CN106834273A - 分离核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离核酸的方法,具体涉及分离和/或纯化含核酸起始材料中的核酸,特别是短链核酸的方法和试剂盒,其特征在于以下方法步骤:(a)在有至少一种离液化合物和优选异丙醇存在下使起始材料与核酸结合支持材料接触从而将核酸结合于所述核酸结合支持材料,其中所述异丙醇的存在浓度为≥15%(v/v)和≤35%(v/v),(b)任选从核酸结合支持材料洗脱结合的核酸。所述方法尤其适于纯化母体血液中的胎儿DNA。
Description
本发明专利申请是国际申请号为PCT/EP2009/003364,国际申请日为2009年5月12日,进入中国国家阶段的申请号为“200980120955.8”,发明名称为“分离核酸的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及分离和/或纯化核酸,特别是短链核酸的方法。
背景技术
通常按照均匀基本模式分离植物、动物或人材料的核酸,例如DNA和RNA:首先部分利用降解蛋白质的酶断裂含有核酸的所述起始材料。随后采用各种方法除去各成分。此外,可在其中核酸是游离形式,即它们不在细胞内的样品材料中分离它们。因此,游离核酸可能在人工样品混合物中产生,也可能在天然样品,例如血液中产生。此类自由循环的核酸也称为胞外核酸。
纯化所述核酸的大多数现有技术方法依据以下两种分离原理:
典型的方法依据一步过程,包括加入含有离液剂(在大多数情况中)和有机萃取剂(通常是苯酚和/或氯仿)的缓冲液后进行提取。不希望的相伴物质与有机相一起弃去。然后可通过分开诸相取出保留在水相中的核酸,从而分离核酸。利用毒性和有害物质,例如苯酚和/或氯仿导致该过程的重要缺点是核酸水性溶液中残留水溶性物质作为污染物,从而不得不再采用极其费时的纯化步骤除去。
因此,鉴于这些缺点,现有技术建立了备选方法,该方法依据将核酸选择性吸附于固体支持性材料,例如二氧化硅。如果需要,裂解含核酸的起始材料,在限定条件下与所述支持材料接触以使该核酸结合该支持材料;适当时可进行洗涤步骤。随后并任选借助合适缓冲液将结合支持物的核酸从该支持物上洗脱。
例如,US 5,234,809(Boom)公开了分离核酸的方法,该方法适合多种不同应用。其描述了通过培育含核酸的起始材料与离液缓冲液和DNA-结合固相从而分离所述起始材料的核酸的方法。如果需要,离液缓冲液裂解起始材料并使核酸结合固相。所述方法非常适于分离较小样品量的核酸。WO 93/11221还描述了依据相似原理的方法。
现有技术公开了纯化核酸的许多方法,包括混合固相与离液缓冲液。由于在所有已知方法中,长链核酸与固相的结合至少优于(在大多数情况中远优于)短链核酸(例如,长度小于1000bp、500bp或甚至300bp),现有技术方法不适于有效纯化,甚至不适于相对长链核酸浓缩短链核酸。
不适于纯化短链核酸估计是因为所述短链核酸与支持材料的结合次于长链核酸(例如,基因组DNA)这一事实。因此,在大多数纯化方法中,很大部分的短链核酸丧失,纯化核酸中短链核酸不存在或不足。然而,对于某些应用,尤其需要相对于长链核酸而分离或浓缩短链核酸。
为优先浓缩短链核酸或分离短链核酸与长链核酸,现有技术中以前采用各种原理。例如,DE 10 2006 045 391描述了从短核酸中除去长核酸的方法,包括将样品应用于特别设计的固相数次。另一方法依据利用含柠檬酸盐而非离液盐的特定结合缓冲液,以此方式结合短链核酸(WO 2007/065934)。
对于各种应用领域,纯化/浓缩短链核酸(RNA和DNA)至关重要。短链核酸起关键作用的领域是产前诊断。除了内源性游离循环DNA外,妊娠妇女的血液也含胎儿的游离循环DNA。估计在妊娠妇女血液中游离循环的胎儿DNA与母亲的游离循环DNA大小不同。虽然母体游离循环DNA的平均长度常大于500bp,主要的胎儿游离循环DNA显著较小,平均长度为500bp。如果有合适的纯化方法可用,则可利用胎儿和母体核酸之间的大小差异来浓缩进而更详细地研究胎儿DNA。利用胎儿来源的游离循环DNA以供产前诊断优于经典方法,例如羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样在于其不危及胎儿,因此风险较低。然而,血液中胎儿来源的游离循环DNA量极低。根据妊娠阶段,1ml血液含有20-260拷贝的胎儿DNA不等。因此,游离循环胎儿DNA的浓度较低,但仍高于游离循环胎儿细胞的浓度。当分离母体血液中的游离循环总DNA时,与游离循环的母体DNA相比,还存在游离循环胎儿DNA的浓度极低,因此只有一部分遗传材料源自胎儿;而大多数分离的遗传材料源自母亲的问题。在许多情况中,母体DNA的背景高阻碍检测胎儿基因部分,在一些情况中,即便与实时PCR一样敏感的检测方法的灵敏度亦不足以检测胎儿DNA。
以前用于分离母体血液的游离循环DNA的方法常将胎儿和母体DNA纯化至相同程度,从而胎儿与母体DNA维持不佳的比例--胎儿DNA只占总DNA的一小部分。迄今为止,未能相对于母体DNA浓缩胎儿DNA。此外,胎儿核酸的纯化总较差,因为纯化期间常不能很好捕获短链核酸。由于纯化期间不能很好捕获它们,它们在纯化样品中的浓度低于起始样品。然而,有效纯化、甚至特异性浓缩短链胞外核酸,例如胎儿DNA是有利的,因为这将实质性增加依据游离循环胎儿DNA的产前诊断灵敏度以及由此的可靠性。
发明内容
因此,本发明的目是提供能有效分离/纯化胞外核酸,特别是短链核酸的核酸分离和/或纯化方法。本发明的另一目的是提供分离母体血液中的胎儿DNA的方法,从而能有效分离和/或浓缩所述胎儿DNA。
本申请通过分离和/或纯化含核酸的起始材料中的核酸,特别是短链核酸的方法来实现该目的,该方法的特征在于以下步骤:
(a)在有离液化合物和醇,优选异丙醇存在下使起始材料与核酸结合支持材料接触从而将核酸结合于所述核酸结合支持材料,所述醇的存在浓度为≥5体积%(%(v/v)),优选≤40体积%、优选≤35体积%、更优选≤32体积%;
(b)任选从核酸结合支持材料除去结合的核酸。
附图说明
图1:实施例1中的结果,描述了胎儿DNA的大小分布与所用合并物的函数关系。
图2:实施例1中的结果,描述了总DNA的大小分布与所用合并物的函数关系。
图3:实施例2中的结果,显示据实时PCR测定,不同结合缓冲条件所得DNA-片段收率(219bp片段和1018bp片段)。
图4:实施例3中的结果,显示据实时PCR测定,不同结合缓冲条件所得DNA-片段收率(219bp片段和1018bp片段)。
图5:实施例4中的结果,显示据SRY/18S实时PCR测定,不同提取方法/结合缓冲条件所得每毫升血浆循环DNA拷贝数。
