CN106795208A - 修饰的脑膜炎球菌fHbp多肽 - Google Patents

Abstract

本发明人已经鉴定了可以被修饰以增强其特性的脑膜炎球菌fHbp的变体2和变体3内的残基。

Description

修饰的脑膜炎球菌fHbp多肽

技术领域

本发明在蛋白工程改造的领域中，具体涉及脑膜炎球菌因子H结合蛋白(fHbp)，其已知是有用的疫苗免疫原。

背景

脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰阴性荚膜细菌，其定居在大约10％人群的上呼吸道。针对血清群A、C、W135和Y的缀合物疫苗可用，但可用于保护免于血清群B的唯一疫苗通常是在2013年批准的BEXSERO™产品。

BEXSERO™中的保护性免疫原之一是fHbp，其也被称为蛋白‘741’(参考文献1中的SEQ ID NO:2536；本文中的SEQ ID 1)，‘NMB1870’，‘GNA1870’[2-4]，‘P2086’，‘LP2086’或‘ORF2086’[5-7]。该蛋白的3D结构是已知的[8，9]，且该蛋白具有通过短接头连接的两个β-桶(β-barrels)。许多出版物都报道了该蛋白在脑膜炎球菌疫苗中的保护效力，例如参见参考文献10-14。fHbp脂蛋白在所有血清群的各种菌株中都表达。已将fHbp序列分为三种变体[2](在本文中称为v1、v2和v3)，并且已通常发现针对给定变体产生的血清针对表达该变体的菌株是杀细菌的，但其对表达其他两种变体之一的菌株无活性，即存在变体内交叉保护、但不存在变体间交叉保护(除了一些v2和v3交叉反应性)。

为了增加家族内交叉反应性，fHbp序列已被工程改造以含有针对所有三种变体的特异性[15]。蛋白工程改造也已经被用于去除fHbp与铁载体[16]和与人因子H[17-25]的相互作用。对于所有三种变体已经报道了与fH的相互作用的破坏，并且据推测提供了优异的疫苗免疫原[22，26]。然而，对于v2多肽，参考文献23和24报道了固有不稳定性，这也见于fH结合被破坏的突变体。该不稳定性似乎由N-末端β-桶结构域导致，并且参考文献23警告，该桶中的任何取代可能促进不稳定性。目的在于改善v2序列的稳定性的突变公开于参考文献27中。

本发明的一个目标是提供具有增强的特性的fHbp v2和v3突变体。

发明概述

在一个方面，本发明提供了包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:5的残基123和240处不同于SEQ IDNO:5，并且所述多肽可以在施用于人之后引发可识别由SEQ ID NO:4组成的多肽的抗体。

本发明的另一个方面是包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:5的残基32、123和240处不同于SEQ IDNO:5，并且所述多肽可以在施用于人之后引发可识别由SEQ ID NO:4组成的多肽的抗体。

本发明的另一个方面是包含与SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:17的残基126和243处不同于SEQ IDNO:17，并且所述多肽可以在施用于人之后引发可识别由SEQ ID NO:40组成的多肽的抗体。

本发明的另一个方面是包含与SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:17的残基32、126和243处不同于SEQID NO:17，并且所述多肽可以在施用于人之后引发可识别由SEQ ID NO:40组成的多肽的抗体。

本发明的另一个方面是包含与SEQ ID NO:47具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中相对于SEQ ID NO:47，残基123不是亮氨酸，且残基240不是谷氨酸；并且其中当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

本发明的另一个方面是包含与SEQ ID NO:47具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中相对于SEQ ID NO:47，残基32不是丝氨酸，残基123不是亮氨酸，且残基240不是谷氨酸；并且其中当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

本发明的另一个方面是包含与SEQ ID NO:48具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中相对于SEQ ID NO:48，残基126不是亮氨酸，且残基243不是谷氨酸；并且其中当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

本发明的另一个方面是包含与SEQ ID NO:48具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中相对于SEQ ID NO:48，残基32不是丝氨酸，残基126不是亮氨酸，且残基243不是谷氨酸；并且其中当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

本发明的另一个方面是融合多肽，当施用于人时，其引发针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌和表达v3 fHbp的脑膜炎球菌两者杀细菌的抗体应答。

本发明的另一个方面是包含药学上可接受的载体和本发明的多肽或融合多肽的免疫原性组合物。

本发明的另一个方面是产生人中的抗体应答的方法，其包括向所述人施用根据本发明的免疫原性组合物。

附图简述

图1显示野生型v2 fHbp(最上面的线)、v2的E266突变体(最下面的线)和v2的S58V/L149R突变体(中间线)与固定化fH的结合的SPR响应。y-轴显示相对单位，且x-轴显示时间(秒，其中0是样品注射)。

图2显示野生型和S58V/L149R突变体v2 fHbp的DSC结果。C-末端结构域不受所述突变影响，但N-末端结构域的Tm增加>20℃(用箭头标记)。y-轴显示Cp (kcal/mol/℃)，且x-轴显示温度(℃)。

图3显示野生型和E266A突变体v2 fHbp的DSC结果。N-末端转变在突变体中消失，但C-末端结构域的Tm增加>16℃。

图4显示了“野生型”(上线，虚线)和“SNB突变体”(下线，实线) v2-v3-v1 fHbp融合多肽的SPR响应。

图5显示(A)“野生型”和(B)“SNB突变体”v2-v3-v1 fHbp融合多肽的DSC结果。

图6显示作为野生型(顶部)或具有各种突变的v3 fHbp的SPR响应。

图7显示在使用S58和L149突变稳定fHbp后在因子H不存在的情况下通过X-射线晶体学测定的v2(图7a)和v3(图7b)fHbp的结构。

图8比较通过Western印迹探测的大肠杆菌提取物中的“野生型”融合体(SEQ IDNO:18)相比于稳定的非结合融合体(SEQ ID NO:27)的稳定性。图8a显示稳定的非结合融合体的截短形式不太普遍。图8b表明稳定的非结合融合体比“野生型”融合体更不易被胰凝乳蛋白酶切割。

图9提供231 SNB融合体的示意图。

详述

v2中来自菌株2996的全长fHbp具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

成熟脂蛋白缺乏SEQ ID NO:2的前19个氨基酸(加下划线；提供SEQ ID NO:4，以Cys-20开始)。还已知产生fHbp的“ΔG”形式，其中N-末端被截短最多达残基26(即去除聚甘氨酸区段，并且代替以Val-27开始)，因此提供SEQ ID NO:5。

v3中来自菌株M1239的全长fHbp具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

成熟脂蛋白缺乏SEQ ID NO:3的前19个氨基酸(加下划线；提供了SEQ ID NO:40)，且SEQ ID NO:3的ΔG形式缺乏前31个氨基酸(SEQ ID NO:17)。

本发明人已经研究了v2和v3中的两种不同类型的突变。首先，他们已经鉴定了SEQID NO:2和SEQ ID NO:3内可以被修饰以增加多肽的稳定性的残基。其次，他们已经鉴定了减少与人因子H(fH)的结合的残基。本发明涉及包含两种类型的突变的突变体fHbp多肽，由此提供具有增强特性的fHbp多肽。具体地，不结合因子H、但保留免疫原性的fHbp突变体是有利的，因为所得抗体应答针对fH结合位点中或附近的表位。在使用野生型fHbp疫苗抗原接种后，此类表位可能被因子H结合遮蔽。

最感兴趣的氨基酸如下，其根据全长序列(SEQ ID NO:1和3)以及还根据ΔG序列(SEQ ID NO:5和17)进行编号：

**当这些残基中只有一个被突变时，其优选为亮氨酸。

突变体v2 fHbp

因此，在第一个方面，本发明提供了包含突变体fHbp v2氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少k%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:5的片段；但(b)所述氨基酸序列在残基L123和E240处(和任选地，在残基S32处)(氨基酸的编号相对于SEQ ID NO:5)不同于SEQ ID NO:5。

当特征(a)涉及片段时，所述片段将包括(b)中列出的两个(或任选三个)残基，但当与SEQ ID NO:5中的那些位置相比时，那些残基将不同。突变体fHbp v2氨基酸序列可以与SEQ ID NO:5具有至少k%序列同一性且包括SEQ ID NO:5的几个片段，其中每个此类片段是至少7个氨基酸长。这些片段将通常包括来自SEQ ID NO:5的至少一个表位。对于fHbp确立了表位鉴定和作图[11；28-32]。

k的值可以选自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其优选为90(即，突变体fHbp v2氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性)且更优选为95。

施用于合适宿主动物(诸如小鼠或人)之后，所述多肽可以引发可以识别由SEQ IDNO:4组成的野生型脑膜炎球菌多肽的抗体。这些抗体将包括不识别v1或v3多肽(例如，将不识别由SEQ ID NO:46组成的野生型脑膜炎球菌多肽和由SEQ ID NO:40组成的野生型脑膜炎球菌多肽)的一些抗体，尽管它们还可以包括与v1和/或v3多肽交叉反应的一些抗体。所述抗体理想地针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌菌株、例如针对M2091菌株是杀细菌的(参见下文)。

在相同实验条件下，所述多肽具有比相同、但无(b)的序列差异的多肽更高的稳定性，例如比由SEQ ID NO:4组成的野生型脑膜炎球菌多肽更高的稳定性。稳定性增强可以使用差示扫描量热法(DSC)进行评价，例如如参考文献33和34中所讨论。DSC先前已经用来评价v2 fHbp的稳定性[24]。用于DSC评价稳定性的合适条件可以使用具有pH 6-8 (例如7-7.5)和100-200mM NaCl (例如150mM)的缓冲溶液(例如25mM Tris)中的20µM多肽。

稳定性的增加理想地为至少5℃，例如至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或更高。这些温度是指如通过DSC所评价的热转变中点(thermal transition midpoint)(Tm)的提高。野生型fHbp在解折叠期间显示两个DSC峰(N-末端结构域一个，且C-末端结构域一个)，并且当本发明的多肽包括两个此类结构域时，所述提高是指N-末端结构域的稳定性，这对于野生型v2序列可以甚至低于40℃发生[24](而C-末端结构域可以具有80℃或更高的Tm)。因此，本发明的突变体fHbp v2氨基酸序列优选具有这样的N-末端结构域，其具有至少45℃，例如，>50℃、>55℃、>60℃、>65℃、>70℃、>75℃或甚至>80℃的Tm。

除了这种增加的稳定性之外，在相同实验条件下，所述多肽具有比相同、但无(b)的序列差异的多肽更低的针对人fH的亲和力，例如比由SEQ ID NO:4组成的野生型脑膜炎球菌多肽更低的亲和力。亲和力破坏可以使用表面等离子共振(SPR)(例如，如参考文献18和21-24中所公开)以固定的人fH进行定量评价。至少10倍、且理想地至少100倍的亲和力减少(即，解离常数K_D的增加)是优选的。

在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:5是截短的。与野生型成熟序列相比，SEQ ID NO:5已经在N-末端截短，所述截短最多达且包括聚-甘氨酸序列(比较SEQ IDNO:4和5)，但SEQ ID NO:5可以在C-末端截短和/或在N-末端进一步截短。

突变体v3 fHbp

在第二个方面，本发明提供了包含突变体fHbp v3氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少j%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:17的片段；但(b)所述氨基酸序列在残基L126和E243处(和任选地，在残基S32处)(氨基酸的编号相对于SEQID NO:17)不同于SEQ ID NO:17。

当特征(a)涉及片段时，所述片段将包括(b)中列出的两个(或任选三个)残基，但当与SEQ ID NO:17中的那些位置相比时，那些残基将不同。突变体fHbp v3氨基酸序列可以与SEQ ID NO:17具有至少j%序列同一性且包括SEQ ID NO:17的几个片段，其中每个此类片段是至少7个氨基酸长。这些片段将通常包括来自SEQ ID NO:17的至少一个表位。对于fHbp确立了表位鉴定和作图[11；28-32]。

j的值可以选自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其优选为90(即，突变体fHbp v3氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少90％同一性)且更优选为95。

