使用具有抑菌成分的清洗液，从而在能够清楚除去羊膜上残留的血迹的同时，还能够对羊膜实现消毒抑菌的功效。
可选的，本发明中，所述清洗为多次清洗，例如可以为2、3、4、5或更多次清洗。
本发明中，所述HBSS缓冲溶液为平衡盐溶液。。
本发明中，所述含2～5％双抗的HBSS缓冲溶液为含2～5％青霉素和链霉素的HBSS缓冲溶液。
可选的，本发明中，步骤(2)中所述胰酶消化处理是在33～39℃条件下用胰酶消化处理20～40min；优选的，本发明中，步骤(2)中所述胰酶消化处理是在35～37℃条件下用胰酶消化处理30～35min。
本发明中，通过对消化处理温度和时间的调整，从而能够提高酶活性，并进一步提高酶解处理效率；同时还不会由于酶解时间过长所导致的处理效率过低以及对目标细胞组织的破坏
可选的，本发明中，所述消化处理为消化处理2～4次；优选的，本发明中，所述消化处理为消化处理3次。
本发明中，通过对酶解消化处理次数的选择和调整，从而可以实现充分的纯化处理。
可选的，本发明中，步骤(3)中所述过滤是以孔径为200～400目的筛网进行过滤；优选的，本发明中，骤(3)中所述过滤是以孔径为300～350目的筛网进行过滤。
本发明中，通过对过滤所用筛网孔径的选择和调整，从而能够将未消化的组织充分过滤除去。
可选的，本发明中，步骤(3)中所述离心是在转速为1300～1600rpm的条件下离心5～15min；优选的，本发明中，步骤(3)中所述离心是在转速为1400～1500rpm的条件下离心8～10min。
本发明中，通过对离心转速以及离心时间的选择和调整，从而可以在时间充分离心纯化的同时，还不会由于处理时间过长所导致的纯化处理效率过低。
可选的，本发明中，步骤(5)中所述胰酶消化是在33～39℃条件下用胰酶消化处理3～10min；优选的，本发明中，步骤(5)中所述胰酶消化是在35～37℃条件下用胰酶消化处理8～10min；更优选的，本发明中，步骤(5)中所述胰酶消化是在37℃条件下用胰酶消化处理10min。
同时，本发明还提供了一种人羊膜上皮细胞，所述人羊膜上皮细胞是由本发明方法分离培养得到的。
本发明中，通过采用本发明方法提取纯化并增殖培养得到的人羊膜上皮细胞，从而能够产业化制备人羊膜上皮细胞，同时具有所培养得到的人羊膜上皮细胞纯度高等优点。
进一步的，本发明还提供了所述人羊膜上皮细胞在制备治疗疾病药物中的应用。
本发明中，所述人羊膜上皮细胞能够用于糖尿病等疾病的治疗中，并能够有效控制控制患者的血糖水平。
可选的，本发明中，所述疾病为糖尿病。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明中，通过将羊膜上皮细胞从胎盘上提取分离并纯化，然后在体外扩大增殖培养，具有方法简易、便捷且能够规模化制备羊膜上皮细胞等优点；
(2)本发明中，通过对酶解消化处理等步骤条件的选择、调整以及优化，从而进一步提高了本发明羊膜上皮细胞提取纯化效率；
(3)本发明中所述人羊膜上皮细胞能够用于糖尿病等疾病的治疗以及相应疾病治疗药物的制备中，并能够有效控制控制患者的血糖水平。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为培养48h后，在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；
图2为培养基中细胞汇合度达到80％-90％时，4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；
图3为P1代人羊膜上皮细胞在在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；
图4为P5代人羊膜上皮细胞在在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；
图5为细胞表面子在人羊膜上皮细胞上的表达分析检测图谱。
图6A为未经诱导分化处理的P3代羊膜上皮细胞在4×显微镜下观察到的细胞形态。
图6B为经成脂诱导试剂诱导分化处理后P3代羊膜上皮细胞在4×显微镜下观察到的细胞染色情况。
图6C为经成骨诱导试剂诱导分化处理后P3代羊膜上皮细胞在4×显微镜下观察到的细胞染色情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(1)在无菌条件下，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，然后用含3％双抗的HBSS缓冲溶液冲洗数次清除残留血迹；
(2)将冲洗后的羊膜组织剪碎后，加入胰酶，并在37℃水浴锅内消化处理3次，每次消化处理30min；
(3)将消化处理后所得的消化液过300目筛网，以去掉未消化组织，并收集过滤后所得的细胞滤液；然后将细胞滤液在1500rpm条件下，离心处理10min；
(4)将离心后所得沉淀细胞用低糖DMEM培养基重新悬浮，并按照1×106细胞密度接种于10cm培养皿内；并将培养基放入37℃CO2培养箱内，在培养48小时后，得到图1所示细胞形态的培养基，并更换为新的低糖DMEM培养基；
(5)如图2所示，当培养基中细胞汇合度达到80％-90％后，向培养基中加入胰酶，并在37℃条件下消化5min；然后再向加入低糖DMEM培养基终止消化，即得到图3所示的P1代人羊膜上皮细胞；然后按1:3进行传代培养，即得到传代培养的人羊膜上皮细胞。本发明方法培养的人羊膜上皮细胞可稳态传代至如图4所示的P5代。
实验例1
流式细胞仪检测
收集实施例1步骤(3)中消化处理后，过滤离心得到的人羊膜上皮细胞，并收集约106个细胞；
将收集得到的细胞用PBS缓冲溶液洗涤2次，并适当稀释；然后在流式细胞仪上加样检测；
检测后，采用软件分析CD73、CD90、CD44、CD45、CD105等5种细胞表面子在人羊膜上皮细胞上的表达，分析结果如图5所示；
进一步根据图5所示分析结果进行积分计算，得出5种细胞表面子在各代的表达情况，结果如下：