图6:实施例4中的结果,显示不同提取方法/结合缓冲条件分离所得循环DNA的SRY/18S之比。
图7:实施例5中的结果,显示据SRY/18S实时PCR测定,不同提取方法/结合缓冲条件所得每毫升血浆循环DNA拷贝数。
图8:实施例5中的结果,显示不同提取方法/结合缓冲条件分离所得循环DNA的SRY/18S之比。
图9:图9中表格所示为核酸结合支持材料所处的各种结合条件。结果见图10。
图10:实施例5中的结果,显示据实时PCR测定,不同结合条件(见图9)所得DNA-片段收率(219bp片段和1018bp片段)。
图11:实施例6中的结果,显示的是采用Taqman探针,通过定量、双重实时PCR检测实施例6中不同方案所得Y-染色体靶标(DYS 14)和18S rDNA的拷贝数。
图12:实施例6中的结果,显示的是不同分离方案所得加入的200bp(模拟胎儿核酸)和1000bp(模拟长链母体片段)DNA标记片段的收率。图12下方的表格显示从样品中各自获得多少片段(200bp和1000bp)。
图13:实施例6中的结果,显示不同方案纯化所得200bp片段与1000bp片段之比。
图14:按照实施例8方案纯化的结果。该图显示的是双重实时PCR定量测得的循环DNA收率(18S 500bp;18S 66bp)。用QuantiTect多重PCR试剂盒进行实时PCR。
图15:实施例9中的结果,该实施例纯化游离循环无细胞RNA。通过GAPDH、c-fos和β-球蛋白mRNA的特异性实时RT-PCR定量测定RNA收率。用QuantiTect多重RT-PCR试剂盒进行实时RT-PCR。所得Ct值见图15。
具体实施方式
按照本发明方法,在特定反应条件下将核酸固定于支持材料。两种组分对于短链核酸有效结合于支持材料至关重要,即至少一种离液化合物和支链和/或非支链醇。按照本发明,在支持材料结合期间选择样品混合物中正确的醇浓度尤其重要,即≥5体积%。然而,优选醇浓度较高,因此是≥15体积%,特别是≥19体积%。选择正确的醇浓度时,短链核酸显示与支持材料结合非常好。在一定程度上可通过增加离液物质的浓度来平衡较低的醇浓度。因此,醇浓度和离液化合物浓度之间有相互作用(见下文)。调节本发明的醇浓度导致短链核酸特别有效结合,因此能在纯化期间捕获。
按照一个实施方式,醇浓度为约19至40体积%,因为可结合短链核酸,特别是DNA,因此在该范围内尤其能良好分离。微调结合调节还能相对于长链核酸而浓缩短链核酸。采用25-40体积%、25-35体积%、25-32体积%和28-32体积%的醇浓度尤其能实现该有利的浓缩作用。在这些条件下,短链核酸比长链核酸结合更佳,因此优先结合支持材料,如实施例所示。离液化合物的浓度也影响核酸的结合。选择较高浓度的离液化合物则能采用较低的醇浓度。
按照特别适于有效分离/纯化生物学样品中的胞外核酸的优选实施方式,步骤(a)的醇浓度为≥15体积%至≤25体积%。例如,在步骤(a)中,混合物中醇浓度为约18-20体积%。实验证明即使在这些低醇浓度下,可有效纯化不同长度的核酸和短链核酸,因此能有效捕获的尺寸范围较宽。为确保便于捕获短链核酸,步骤(a)中的离液化合物应有足够高的浓度。因此,步骤a)中离液化合物的浓度是≥2mol/l。为有效结合短链核酸必须专门使用的离液化合物的浓度取决于所用离液化合物的强度。因此,例如,采用较弱的离液化合物,如盐酸胍需要的浓度高于采用较强的离液化合物,如硫氰酸胍。可根据“霍夫迈斯特序列”选择即使在较低醇浓度下也能促进短链核酸结合的合适强离液化合物。按照霍夫迈斯特序列,强离液阴离子是NO3 -、ClO4 -、SCN-、NCS-和Cl3CCOO-。强离液阳离子的例子是Ba2+和胍。优选采用的离液化合物是硫氰酸盐、异硫氰酸盐和/或高氯酸盐,特别是硫氰酸胍或异硫氰酸胍。这些强离液化合物宜与≤25体积%的较低醇浓度联用。合适的浓度是≥2.0mol/l和≤3.1mol/l。
可任选进行洗涤步骤。然后从所述支持材料取出与支持材料结合的核酸,例如采用本身已知的方式洗脱,如果需要回收短链核酸的话。然后可采用已知方式进一步加工,即分析按照本发明分离/浓缩的核酸。然而,根据计划的后续进一步加工或分析,可能采用结合于支持材料的核酸因而无需洗脱。还可采用该方法除去样品的核酸。
可通过一步方法实施本发明方法。1-步方法的优点是通常获得较高的核酸产率(总产率);纯化过程中只有少部分核酸丧失。由于短链核酸能有效结合于支持材料,从而能通过本发明方法的1-步改变方式分离/浓缩,以此方式分离/浓缩短链核酸对于许多应用足够了。1-步方法对于用户还尤其方便,因为其能快速而简易地实施。如实施例中所示比较实验证明的,分离短链核酸的本发明1-步方法显然优于现有技术公开的方法,因为本发明方法能以高产率有效分离短链核酸,甚至相对于长链核酸而浓缩短链核酸。1-步方法还尤其适于有效纯化样品,特别是体液,例如尤其是血浆或血清中的胞外核酸。
对于具体应用,优选尽可能有效地相对于长链核酸而浓缩短链核酸;应能回收短链核酸而长链核酸背景没有或极低。在此情况中,最好尽可能少地纯化长链核酸。为特别有效地实现这点,按照本发明的一个实施方式,在实际分离步骤a)和除去/洗脱短链核酸的任选b)之前进行有效稀释长链核酸的步骤(x)。预先稀释长链核酸能回收特别纯的短链核酸。
按照本发明,分离和/或纯化含核酸的起始材料中的短链核酸的相应改进方法具有以下步骤:
(x)在有至少一种离液化合物和至少一种支链和/或非支链醇存在下使起始材料与核酸结合支持材料接触从而将核酸结合于所述核酸结合支持材料,所述醇的存在浓度为≤25体积%;
(a)在有至少一种离液化合物和至少一种支链和/或非支链醇存在下使步骤(x)的流出/上清液与核酸结合支持材料接触从而将所述步骤(x)的流出/上清液结合于所述核酸结合支持材料,所述醇的存在浓度为≥5体积%,优选≤40体积%、优选≤35体积%、更优选≤32体积%;
(b)任选从核酸结合支持材料洗脱结合的核酸。
按照本发明方法的该2-步改变形式,在实际分离步骤a)和分离/纯化短链核酸的b)之前进行有效稀释长链核酸的步骤(x)。结合步骤(x)包括在有离液化合物和支链和/或非支链醇存在下将核酸结合于支持材料。结合条件,特别是结合期间整个样品中醇的浓度对于长链核酸的有效稀释依旧至关重要。步骤(x)中醇浓度≤30体积%,甚至优选≤25体积%。令人吃惊的是,约25体积%的醇浓度显示能逆转大小选择性。如果依此选择离液化合物浓度,低于25体积%,优选低于20体积%时,长链和/或更长链的核酸优先结合于支持材料(参见下文)。在这些条件下,短链核酸不结合或与支持材料结合差,以此处于流出/上清液中(取决于所用的支持材料)。然后在后续步骤a)和任选的b)中,从尤其含有短链核酸的步骤(x)的流出/上清液中分离短链核酸,因而得到浓缩。