施用于合适宿主动物(诸如小鼠或人)之后，所述多肽可以引发可以识别由SEQ IDNO:40组成的野生型脑膜炎球菌多肽的抗体。这些抗体将包括不识别v1或v2多肽(例如，将不识别由SEQ ID NO:46组成的野生型脑膜炎球菌多肽和由SEQ ID NO:4组成的野生型脑膜炎球菌多肽)的一些抗体，尽管它们还可以包括与v1和/或v2多肽交叉反应的一些抗体。所述抗体理想地针对表达v3 fHbp的脑膜炎球菌菌株、例如针对M01-240355菌株是杀细菌的(参见下文)。

在相同实验条件下，所述多肽具有比相同、但无(b)的序列差异的多肽更高的稳定性，例如比由SEQ ID NO:40组成的野生型脑膜炎球菌多肽更高的稳定性。稳定性增强可以使用差示扫描量热法(DSC)进行评价，例如如参考文献33和34中所讨论。DSC先前已经用来评价v3 fHbp的稳定性[23]。用于DSC评价稳定性的合适条件可以使用具有pH 6-8 (例如7-7.5)和100-200mM NaCl (例如150mM)的缓冲溶液(例如25mM Tris)中的20µM多肽。

稳定性的增加理想地为至少5℃，例如至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或更高。这些温度是指如通过DSC所评价的热转变中点(Tm)的提高。野生型fHbp在解折叠期间显示两个DSC峰(N-末端结构域一个，且C-末端结构域一个)，并且当本发明的多肽包括两个此类结构域时，所述提高是指N-末端结构域的稳定性，这对于野生型v3序列可以在约60℃或更低时发生[24](而C-末端结构域可以具有80℃或更高的Tm)。因此，本发明的突变体fHbpv3氨基酸序列优选具有这样的N-末端结构域，其具有至少65℃，例如，>70℃、>75℃或甚至>80℃的Tm。

除了这种增加的稳定性之外，在相同实验条件下，所述多肽具有比相同、但无(b)的序列差异的多肽更低的针对人fH的亲和力，例如比由SEQ ID NO:40组成的野生型脑膜炎球菌多肽更低的亲和力。亲和力破坏可以使用表面等离子共振(SPR)(例如，如参考文献18和21-24中所公开)以固定的人fH进行定量评价。至少10倍、且理想地至少100倍的亲和力减少(即，解离常数K_D的增加)是优选的。

在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:17是截短的。与野生型成熟序列相比，SEQ ID NO:17已经在N-末端截短，所述截短最多达且包括聚-甘氨酸序列(比较SEQID NO:40和17)，但SEQ ID NO:17可以在C-末端截短和/或在N-末端进一步截短。

相对于SEQ ID NO:5的突变

本发明的第一个方面的多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:5的片段。然而，与SEQ ID NO:5相比， 该氨基酸序列至少在氨基酸残基L123和E240处(和任选地，还在残基S32处)具有修饰。这些残基根据SEQ ID NO:5编号；以匹配新生(nascent)野生型序列(SEQ ID NO:2)，所述编号应当改变+26(即SEQ ID NO:5的Ser-32是SEQ ID NO:2的Ser-58)，且以匹配成熟野生型序列(SEQ ID NO:4)，所述编号应当改变+7(其还允许与参考文献25的容易比较)。

三个指定残基可以被缺失，但其优选被不同的氨基酸取代。例如，Leu-123可以被其他19个天然存在的氨基酸中的任一个取代。在一些实施方案中，当进行取代时，替代氨基酸可以是简单氨基酸，诸如甘氨酸或丙氨酸。在其他情况下，替代氨基酸是保守取代，例如其在以下四组内进行：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。在其他实施方案中，所述取代是非保守的。

指定残基处的优选取代如下：S32V；L123R；和E240A。

除了目的在于增强稳定性且破坏多肽结合至fH的能力的上述突变以外，多肽可以包括一个或多个进一步突变，例如，以破坏多肽与铁载体的相互作用。与铁载体相互作用的残基可以使用参考文献16和35中的指导进行突变，例如通过比对本文中的SEQ ID NO:5与参考文献16的SEQ ID NO:4，以鉴定可以与铁载体(例如与儿茶酚盐型(catecholates)、氧肟酸盐型(hydroxamates)或羧酸盐型(carboxylates))相互作用的残基。

参考文献24报道了，v2中的某些取代可以增加对于fH的亲和力，并且因此通常应当避免这些，例如SEQ ID NO:5中的E85(参考文献24中的残基157)。

也可以突变其他残基，条件是与野生型序列(例如SEQ ID NO:4)相比，所述多肽具有更高的稳定性，具有更低的对于fH的亲和力，并且当施用于合适的哺乳动物时，可以引发针对脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

第一个方面的多肽可以包含SEQ ID NO:47。在SEQ ID NO:47中，残基32是任何氨基酸，残基123不是亮氨酸，且残基240不是谷氨酸。另一个选项是SEQ ID NO:39，其中残基32不是丝氨酸，残基123不是亮氨酸，且残基240不是谷氨酸。在SEQ ID NO:47的一个优选实施方案中，残基32是缬氨酸，残基123是精氨酸，且残基240是丙氨酸(即SEQ ID NO:50)。在SEQ ID NO:47的另一个优选实施方案中，残基32是丝氨酸，残基123是精氨酸，且残基240是丙氨酸(即SEQ ID NO:53)。

第一个方面的多肽可以包含SEQ ID NO:31。在SEQ ID NO:31中，残基32是任何氨基酸，且残基123不是亮氨酸。另一个选项是SEQ ID NO:37，其中残基32不是丝氨酸，且残基123不是亮氨酸。在SEQ ID NO:31的一个优选实施方案中，残基32是缬氨酸，且残基123是精氨酸(即SEQ ID NO:45)。在SEQ ID NO:31的另一个优选实施方案中，残基32是丝氨酸，且残基123是精氨酸(即SEQ ID NO:54)。

v2序列中指明用于突变的氨基酸残基相对于来自菌株2996的SEQ ID NO:5进行编号。来自任何其他菌株的v2 fHbp中的相应氨基酸残基可以通过序列比对容易地鉴定，例如是这样的氨基酸：当使用双序列比对算法(例如，Needleman-Wunsch全局比对算法，如下面详述)与SEQ ID NO:5比对时，其与本文提及的氨基酸对齐(aligns with)。经常地，所述氨基酸将与SEQ ID NO:5中所见的是相同的(例如残基32将是丝氨酸)，但如果不是这样，所述比对将容易地鉴定出来。

相对于SEQ ID NO:17的突变

本发明的第二个方面的多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少j%同一性的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:17的片段。然而，与SEQ ID NO:17相比， 该氨基酸序列至少在氨基酸残基L126和E243处(和任选地，在残基S32处)具有修饰。这些残基根据SEQ ID NO:17编号；以匹配新生野生型序列(SEQ ID NO:3)，所述编号应当改变+31(即SEQ ID NO:17的Ser-32是SEQ ID NO:3的Ser-63)，且以匹配成熟野生型序列(SEQ ID NO:40)，所述编号应当改变+12。

两个(或三个)指定残基可以被缺失，但其优选被不同的氨基酸取代。例如，Leu-126可以被其他19个天然存在的氨基酸中的任一个取代。在一些实施方案中，当进行取代时，替代氨基酸可以是简单氨基酸，诸如甘氨酸或丙氨酸。在其他实施方案中，替代氨基酸是保守取代，例如其在以下四组内进行：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。在其他实施方案中，所述取代是非保守的。

指定残基处的优选取代如下：S32V；L126R；和E243A。

除了目的在于增强稳定性且破坏多肽结合至fH的能力的上述突变以外，多肽可以包括一个或多个进一步突变，例如，以破坏多肽与铁载体的相互作用。与铁载体相互作用的残基可以使用参考文献16和35中的指导进行突变，例如通过比对本文中的SEQ ID NO:17与参考文献16的SEQ ID NO:4，以鉴定可以与铁载体(例如与儿茶酚盐型、氧肟酸盐型或羧酸盐型)相互作用的残基。

参考文献24报道了，v3中的某些取代可以增加对于fH的亲和力，并且因此通常应当避免这些，例如SEQ ID NO:17中的P44(参考文献24中的残基106)。

也可以突变其他残基，条件是与野生型序列(例如SEQ ID NO:40)相比，所述多肽具有更高的稳定性，具有更低的对于fH的亲和力，并且当施用于合适的哺乳动物时，可以引发针对脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

第二个方面的多肽可以包含SEQ ID NO:48。在SEQ ID NO:48中，残基32是任何氨基酸，残基126不是亮氨酸，且残基243不是谷氨酸。另一个选项是SEQ ID NO:57，其中残基32不是丝氨酸，残基126不是亮氨酸，且残基243不是谷氨酸。在SEQ ID NO:48的一个优选实施方案中，残基32是缬氨酸，残基126是精氨酸，且残基243是丙氨酸(即SEQ ID NO:51)。在SEQ ID NO:48的另一个优选实施方案中，残基32是丝氨酸，残基126是精氨酸，且残基243是丙氨酸(即SEQ ID NO:55)。

第二个方面的多肽可以包含SEQ ID NO:32。在SEQ ID NO:32中，残基32是任何氨基酸，且残基126不是亮氨酸。另一个选项是SEQ ID NO:38，其中残基32不是丝氨酸，残基126不是亮氨酸。在SEQ ID NO:32的一个优选实施方案中，残基32是缬氨酸，且残基126是精氨酸(即SEQ ID NO:44)。在SEQ ID NO:32的另一个优选实施方案中，残基32是丝氨酸，且残基126是精氨酸(即SEQ ID NO:56)。

v3序列中指明用于突变的氨基酸残基相对于来自菌株M1239的SEQ ID NO:17进行编号。来自任何其他菌株的v3 fHbp中的相应氨基酸残基可以通过序列比对容易地鉴定，例如是这样的氨基酸：当使用双序列比对算法(例如，Needleman-Wunsch全局比对算法，如下面详述)与SEQ ID NO:17比对时，其与本文提及的氨基酸对齐。经常地，所述氨基酸将与SEQID NO:17中所见的是相同的(例如残基32将是丝氨酸)，但如果这不是这样的情况，所述比对将容易地鉴定。

本发明的突变体序列

如上所提及，本发明的第一个方面的多肽可以包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:37，且第二个方面的多肽可以包含SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:57。

在与第一个方面重叠的本发明的第三个方面，本发明提供了包含与SEQ ID NO:47具有至少v%序列同一性的氨基酸序列的多肽，条件是(i)残基32是任何氨基酸，但在一些实施方案中不是丝氨酸，(ii)残基123不是亮氨酸，(iii)残基240不是谷氨酸，(iv)与野生型序列(例如SEQ ID NO:4)相比，所述多肽具有较高的稳定性且具有对于fH的较低的亲和力，(v)当施用于合适的哺乳动物时，可以引发针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。(i)至(iii)的残基编号是根据SEQ ID NO:47。

v的值可以选自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其优选为90(即，突变体fHbp v2氨基酸序列与SEQ ID NO:47具有至少90％同一性)且更优选为95。

