CN102917730A

CN102917730A - 修饰的脑膜炎球菌fHBP多肽

Info

Publication number: CN102917730A
Application number: CN201080060450XA
Authority: CN
Inventors: L·班西; F·坎蒂尼; S·德拉戈内蒂; M·A·简蒂莱; D·维吉; M·斯卡塞利; M·皮萨
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2013-02-06
Also published as: MX2012004850A; JP2016040302A; AU2010310985B2; US20130022633A1; JP5960055B2; JP2014503172A; AU2010310985A1; EP2493499A1; WO2011051893A1; CA2779816A1; BR112012010531A2; US20140348869A1

Abstract

可使脑膜炎球菌fHBP的H因子结合活性与其杀菌敏感性分开。NMR研究鉴定了参与fHBP/H相互作用的多个氨基酸残基，修饰fHBP中这些残基的一个或多个可降低或消除其结合fH的能力。

Description

修饰的脑膜炎球菌fHBP多肽

本申请要求2009年10月27日提交的美国临时申请61/279,977的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明属于免疫领域，具体地说，是针对奈瑟球菌属，如脑膜炎奈瑟球菌致病菌导致疾病的免疫。

技术背景

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰阴性荚膜菌，寄居在大约10％人群上呼吸道中。虽然已有针对A、C、W135和Y血清群的多糖和偶联疫苗，但疫苗不能应用于血清群B，因为其荚膜多糖是一种多聚唾液酸的聚合物，是人类的一种自身抗原。为了开发针对血清群B的疫苗，已采用了外膜囊泡(OMV)包含的表面暴露蛋白。这些疫苗能诱导产生血清杀菌抗体应答和抵抗疾病，但不能诱导菌株间交叉保护作用[1]。因此，一些研究人员专注于可用于疫苗的特异性脑膜炎球菌抗原[2]。

一种这样的抗原是脑膜炎H因子结合蛋白(fHBP)，也称作蛋白‘741’[文献3中的SEQ IDs 2535 & 2536；本文的SEQ ID 1]，‘NMB1870’，‘GNA1870’[文献4-6，以下文献2]，‘P2086’，‘LP2086’或‘0RF2086’[7-9]。这种脂蛋白在所有脑膜炎球菌血清群中都有表达，见于多种脑膜炎球菌株，已将fHBP序列分为三个家族[4](在本文中称为家族I、II和III)，已发现产生的对某给定家族血清对同一家族有杀细菌活性，但对表达其它两个家族之一的菌株无活性，即具有家族内、而非家族间交叉保护作用。

发明内容

使fHBP结合fH的能力与其免疫原性解离可产生改良的抗原。例如，fHBP表面上的重要表位可能在体内结合fH后被隐藏躲开了免疫***。相反，宿主蛋白与疫苗组分的高亲和性结合在一些对象中可能导致意想不到的疫苗接种后果。

因此，本发明的一个目的是提供经过修饰结合fH能力比野生型fHBP减弱但保留了诱导杀菌性抗fHBP抗体能力的fHBP。

文献10已经鉴定了fHBP/fH相互作用中的几个重要残基。例如，野生型的两个谷氨酸残基突变使该蛋白对fH的亲和力降低了两个数量级。然而，文献10没有公开这些改变对fHBP免疫原性的影响。然而如本文所示，表达这二个Glu突变的细菌对野生型fHBP诱导的杀菌性抗体敏感。因此，有可能使fHBP的H因子结合活性与其杀菌敏感性解离。

菌株MC58的全长fHBP氨基酸序列(SEQ ID NO：1)如下：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

该序列是fHBP家族I的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO：1前19个氨基酸(SEQ ID NO：4)，而fHBP的ΔG形式缺少前26个氨基酸(SEQ ID NO：7)菌株2996的全长fHBP氨基酸序列(SEQ ID NO：2)如下：

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

该序列是fHBP家族II的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO：1前19个氨基酸(SEQ ID NO：5)，而fHBP的ΔG形式缺少前26个氨基酸(SEQ ID NO：8)。

菌株M1239的全长fHBP氨基酸序列(SEQ ID NO：3)如下：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

该序列是fHBP家族III的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO：1前19个氨基酸(SEQ ID NO：6)，而fHBP的ΔG形式缺少前31个氨基酸(SEQ ID NO：9)。

NMR研究鉴定了参与fHBP/fH相互作用的各个氨基酸残基。因此，可修饰SEQID NO：4、5和6各自中以下编号的一个或多个残基，以抑制fH/fHBP相互作用：

SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：5	SEQ ID NO：6
				Asp-37	Asp-37	Glu-42	*
Asn-43	Asn-43	Asn-48
				Lys-45	Lys-45	Thr-50	*
Thr-56	Thr-56	Thr-61
				Glu-83	Glu-83	Glu-91	*
Glu-95	Glu-95	Glu-103	*
				Glu-112	Glu-112	Glu-120	*
Asp-116	Asn-116	Asn-124
				His-119	Lys-119	Lys-127
Lys-122	Ser-122	Ser-130
				Val-124	Ile-124	Ile-132	*
Arg-127	Arg-127	Arg-135	*
				Thr-139	Thr-139	Thr-147	*
Phe-141	Phe-141	Phe-149	*
				Asp-142	Asn-142	Asn-150
Lys-143	Gln-143	Gln-151	*
				Ile-198	Leu-197	Leu-205
Ser-211	Asp-210	Asp-218
				Leu-213	Arg-212	Arg-220	*
Lys-219	Lys-218	Lys-226
				Ser-221	Thr-220	Thr-228
Lys-241	Lys-240	Lys-248

*号列是优选的残基，因为它们不存在于文献10用X光研究所确定的fH结合位点内。不想受理论的束缚，鉴定到这些额外位点是由于(i)与X光晶体研究相比，NMR试验条件更加天然，和/或(ii)NMR研究包括了fH的结构域5。

文献11公开了与fH相互作用残基经过修饰的fHBP蛋白。用于提出可修饰的具体氨基酸残基包括38、41、42、43、44、80、82、84、85、89、91、92、115、116、117、118、119、120、126、128、129、130、131、134、197、199、201、202、203、207、209、218、220、221、223、224、237、239、241、246、和248位残基(根据SEQ ID NO：？4编号，与文献11自身编号缺少65位残基)。将文献11的两个优选残基Glu 218和Glu-239突变成丙氨酸得到的蛋白“几乎完全丧失H因子的结合能力”。文献11中列出与本文列出的重叠残基如下(仅与SEQ ID NO：4相比)：43、116、119、221和241。在本发明的一些实施方式中，该多肽不包括SEQ ID NO：35。

因此，本发明提供的多肽含有的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：4，5或6之一至少有k％相同性，和/或包含SEQ ID NO：4，5或6的片段；但(b)其中上表列出的一个或多个氨基酸残基缺失或被不同氨基酸取代。(a)所述片段包含(b)所述相关表格中的残基。给予宿主动物后，该多肽能诱导识别野生型脑膜炎球菌多肽，包括SEQ ID NO：4，5或6的抗体。在相同实验条件下，该多肽对人H因子的亲和力比相同但不含(b)修饰的多肽低。

本发明也提供含以下氨基酸序列的多肽：(a)与SEQ ID NO：4至少k％相同和/或含SEQ ID NO：4片段，但(b)其中上表中列出的一个或多个氨基酸残基缺失或被不同氨基酸取代。给予宿主动物后，该多肽诱导能识别含SEQ ID NO：4的野生型脑膜炎球菌多肽的抗体，该多肽组成。在相同实验条件下，此多肽对人fH的亲和力比相同但不含(b)所述修饰的多肽低。在相同实验条件下，此多肽对人fH的亲和力含SEQ ID NO：4的野生型脑膜炎球菌多肽低。

类似地，本发明提供的一种多肽所含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：5至少k％相同，和/或含SEQ ID NO：5片段，但(b)其中上表列出的一个或多个氨基酸残基缺失或被不同氨基酸取代。给予宿主动物后，此多肽诱导能识别含SEQ ID NO：5野生型脑膜炎球菌多肽的抗体。在相同实验条件下，此多肽对人fH的亲和力比相同但不含(b)所述修饰的多肽低。在相同实验条件下，此多肽对人fH的亲和力比含SEQ ID NO：5的野生型脑膜炎球菌多肽低。

类似地，本发明提供的一种多肽所含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：6至少k％相同性，和/或含SEQ ID NO：6片段，但(b)其中上表列出的一个或多个氨基酸残基缺失或被不同氨基酸取代。给予施给宿主动物后，此多肽诱导起能识别含SEQ IDNO：6的野生型脑膜炎球菌多肽的抗体。在相同实验条件下，此多肽对人fH的亲和力比相同但不含(b)所述修饰的多肽低。在相同实验条件下，此多肽对人fH的亲和力比含SEQ ID NO：6的野生型脑膜炎球菌多肽低。