按照一个实施方式,1-步方法的步骤a)和b)(见上文)与2-步方法的步骤a)和b)非常相似和/或它们实际上相同。最后,2-步方法采用步骤(x)的流出/上清液而非含核酸的起始材料。因此,如1-步方法所述,相同的优选条件适用于2-步方法的步骤a)和b)。在前步骤(x)最终额外起到稀释长链核酸的作用,从而流出/上清液中的长链核酸存在量至少较低。如果需要,在2-步方法的情况中,长链核酸也可从步骤(x)结合的支持材料上洗脱并进一步用于不同目的。
所述离液化合物的类型和浓度影响核酸结合,特别是短链核酸的结合效率。因此,如果在先步骤(x)和后续步骤(a)中醇的浓度相同或实际相同,步骤(x)相比于步骤(a)采用较低浓度的离液化合物和/或较弱的离液化合物。进而可稀释长链核酸,因而浓缩短链核酸。步骤(x)中可用的较弱离液化合物的合适例子是盐酸胍。
各种材料,特别是生物学材料可用作含核酸的起始材料。这些包括,例如病毒、噬菌体和细胞,例如细菌,例如但不限于人、动物或植物细胞。然而,除此以外,该方法还尤其可用于分离/纯化不含细胞的样品或照此制备的样品中的游离核酸。更具体地说,本发明方法适于,例如分离人或动物来源的样品材料,特别是临床样品,如血液、血浆、血清、口腔清洗液、尿液、脑液、痰、粪便、穿刺液、上皮拭子、活检和其它组织或骨髓样品中的核酸,如DNA和/或RNA。更具体地说,本发明方法适于分离母体血液样品,特别是血浆中的胎儿DNA。本发明方法还适于分离体液,例如特别是血浆和/或血清中的游离循环核酸,例如肿瘤DNA和肿瘤RNA。
在特定情况中,样品可用于本发明方法而无需预处理。然而,在许多情况中,首先需要采用合适方法破裂样品,释放存在于所述样品中的生物学材料。技术人员已知破裂样品和细胞的方法,这些方法可以是化学、酶学或物理学方法。还可能联用这些方法。
各种因素可证明对于本文的各种生物学材料是有利的;以下方法原则上良好适用:在合适缓冲液中采用离子型和非离子型去污剂,例如SDS、LiDS或十二烷基肌氨酸钠,采用离液盐,例如盐酸胍(GHCL)、硫氰酸胍(GTC)、异硫氰酸胍(GITC)、碘化钠、高氯酸钠等促进裂解;机械撕裂,例如借助弗氏细胞压碎器、超声波、用玻璃球、镍球、铝或在液氮中研磨;酶促裂解,例如采用溶菌酶、蛋白酶、蛋白酶K或纤维素酶或借助其它可商品化购得的酶以便裂解;借助噬菌体或病毒感染裂解细胞;冻干;渗透压休克;微波处理;温度处理;例如加热或煮沸或在,例如干冰或液氮中冷冻并融化;碱性裂解。
上述方法是裂解技术的现状并且是熟知的,因此无需赘述。
当纯化游离循环核酸,例如血液样品的DNA,例如纯化母体样品中的胎儿DNA时,首先除去细胞和血液的其它固体组分(例如,通过离心),再加工如此获得的血浆。所述血浆通常不含细胞,但含有游离循环的核酸,例如母体和胎儿DNA。从血浆纯化游离核酸无需实际裂解细胞以释放核酸,因为后者早已是游离循环形式。这还适用于含有游离核酸(因此不位于细胞内)的其它样品。然而,游离循环核酸可与蛋白质和/或其它物质形成复合物。为此原因,首先用确保核酸从复合物形式释放的释放缓冲液处理含核酸的起始材料,例如血浆。释放缓冲液的功能和组成类似于用于细胞破裂的裂解缓冲液;释放缓冲液在样品中产生合适条件以便释放核酸,从而后者不再作为复合物存在。加入释放缓冲液使得核酸更易于纯化。因此,本发明方法还可用于无细胞的起始材料。依据其组成,相应的释放缓冲液还可用作裂解缓冲液以有效纯化或浓缩核酸。常用的裂解缓冲液通常可用作释放缓冲液。
根据本发明,采用含有离液剂的裂解缓冲液特别有效,甚至更是因为释放或裂解缓冲液的组成还影响核酸结合支持材料的条件。因此,还可通过选择释放或裂解缓冲液,例如以合适方式联用结合缓冲液来调节样品中对于本发明方法的效率至关重要的结合条件。本发明的释放或裂解缓冲液含有离液化合物,例如GTC或GHCL,如果合适,还含有去污剂,例如SDS或吐温。这些试剂可以是水性溶液或缓冲溶液,即“释放缓冲液”或“裂解缓冲液”。所用的缓冲液可以是任何合适缓冲液,例如三羟甲基氨基甲烷、N,N-二(羟乙基)甘氨酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸或磷酸缓冲液。或者,还可分别加入裂解或释放试剂。可依据各自***、细胞的类型等改变裂解或释放试剂的合适浓度和用量,可由技术人员确定。对于具体应用,特别是从血液样品中纯化胎儿DNA,已证实,例如2-7M浓度的离液化合物,如GTC、GHCL或NaI或高氯酸钠,0.1M-1M碱性试剂,如NaOH和0.1-50重量%(w/v)去污剂,特别是非离子型去污剂,如吐温是有用的。
核酸与支持材料结合期间,样品混合物中还存在离液化合物。然而,所述离液化合物可以,例如来自裂解或释放缓冲液和/或以,例如结合缓冲液的形式分别加入。最终,核酸与支持材料结合期间,样品中的结合条件至关重要。此处,最终存在的离液化合物最高可以是溶解度的上限。采用离液化合物有利于有效结合核酸。结合期间,样品中离液化合物的浓度优选为1-10mol/l,尤其优选2-6mol/l。合适化合物的例子是碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍和盐酸胍。上文已详细描述了所用离液化合物的浓度和类型与醇浓度和类型在调节结合条件中的相互作用。我们参考以上内容。
结合期间,样品还可含去污剂,例如非离子型去污剂,特别是吐温。所述去污剂可与释放/裂解缓冲液一起加入或是结合缓冲液的一部分。去污剂使得样品中的各种组分,例如血清和血浆组分有效溶解。如此可防止核酸结合支持材料阻塞。这在采用二氧化硅膜时特别有利。
如所述的,核酸与支持材料结合期间,样品中醇的浓度对于本发明方法至关重要。优选采用1-5碳原子的短链分支或非分支链烷醇,例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或戊醇。还可采用相应醇的混合物。尤其优选采用异丙醇或具有异丙醇样特性的醇或醇混合物。根据结合步骤(稀释长链核酸的结合步骤(x),或结合短链核酸的结合步骤a))改变醇浓度。
如果在预备步骤(x)中稀释长链核酸,采用促进长链核酸与支持材料结合的醇浓度,从而能自样品中除去这些核酸。上文详细讨论了离液化合物的浓度与醇浓度的相互作用。我们参考以上内容。流出液或上清液因所述稀释而含有较高比例的所需短链核酸。