在与第二个方面重叠的本发明的第四个方面，本发明提供了包含与SEQ ID NO:48具有至少w%序列同一性的氨基酸序列的多肽，条件是(i)残基32是任何氨基酸，但在一些实施方案中不是丝氨酸，(ii)残基126不是亮氨酸，(iii)残基243不是谷氨酸，(iv)与野生型序列(例如SEQ ID NO:40)相比，所述多肽具有较高的稳定性且具有对于fH的较低的亲和力，(v)当施用于合适的哺乳动物时，可以引发针对表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。(i)至(iii)的残基编号是根据SEQ ID NO:48。

w的值可以选自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其优选为90(即，突变体fHbp v3氨基酸序列与SEQ ID NO:48具有至少90％同一性)且更优选为95。

在第五个方面，本发明提供了包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的多肽，其通过最多达5个单一氨基酸改变(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或***)修饰，条件是(i)残基32是任何氨基酸，但在一些实施方案中不是丝氨酸，(ii)残基123不是亮氨酸，(iii)残基240不是谷氨酸，(iv)与野生型序列(例如SEQ ID NO:4)相比，所述多肽具有较高的稳定性且具有对于fH的较低的亲和力，(v)当施用于合适的哺乳动物时，可以引发针对表达v2fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

在第六个方面，本发明提供了包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的多肽，其通过最多达5个单一氨基酸改变(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或***)修饰，条件是(i)残基32是任何氨基酸，但在一些实施方案中不是丝氨酸，(ii)残基126不是亮氨酸，(iii)残基243不是谷氨酸，(iv)与野生型序列(例如SEQ ID NO:40)相比，所述多肽具有较高的稳定性且具有对于fH的较低的亲和力，(v)当施用于合适的哺乳动物时，可以引发针对表达v3fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。(i)至(iii)的残基编号是根据SEQ ID NO:48。

这些多种v2和v3多肽可以组合于融合多肽中，由此用单一多肽提供针对两种变体的免疫应答。因此，本发明的第七个方面提供了包含以下的融合体的多肽：(i)如根据本发明的第一、第三或第五个方面定义的多肽；和(ii)如根据本发明的第二、第四或第六个方面定义的多肽。有利地，当施用于合适的哺乳动物时，此类融合多肽可以引发针对表达v2fHbp的脑膜炎球菌和表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

因此，在第七个方面内，所述融合多肽包含：

(I)选自以下的第一氨基酸序列：

• 突变体fHbp v2氨基酸序列，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少k%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:5的片段；但(b)所述氨基酸序列在残基L123和E240处(和任选地，还在残基S32处)不同于SEQ ID NO:5；

• 与SEQ ID NO:47具有至少v%序列同一性的氨基酸序列，条件是(i)残基32是任何氨基酸，但在一些实施方案中不是丝氨酸，(ii)残基123不是亮氨酸，(iii)残基240不是谷氨酸；或者

• 氨基酸序列SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:50，其任选地通过最多达5个单一氨基酸改变(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或***)修饰，条件是(i)残基32是任何氨基酸，但在一些实施方案中不是丝氨酸，(ii)残基123不是亮氨酸，(iii)残基240不是谷氨酸；

以及(II)选自以下的第二氨基酸序列：

• 突变体fHbp v3氨基酸序列，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少j%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:17的片段；但(b)所述氨基酸序列在残基L126和E243处(和在一些实施方案中，还在残基S32处)不同于SEQ ID NO:17；

• 与SEQ ID NO:48具有至少w%序列同一性的氨基酸序列，条件是(i)残基32是任何氨基酸，但在一些实施方案中不是丝氨酸，(ii)残基126不是亮氨酸，(iii)残基243不是谷氨酸；或者

• 氨基酸序列SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:51，其任选地通过最多达5个单一氨基酸改变(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或***)修饰，条件是(i)残基32是任何氨基酸，但在一些实施方案中不是丝氨酸，(ii)残基126不是亮氨酸，(iii)残基243不是谷氨酸，

其中所述融合多肽(a)当施用于合适的哺乳动物时，可以引发针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌和表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答；(b)与由SEQ ID NO:4组成的野生型脑膜炎球菌fHbp相比具有更高的稳定性和更低的对于fH的亲和力；(c)与由SEQ ID NO:40组成的野生型脑膜炎球菌fHbp相比具有更高的稳定性和更低的对于fH的亲和力。

稳定性的增加理想地为至少5℃，例如至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或更高，如上所讨论。较低的亲和力优选为至少10倍，且理想地至少100倍，如上所讨论。

在第七个方面的一个实施方案中，本发明提供了包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽，其中第一氨基酸序列是SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:39，且第二氨基酸序列是SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:57。

所述第一和第二氨基酸序列可以是从N-至C-末端的任一顺序，但优选的是，所述第一序列在第二序列的上游。

所述第一和第二氨基酸序列可以通过接头序列连接。此类接头序列通常是短的(例如20个或更少氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括促进克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即Gly _n ，其中n = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQ ID NO:58))和组氨酸标签(即His _n ，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQID NO:59))。其他合适的接头氨基酸序列是本领域技术人员将显而易见的。一种有用的接头是GSGGGG (SEQ ID NO:20)，其中Gly-Ser二肽从BamHI限制性位点形成，因此有助于克隆和操作。另一种有用的接头是SEQ ID NO:21，其可以任选地前置有Gly-Ser二肽(SEQ IDNO:22，来自BamHI)或Gly-Lys二肽(SEQ ID NO:23，来自HindIII)。

所述融合多肽还可以包括v1 fHbp序列，由此用单一多肽提供针对所有三种fHbp变体的免疫应答，即当施用于合适的哺乳动物时，所述多肽可以引发针对表达v1 fHbp的脑膜炎球菌、表达v2 fHbp的脑膜炎球菌和表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。因此，第七个方面的多肽还可以包括(i)与SEQ ID NO:16具有至少i%序列同一性和/或(ii)包含SEQ ID NO:16的片段的氨基酸序列。i的值可以选自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其优选为90(即，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性)且更优选为95。(ii)的片段将通常为至少7个氨基酸长，例如来自SEQ ID NO:16的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个连续氨基酸。所述片段将通常包括来自SEQ ID NO:16的至少一个表位。与SEQ IDNO:16共享至少30个连续氨基酸将是典型的，并且通常v1 fHbp氨基酸序列将包括来自SEQID NO:16的几个(例如2、3、4、5个或更多个)片段。总体而言，与第七个方面一起使用的v1fHbp序列可以与SEQ ID NO:16具有至少i%序列同一性，且包括SEQ ID NO:16的几个片段。

有利地，v1 fHbp序列包括这样的突变，所述突变给予其与相同、但无(b)的序列差异的多肽相比对于人fH更低的亲和力(如上所讨论)，例如，与由SEQ ID NO:46组成的野生型脑膜炎球菌多肽相比更低的亲和力。例如，SEQ ID NO:16中的氨基酸残基Arg-34(SEQ IDNO:1中的残基Arg-60，和SEQ ID NO:46中的Arg-41)可以突变为Ser以破坏fHbp/fH相互作用[19,21]。因此，用于本发明的优选的v1 fHbp序列包含SEQ ID NO:49，其中残基34不是精氨酸(例如SEQ ID NO:52，其中残基34是丝氨酸)。

当多肽包括v1、v2和v3序列中每一个时，这些可以以从N至C-末端的任何顺序存在，即v1-v2-v3、v1-v3-v2、v2-v1-v3、v2-v3-v1、v3-v1-v2或v3-v2-v1。最优选的顺序是v2-v3-v1。

通常，本发明的优选fHbp融合多肽具有下式的氨基酸序列：

NH₂—A-[-X-L-]₃-B—COOH

其中每个X是如本文所定义的不同的变体fHbp序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，且B是任选的C-末端氨基酸序列。

三个X部分是如本文所讨论的v1、v2和v3序列，因此当施用于合适的哺乳动物时，所述多肽可以引发针对表达v1 fHbp的脑膜炎球菌、表达v2 fHbp的脑膜炎球菌和表达v3fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。如上所提及，三种变体优选为N-末端至C-末端v2-v3-v1的顺序。

对于[-X-L-]的每种情况，接头氨基酸序列-L-可以存在或不存在。合适的接头序列如上所讨论。

-A-是任选的N-末端氨基酸序列。这通常是短的(例如，40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括引导蛋白运输的前导序列。如果X₁缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-可以在翻译的多肽中提供此类甲硫氨酸残基(例如，-A-是单个Met残基)。Met可以在接头序列诸如SEQ ID NO:21的N-末端(即SEQ ID:24)，或在短序列(例如SEQ ID NO:25)的N-末端。

-B-是任选的C-末端氨基酸序列。这通常是短的(例如，40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括指导蛋白运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(例如包含组氨酸标签，即His _n ，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQID NO:59))，或增强多肽稳定性的序列。其他合适的C-末端氨基酸序列是本领域技术人员将显而易见的。一种合适的-B-部分是SEQ ID NO:26，其中组氨酸标签上游的Leu-Glu来自XhoI限制性位点。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的多肽。从N-末端至C-末端，该序列由以下SEQ ID氨基酸序列构成：

通过包括SEQ ID NO:24作为N-端-A部分，本发明还提供了包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的多肽。从N-末端至C-末端，该序列由以下SEQ ID氨基酸序列构成：

通过包括SEQ ID NO:24作为N-端-A部分，本发明还提供了包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的多肽。

多肽

可通过各种方式，例如通过化学合成(至少部分地)，通过使用蛋白酶消化较长多肽，通过从RNA翻译，通过从细胞培养物(例如从重组表达或从脑膜炎奈瑟氏菌培养物)纯化等制备本发明的多肽。大肠杆菌宿主中的异源表达是优选的表达途径。

本发明的多肽理想地为至少100个氨基酸长，例如150aa、175aa、200aa、225aa或更长。它们包括突变体fHbp v2和/或v3氨基酸序列，并且突变体fHbp v2或v3氨基酸序列应当类似地为至少100个氨基酸长，例如150aa、175aa、200aa、225aa或更长。

fHbp是脑膜炎奈瑟氏菌的天然脂蛋白。也已经发现其当在大肠杆菌中具有其天然前导序列或具有异源前导序列表达时被脂化。本发明的多肽可具有可被脂化的N-末端半胱氨酸残基，例如，其包含棕榈酰基，通常形成三棕榈酰-S-甘油酰-半胱氨酸。在其他实施方案中，所述多肽不被脂化。

优选制备实质上纯或实质上分离的形式的多肽(即实质上不含其他奈瑟氏菌或宿主细胞多肽)。通常，在非天然存在的环境中提供所述多肽，例如，将其与其天然存在的环境分开。在某些实施方案中，与起始材料相比，所述多肽存在于富含所述多肽的组合物中。因此提供纯化的多肽，其中纯化的意指所述多肽存在于实质上不含其他表达多肽的组合物中， 其中实质上不含意指所述组合物的总多肽中的超过50% (例如>75%、>80%、>90%、>95%或>99%)为本发明的多肽。

多肽可以采用各种形式(例如，天然的，融合体，糖基化的，非糖基化的，脂化的，二硫键等)。

SEQ ID NO 4、5、17和40不包括N-末端甲硫氨酸。如果通过在生物宿主中翻译来产生本发明的多肽，则需要起始密码子，其在大多数宿主中将提供N-末端甲硫氨酸。因此，本发明的多肽将至少在新生阶段包括位于所述SEQ ID NO序列上游的甲硫氨酸残基。

新生序列的切割意味着，突变体fHbp v2或v3氨基酸序列可能本身提供多肽的N-末端。然而，在其他实施方案中，本发明的多肽可以包括突变体fHbp v2或v3氨基酸序列的上游的N-末端序列。在一些实施方案中，所述多肽在N-末端具有单个甲硫氨酸，随后紧接着突变体fHbp v2或v3氨基酸序列；在其他实施方案中，可以使用更长的上游序列。这样的上游序列可以较短(例如，40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括指导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(例如组氨酸标签，即His _n ，其中n＝4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQ ID NO:60))。其他合适的N-末端氨基酸序列是本领域技术人员将显而易见的，例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中存在的天然上游序列。