上述k值选自85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。优选90或以上。

(a)所述片段包含(b)所述相关表格中的残基，但与相关SEQ ID残基比较有残基缺失或被取代。所述片段通常至少长7个氨基酸，例如长8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60个连续氨基酸或以上。所述片段通常包含SEQ ID的表位。

在一些优选实施例中，本发明的多肽式SEQ ID NO：4、5或6短，例如其N-端截短，包括聚甘氨酸序列(如SEQ ID NOs：7，8和9中所示)被截去。因此，该多肽包含与SEQ ID NOs：7，8或9之一具有至少k％相同性的氨基酸序列，含有上表中列出的一个或多个修饰的氨基酸残基。

fH亲和力降低理想地至少降低2-倍，例如降低＞5倍，＞10倍，＞50倍，＞100倍等，fH的结合可能完全被消除。可用文献10中公开的方法和试剂，例如通过采用固定的fH和50nM可溶性fHBP(或相反)表面质子共振，适当评估fH/fHBP相互作用的亲和力。

本发明还提供设计修饰fHBP中氨基酸序列的方法，包括步骤：(i)提供起始氨基酸序列，其中包含该起始氨基酸序列或由其组成的蛋白质能与人H因子结合；(ii)用配对序列比对算法鉴定起始氨基酸序列内与上表所示SEQ ID NO：4、5或6的残基相对的氨基酸残基；(iii)删除步骤(ii)中鉴定的氨基酸，或用不同的氨基酸置换，从而提供修饰的fHBP氨基酸序列。可重复步骤(ii)和(iii)一次或多次。含起始氨基酸序列或由其组成的蛋白质能结合人H因子，亲和力比实施该方法制备的相同蛋白质高。所述起始氨基酸序列可以是野生型序列，例如可以是文献4，5，7，8，9，195，196，197，198，199，200 & 201中公开的野生型或修饰或人造fHBP氨基酸序列之一。例如，起始氨基酸序列可以是本文中的SEQ ID NO：1-9或20-22之一。

本发明还提供用该方法设计的含修饰fHBP氨基酸序列的多肽。该多肽有免疫原性，能结合人H因子。

修饰

本发明的多肽上表中列出的一个或多个，例如2、3、4、5或更多个修饰的氨基酸残基。

表中列出的残基缺失或被不同的氨基酸取代。例如，Asp37可被其它19种天然氨基酸之一取代。当进行取代时，一些实施方式中取代的氨基酸是简单氨基酸，例如甘氨酸或丙氨酸。在其它实施方式中，取代的氨基酸是非保守氨基酸。保守取代可在以下四组内进行：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。在一些实施方式中，优选用丙氨酸取代。

当进行一个以上氨基酸的修饰时，要修饰的氨基酸可选自下组A-D：

A：残基112，116，119，122，和/或127。

B：残基43，45，56，和/或83。

C：残基211，219，221，和/或241。

D：残基139，141，142，143，和/或198。

因此，例如，如果要修饰残基112，优选修饰的第二个残基应是116，119，122或127，如果要修饰残基43，优选修饰的第二个残基应是45，56，或83等。

铁载体结合

fHBP显示与铁载体蛋白(siderophore)在结构上同源。铁载体蛋白能结合一种细菌铁载体-肠菌素。如本文所示，fHBP也能结合肠菌素。因此，本发明提供一种奈瑟菌(例如脑膜炎球菌)fHBP和铁载体的复合物。

铁载体通常根据其能螯合铁的配体分类。它们可以是胆酸盐(catecholates)、氧肟酸盐或羧酸盐。在一些实施方式中，铁载体不是柠檬酸盐。铁载体可选自：铁色素、去铁胺B、去铁胺E、镰霉氨酸C、鸟氨菌素(ornibactin)、肠菌素、芽孢菌素、弧菌菌素(vibriobactin)、固氮菌素(azotobactin)、脓绿素(pyoverdine)、产气菌素(aerobact in)、沙门菌亲铁蛋白(salmochelin)或耶尔森菌素(yersiniabactin)。优选沙门菌亲铁蛋白或更优选肠菌素。