根据本发明,为促进步骤(x)中长链核酸的结合从而改善稀释,核酸与支持材料结合期间的醇浓度低于30体积%。如果醇浓度为≤25%、尤其优选≤20体积%,可实现特别好的结果。在这些条件下,长链核酸尤其结合良好。有≥1mol/l离液化合物,优选≥2mol/l、特别是≥2.4mol/l存在时尤其是这样。此外,稀释长链核酸的离液剂浓度优选≤4mol/l、更优选≤3.5mol/l、甚至更优选≤3.2mol/l、最优选≤3.1mol/l。样品中离液化合物的优选浓度还取决于所述离液化合物的类型和/或强度。特别强的离液剂,例如硫氰酸胍应在较低浓度下使用以促进长链核酸(而非短链核酸)结合。在步骤(x)中,优选采用≥2.5mol/l和≤3.1mol/l浓度的盐酸胍,醇浓度为15-25%,优选约20%以结合长链核酸,从而在步骤(x)中稀释它们。
2-步方法的步骤a)采用较高的醇浓度以便优先结合短链核酸。为改善短链核酸的结合,结合期间样品中的醇浓度优选≥15体积%、≥19体积%,特别是约19-36%。浓度高于约25体积%时,甚至发现能相对于长链核酸浓缩短链核酸,特别是当所述核酸已被稀释时。这尤其适于调节离液化合物的浓度;合适浓度如上所述。当步骤(a)中采用≥25体积%的较高醇浓度时,采用较弱离液化合物,例如盐酸胍,或较低浓度的较强离液化合物。因此,当步骤(a)中采用≤25体积%的较低醇浓度时,相应采用较高浓度的离液化合物或更强的离液化合物,例如异硫氰酸胍或硫氰酸胍。该结果对于从血液样品中纯化胞外核酸,例如胎儿DNA尤其有利,因为样品,例如母体血浆通常主要含有长链核酸。因此,本发明方法甚至能更有效地纯化和浓缩短链核酸。
按照一个实施方式,在核酸与支持材料结合期间,样品混合物含有约30体积%的醇以便优先结合短链核酸。这些提供了浓缩短链核酸的有效方法,从而将短链核酸浓缩>2倍、>5倍、甚至10倍以上。通常可通过比较200bp核酸片段与1000bp核酸片段来测定方法的浓缩潜力。因此,本发明方法也明显优于现有技术方法。
按照1-步或2-步方法的一个实施方式,步骤(a)的样品混合物中的醇为选自下组的浓度:
·≥19体积%;
·≥25体积%;
·≥25-≤50体积%;
·≥25-≤40体积%;
·≥19-≤36体积%;
·≥19-<35体积%;
·≥15-≤25(v/v);
·≥25-≤35体积%;
·≥25-≤32体积%;
·≥28-≤32体积%。
在步骤(x)中包括稀释长链核酸的2-步方法中,步骤a)中离液化合物的浓度≥步骤(x)中离液化合物的浓度。在方法步骤(x)过渡到方法步骤a)之时,增加醇浓度而非降低离液化合物的浓度获得明显更好的结果。在实际分离步骤a)中采用的离液化合物浓度和醇浓度优选高于步骤(x)中,以促进短链核酸与支持材料结合。
按照一个实施方式,本发明方法具有至少一种以下特征:
·步骤(x)和/或步骤(a)中,混合物中离液化合物的浓度≥1mol/l至最高为溶解度界限;和/或
·步骤(x)和/或步骤(a)中,混合物中离液化合物的浓度≥2mol/l、≥2.4mol/l或≥2.6mol/l;和/或
·步骤(a)中离液化合物的浓度≥步骤(x)中离液化合物的浓度;和/或
·事先用裂解缓冲液处理含核酸的起始材料;和/或
·含核酸的起始材料不含任何细胞,不进行细胞裂解;和/或
·事先用释放缓冲液处理含核酸的起始材料;和/或
·不进行苯酚萃取;和/或
·用DNA酶处理分离的核酸;和/或
·借助该方法可分离至少30%的短链核酸;和/或
·借助该方法可分离至少50%的短链核酸;和/或
·借助该方法可分离至少60%的短链核酸;和/或
·获得至少2-倍浓度的短链核酸;和/或
·获得至少5-倍浓度的短链核酸;和/或
·获得至少10-倍浓度的短链核酸;和/或
·分离和/或浓缩特定长度的短链核酸,所述核酸选自下组:长度为≤500bp、≤400bp和/或≤300bp和/或≥50bp和/或≥100bp的核酸;和/或
·分离胞外核酸。
核酸结合支持材料优选选自下组的核酸结合固相:硅材料、硅胶、二氧化硅、玻璃、沸石、氧化铝、二氧化钛、二氧化锆、高岭土、胶状二氧化硅、陶瓷或聚合支持材料和聚苯乙烯珠。最重要的是支持材料能结合核酸这一事实。尤其优选使用二氧化硅材料。已证实二氧化硅膜和具有二氧化硅或玻璃表面的磁性颗粒可用于本发明。后者基本上是珠样或球状,优选粒径为0.02-30μm、优选0.05-15μm、特别优选0.1-10μm。本发明方法优选使用的磁性二氧化硅颗粒描述于,例如国际申请WO 01/71732,其全部内容通过引用纳入本文。
支持基质与含核酸材料培育后,核酸从其余样品液体中除去。通常借助磁场分开按照本发明结合的核酸与颗粒(使用磁性二氧化硅颗粒时)来实现。例如,可将磁性颗粒吸至进行培育的容器壁。然后可除去含有未结合磁性颗粒的样品成分的液体。在步骤(x)中,可进一步加工上清液(长链核酸结合于磁性颗粒);在步骤a)中,短链核酸结合于磁性颗粒,如果适当,在洗涤步骤后任选在步骤b)中从颗粒上洗脱短链核酸。该过程取决于进行培育的容器类型。除去液体的合适方法步骤的例子是通过倾析、移液、过滤或抽吸除去液体的那些。
例如,还可能使用所述二氧化硅膜。可通过离心、通过施加真空或通过加压除去液体。在本发明的许多应用中,特别是从母体血液样品中纯化胎儿DNA时,待纯化核酸的浓度低而体积大。现有技术中应用二氧化硅膜常产生样品体积大可能阻塞膜的问题。然而,本发明方法因为采用了特定缓冲物质/缓冲浓度而不会发生该问题。如果使用去污剂则特别有利。
可通过本发明方法分离的核酸的例子是DNA、RNA、mRNA、线粒体、外遗传修饰的、单链、双链、环状、质粒、粘粒、人工或合成核酸,还包括cDNA及其片段。本发明方法尤其适用于浓缩长度≤1000bp、≤800bp、≤500bp或≤300bp的短链核酸(例如任何形式的DNA和RNA,包括非编码RNA,例如miRNA或合成核酸)。按照一个实施方式,分离和/或浓缩任何特定长度的短链核酸,所述核酸选自下组:长度为≤500bp、≤400bp和/或≤300bp和/或≥50bp、≥100bp的核酸。优选纯化DNA和/或RNA。能特别有效地纯化长度≥50个核苷酸的DNA或RNA。为获得短链RNA,优选用DNA酶处理纯化的核酸。
还可通过选择醇浓度,特别是联用离液剂浓度来改变/控制分离核酸的大小。本发明方法的两种改变形式(1-步方法和2-步方法)还能有效分离短链核酸。如本文所述,还可通过适当调整结合条件来特异性浓缩短链核酸。如下文实施例所证实的,该方法特别适用于浓缩胎儿核酸。
因此,优选采用本发明方法分离母体血液中的胞外核酸,例如胎儿DNA。因此,本发明还提供浓缩血液样品,特别是血浆或血清中的胎儿核酸的方法,该方法的特征在于实施本发明方法以便分离/纯化短链核酸。所述方法的细节如上所述。
然而,还发现有其它应用领域,例如法庭和纯化小核酸至关重要的其它领域。此外,本发明方法还可用于诊断,例如纯化样品,如血液中的游离循环肿瘤核酸。