本发明的多肽也可以包括突变体fHbp v2或v3氨基酸序列的最后氨基酸下游的氨基酸。这样的C-末端延伸可以较短(例如，40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括指导蛋白运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(例如包含组氨酸标签，即His _n ，其中n＝4、5、6、7、8、9、10或更多(SEQ ID NO:60))，或增强多肽稳定性的序列。其他合适的C-末端氨基酸序列是本领域技术人员将显而易见的。

术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语也涵盖天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述干预例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义还包括，例如，含有氨基酸的一个或多个类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。多肽可以作为单链或缔合链存在。

可以将本发明的多肽附接或固定至固体支持物。

本发明的多肽可以包含可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记或生物素标记。这在免疫测定技术中是特别有用的。

如参考文献162中所公开，fHbp可以被分割为三个结构域，称为A、B和C。以SEQ IDNO:1为例，所述三个结构域为(A) 1-119，(B) 120-183和(C) 184-274：

结构域“A”的成熟形式，从其N-末端的Cys-20至Lys-119，称为“A_成熟”。

多个fHbp序列是已知的，并且这些可以容易地用标准方法进行比对。通过这样的比对，技术人员可以(a)通过与MC58序列中的坐标比较来鉴定任何给定fHbp序列中的结构域“A”(和“A_成熟”)、“B”和“C”，和(b)鉴定多个fHbp序列中的单个残基，例如，用于鉴定取代。然而，为了便于参考，结构域定义如下：

- 给定fHbp序列中的结构域“A”是当使用双序列比对算法与SEQ ID NO:1比对时，以与SEQ ID NO:1的Met-1对齐的氨基酸开始且以与SEQ ID NO:1的Lys-119对齐的氨基酸结束的该序列的片段。

- 给定fHbp序列中的结构域“A_成熟”是当使用双序列比对算法与SEQ ID NO:1比对时，以与SEQ ID NO:1的Cys-20对齐的氨基酸开始且以与SEQ ID NO:1的Lys-119对齐的氨基酸结束的该序列的片段。

- 给定fHbp序列中的结构域“B”是当使用双序列比对算法与SEQ ID NO:1比对时，以与SEQ ID NO:1的Gln-120对齐的氨基酸开始且以与SEQ ID NO:1的Gly-183对齐的氨基酸结束的该序列的片段。

- 给定fHbp序列中的结构域“C”是当使用双序列比对算法与SEQ ID NO:1比对时，以与SEQ ID NO:1的Lys-184对齐的氨基酸开始且以与SEQ ID NO:1的Gln-274对齐的氨基酸结束的该序列的片段。

用于定义所述结构域的优选双序列比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[156]，其使用默认参数(例如，缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)。在EMBOSS软件包中的needle工具方便地进行该算法[157]。

在一些实施方案中，将本发明的突变体fHbp v2或v3氨基酸序列截短以去除其结构域A。然而，通常，优选的是，突变体fHbp v2或v3氨基酸序列应当包括N-末端β-桶和C-末端β-桶两者。

在一些实施方案中，多肽包含如上所述的氨基酸序列，除了N-末端处的最多达10个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸和/或C-末端处的最多达10 个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸缺失。

核酸

本发明提供了编码上如上所定义的本发明的多肽的核酸。

可以以许多方式从基因组或cDNA文库等制备本发明的核酸，例如，通过完全或部分化学合成(例如，DNA的亚磷酰胺合成)，通过使用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸，通过连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)。

本发明的核酸可以采用各种形式，例如，单链的、双链的、载体、引物、探针、标记的、未标记的等。

本发明的核酸优选为分离的或实质上分离的形式。

术语“核酸”包括DNA和RNA，还有其类似物，诸如含有修饰主链的类似物，还有肽核酸(PNA)等。

根据本发明的核酸可以进行标记，例如，用放射性或荧光标记进行标记。

本发明还提供了包含本发明的核苷酸序列的载体(诸如质粒)(例如克隆或表达载体，诸如适合于核酸免疫的载体)和用这样的载体转化的宿主细胞。

杀细菌应答

本发明的优选多肽可以引发针对脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。杀细菌抗体应答在小鼠中方便地测量，并且是疫苗效力的标准指标(例如，参见参考文献36的尾注14；还有参考文献37)。因此，所述抗体在合适的血清杀细菌测定法(SBA)中针对测试菌株是杀细菌的。

本发明第一个方面的多肽可优选例如在小鼠中引发针对表达v2 fHbp序列的脑膜炎奈瑟氏菌菌株(例如以下菌株中的一种或多种)杀细菌的抗体应答：961-5945、2996、96217、312294、11327、a22、gb013 (=M01-240013)、e32、m1090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、c11、m986、m2671、1000、m1096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38和/或L93/4286。杀细菌应答例如可以针对var2菌株M2091 (ATCC 13091)进行评价。

本发明第一个方面的优选多肽可以在小鼠中引发抗体，其在血清杀细菌测定中针对菌株M2091是杀细菌的。

本发明第二个方面的多肽可优选例如在小鼠中引发针对表达v3 fHbp序列的脑膜炎奈瑟氏菌菌株(例如菌株M1239、16889、gb355 (=M01-240355)、m3369、m3813、ngp165中的一种或多种)杀细菌的抗体应答。杀细菌应答可以例如针对已经完全测序(参见EMBL IDCP002422 [39])的var3菌株M01-240355(其为奈瑟氏菌MLST参考菌株(参考文献38中的id19265))进行评价。

本发明第二个方面的优选多肽可以在小鼠中引发抗体，其在血清杀细菌测定中针对菌株M01-240355是杀细菌的。

例如，包含这些多肽的免疫原性组合物可以提供>1:4的血清杀细菌滴度(其使用用人补体的Goldschneider测定[40-42])，和/或提供>1:128的血清杀细菌滴度(其使用幼兔补体)。

免疫

本发明的多肽可用作免疫原性组合物的活性成分，所以本发明提供了包含本发明的多肽的免疫原性组合物（例如，疫苗）。

本发明还提供在哺乳动物、例如小鼠或人中产生抗体应答的方法，其包括向哺乳动物施用本发明的免疫原性组合物。所述抗体应答优选为保护性和/或杀细菌抗体应答。本发明还提供了本发明的多肽，其用于这样的方法中。

本发明还提供了用于保护哺乳动物、例如小鼠或人免于奈瑟氏菌(例如脑膜炎球菌)感染的方法，其包括向哺乳动物施用本发明的免疫原性组合物。

本发明提供了本发明的多肽，其用于用作药物(例如，作为免疫原性组合物或疫苗)或作为诊断试剂。其还提供了本发明的核酸或多肽在制备用于预防哺乳动物、例如小鼠或人中的奈瑟氏菌(例如脑膜炎球菌)感染的药物中的用途。

所述哺乳动物优选是人。所述人可以是成人或优选为儿童。当所述疫苗用于预防性用途时，所述人优选是儿童(例如幼童或婴儿)；当疫苗用于治疗用途时，所述人优选是成人。意图用于儿童的疫苗也可施用于成人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。

所述用途和方法特别可用于预防/治疗疾病，包括但不限于脑膜炎(特别是细菌性脑膜炎，诸如脑膜炎球菌性脑膜炎)和菌血症。例如，它们适合于针对由脑膜炎奈瑟氏菌(例如血清群B中)引起的侵袭性脑膜炎球菌疾病主动免疫个体。

治疗性治疗的效力可以通过在施用本发明的组合物之后监测奈瑟氏菌感染来测试。预防性治疗的效力可以通过在施用所述组合物之后监测针对fHbp的免疫应答来测试。本发明的组合物的免疫原性可通过向测试主体(例如， 12-16月龄的儿童，或动物模型)施用它们，然后确定标准参数，包括血清杀细菌抗体(SBA)和ELISA滴度(GMT)来确定。通常在施用所述组合物之后约4 周确定这些免疫应答，并与施用所述组合物之前测定的值进行比较。至少4倍或8倍的 SBA增加是优选的。当施用多于一个剂量的组合物时，可以进行多于一次施用后确定。

本发明的优选组合物可以在人患者中赋予抗体滴度，所述抗体滴度优于各抗原组分对于可接受百分比的人主体的血清保护的标准。具有这样的相关抗体滴度的抗原是众所周知的，高于所述相关抗体滴度宿主被认为针对抗原是血清转化的，并且这样的滴度由组织诸如WHO公布。优选多于80%的统计学显著的主体的样品发生血清转化，更优选多于90%，仍更优选多于93%，最优选96-100%。

本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫。

本发明的组合物将通常直接施用于人患者。直接递送可通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙)，或通过直肠、经口、***、局部、透皮、鼻内、眼、耳、肺或其他粘膜施用完成。优选在大腿或上臂进行肌内施用。注射可以经由针头(例如皮下针头)进行，但或者可以使用无针注射。肌内剂量通常为约0.5 ml(例如，如BEXSERO™产品中所见)。

剂量治疗可以是单剂量时间表或多剂量时间表。多剂量可用于初次免疫时间表和/或加强免疫时间表。初次剂量时间表之后可以是加强剂量时间表。可以常规确定引发剂量之间(例如4-16周之间)和引发和加强剂量之间的合适时机。例如，取决于主体(例如婴儿或其他)，BEXSERO™产品作为两个或三个剂量施用，注意分开少于1个月或不少于2个月。

本发明的免疫原性组合物将通常包括药学上可接受的载体，其可以是本身不诱导产生对接受所述组合物的患者有害的抗体的任何物质，且可以在无不当毒性的情况下施用。药学上可接受的载体可包括液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等也可存在于这样的媒介物中。合适运体的充分讨论可见于参考文献43中。例如，BEXSERO™产品包括氯化钠、组氨酸、蔗糖、氢氧化铝和注射用水。

奈瑟氏菌感染影响机体的各个区域，所以可将本发明的组合物以各种形式制备。例如，可将所述组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。适合于肠胃外注射(例如至肌肉中)的组合物是最优选的。

所述组合物优选是无菌的。其优选不含热原。其优选被缓冲的，例如在pH 6到pH 8之间，通常为约pH 7。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选使用组氨酸缓冲剂[44]。本发明的组合物相对于人可以是等张的。

免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原，以及需要的任何其他的其他指定组分。“免疫有效量”意指以单一剂量或作为一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫***合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其他相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽范围内。剂量治疗可以是单剂量时间表或多剂量时间表(例如，包括加强剂量)。所述组合物可与其他免疫调节剂结合施用。

本发明的组合物中可以使用的佐剂包括但不限于不溶性金属盐，水包油乳剂(例如MF59或AS03，两者均含有角鲨烯)，皂苷，LPS的无毒衍生物(诸如单磷酰脂质A或3-O-脱酰化MPL)，免疫刺激性寡核苷酸，脱毒的细菌ADP-核糖基化毒素，微粒，脂质体，咪唑并喹诺酮类(imidazoquinolones)，或其混合物。充当免疫刺激剂的其他物质公开于参考文献45的第7章。

使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂是特别优选的，并且多肽通常吸附至这些盐。这些盐包括羟基氧化物和羟基磷酸盐(例如参见参考文献45的第8和9章)。所述盐可采取任何合适的形式(例如，凝胶、晶体、无定形等)。Al⁺⁺⁺应当以<1 mg/剂量存在。

最优选的佐剂是氢氧化铝，如BEXSERO™产品中所使用。本发明的组合物中的多肽可以吸附至该佐剂，如BEXSERO™产品中所见。其可以以约1 mg/ml Al⁺⁺⁺(即0.5mg/0.5ml剂量)被包括。