铁载体通常包含螯合的铁离子(Fe³⁺)，例如Fe³⁺的六齿八面体络合物。然而，在一些实施方式中铁载体不包含铁离子而包含螯合的铝、镓、铬、铜、锌、铅、锰、镉、钒、铟、钚、或钨离子。

本发明还提供包含以下氨基酸序列的多肽：(a)与SEQ ID NO：4，5或6之一至少k％相同，和/或含SEQ ID NO：4、5或6片段；和(b)给予宿主动物后能诱导识别含SEQ ID NO：4，5或6的野生型脑膜炎球菌多肽的但(c)不能结合肠菌素的抗体。k值和片段长度如文所定义。

该多肽与SEQ ID NO：4相比，含有102，136-138，148-154，166，205，230和254位氨基酸中的一个或多个突变。因此，该多肽中与SEQ ID NO：4中这些残基的一个或多个氨基酸残基相对的氨基酸，用配对比对算法时比较时，与SEQ IDNO：4中的不同。例如Lys-254可用非赖氨酸残基(如丙氨酸)替换。因此，本发明提供的多肽，例如，包含SEQ ID NO：29、30、31和32之一。

本发明还提供一种设计修饰fHBP氨基酸序列的方法，包括以下步骤：(i)提供起始氨基酸序列，含该起始氨基酸序列或由其组成的蛋白质能结合人H因子和结合铁载体蛋白；(ii)鉴定该起始氨基酸序列内与铁载体相互作用的氨基酸残基；(iii)删除步骤(ii)鉴定的氨基酸，或用不同的氨基酸置换，从而提供修饰的fHBP氨基酸序列。所述的起始氨基酸序列与SEQ ID NO：4、5或6之一至少k％相同。

多肽

可通过许多方法，例如化学合成(至少部分)，用蛋白酶消化较长的多肽，通过翻译RNA，纯化细胞培养物(例如从重组表达或培养脑膜炎奈瑟氏球菌物)等制备本发明的多肽。在大肠杆菌宿主中异源表达是优选的表达途径。

fHBP是脑膜炎奈瑟球菌的一种天然脂蛋白。已发现其在大肠杆菌中表达时已脂化带有天然的前导序列。本发明的多肽N末端有一个可被脂化的半胱氨酸残基，，例如，其包含的棕榈酰基团通常会形成三棕榈酰-S-甘油酰-半胱氨酸。在其它实施方式实施方式中，所述多肽不脂化。

制备的多肽优选为基本纯或基本上为分离形式(即基本不含其它奈瑟球菌或宿主细胞多肽)或基本上为分离形式。一般而言，在非天然环境中提供的所述多肽，例如是与其天然环境相分离的多肽。在一些实施例中，组合物中存在的目标多肽比对照中的该多肽丰富。因此提供的为纯化多肽，纯化指组合物中只存在所述多肽而基本没有其它表达的多肽的，基本上没有意指组合物中其它表达多肽少于90％、通常少于60％、更常少于50％。多肽可以是多种形式(例如，天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、二硫桥等形式的多肽)。

SEQ ID NO 4-9不包括N末端甲硫氨酸。如果本发明的多肽通过在生物宿主细胞中翻译产生，则需要起始密码子，大多数宿主细胞能提供N末端甲硫氨酸。因此本发明的多肽至少在新生阶段包含所述SEQ ID NO序列上游的甲硫氨酸残基。

在一些实施方式中，所述多肽的N末端有一个甲硫氨酸，其后紧接所述SEQ IDNO序列；在其它实施方式中，可采用更长的上游序列。这类上游序列可较短(如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。例子包括指导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸尾，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。本领域技术人员知道其它合适的N末端氨基酸序列，例如SEQ IDNO：1、2和3中的天然上游序列。

本发明的多肽还可包含所述SEQ ID NO序列下游的最后氨基酸。这类延伸的C-末端可较短(如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。例子包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸尾，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或能提高蛋白质稳定性的序列。本领域技术人员知道其它合适的C末端氨基酸序列。术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。此聚合物可以是线性或支链聚合物，可包含修饰的氨基酸，可用非氨基酸间隔。该术语也包括天然或人为介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰。产生的多肽可以是单链或结合链形式。

可将本发明多肽连接于或固定于固相支持物。

本发明多肽可含可检测标记，例如，放射标记、荧光标记或生物素标记。这在免疫测定技术中特别有用。

如文献199所述，fHBP可分成三个结构域，称为A、B和C结构域。根据SEQ ID NO：1，这三个结构域为(A)1-119，(B)120-183和(C)184-274：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSE HSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAV ISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