本发明还提供浓缩样品中的核酸,但不浓缩血液样品中的胎儿核酸的方法,该方法的特征在于实施本发明方法以便分离/纯化短链核酸。所述方法的细节如上所述。
本发明方法尤其适用于诊断。还能将其自动化,因此可在相应的纯化机器人上使用。
本发明还提供分离和/或纯化含核酸的起始材料中的核酸,特别是短链核酸的试剂盒,所述试剂盒具有缓冲液和/或试剂和任选的至少一种核酸结合支持材料以便实施本发明方法。所述方法的细节如上所述。
可使用相应的试剂盒纯化血液样品中的胎儿DNA。此外,提供相应试剂盒以便纯化样品中的短链核酸,但不浓缩血液样品中的胎儿DNA。此外,提供相应试剂盒以便纯化样品中的短链核酸,但不浓缩血液样品中的胎儿DNA。
本发明试剂盒尤其可用于诊断领域和医学应用。可以自动化方式使用它们。
实施例
现在依据实施例说明本发明。依据下文所述的实验分案进行实验。
应用本发明方法分离母体血液中的游离循环胎儿DNA,同时相对于母体DNA浓缩所述胎儿DNA的出发点是发现(如文献所述)两种核酸物质的平均长度不同。目前估计胎儿DNA的平均长度短于500bp,母体DNA的平均长度长于500bp。
实施例1:测定胎儿和母体DNA的平均长度的试验
采用怀男婴妇女的血液产生的三份不同血浆合并物研究其中游离循环DNA的大小分布。所述血浆合并物是合并物A、B和C。合并物A包含妊娠期前三个月至末三个月的怀孕妇女血液样品的血浆。在各情况中,合并物B和C包含取自妊娠期前三个月至次三个月的怀孕妇女的血液的血浆;此时游离循环胎儿DNA的含量仍较低,但对于临床诊断时机具有较高相关性。
所用的起始材料是10ml血浆,合并物A的情况中是5ml血浆。流程是调节为10ml体积的QIAamp血液DNA Midi方案(恰根公司(QIAGEN))。各情况中采用300μl AE缓冲液(恰根公司,可商品化购得)进行洗脱。洗脱后进行乙醇/乙酸钠沉淀,将干燥的沉淀物重悬在15μl缓冲液EB中(恰根公司,可商品化购得)。琼脂糖凝胶电泳后,从凝胶上割下各大小片段,按照凝胶提取的QIA快速真空方案进行凝胶提取。对于各凝胶片段,用100μl洗脱;在随后的PCR中,一式两份使用各情况的20μl洗脱液。采用合适引物进行扩增,首先是SRY基因座以便检测游离循环胎儿DNA。SRY只能在男性个体中检测到。由于仅使用确定怀有男婴的妊娠妇女的血液,所有SRY信号归因于胎儿来源的DNA。使用c-myc基因座的合适引物进行扩增以便检测母体血液中的总游离循环DNA。使用ABI 7500仪器(应用生物***公司(AppliedBiosystems))进行所述扩增。图1和图2描述了所得结果。
图1描述了胎儿DNA的大小分布与所用合并物的函数关系。
图2描述了总DNA的大小分布与所用合并物的函数关系。
该实验证明胎儿DNA仅作为短片段存在,如文献所述。大多数片段明显小于300bp,显著部分显示片段长度为300-500bp。母体血液中只有极少部分游离循环胎儿DNA长于500bp。另一方面,不是所有母体DNA长于500bp。血液中约一半的游离循环母体DNA可能仅长500bp或短一些,但另一半显著长于500bp。因此,可借助分离/浓缩核酸的大小分级相对于母体DNA显著而相对地浓缩胎儿DNA。
实施例2
为模拟胎儿DNA(大多数短于300bp,见实施例1)和母体DNA(大多数长于500bp)的不同大小分布,向血浆中加入两种不同PCR扩增子作为背景。219bp片段模拟胎儿DNA,长1018bp的片段模拟母体DNA。在第一项实验中,为此使用较高含量的所述PCR扩增子,即各例中使用2x 106拷贝/600μl血浆。流程如以下方案所示:
在5ml容器中,向600μl血浆中加入90μl蛋白酶(恰根公司)和含有胍的600μl缓冲液AL(恰根公司,可商品化购得)。涡流振荡混合后,56℃培育混合物15分钟。裂解后,将219或1018bp长度的PCR扩增子加入裂解液。用100μl异丙醇调节结合条件,从而总样品中异丙醇的浓度为6.9%(w/v)。
涡流振荡混合,然后在室温下培育10分钟。为进行结合,加入50μl具有二氧化硅表面的MagAttract磁性颗粒(恰根公司),利用摇床使混合物结合5分钟。结合后,借助磁铁分开颗粒与上清液,取出上清液。将上清液保存于4℃待进一步处理。
处理MagAttract颗粒
除去上清液后,利用平板摇床混合磁性颗粒与750μl缓冲液AW1(恰根公司,可商品化购得)5分钟,然后将颗粒悬液转移至1.5ml反应容器。在该容器中磁性分离后,取出上清液并弃去。然后用750μl缓冲液AW2(恰根公司,可商品化购得)和750μl乙醇(各情况中,利用摇床培育5分钟后)连续洗涤颗粒。用醇洗涤后,56℃,用加热块干燥颗粒10分钟。使用200μl无RNA酶的水(恰根公司)洗脱结合于颗粒的核酸,其中通再次过振荡进行所述洗脱5分钟。磁性分离后将洗脱液转移至新容器。
处理结合上清液
如下所示后处理结合的上清液/流出液(未结合磁性颗粒的材料)。结合后的上清液与2ml缓冲液B6(2.5M GuHCl,50%异丙醇)混合,产生异丙醇浓度为32.4体积%,通过涡流旋振混合,室温下培育10分钟。
培育后,加入50μl MagAttract颗粒,该流程与第一结合混合物所述相同(用AW1(恰根公司,可商品化购得)、AW2(恰根公司,可商品化购得)、乙醇洗涤、用不含RNA酶的水洗涤)。或者,结合后向上清液中加入2ml100%异丙醇(缓冲液B11),因而获得异丙醇浓度为61.9体积%。取得洗脱液的等量试样,采用实时PCR扩增119bp扩增子,该扩增子从219bp片段和1018bp片段产生相同片段。PCR期间,用所述SYBR绿检测扩增子。
如此产生图3所示图像。
该实验证明,在所选结合条件下,只有小核酸(219bp片段和1018bp片段)结合第一MagAttract颗粒,各情况中只有约10%。然而,用缓冲液B6或B11再调节结合条件,令人吃惊地导致产率依据片段大小而有差异。借助缓冲液B6,可回收超过80%的短DNA(代表胎儿DNA),而较长DNA(代表母体DNA)的结果只有约50%的收率。相反,使用缓冲液B11未在两种DNA片段长度之间产生任何实质性收率差异。
该项实验证明,在合适条件下,借助两个固体相,借助两步结合***可相对于母体DNA浓缩胎儿DNA,所回收胎儿DNA的收率中只有极少损失。
实施例3
流程如实施例2所述,但这次仅使用200,000拷贝的确定片段以模拟血液中实际游离循环拷贝数的更现实场景。这次,使用100μl缓冲液B11(参见上文)+1.2ml缓冲液B6实施第一条件下的基质结合,因而获得异丙醇浓度为20.3体积%(参见上文)。对于结合基质的其它条件,将100μl缓冲液B11和2.0ml缓冲液B6加入血浆裂解液。此外,在两种上述缓冲条件下,各情况的结合混合物中的DNA片段结合于MagAttract基质或QIAamp迷你柱。