其他抗原性组分

本发明的组合物包括突变体v2和/或v3 fHbp序列。所述组合物应当不包括抗原的复杂或未定义的混合物是有用的，例如，优选组合物中不包括外膜囊泡。本发明的多肽优选在异源宿主中重组表达，然后纯化。

除了包括fHbp序列以外，本发明的组合物还可包括一种或多种其他奈瑟氏菌免疫原，因为靶向每种细菌多于一种免疫原的疫苗降低选择逃逸突变体的可能性。因此，组合物可包括第二多肽，当施用于合适的哺乳动物时，所述第二多肽引发针对脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。所述第二多肽可以是脑膜炎球菌 fHbp，但经常不是fHbp，例如，其可以是NHBA序列、NadA序列等。

本发明的组合物可以包括NHBA抗原。NHBA抗原作为基因NMB2132包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[46]中(GenBank登录号GI：7227388；本文为SEQ IDNO:6)。从那时起已经公开了来自许多菌株的NHBA抗原的序列。例如，NHBA的等位基因形式可见于参考文献47的图5和15中和参考文献1的实施例13和图21中(其中的SEQ ID 3179至3184)。也已经报道了NHBA抗原的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的287抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:6具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQID NO:6的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ IDNO:6的表位。在施用于主体之后，本发明的最有用的NHBA抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于主体之后，用于本发明使用的有利的NHBA抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括NadA抗原。NadA抗原作为基因NMB1994包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[46]中(GenBank登录号GI：7227256；本文为SEQ IDNO:7)。从那时起已经公开了来自许多菌株的NadA抗原的序列，并且已经充分记录了该蛋白作为奈瑟氏菌黏附素的活性。也已经报道了NadA的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的NadA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:7具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:7的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:7的表位。在施用于主体之后，本发明的最有用的NadA抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于主体之后，用于本发明使用的有利的NadA抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO:15是一种这样的片段。

本发明的组合物可以包括NspA抗原。NspA抗原作为基因NMB0663包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[46]中(GenBank登录号GI：7225888；本文为SEQ IDNO:8)。该抗原先前从参考文献48和49已知。从那时起已经公开了来自许多菌株的NspA抗原的序列。也已经报道了NspA的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的NspA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:8具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ IDNO:8的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ IDNO:8的表位。在施用于主体之后，本发明的最有用的NspA抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于主体之后，用于本发明使用的有利的NspA抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括脑膜炎球菌HmbR抗原。全长HmbR序列作为基因NMB1668包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[46]中(本文为SEQ ID NO:9)。本发明可以使用包含全长HmbR序列的多肽，但其将经常使用包含部分HmbR序列的多肽。因此，在一些实施方案中，根据本发明使用的HmbR序列可以包含与SEQ ID NO:9具有至少i%序列同一性的氨基酸序列，其中i的值为50、60、70、80、90、95、99或更高。在其他实施方案中，根据本发明使用的HmbR序列可以包含来自SEQ ID NO:9的至少i个连续氨基酸的片段，其中j的值是7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多。在其他实施方案中，根据本发明使用的HmbR序列可以包含(i)与SEQ ID NO:9具有至少i%序列同一性的氨基酸序列和/或(ii)包含来自SEQ ID NO:9的至少j个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。j个氨基酸的优选片段包含来自SEQ ID NO:9的表位。这样的表位将通常包含位于HmbR的表面上的氨基酸。有用的表位包括具有参与HmbR与血红蛋白的结合的氨基酸的那些，因为结合至这些表位的抗体可以阻断细菌结合至宿主血红蛋白的能力。参考文献50中研究了HmbR的拓扑学及其关键功能残基。在施用于主体之后，本发明的最有用的HmbR抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:9组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于主体之后，用于本发明使用的有利的HmbR抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括NhhA抗原。NhhA抗原作为基因NMB0992包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[46]中(GenBank登录号GI：7226232；本文为SEQ IDNO:10)。从那时起已经公开了来自许多菌株的NhhA抗原的序列，例如参考文献47和51，并且已经报道了NhhA的各种免疫原性片段。其也被称为Hsf。用于本发明使用的优选的NhhA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:10具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQID NO:10的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQID NO:10的表位。在施用于主体之后，本发明的最有用的NhhA抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:10组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于主体之后，用于本发明使用的有利的NhhA抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括App抗原。App抗原作为基因NMB1985包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[46]中(GenBank登录号GI：7227246；本文为SEQ IDNO:11)。从那时起已经公开了来自许多菌株的App抗原的序列。也已经报道了App的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的App抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:11具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:11的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:11的表位。在施用于主体之后，本发明的最有用的App抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:11组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于主体之后，用于本发明使用的有利的App抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括Omp85抗原。Omp85抗原作为基因NMB0182包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[46]中(GenBank登录号GI：7225401；本文为SEQID NO:12)。从那时起已经公开了来自许多菌株的Omp85抗原的序列。关于Omp85的进一步信息可见于参考文献52和53。也已经报道了Omp85的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的Omp85抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:12具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:12的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:12的表位。在施用于主体之后，本发明的最有用的Omp85抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:12组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于主体之后，用于本发明使用的有利的Omp85抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括936抗原。936抗原作为基因NMB2091包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[46]中(本文为SEQ ID NO:13)。用于本发明使用的优选的936抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:13具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:13的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:13的表位。在施用于主体之后，本发明的最有用的936抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。936抗原是fHbp的良好融合伴侣(例如，参见参考文献54和55)。

组合物可以包含：包含SEQ ID NO:14的多肽；包含SEQ ID NO:15的多肽；和本发明的包含突变体fHbp v2氨基酸序列和SEQ ID NO:13的多肽(参见参考文献54和55)。

组合物可以包含：包含SEQ ID NO:14的多肽；包含SEQ ID NO:15的多肽；和本发明的包含突变体fHbp v3氨基酸序列和SEQ ID NO:13的多肽(参见参考文献54和55)。

在一些实施方案中，将本发明的多肽与进一步脑膜炎球菌fHbp序列组合。具体而言，可以将v2多肽与v1和/或v3多肽组合以增加菌株覆盖谱[160]。因此，组合物可以包含：(i)本发明的包含突变体fHbp v2氨基酸序列的多肽；和(ii)v1 fHbp多肽和/或v3 fHbp多肽。在其他实施方案中，本发明的多肽可以包含：(i)突变体fHbp v2氨基酸序列和(ii) v1fHbp氨基酸序列和/或v3 fHbp氨基酸序列。因此，可以将v1和/或v3序列与突变体v2序列作为分开实体组合于组合物中(或融合多肽内，如上所讨论)。

类似地，可以将v3多肽与v1和/或v2多肽组合以增加菌株覆盖谱[160]。因此，组合物可以包含：(i)本发明的包含突变体fHbp v3氨基酸序列的多肽；和(ii)v1 fHbp多肽和/或v2 fHbp多肽。在其他实施方案中，本发明的多肽可以包含：(i)突变体fHbp v3氨基酸序列和(ii) v1 fHbp氨基酸序列和/或v2 fHbp氨基酸序列。因此，可以将v1和/或v2序列与突变体v3序列作为分开实体组合于组合物中(或融合多肽内，如上所讨论)。

而且，可以将突变体v2和v3多肽与彼此组合以增加菌株覆盖。因此，组合物可以包含：(i)本发明的包含突变体fHbp v2氨基酸序列的多肽；(ii)本发明的包含突变体fHbp v3氨基酸序列的多肽；和(iii) fHbp v1多肽。在其他实施方案中，本发明的多肽可以包含：(i)突变体fHbp v2氨基酸序列，(ii)突变体v3 fHbp氨基酸序列和(iii) fHbp v1氨基酸序列。因此，可以将突变体v2和v3序列与v1序列作为分开实体组合于组合物中(或融合多肽内，如上所讨论)。v1序列可以是野生型序列或突变体序列。

v1 fHbp可以包含(a)与SEQ ID NO:16具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:16的片段。上面给出关于‘k’和片段的信息。该片段将通常包括来自SEQ ID NO:16的至少一个表位，且v1 fHbp多肽将包括本发明的v2或v3氨基酸序列中不存在的至少一个表位，使得由v1 fHbp引发的抗体可以识别v1菌株。理想地，v1 fHbp可以引发针对v1菌株、例如针对菌株MC58(可作为‘BAA-335’得自ATCC)杀细菌的抗体。v1 fHbp可以包括破坏其结合至fH的能力的氨基酸突变。

v2 fHbp可以包含(a)与SEQ ID NO:5具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:5的片段。上面给出关于‘k’和片段的信息。该片段将通常包括来自SEQ ID NO:5的至少一个表位，且v2 fHbp多肽将包括本发明的v3氨基酸序列中不存在的至少一个表位，使得由v2 fHbp引发的抗体可以识别v2菌株。理想地，v2 fHbp可以引发针对v2菌株、例如针对菌株M2091 (ATCC 13091)杀细菌的抗体。v2 fHbp可以是本发明的第一个方面的多肽。

v3 fHbp可以包含(a)与SEQ ID NO:17具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:17的片段。上面给出关于‘k’和片段的信息。该片段将通常包括来自SEQ ID NO:17的至少一个表位，且v3 fHbp多肽将包括本发明的v2氨基酸序列中不存在的至少一个表位，使得由v3 fHbp引发的抗体可以识别v3菌株。理想地，v3 fHbp可以引发针对v3菌株、例如针对菌株M01-240355杀细菌的抗体。v3 fHbp可以是本发明的第二个方面的多肽。

除了奈瑟氏菌多肽抗原以外，所述组合物可包括用于针对其他疾病或感染免疫的抗原。例如，所述组合物可包括以下其他抗原中的一种或多种：

- 来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，诸如参考文献56中公开的来自血清群C的糖(还参见参考文献57)或参考文献58中的糖。

- 来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如，59，60，61]。

- 来自甲型肝炎病毒，诸如灭活病毒的抗原[例如，62，63]。

- 来自乙型肝炎病毒的抗原，诸如表面和/或核心抗原[例如，63，64]。

- 白喉抗原，诸如白喉类毒素[例如参考文献65的第3章]，例如CRM₁₉₇突变体[例如，66]。

- 破伤风抗原，诸如破伤风类毒素(例如参考文献65的第4章)。

- 来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，诸如来自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合(例如参考文献67和68)。

- 来自流感嗜血杆菌B（Haemophilus influenzae B）的糖抗原[例如57]。

- 脊髓灰质炎抗原[例如，69，70]，诸如IPV。

- 麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原(例如参考文献65的第9、10和11章)。

- 流感抗原(例如参考文献65的第19章)，诸如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

- 来自卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[例如71]。

- 来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)的蛋白抗原[例如72，73]。

- 来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)的糖抗原。

- 来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)的抗原[例如73，74，75]。

- 来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原[例如76]。

所述组合物可以包含这些其他抗原中的一种或多种。

必要时，可使毒性蛋白抗原脱毒(例如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[68])。

当所述组合物中包括白喉抗原时，优选还包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当包括破伤风抗原时，优选还包括白喉和百日咳抗原。类似地，当包括百日咳抗原时，优选还包括白喉和破伤风抗原。DTP组合因此是优选的。

糖抗原优选为缀合物的形式。下文更详细讨论缀合物的载体蛋白。

组合物中的抗原通常各以至少1μg/ml的浓度存在。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。

本发明的免疫原性组合物可以治疗性地(即，治疗已有感染)或预防性地(即，预防将来的感染)使用。

作为本发明的免疫原性组合物中使用蛋白抗原的替代方案，可使用编码该抗原的核酸(其可以是RNA，诸如自复制RNA，或DNA，诸如质粒)。

在一些实施方案中，除了fHbp序列以外，本发明的组合物还包含来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中的1、2、3或4种的缀合的荚膜糖抗原。在其他实施方案中，除了fHbp序列以外，本发明的组合物还包含至少一种缀合的肺炎球菌荚膜糖抗原。

脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A

目前的血清群C疫苗(MENJUGATE™[56，77]，MENINGITEC™和NEISVAC-C™)包括缀合的糖。Menjugate™和Meningitec™具有与CRM₁₉₇载体缀合的寡糖抗原，而NEISVAC-C™使用与破伤风类毒素载体缀合的完整多糖(脱-O-乙酰化)。MENACTRA™疫苗含有来自血清群Y、W135、C和A各自的缀合的荚膜糖抗原。

本发明的组合物可包括来自脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A中的一种或多种的荚膜糖抗原，其中所述抗原与载体蛋白缀合和/或是寡糖。例如，所述组合物可包括来自：血清群C；血清群A和C；血清群A、C和W135；血清群A、C和Y；血清群C、W135和Y；或来自血清群A、C、W135和 Y中的所有四种的荚膜糖抗原。

每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的典型量为1μg至20μg，例如，约1μg、 约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(表示为糖)。

当混合物包含来自血清群A和C的荚膜糖时，MenA糖∶MenC糖的比率(w/w)可以为大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。在混合物包含来自血清群Y以及血清群C和W135之一或两者的荚膜糖时，MenY 糖:MenW135糖的比率(w/w)可以大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)，和/或MenY糖:MenC糖的比率(w/w)可以小于1(例如，1:2、1:3、1:4、1:5或更低)。来自血清群A:C:W135:Y的糖的优选比率(w/w)为：1:1:1:1；1:1:1:2；2:1:1:1；4:2:1:1；8:4:2:1；4:2:1:2；8:4:1:2；4:2:2:1；2:2:1:1；4:4:2:1；2:2:1:2；4:4:1:2；和2:2:2:1。来自血清群C:W135:Y的糖的优选比率(w/w)为：1:1:1；1:1:2；1:1:1；2:1:1；4:2:1；2:1:2；4:1:2；2:2:1；和2:1:1。优选使用实质上相等质量的各种糖。

可以使用寡糖形式的荚膜糖。这些通过以下方便地形成：对纯化的荚膜多糖进行片段化(例如通过水解)，通常随后为纯化期望大小的片段。

优选进行多糖的片段化，以使寡糖的最终平均聚合度(DP)小于30(例如，对于血清群A，10至20，优选约10；对于血清群W135和Y，15至25，优选约 15-20；对于血清群C，12至22；等)。DP可通过离子交换层析或通过比色测定方便地测量[78]。

如果进行水解，则通常对水解产物进行筛分，以去除短长度寡糖[57]。这可以各种方式诸如超滤和随后离子交换层析实现。对于血清群A，优选去除聚合度小于或等于约6的寡糖；对于血清群W135和Y，优选去除聚合度小于约4的寡糖。

参考文献77中公开了优选的MenC糖抗原，如Menjugate™中所使用。

所述糖抗原可以进行化学修饰。这对于降低血清群A的水解是特别有用的[79]。可以进行脑膜炎球菌糖的脱-O-乙酰化。对于寡糖，修饰可发生在解聚之前或之后。

当本发明的组合物包括MenA糖抗原时，所述抗原优选为修饰糖，其中天然糖上的一个或多个羟基已被保护基团所替代[79]。该修饰改善对水解的耐受性。

共价缀合

本发明的组合物中的荚膜糖通常与载体蛋白缀合。通常，缀合增强糖的免疫原性，因为所述缀合可将糖从T-非依赖性抗原转化为T-依赖性抗原，因此引发免疫记忆。缀合对于儿科疫苗是特别有用的，并且是众所周知的技术。

典型的载体蛋白是细菌毒素，诸如白喉或破伤风毒素或类毒素或其突变体。CRM₁₉₇白喉毒素突变体[80]是有用的，并且是PREVNAR™产品中的载体。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白复合物[81]、合成肽[82,83]、热休克蛋白[84,85]、百日咳蛋白[86,87]、细胞因子[88]、淋巴因子[88]、激素[88]、生长因子[88]、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4⁺ T细胞表位的人工蛋白[89]诸如N19[90]、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[91-93]、肺炎球菌溶血素[94]或其无毒衍生物[95]、肺炎球菌表面蛋白PspA[96]、摄铁蛋白[97]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[98]、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白 A(rEPA)[99]等。

可以使用任何合适的缀合反应，在必要时使用任何合适的接头。

糖通常将在缀合前活化或官能化。活化可涉及例如氰化剂(cyanylatingreagents)，诸如CDAP(例如1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate)[100、101等])。其他合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷(norborane)、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU等。

可使用任何已知程序，例如参考文献102和103中描述的程序，经由接头基团进行连接。一种类型的连接涉及多糖的还原胺化，将所得氨基与己二酸接头基团的一个末端偶联，然后将蛋白偶联至己二酸接头基团的另一末端[104，105]。其他接头包括B-丙酰胺基[106]、硝基苯基-乙胺[107]、卤代酰基卤化物[108]、糖苷键[109]、6-氨基己酸[110]、ADH[111]、C₄至C₁₂部分[112]等。作为使用接头的替代方案，可使用直接连接。与蛋白的直接连接可包括氧化多糖，随后与蛋白还原胺化，如例如参考文献113和114中所述。

优选涉及以下步骤的方法：将氨基引入糖中(例如通过用-NH₂替代末端=O基团)，随后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生化，并且与载体蛋白反应。另一种优选的反应使用CDAP活化蛋白D载体，例如对于MenA或MenC。

外膜囊泡(OMV)

优选的是，本发明的组合物应当不包括抗原的复杂或未定义的混合物，这是OMV的典型特征。然而，本发明可以与OMV结合使用，因为已发现fHbp增强其效力[4]，无论是通过简单混合还是通过在用于OMV制备的菌株中过表达本发明的多肽。

通常可以使用该方法来改善脑膜炎奈瑟氏菌血清群B微泡[115]、“天然 OMV”[116]、小泡和外膜囊泡(例如参考文献117-123等)的制备。

典型的外膜囊泡从细菌人工制备，并且可使用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或通过非去污剂方式(例如参见参考文献127)制备。用于形成OMV的技术包括：用胆汁酸盐去污剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、熊胆酸等的盐，且脱氧胆酸钠[124和125]优选用于处理奈瑟氏菌)在不沉淀去污剂的足够高pH下[126]处理细菌。其他技术基本上可以在去污剂不存在的情况下[127,128]使用技术诸如超声处理、均质化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、弗氏压碎器压碎(French press)、混合等来进行。不用去污剂或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原，诸如NspA和fHbp[127]。因此，本发明使用的OMV可以使用含有约0.5％或更低、例如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或甚至零的脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液来制备。

被称为MV(膜囊泡)和NOMV(天然外膜囊泡)的囊泡是天然存在的膜囊泡，其在细菌生长期间自发形成，且释放至培养基中。可以通过以下获得MV：在肉汤培养基中培养奈瑟氏菌，将肉汤培养基中的全细胞与较小MV分离(例如，通过过滤或通过低速离心以仅沉淀细胞而不沉淀较小囊泡)，然后从细胞耗竭的培养基收集MV(例如，通过过滤，通过差速沉淀或MV的聚集，通过高速离心以沉淀MV)。通常可根据培养基中产生的MV的量来选择用于产生MV的菌株，例如，参考文献135和136描述了具有高MV产量的奈瑟氏菌。

囊泡可以从已经遗传操作的细菌制备[129-132]，例如，以增加免疫原性(例如超表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。它们可以从高发泡菌株(hyperblebbing strains)制备[133-136]。可使用来自具有不同I类外膜蛋白亚型的细菌的囊泡，例如，使用两种不同的遗传工程改造的囊泡群体(各自展示三种亚型)的六种不同亚型[137,138]，或使用三种不同的遗传工程改造的囊泡群体(各自展示三种亚型)的九种不同亚型等。有用的亚型包括：P1.7,16；P1.5-1,2-2；P1.19,15-1；P1.5-2,10；P1.12-1,13；P1.7-2,4；P1.22,14；P1.7-1,1；P1.18-1,3,6。然而，通常，对于本发明优选的是，从野生型脑膜炎球菌菌株制备OMV。

因此，本发明所用的囊泡可以从任何野生型脑膜炎球菌菌株制备。所述囊泡通常来自血清群B菌株，但也可能从除了B以外的血清群(例如，参考文献126描述了血清群A的方法)诸如A、C、W135或Y来制备。所述菌株可以是任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型(例如，P1.4)和任何免疫型(例如，L1；L2；L3；L3,7；L3,7,9；L10；等)。所述脑膜炎球菌可以来自任何合适的谱系，包括高侵袭性和高毒力谱系，例如以下七种高毒力谱系中的任一种：亚群I；亚群III；亚群IV-1；ET-5复合群(complex)；ET-37复合群；A4簇；谱系3。最优选地，从菌株NZ98/254或具有P1.4 PorA血清亚型的另一菌株制备OMV。本发明有利地使用BEXSERO™和MENZB™产品中使用的从菌株NZ98/254制备的相同OMV。

囊泡将通常包括脑膜炎球菌脂寡糖(LOS，也称为LPS，脂多糖)，但OMV中的LOS的热原效应比用相同量的纯化的LOS所见的热原效应低得多，并且OMV至氢氧化铝的吸附进一步降低热原性。LOS水平以内毒素的国际单位(IU)表示，并且可以通过LAL测定法(鲎变形细胞溶解物)测试。优选地，LOS以小于2000 IU/μg OMV蛋白存在。

当LOS存在于囊泡中，可处理囊泡，以便连接其LOS和蛋白组分(“泡内”缀合[139])。

用于OMV纯化的一种有用方法描述于参考文献140中，并且涉及对粗制OMV 超滤，而非代替高速离心。该方法可以涉及在超滤进行之后的超离心的步骤。该方法可以涉及在超滤进行之后的超离心的步骤。OMV也可以使用参考文献152中描述的两阶段大小过滤方法进行纯化。

OMV可以在制备它们之后有用地悬浮于蔗糖溶液中。

宿主细胞

本发明提供了表达本发明的多肽的细菌。所述细菌可以是脑膜炎球菌或大肠杆菌。所述细菌可以组成型表达所述多肽，但是在一些实施方案中，表达可以在诱导型启动子的控制下。所述细菌可以超表达所述多肽(参见参考文献141)。所述多肽的表达理想地不是相可变的(phase variable)。

本发明还提供了从本发明的细菌(特别是从脑膜炎球菌)制备的外膜囊泡。其还提供了从本发明的细菌产生囊泡的方法。从这些菌株制备的囊泡优选包含本发明的多肽，其在囊泡中应当为免疫可及的形式，即可以结合至本发明的纯化多肽的抗体也应当能够结合存在于囊泡中的多肽。

除了编码本发明的多肽以外，本发明的细菌可以具有一种或多种进一步修饰。例如，它们可以具有修饰的fur基因[142]。可以上调nspA表达的表达并伴有porA和cps敲除。用于OMV产生的脑膜炎奈瑟氏菌的进一步敲除突变体公开于例如参考文献139中。参考文献143描述了从经修饰以表达六种不同的PorA亚型的菌株构建囊泡。也可使用通过敲除参与LPS生物合成的酶而实现的具有低内毒素水平的突变体奈瑟氏菌[144，145]。本发明可以使用经工程改造以降低或关闭参与赋予LPS的脂质A部分毒性的至少一种基因、具体地lpxl1基因的表达的突变体奈瑟氏菌[146]。类似地，本发明可以使用经工程改造以降低或关闭参与荚膜多糖合成或输出的至少一种基因、具体地synX和/或ctrA基因的表达的突变体奈瑟氏菌。这些或其他突变体都可用于本发明。