CD73表达情况：
种群 数量 占母本比例(％) 占全部比例
母本 10000 — 100.0
P1代 7572 75.7 75.7
P2代 7557 99.8 75.6
CD90表达情况：
种群 数量 占母本比例(％) 占全部比例
母本 10000 — 100.0
P1代 4962 49.6 49.6
P2代 4602 92.7 46.0
CD105表达情况：
种群 数量 占母本比例(％) 占全部比例
母本 10000 — 100.0
P1代 7065 76.0 76.0
P3代 36 0.5 0.4
CD45表达情况：
种群 数量 占母本比例(％) 占全部比例
母本 10000 — 100.0
P1代 7542 75.4 75.4
P3代 0 0.0 0.0
CD44表达情况：
种群 数量 占母本比例(％) 占全部比例
母本 10000 — 100.0
P1代 4509 45.1 45.1
P3代 4497 99.7 45.0
然后统计各标志物表达情况，结果如下表所示：
细胞表面标志物 羊膜上皮细胞
CD73 99.8％
CD44 99.7％
CD105 0.5％
CD90 92.7％
CD45 0％
检测结果显示，本发明人羊膜上皮细胞高表达了CD73、CD44以及CD90，基本不表达CD105以及CD45。
实验例2
成脂及成骨分化的实验研究
干细胞具有自我复制及多项分化的潜能。到目前为止人们已经陆续从脐带，胎盘，骨髓，脂肪，皮肤，毛囊等组织提取分离出间充质干细胞。分离方法主要有种植法和酶消化法两种。不同的方法和实验程序对提取的干细胞的质量和纯度有很大差异。所以干细胞的分化实验是世界上普遍认可的干细胞鉴定标准。
具体检测方法如下：
a、将实施例1步骤(5)中P3代羊膜上皮细胞以1x105ml-1的密度接种于12孔板，待其融合度达到70％-80％后，加入成脂诱导液，并有对照孔。每周换液两次，诱导14-18天后，进行油红O染色鉴定脂滴形成，显微镜下观察并拍照见图6B。
b、将实施例1步骤(5)中P3代羊膜上皮细胞以1x105ml-1的密度接种于12孔板，待其融合度达到70％-80％加入成骨诱导液，并有对照孔。每周换液两次，诱导21-25天后，进行茜素红染色鉴定骨结节形成，显微镜下观察并拍照见图6C。
图6A为阴性对照，经对照检测发现，本发明羊膜上皮细胞具有良好的成脂、成骨能力。
实验例3
糖尿病治疗效果实验
T1DM模型大鼠18只，随机分为两组，其中6只大鼠接受胰岛素治疗，记为胰岛素治疗组；6只大鼠接受人羊膜上皮细胞治疗，记为人羊膜上皮细胞治疗组；6只不接受任何治疗，记为对照组。同时随机选取6只正常大鼠作为正常对照组，记为正常组。
其中，胰岛素治疗组为在每日大鼠进食前1h腹部注射3U胰岛素；人羊膜上皮细胞治疗组为将大鼠禁食12h后麻醉，并舌下静脉注射P3代人羊膜上皮细胞(1×106)悬液300μL/只；对照组不做任何治疗。
然后，每周对各组大鼠定时取血检测血糖，至第6周，并统计和计算各组小鼠血糖平均值，结果如下表所示：
由上述实验结果可知，本发明羊膜上皮细胞能够有效控制血糖含量，并能够使得大鼠血糖水平接近正常范围值。
进一步的，临床试验表明，本发明羊膜上皮细胞对人体由于糖尿病引发的高血糖也有很好的控制作用，经注射本发明羊膜上皮细胞悬浮液后，75％的糖尿病患者的血糖能够恢复至较正常水平；且体内胰岛素水平明显有所升高。
本发明中，通过将羊膜上皮细胞从胎盘上提取分离并纯化，然后在体外扩大增殖培养，能够简易、便捷且能够规模化制备羊膜上皮细胞；同时，本发明方法培养得到的羊膜上皮细胞能够用于治疗糖尿病，并能够有效控制糖尿病患者的血糖水平。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种人羊膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将羊膜从胎盘组织上剥离后清洗；
(2)将清洗后的羊膜剪碎，并用胰酶消化处理；
(3)将消化处理后得到的消化液过筛后，收集细胞滤液，并离心处理；
(4)将离心处理得到的细胞用培养基悬浮后接种，并培养；
(5)当培养的细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得人羊膜上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述清洗是以含2～5％双抗的HBSS缓冲溶液进行清洗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述胰酶消化处理是在33～39℃条件下用胰酶消化处理20～40min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消化处理为消化处理2～4次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述过筛是以孔径为200～400目的筛网进行过滤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心是在转速为1300～1600rpm的条件下离心5～15min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述胰酶消化是在33～39℃条件下用胰酶消化处理3～10min。
8.一种人羊膜上皮细胞，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞是由权利要求1-7中任一项所述方法分离培养得到的。
9.权利要求8所述人羊膜上皮细胞在制备治疗疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病为糖尿病。
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