该实验的流程如下所示:将缓冲液B11和B6加入上清液,混合,室温下温育10分钟。合并两份样品,借助伸缩管(恰根公司)真空施加于QIAamp迷你柱(恰根公司)。用1000μl(对于结合MagAtract颗粒)或750μl(对于结合QIAamp迷你柱)的AW1(恰根公司,可商品化购得)、AW2(恰根公司,可商品化购得)和乙醇连续洗涤。为干燥,以14,000rpm离心柱3分钟,置于56℃加热块中5分钟。如实施例2所述处理MagAttract颗粒。此处也用200μl无RNA酶的水(以14,000rpm离心1分钟)洗脱。随后的实时PCR产生图4所示图像。
本项实验令人吃惊地显示,如果采用相同的缓冲液组成,无论用磁性颗粒还是二氧化硅膜作为固相均很难有任何差异。加入1.2ml缓冲液B6导致较长DNA片段(约1000bp)浓缩于DNA样品中,而出乎意料且相反的是,加入2.0ml缓冲液B6浓缩了短DNA片段(约200bp)。使用二氧化硅膜(QIAamp迷你)时,DNA收率整体上高于MagAttract颗粒,但大小依赖性DNA结合仍不太显著。因此,在两-步DNA提取中联用磁性颗粒(第一基质)和二氧化硅膜(第二基质)(其中第一结合的含DNA上清液进一步使用并结合于二氧化硅膜)特别适合以两步骤有效浓缩短DNA片段,因而还适于利用第二基质相对于母体DNA有效浓缩胎儿DNA。
实施例4
流程与实施例3所示相似,但这次利用实际血液样品,采用两步结合方法。包括将1.2ml缓冲液B6加入样品以便进行第一结合步骤,随后用额外的缓冲液B6调节第一结合步骤的流出液或上清液至缓冲液B6总共为2.0ml。起始材料是确定怀有男婴的头三月和次三月妊娠妇女的血浆样品合并物。随后采用实时PCR,通过扩增SRY基因座来检测胎儿DNA,通过扩增18S基因座来检测总DNA(也参见实施例1)。为进行比较,按照对应于现有技术的QIAamp MinElute病毒真空(QIAamp MinElute Virus Vacuum)方案实施单柱方案。结果描述于图5。
本项实验的结果与实施例3的结果匹配,证明利用219bp和1018bp片段的人工***良好模拟了实际情况(实施例4)。虽然经过第一基质实际上没有胎儿DNA损失,但显著量的母体DNA早已结合于所述第一基质(此处是:MagAttract磁性颗粒)。因此,母体DNA在该步骤(x)中有效稀释,因而在经第二柱的纯化过程中早已消除。与现有技术(MinElute 1-步骤)相比,双-基质方法不仅提高胎儿DNA的绝对数量,还因通过第一基质至少部分消除母体DNA而在洗出液中获得明显更好的胎儿与母体DNA比例,从而明显提高了母体血液中胎儿遗传材料的可检测性。图6再次描述了胎儿与母体DNA的改进比例。虽然现有技术的一步纯化得到洗出液中胎儿DNA的比例约为15%(通过SRY/18S双重实时PCR定量测定),但两步纯化得到的比例是其两倍以上,即30-40%。
实施例5
流程如实施例4所示,但这次利用更高体积的血浆(每份反应混合物3ml)。此外,相互比较结合表面(MagAttract颗粒和QIAamp迷你柱)的各种组合和MagAttract的各种用量。另外,在膜2-步方案中,裂解持续30分钟而非仅15分钟。结果示于图7。该实验证实了以前实验的结果。与现有技术的1-步方案相比,本发明的2-步方案总能获得改进的胎儿DNA与母体DNA比例,而无论第二结合步骤中利用含二氧化硅表面的磁性颗粒或二氧化硅膜。本项实验中将裂解延长为30分钟看来仍进一步改善了胎儿DNA与母体DNA之比使之有利于胎儿DNA,从而能显著消除母体DNA。所述比例的改善也描述于图8。
虽然现有技术的1-基质方案获得的胎儿DNA与母体DNA之比仅为约15%,2-基质方案可将该比例增加为最高50%胎儿DNA。因此,与现有技术相比,能显著提高母体血浆中纯化的循环DNA中胎儿DNA的比例。
图9所示表格还显示了样品中核酸结合支持材料的各种反应条件(按照本发明的1-步方法)。MagAttract颗粒用作支持材料。结果示于图10。
实施例6
为比较本发明方法提取人血浆的游离循环DNA的效率,对以下方案互相比较:
1.现有技术采用的游离循环DNA的1-步方法,即,下述改进的QIAamp MinElute病毒方案。
2.提取/分离游离循环DNA的本发明1-步方案(“一步”)。
本项实验利用和测试男性献血者的合并血浆,每个方案重复提取四次。根据具体方案提取DNA。利用5ml血浆;洗脱的DNA为50μl。
1.QIAamp MinElute病毒真空方案,改进的现有技术
从5ml EDTA血浆分离游离循环核酸。方案如下所示:
释放条件
将750μl恰根蛋白酶(溶解于蛋白酶溶剂)移入50ml容器。然后加入5ml血浆和5ml含胍缓冲液AL(含5.6μg运载体RNA)。封闭容器,充分涡流振荡以获得均匀溶液。然后在56℃水浴中培育所述均匀溶液30分钟。
加入标记片段
然后向均匀混合物中加入20μl标记片段混合物以模拟胎儿核酸与母体核酸混合的情况。为此目的,各情况中加入200,000拷贝219bp(对应于胎儿DNA)和1018bp(对应于母体DNA)片段。
结合
向裂解液中加入6ml乙醇。涡流振荡混合物,在冰上培育5分钟。将裂解液加载于QIAamp迷你柱,该柱通过伸缩管连接于QIAvac 24真空设备。通过施加所述真空吸引裂解液通过该柱。小心地除去伸缩管。
洗涤步骤
将600μl缓冲液AW1(恰根公司,可商品化购得)施加于该柱并施加真空。用750μl缓冲液AW2(恰根公司,可商品化购得)和750μl乙醇重复该洗涤步骤。
将该柱置于2ml收集管中,以14,000rpm离心3分钟。然后将柱转移至新鲜的收集管中,56℃加热块干燥10分钟。
洗脱
将干燥的柱置于1.5ml容器中,将50μl缓冲液AVE(恰根公司,可商品化购得)施加于各柱;培育3分钟,以14,000rpm离心1分钟。
该方式获得的核酸存在于洗出液中。
2.按照本发明的1-步方法分离游离循环核酸
释放
将750μl恰根蛋白酶(溶解于蛋白酶溶剂)移入50ml容器。加入5ml血浆和5ml含胍裂解/释放缓冲液AL(恰根公司,可商品化购得,不含运载体RNA)。
封闭容器,充分涡流振荡以形成均匀溶液。然后在56℃水浴中培育所述均匀溶液30分钟。
加入标记片段
此处也加入20μl标记片段混合物(各自为200,000拷贝200bp和1000bp片段以模拟胎儿与母体DNA之比)。
结合
然后加入结合缓冲液调节以下结合条件:约25-35%的异丙醇和超过2M的离液化合物。样品总体的而非缓冲液中的反应条件是至关重要的,因为混合物中的反应条件对于短链核酸与支持材料的结合效率至关重要。