在一些实施方案中，菌株可以已经对PorA表达下调，例如，其中PorA 的量已经相对于野生型水平(例如相对于菌株H44/76)减少了至少20％(例如， > 30%、 > 40%、 > 50%、 > 60%、 > 70%、 > 80%、 > 90%、 > 95%等)，或者甚至被敲除。

在一些实施方案中，菌株可以超表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白。例如，菌株可以超表达NspA、蛋白287[117]、fHbp[141](包括本发明的fHbp)、TbpA 和/或TbpB[147]、Cu,Zn-超氧化物歧化酶、HmbR等。

可将编码本发明的多肽的基因整合入细菌染色体中，或以附加体形式存在，例如在质粒内。

有利地，对于囊泡产生，可以将脑膜炎球菌遗传工程改造，以确保多肽的表达不发生相转变。用于减少或消除脑膜炎球菌中的基因表达的相转变的方法公开于参考文献148中。例如，可将基因置于组成型或诱导型启动子的控制下，或通过去除或替代负责其相转变的DNA基序。

在一些实施方案中，菌株可以包括参考文献122、129、133和139中公开的敲除和/或超表达突变中的一种或多种。例如，遵循这四个文件中的指导和命名，用于下调和/或敲除的有用基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；或(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB、SynX和/或SynC。

在一些实施方案中，当使用突变体菌株时，其可以具有以下特征中的一种或多种或所有：(i)下调或敲除的LgtB和/或GalE以截短脑膜炎球菌LOS；(ii)上调的TbpA；(iii)上调的NhhA；(iv)上调的Omp85；(v)上调的LbpA；(vi)上调的NspA；(vii)敲除的PorA；(viii)下调或敲除的FrpB；(ix)下调或敲除的Opa；(x)下调或敲除的Opc；(xii)缺失的cps基因复合体。截短的LOS可以是不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位的截短的LOS，例如，其可以是半乳糖缺陷的LOS。所述LOS可以不具有α链。

根据用于制备囊泡的脑膜炎球菌菌株，它们可包括或不包括菌株的天然fHbp抗原[149]。

在一个优选的实施方案中，脑膜炎球菌不表达功能性MltA蛋白。如参考文献150和151中所讨论，脑膜炎球菌中的MltA(膜结合的裂解性转糖基酶，也称为GNA33)的敲除提供了这样的细菌，其将大量膜囊泡自发释放入培养基，它们可以容易地从所述培养基纯化。例如，所述囊泡可以使用参考文献152的两阶段大小过滤方法进行纯化，所述方法包括：(i)第一过滤步骤，其中囊泡基于它们不同的大小与细菌分离，且囊泡进入滤液；和(ii)第二过滤步骤，其中囊泡保留于保留物中。所述MltA突变(下调或敲除)已经用于'GMMA'疫苗中[153]，并且可以方便地与具体地至少一种参与赋予LPS的脂质A部分毒性的基因(特别是lpxl1)和/或至少一种参与荚膜多糖合成或输出的基因(特别是synX和/或ctrA基因)的进一步下调或敲除进行组合。

使用该方法的‘GMMA’(膜抗原的广义模块)疫苗的优选脑膜炎球菌菌株表达本发明的第一、第三或第五个方面的突变体v2 fHbp和/或第二、第四或第六个方面的突变体v3fHbp，并且表达可由强启动子驱动。该菌株释放的囊泡包括免疫原性形式的突变体v2和/或v3 fHbp蛋白，并且囊泡的施用可以提供杀细菌抗体应答，如参考文献153中所讨论。该菌株也可以表达v1 fHbp，或者可以替代提供v1 fHbp作为可溶形式的单独重组蛋白(并且v1fHbp可以是野生型或突变体序列，例如经突变，以破坏其结合至fH的能力，如上所讨论)。本发明提供这样的菌株，并且还提供了这些菌株释放的囊泡，例如如菌株的生长之后从培养基所纯化。用于在这些菌株中表达的优选的v2突变体具有如本文所讨论的L123和E240 (和任选地S32)处的突变，并且用于在这些菌株中表达的优选的v3突变体具有如本文所讨论的L126和E243 (和任选地S32)处的突变。因此，从表达这些v2和v3突变体fHbp序列的脑膜炎球菌制备的囊泡是用于本发明的疫苗中的特别优选的免疫原。用于以该方式诱变的有用的野生型v2序列包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:33(包含ΔG形式SEQ ID NO:34)，并且用于以该方式诱变的有用的野生型v3序列包含SEQ ID NO:36。

用于这样的菌株中的有用的启动子包括参考文献154和155中公开的那些。例如，所述启动子可以是：(a)来自孔蛋白基因，优选porA或porB的启动子，特别是来自脑膜炎奈瑟氏菌；或(b) rRNA基因启动子(诸如16S rRNA基因)，特别是来自脑膜炎奈瑟氏菌。当使用脑膜炎球菌孔蛋白启动子时，其优选来自porA，并且甚至更特别是来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域，和/或来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域(优选地，其中-10区域和-35区域由12-20个核苷酸的间插序列分开，并且其中所述间插序列不含聚-G序列或包括具有不超过八个连续G核苷酸的聚-G序列)。当使用rRNA基因启动子时，其可以包含更具体地(i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域和/或(ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。也可使用(a)和(b)的杂合体，例如以具有来自porA启动子的-10区域和来自rRNA基因启动子的-35区域(其可以是共有的-35区域)。因此，有用的启动子可以是这样的启动子，其包括(i)来自(特别是脑膜炎球菌)rRNA基因的-10区域和来自(特别是脑膜炎球菌)porA基因的-35区域，或(ii)来自(特别是脑膜炎球菌)porA基因的-10区域和来自(特别是脑膜炎球菌)rRNA基因的-35区域。

一般概念

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括额外物质，例如X+Y。提及“包含(comprising)”(或“包含(comprises)”等)可以任选地被提及“由...组成(consisting of)”(或“由…组成(consists of)”等)替代。

与数值x相关的术语“约”是任选的，并且意指，例如x±10％。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。

“序列同一性”优选通过Needleman-Wunsch全局比对算法[156]使用默认参数(例如，缺口开放罚分＝10.0和缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)确定。在EMBOSS软件包中的needle工具方便地进行该算法[157]。当应用是指与具体SEQ ID的序列同一性，应当经该SEQ ID的全长来计算同一性。

血清群之后，脑膜炎球菌分类包括血清型、血清亚型和然后免疫型，并且标准命名法列出血清群、血清型、血清亚型和免疫型，其各自通过冒号隔开，例如B:4:P1.15:L3,7,9。在血清群B内，一些谱系经常引起疾病(高侵袭性)，一些谱系引起比其他谱系更严重形式的疾病(高毒力)，且其他谱系完全很少引起疾病。识别七种高毒力谱系，即亚群I、III和IV-1、ET-5复合群、ET-37复合群、A4簇和谱系3。这些已经通过多位点酶电泳(MLEE)定义，但多位点序列分型(MLST)也已经用于分类脑膜炎球菌。四种主要的高毒力簇是ST32、ST44、ST8和ST11复合群。

通常，本发明不涵盖参考文献2、3、5、6、7、158、159、160、161、162、163、164和165中具体公开的各种fHbp序列。

实施例

实施例1：针对fH结合的诱变

当通过使用固定化的人fH的表面等离子共振(SPR)评价时，野生型v2蛋白(SEQ ID NO:2)显示与fH的强结合(图1，最上面的线)。为了破坏fHbp结合fH的能力，将v2中的Glu-266(SEQ ID NO:5中的E240；对应于参考文献19和25中的E248)和v3中的Glu-274(SEQ ID NO:17中的E243)突变为Ala。v2中的E266A突变强烈降低fH结合(图1，最下面的线)。

类似地，引入v1 fHbp的已知‘R41S’突变(SEQ ID NO:52)。

实施例2：针对稳定性增加的诱变

v2和v3 fHbp都比v1显著地更不稳定，特别是在其N-末端结构域中，并且v2是三种变体中最不稳定的。为了改善v2中的稳定性，突变两个残基：将SEQ ID NO:2的Ser-58(SEQ IDNO:5中的S32)和SEQ ID NO:2的Leu-149(SEQ ID NO:5中的L123)分别突变为Val和Arg。通过DSC分析突变体v2蛋白(SEQ ID NO:19)，并且与野生型序列SEQ ID NO:2相比，C-末端结构域的T_m不受所述突变影响。N-末端结构域的T_m高>20℃(图2，用箭头标记的增加)。还将等同突变引入v3 (SEQ ID NO:44)。

令人惊讶地，尽管已经引入S58V和L149R突变以改善稳定性并且的确实现了该目标，但图1(中间线)显示突变体多肽(SEQ ID NO:19)(甚至没有E266A突变)也显示低得多的与fH的结合。此外，在血清杀细菌测定法中，该v2突变体可以竞争与已经针对SEQ ID NO:18产生的人抗体的结合：

v2中的S58V/L149R稳定突变对fH结合具有令人惊讶的影响，所以还研究E266A对稳定性的影响。出乎意料地，该突变降低了N-末端结构域的稳定性，但与野生型相比，使C-末端结构域的稳定性增加>15℃(从83℃增加直至99℃，如图3中所示)，因此表明β桶的潜在稳定。

在v3中研究单独S58V和L149R突变对fH结合的影响。因此，根据SEQ ID NO:17编号，将突变S32V或L126R引入v3序列。将这两种突变体与两种不同的野生型v3序列进行比较，并且还与已知破坏v3中的fH结合的‘E313A’突变体[23]进行比较。

如图6中所示，两种野生型v3结合fH(最上面的两条线)。经设计以改善稳定性的S58V突变使SPR峰降低约2倍。最令人惊讶地，L149R突变(再次，经设计以改善稳定性)将fH亲和力降低至与已知E313A突变体类似的水平(最下面的两条线)。

还通过DSC研究v3中的S58V和L149R突变，并且发现其使N-末端T_m增加5.5℃(S58V)或6.7℃(L149R)。每种突变体的T_m比v2 S58V/L149R双突变体中所见更高。L149R v3突变体也显示对于其C-末端结构域更高的T_m值，而对于S58V v3突变体几乎没有移位。

实施例3：融合多肽

将针对稳定性和fHbp结合的突变组合至v2 (SEQ ID NO:50) 和v3 (SEQ ID NO:51)的突变体形式中。将这些与突变体v1序列(SEQ ID NO:52)以顺序v2-v3-v1融合，并使用接头连接，以得到SEQ ID NO:27 (‘SNB’)。因此，与三种野生型序列相比，该融合多肽包括总共7个点突变(图9)。将SNB融合体与不具有这些点突变的“野生型”融合多肽(SEQ ID NO:18；来自参考文献163的SEQ ID NO:36)进行比较。通过western印迹探测表达蛋白的两种形式的大肠杆菌提取物，并且使用融合体的稳定的非结合形式(SEQ ID NO:27)，蛋白的降解形式更少见得多(图8)。

通过SPR研究SNB融合体与fH的结合，并且与“野生型”融合体进行比较。图4显示“野生型”融合体显示与fH的强结合(最上面的线)，而SNB突变体不与fH显著相互作用(最下面的线)。

使用DSC研究两种融合多肽的稳定性(图5)。“野生型”融合体的温谱图(图5A)不包括归因于v3的任何N-末端转变，表明该结构域没有正确折叠。相比之下，对于‘SNB’突变体，温谱图显示所有6个结构域(对于N-和C-末端各3个)的转变，表明它们都正确折叠(图5B)。

分别地，将v2 (SEQ ID NO:45)和v3 (SEQ ID NO:44)中的针对稳定性的突变与‘R41S’突变体v1序列(SEQ ID NO:52)以顺序v2-v3-v1融合，并使用接头连接，以得到SEQID NO:29。因此，与三种野生型序列相比，该融合多肽包括总共5个点突变。