涡流振荡样品,在冰上培育5分钟。
然后将与结合缓冲液混合的裂解液加载于QIAamp迷你柱,该柱通过伸缩管连接于QIAvac 24真空设备。通过施加真空吸引裂解液通过该柱。然后小心除去伸缩管。
洗涤步骤
将600μl洗涤缓冲液,例如AW1(恰根公司,可商品化购得)施加于该柱,通过真空除去。再可用750μl缓冲液AW2(恰根公司,可商品化购得)和750μl乙醇重复该洗涤步骤。
将经洗涤的柱置于2ml收集管中,以14,000rpm离心3分钟。然后将柱转移至新鲜的收集管中,56℃加热块干燥10分钟。
洗脱
将柱置于1.5ml容器中,将50μl洗脱缓冲液AVE(恰根公司,可商品化购得)施加于各柱;培育3分钟,以14,000rpm离心1分钟。主要的短链核酸存在于洗出液中。
3.结果
采用Taqman样品,通过定量、双重实时PCR检测各方案的DNA收率(每份DNA提取物4次PCR循环)。首先利用Y-染色体靶标(DYS14)和18SrDNA-特异性靶标测定DNA。两种方法最终测定了样品中DNA的浓度。由于18S rDNA存在于两种染色体上,其含量是Y-染色体靶标的两倍。以每毫升血浆的单倍体基因组拷贝数表示DNA收率。
采用双重实时PCR独立测定浓缩的200bp和1000bp DNA片段中DNA小片段的浓度。
结果示于以下所述的图11等。
图11描述每份样品的DNA收率(各提取方法检验4份样品)。因此,显示的是通过各方法获得的DNA总含量。该图总体表明本发明的1-步方法获得的收率明显高于现有技术中已知的1-步方法(MinElute)。DNA收率高出数倍,这对于测定表达/存在量低的核酸特别有利。
图12描述了所加入的200bp(模拟胎儿核酸)和1000bp(模拟长链母体片段)DNA片段的收率。如上所述,200bp和1000bp片段以1:1比例加入,即各为200,000拷贝。图12表明对于纯化的核酸,短链与长链核酸之比是否仍是1:1或短链核酸是否得到浓缩。如图12所示,现有技术的1-步方法(MinElute)得到的长链与短链核酸之比约为1:1。因此,短链核酸未浓缩。图12下方的表格也表明从样品中各自获得多少片段(200bp和1000bp)。因此,例如,62.5%的200bp片段和36%的1000bp片段得到纯化的信息表明初始加入的200,000拷贝中62.5%的200bp片段和200,000拷贝中36%的1000bp片段得到纯化和分离。该图显示,相比于长链核酸,本发明的1-步方法明显浓缩了短链核酸。比例不再是1:1(加入时的),实质上更多的短链核酸得到纯化,从而浓缩在洗出液中。因此,本发明方法明显优于现有技术。
图13还描述了纯化的200bp与1000bp片段之比。现有技术已知的1-步方法实现的比例约1,而本发明1-步方法中的比例明显向短链核酸移动,因此优先将其浓缩/分离。由于首先在预备步骤中稀释了长链核酸,本发明的2-步方法甚至获得5-到10-倍浓缩。
结果表明本发明的1-步方法明显优于现有技术中已知的1-步方法。本发明的1-步方法在制备期间浓缩小核酸,这可能是因为结合期间独特的反应条件导致优先结合短链核酸。
实施例7
以下描述了从5ml血浆或血清中分离核酸,特别是循环RNA。
将1350μl缓冲液AVE(恰根公司,可商品化购得,含有胍)加入含有1350μg冻干运载体RNA的容器中,从而产生1μg/μl溶液。然后混合所述1μg/μl溶液与缓冲液AL(恰根公司,可商品化购得,含有胍)。根据样品数量调整混合比。为处理一份样品,将8.5ml缓冲液AL与5.6μl缓冲液AVE混合。对于更多的样品,必须相应调整比例。颠倒容器10次进行混合。
将6ml蛋白酶溶液(恰根公司,可商品化购得)加入冻干的恰根蛋白酶(7.5A.U,可商品化购得)并小心混合。
将500μl恰根蛋白酶移入50ml容器(试管),加入5ml血浆。然后加入8.5ml与运载体RNA混合的缓冲液AL(见上文),通过涡流振荡混合各物质。
56℃培育混合的样品30分钟。
将7.5ml结合缓冲液加入裂解液(含有约0.5到1.5mol/l,优选约1mol/l的胍和约60-90%,优选超过70%(v/v)的异丙醇)。涡流振荡混合物30秒,在冰上培育5分钟。将QIAamp迷你柱***QIAvac 24+上的真空接头(VacConnector),将伸缩管置于打开的QIAamp迷你柱中。
将裂解液引入伸缩管并施加真空。一旦吸引裂解液通过该柱,即关掉真空泵并平衡压力。撤去伸缩管。
从真空支持物上取下柱,转移至2ml收集容器。以14,000rpm离心该柱1分钟。
为制备RNA,将10μl DNA酶I储备溶液移入70μl缓冲液RDD中(恰根公司,可商品化购得)。通过晃动试管进行混合。提供的RDD缓冲液含有不含RNA酶的DNA酶套件(恰根公司,目录号79254)。
将柱再次置于QIAvac 24+真空支持物上。将DNA酶I混合物直接移到QIAamp迷你硅胶膜上,中等温度下(20-30℃)培育15分钟。
然后将600μl缓冲液AW1(恰根公司,可商品化购得)移到QIAamp迷你柱上。然后施加真空以使混合物流过该柱。随后加入750μl缓冲液AW2 (恰根公司,可商品化购得),通过施加真空吸引缓冲液通过该柱。
然后将750μl乙醇(96-100%)施加于该柱,借助真空吸引乙醇通过柱。然后从真空支持物上取下QIAamp迷你柱,取下真空接头。将该柱置于清洁的2ml收集容器中,以20,000xg、14,000rpm离心3分钟。
将该柱置于新的2ml收集容器中,56℃开盖干燥10分钟。然后将QIAamp迷你柱置于清洁1.5ml微量离心容器中,弃去收集容器。将20-60μl缓冲液AVE(恰根公司,可商品化购得)移入QIAamp迷你膜的中心。然后闭盖培育3分钟。
然后以20,000x g、14,000rpm离心1分钟以洗脱RNA。然后加入RNA酶抑制剂。
采用相应方案纯化短链RNA。
实施例8
下文描述了1-步方法的另一优选改变形式,其中所用的醇浓度低于25体积%。
该改变形式尤其适于从5ml血浆、血清或其他无细胞体液中分离循环DNA和(m)RNA。下文采用该方法以从5ml血浆中纯化循环核酸(参见图14)。
裂解
裂解期间使用约1.7-2.2mol/l硫氰酸胍和7.5-9%(w/v)去污剂。
结束时,将500μl恰根蛋白酶K移入50ml试管,并加入5ml血浆。加入4.0ml ACL缓冲液(恰根公司,含有5.6μg运载体RNA),关闭盖子,然后通过脉冲涡流振荡混合30秒。
将样品加热至60℃,培育30分钟。简单离心试管以除去盖子内的液滴。
结合
结合期间采用2.1-2.5mol/l硫氰酸胍、9-11%(w/v)去污剂和19-21体积%异丙醇。结束时,将9.0ml ACB缓冲液(恰根公司)加入裂解液,关闭盖子,通过脉冲涡流振荡15-30秒进行彻底混合。在冰上培育该混合物5分钟。
可利用柱(QIAamp迷你柱)进行纯化。将该柱置于真空接头中,将20ml伸缩管置于打开的柱中。伸缩管必须紧紧***该柱以防样品损失。将步骤的裂解液引入该柱的伸缩管,打开真空泵。吸引所有裂解液通过柱后,关掉真空,压力降低至0毫巴。小心除去伸缩管。
洗涤
将600μl缓冲液ACW1(恰根公司)施加于该柱进行洗涤。打开该柱的盖子并打开真空泵。所有缓冲液ACW1流过该柱后,关掉真空泵,压力降低至0毫巴。
将750μl洗涤缓冲液ACW2(恰根公司)施加于该柱。打开该柱的盖子并打开真空泵。所有缓冲液ACW2流过该柱后,关掉真空泵,压力降低至0毫巴。
随后将750μl乙醇(96-100%)施加于该柱。打开该柱的盖子并打开真空泵。所有乙醇流过该柱后,关掉真空泵,压力降低至0毫巴。
关闭该柱的盖子,将该柱置于清洁的收集试管中。然后全速(20 000x g,14000rpm)离心该柱3分钟。
洗脱
将该柱置于新的2ml收集试管,打开盖子,56℃培育化合物10分钟以完全干燥膜。
将该柱置于清洁的1.5ml洗脱试管中,除去收集试管。将20-150μl洗脱缓冲液(AVE缓冲液,恰根公司)施加于柱膜的中心。关闭盖子,然后在室温下培育3分钟。
全速离心1分钟(20 000x g;14 000rpm)以洗脱核酸。洗出液含有循环DNA和RNA。
图14描述了按照实施例8的方案进行纯化的结果。根据实施例8的方案(5ml合并的血浆)纯化游离循环无细胞DNA,QIAamp MinElute病毒真空试剂盒(1ml血浆)作为参比。洗出液体积为100μl。利用18S染色体RNA编码区中的500bp和66bp靶序列,通过双重实时PCR定量测定DNA收率。利用QuantiTect多重PCR试剂盒进行实时PCR。每个条件重复六次核酸提取。如所示的,与现有技术的相应常规方法相比,实施例8的方案获得的循环DNA的收率更高。此处的收率明显高于仅依据样品体积较高所预计的。
实施例9
实施例9显示从样品,特别是血浆、血清或其它体液中纯化RNA的优选方法。以下列出的浓度为5ml样品设计。
采用以下方案从5ml血浆纯化RNA(参见图15)。
如实施例8所述实施此处的方法。然而,为选择性纯化RNA,在结合之后和洗涤步骤之前进行DNA酶I消化DNA的DNA酶步骤。
将该柱转移至2ml收集试管中,以14,000离心1分钟。该步骤除去可阻碍DNA酶消化的裂解液残留物。对于各样品,将10μl DNA酶储备液加入70μl缓冲液RDD(恰根公司),颠倒样品来混合。
将柱放回其原始位置。将DNA酶I培育混合物(80μl)施加于小柱的硅胶膜,中等温度(20-30℃)下培育15分钟。
然后如实施例8所述进行洗涤和洗脱。
结果示于图15。根据实施例9的方案(5ml血浆;包括根据该方案用DNA酶处理QIAamp柱)纯化游离循环无细胞DNA,QIAamp MinElute病毒真空试剂盒(1ml血浆)纯化的游离循环无细胞DNA作为参比。洗出液体积为100μl。通过GAPDH、c-fos和β-球蛋白mRNA的特异性实时RT-PCR定量测定RNA收率。利用QuantiTect多重RT-PCR试剂盒进行实时RT-PCR。每个条件重复六次核酸提取。
Ct值(“阈周期”)较低表明与现有技术的相应常规方法相比,实施例9所述方法获得的循环mRNA收率较高。此处的收率明显高于仅依据样品体积较高所预计的。
Claims (14)
1.一种分离和/或纯化含核酸起始材料中的核酸,特别是短链核酸的方法,其特征在于以下方法步骤:
(a)在有至少一种离液化合物和至少一种支链和/或非支链醇,优选异丙醇存在下使起始材料与核酸结合支持材料接触从而将核酸结合于所述核酸结合支持材料,所述醇的存在浓度为≥15体积%和≤35体积%;
(b)任选从核酸结合支持材料洗脱结合的核酸。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(a)中,所述醇在混合物中的存在浓度为≤25体积%。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤a)中离液化合物的浓度是≥2mol/l和≤3.5mol/l,所述离液化合物选自硫氰酸盐、异硫氰酸盐或高氯酸盐。
4.如权利要求1-3中一项或多项所述的方法,其特征在于以下特征中的一个或多个:
a.步骤a)的混合物中离液化合物的浓度是≤4mol/l、≤3.5mol/l、≤3.2mol/l或≤3.1mol/l;和/或
b.至少一种步骤(a)中的离液化合物是硫氰酸盐、异硫氰酸盐或高氯酸盐;和/或
c.可采用该方法分离起始材料中存在的至少30%、50%、优选至少60%的短链核酸;和/或
d.分离和/或浓缩特定长度的短链核酸,所述短链核酸选自长度≤500bp、≤400bp和/或≤300bp和/或≥50bp和/或≥100bp的核酸。
5.如权利要求1-4中一项或多项所述的方法,其特征在于,所述核酸是胞外核酸。
6.如权利要求1-5中一项或多项所述的方法,其特征在于,待分离/纯化的核酸是DNA。
7.如权利要求1-6中一项或多项所述的方法,其特征在于,所述核酸结合支持材料选自:硅材料、硅胶、玻璃、沸石、氧化铝、二氧化钛、二氧化锆、高岭土、胶状二氧化硅、磁性颗粒,特别是磁性二氧化硅或玻璃颗粒、陶瓷或聚合支持材料。
8.一种将短链核酸结合到核酸结合支持基质的方法,其特征在于权利要求1-7所述特征。
9.一种分离和/或浓缩血液样品,特别是血浆或血清中的胞外核酸,特别是胎儿核酸的方法,其特征在于进行权利要求1-7中一项或多项所述的方法。
10.一种分离和/或浓缩样品的胞外和/或短链核酸,但不浓缩血液样品的胎儿核酸的方法,其特征在于进行权利要求1-9中一项或多项所述的方法。
11.一种分离和/或纯化含核酸起始材料中的核酸,特别是胞外和/或短链核酸的试剂盒,所述试剂盒具有实施权利要求1-7中一项或多项所述方法的缓冲液和/或试剂。
12.如权利要求11所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于纯化血液样品中的胎儿DNA。
13.如权利要求11或12所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于纯化样品的胞外核酸,特别是短链核酸,但不浓缩血液样品的胎儿核酸。
14.如权利要求1-7中一项或多项所述的方法或如权利要求11-13中一项或多项所述的试剂盒在诊断中的应用。
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