在转基因(Tg)小鼠中测试fHbp的非fH结合形式引发SBA滴度的能力：

这些数据表明fHbp的非结合形式可以是更免疫原性的。

实施例4：3D结构

先前，仅在与fH的复合物中解析fHbp var.3结构。对于v2 fHbp-fH复合物，仅fHbp的C-末端结构域在先前研究中是可检测的。

如下制备V2和V3 fHbp突变体的晶体：使用Gryphon结晶机器人(Art RobbinsInstruments)进行结晶实验。在Pilatus 2M检测器上的Swiss Light Source (PaulScherrer Institute, Villigen, Switzerland)光束线X06DA处收集或在EuropeanSynchrotron Radiation Facility (ESRF)(Grenoble, France)的光束线BM30A上收集X-射线衍射数据。所有衍射数据都用iMosflm处理，用Aimless定标(scaled)，并且用CCP4包进行结晶操作。

fHbp构建体	晶体	结构(Å)
			fHbp v2.1 S58V/L149R	是	是(1.7)
fHbp v3.1 S58V/L149R	是	是(3.3)

稳定突变加强了var.2 N末端的结构测定，并且已经在fH不存在的情况下解析了fHbp var.3 S58V的X射线结构。fHbp var.2和var.3的特征在于与var.1相比更不稳定的折叠。与该观察一致，fHbp var2和var3的全长结构难以测定。蛋白的稳定转化为结构和功能性的保持，这建立与(微)环境更好的热力学平衡相关联。作为结果，蛋白稳定经常导致获得适合于结构测定的晶体。S58V和L149R稳定的取代使得能够测定整个fHbp var.3晶体结构和解析fhbp var.2的区段81-254。通过引入稳定突变，已经在fH不存在的情况下获得了N-末端的几乎完整的结构(图7)。

实施例5：表面等离子共振(SPR)分析

SPR用于分析231种嵌合蛋白与fH蛋白的结合。使用Biacore T200仪器(GEHealthcare)在25℃下进行所有SPR实验。简言之，制备羧甲基化葡聚糖传感器芯片(CM-5；GE Healthcare)，其中通过胺偶联固定类似密度(∼400-500响应单位(RU))的231种蛋白。固定的蛋白是：

-固定在流动室2上的231 wt (SEQ ID NO:18)纯化MenB 547 (0.26 mg/ml)

-固定在流动室3上的包含v2和v3两者的R41S、S58V和L149的231 S (SEQ ID NO:29)纯化MenB 532 (0.68 mg/ml)

-固定在流动室4上的包含v2和v3两者的R41S、S58V和L149以及E252A和E255A的231SNB (SEQ ID NO:27)纯化MenB 512 (0.78 mg/ml)

将这些蛋白在乙酸盐pH 5.5中稀释至5ug/ml，并遵循标准胺偶联方案以达到目标密度。将流动室1制备为其他Fc，但不使用蛋白。然后将流动室1用作参考室，并将所得信号从由其他流动室得到的信号中减去。运行缓冲液含有10 mM Hepes，150 mM NaCl，0.05%(vol/vol) P20表面活性剂，pH 7.4 (HBS-P- GE-Healthcare)。然后注射fH蛋白作为一定范围的具有2倍稀释度的渐增分析物浓度(62.5nM至1μM)的5次注射，用于结合实验。测试以下fH构建体：因子H全长(Calbiochem)和由C. Tang提供的仅包含结构域6-7的因子H(Schneider等人, Nature 458, 890-893)。

在每次注射之后，然后用20秒的10 mM甘氨酸pH 1.7的注射再生表面。从每条曲线减去仅缓冲液的空白注射，并从实验传感图减去参考传感图，以得到代表特异性结合的曲线。所示数据代表两次独立实验。使用Biacore T200评估软件(GE Healthcare)分析SPR数据。所得传感图用1:1 Langmuir结合模型拟合，包括解释潜在质量转移的项，以获得各个kon和koff动力学常数；然后将各个值组合以得到报告的单个平均KD值(KD = koff/kon)。稳态分析也用于在pH 7.4下获得热力学解离常数(KD)。用fH结构域6-7的注射滴定的结果如下所示：

融合体

fH蛋白

Kon (1/Ms)

Koff (1/s)

来自1:1拟合的KD(M)

来自稳态分析的KD(M)

比率KD wt/x(残余结合)

231 WT

fH 67

6.4 E+5

0.008

1.24 E-8

2.1 E-8

1 (wt/wt)

231 S

fH 67

7.1 E+5

0.11

1.58 E-7

2.8 E-7

0.076 (wt/S)

231 SNB

fH 67

2.8 E+5

0.29

1.05 E-6

2.0 E-6

0.011 (wt/SNB)

从结合测试，观察到与231 wt相比，231 S蛋白与fH的结合的至少90％的强烈降低，并且观察到与231 wt相比，231 SNB蛋白与fH的结合的至少98％的强烈降低。

用fH全长滴定的结果提供如下：

融合体	fH蛋白	Kon (1/Ms)	Koff (1/s)	来自1:1拟合的KD(M)	比率KD wt/x(残余结合)
						231 WT	fH f.l.	1.1 E+4	0.003	3.1 E-7	1 (wt/wt)
231 S	fH f.l.	2.1 E+4	0.064	3.1 E-6	0.1 (wt/S)
						231 SNB	fH f.l.	2.7 E+3	0.06	2.1 E-5	0.015 (wt/SNB)

从两种结合测试，我们观察到与231 wt相比，231 S蛋白与fH的结合的至少90％的强烈降低，以及与231 wt相比，231 SNB蛋白与fH的结合的98％的强烈降低。

应该理解的是，本发明上文仅借助实例进行描述，并且可以作出修改，而仍在本发明的范围和精神内。

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Claims (18)

1.包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中(a)所述氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:5的残基123和240处不同于SEQ ID NO:5；(b)所述多肽可以在施用于人之后引发可以识别由SEQ ID NO:4组成的多肽的抗体；(c)所述多肽具有比由SEQ ID NO:4组成的多肽更高的稳定性；和(d)所述多肽具有比由SEQ ID NO:4组成的多肽更低的对于人fH的亲和力。

2.权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列还在相对于SEQ ID NO:5的残基32处不同于SEQ ID NO:5；例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:47。

3.权利要求2的多肽，其相对于SEQ ID NO:5具有取代S32V、L123R和E240A，例如SEQ IDNO:50。

4.包含与SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中(a)所述氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:17的残基126和243处不同于SEQ ID NO:17；(b)所述多肽可以在施用于人之后引发可以识别由SEQ ID NO:40组成的多肽的抗体；(c)所述多肽具有比由SEQ ID NO:40组成的多肽更高的稳定性；和(e)所述多肽具有比由SEQ ID NO:40组成的多肽更低的对于人fH的亲和力。

5.权利要求4的多肽，其中所述氨基酸序列还在相对于SEQ ID NO:17的残基32处不同于SEQ ID NO:17；例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:48。

6.权利要求4或权利要求5的多肽，其相对于SEQ ID NO:17具有取代S32V、L126R和E243A，例如，SEQ ID NO:51。

7.多肽，其包含：

与SEQ ID NO:47具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:47，残基123不是亮氨酸，且残基240不是谷氨酸；并且其中(i)与SEQ ID NO:4相比，所述多肽具有更高的稳定性且具有更低的对于fH的亲和力；且(ii)当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答，

或者：

氨基酸序列SEQ ID NO:47，其通过最多达5个单一氨基酸取代修饰，条件是(i)残基123不是亮氨酸，(ii)残基240不是谷氨酸，(iii)与野生型序列、例如SEQ ID NO:4相比，所述多肽具有更高的稳定性且具有更低的对于fH的亲和力，(iv)当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

8.权利要求7的多肽，其中相对于SEQ ID NO:47的残基32不是丝氨酸。

9.多肽，其包含：

与SEQ ID NO:48具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:48，残基126不是亮氨酸，且残基243不是谷氨酸；并且其中(i)与SEQ ID NO:40相比，所述多肽具有更高的稳定性且具有更低的对于fH的亲和力；且(ii)当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答，

或者：

氨基酸序列SEQ ID NO:48，其通过最多达5个单一氨基酸取代修饰，条件是(i)残基126不是亮氨酸，(ii)残基243不是谷氨酸，(iii)与野生型序列、例如SEQ ID NO:40相比，所述多肽具有更高的稳定性且具有更低的对于fH的亲和力，(iv)当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

10.权利要求9的多肽，其中相对于SEQ ID NO:48的残基32不是丝氨酸。

11.融合多肽，其包含：(i)如权利要求1、2、3、7或8中任一项所定义的多肽；和(ii)如权利要求4、5、6、9或10中任一项所定义的多肽。

12.融合多肽，其(a)当施用于人时，可以引发针对表达v2 fHbp的脑膜炎球菌和表达v3fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答；(b)与由SEQ ID NO:4组成的多肽相比具有更高的稳定性和更低的对于人fH的亲和力；(c)与由SEQ ID NO:40组成的多肽相比具有更高的稳定性和更低的对于人fH的亲和力，其中所述多肽包含：(I)选自以下的第一氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:5具有至少k％序列同一性和/或包含SEQ ID NO:5的片段的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:5的残基L123和E240处(和任选地在S32处)不同于SEQID NO:5；(b)与SEQ ID NO:47具有至少v％序列同一性的氨基酸序列，其中相对于SEQ IDNO:47，(i)残基123不是亮氨酸，(ii)残基240不是谷氨酸，(iii)任选地，残基32不是丝氨酸；和氨基酸序列SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:50，其任选地通过最多达5个单一氨基酸改变(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或***)修饰，其中(i)残基32任选地不是丝氨酸，(ii)残基123不是亮氨酸，且(iii)残基240不是谷氨酸；以及(II)选自以下的第二氨基酸序列：氨基酸序列，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少j％序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:17的片段；其中(b)所述氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:17的残基L126和E243处(和任选地在S32处)不同于SEQ ID NO:17；与SEQ ID NO:48具有至少w％序列同一性的氨基酸序列，其中(i)残基126不是亮氨酸，(ii)残基243不是谷氨酸，且(iii)任选地残基32不是丝氨酸；或氨基酸序列SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:51，其任选地通过至多5个单一氨基酸改变(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或***)修饰，其中(i)残基32是任何氨基酸，任选地不是丝氨酸，(ii)残基126不是亮氨酸，且(iii)残基243不是谷氨酸。

13.权利要求12的融合多肽，其中(A)所述第一氨基酸序列是SEQ ID NO:47(例如SEQID NO:50)且所述第二氨基酸序列是SEQ ID NO:48(例如SEQ ID NO:51)或(B)所述第一氨基酸序列是SEQ ID NO:31(例如SEQ ID NO:45)且所述第二氨基酸序列是SEQ ID NO:32(例如SEQ ID NO:44)。

14.权利要求11至13中任一项所述的融合多肽，其还包括v1 fHbp序列，其中当施用于人时，所述多肽可以引发针对表达v1 fHbp的脑膜炎球菌、表达v2 fHbp的脑膜炎球菌和表达v3 fHbp的脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答；并且其中任选地，所述v1 fHbp序列包括给予其与由SEQ ID NO:46组成的脑膜炎球菌多肽相比更低的对于人fH的亲和力的突变，例如，其中所述v1 fHbp序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:49或52。

15.权利要求14的融合多肽，其包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQID NO:30的氨基酸序列。

16.免疫原性组合物，其包含药学上可接受的载体和选自根据权利要求1-10所述的多肽和根据权利要求11-15所述的融合多肽的多肽。

17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

18.在人中产生抗体应答的方法，其包括向所述人施用根据权利要求16所述的免疫原性组合物。