结构域“A”的成熟形式从N末端的Cys-20到Lys-119，称作“A_成熟”。

已知有多个fHBP序列，用标准方法不难进行比对。通过比对，技术人员可通过(a)与MC58序列中的坐标比较来鉴定任何给定fHBP序列中的结构域“A”(和A_成熟)、“B”和“C”，和(b)鉴定多个fHBP序列中要取代的单个残基。然而，为方便参比，这些结构域的定义如下：

-给定fHBP序列中的结构域‘A’是其片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1对比时，结构域A的范围从与SEQ ID NO：1的Met-1相对的氨基酸开始到与SEQ IDNO：1的Lys-119相对的氨基酸结束。

-给定fHBP序列中的结构域‘A_成熟’是其片段，当用配对比对算法与SEQ IDNO：1对比时，结构域A_成熟的范围从与SEQ ID NO：1的Cys-20相对的氨基酸开始到与SEQ ID NO：1的Lys-119相对的氨基酸结束。

-给定fHBP序列中的结构域‘B’是其片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1对比时，结构域B的范围从SEQ ID NO：1的Gln-120相对的氨基酸开始到与SEQ IDNO：1的Gly-183相对的氨基酸结束。

-给定fHBP序列中的结构域‘C’是其片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1对比时，结构域C的满园从与SEQ ID NO：1的Lys-184相对的氨基酸开始到与SEQID NO：1的Gln-274相对的氨基酸结束。

定义所述结构域的优选配对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[12]，它采用默认参数(例如，缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，采用EBLOSUM62评分矩阵)。可用EMBOSS软件包中的needle工具方便地实施这种算法[13]。

在一些实施方式式中，本发明多肽被截短而去除其结构域A，即将结构域A从SEQ ID中删除。

在一些实施方式式中，多肽包含上述的氨基酸序列，除了最多有10个N末端氨基酸(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)和/或最多有10个C末端氨基酸(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)缺失。

核酸

本发明提供编码上述本发明多肽的核酸。

可用许多方法制备本发明的核酸，例如，完全或部分化学合成(例如用亚磷酰胺法合成DNA)、用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如用连接酶或聚合酶)、从基因组或cDNA文库制备等制备本发明的核酸。

本发明核酸可以是各种形式，例如，单链、双链、载体、引物、探针、标记、未标记等形式。

本发明的核酸优选是分离的或基本分离形式的核酸。

术语“核酸”包括DNA和RNA，还有其类似物，如含有修饰主链的类似物，以及肽核酸(PNA)等。

本发明的核酸可以被标记，例如，放射或荧光标记。

本发明还提供了含本发明核苷酸序列的载体(如质粒)(例如克隆或表达载体，如适合核酸免疫的载体)和用这种载体转化的宿主细胞。

杀菌应答反应

本发明的优选多肽能引发对脑膜炎球菌的杀菌抗体应答反应。可方便地检测小鼠杀菌抗体应答反应，作为疫苗效力的标准指标[例如，见参考文献2的尾注14]。本发明多肽能优先引发对以下三组脑膜炎奈瑟球菌菌株至少一组的杀菌抗体应答反应：

(I)MC58、gb185(＝M01-240185)、m4030、m2197、m2937、iss1001、NZ394/98、67/00、93/114、bz198、m1390、nge28、lnp17592、00-241341、f6124、205900、m198/172、bz133、gb149(＝M01-240149)、nm008、nm092、30/00、39/99、72/00、95330、bz169、bz83、cu385、h44/76、m1590、m2934、m2969、m3370、m4215、m4318、n44/89、14847。

(II)961-5945、2996、96217、312294、11327、a22、gb013(＝M01-240013)、e32、m1090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、c11、m986、m2671、1000、m1096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38、L93/4286。

(III)M1239，16889，gb355(＝M01-240355)，m3369，m3813，ngp165。

例如，多肽可以引发对血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58、gb185和NZ394/98的有效杀菌应答反应。

免疫接种

本发明多肽可用作免疫原性组合物的活性成分，因此，本发明提供包含本发明多肽的免疫原性组合物。

本发明也提供引发哺乳动物抗体应答反应的方法，包括给予哺乳动物本发明的免疫原性组合物。所述抗体应答优选保护性和/或杀菌性抗体应答。本发明也提供本发明多肽在这类方法中的应用。

本发明还提供保护哺乳动物免受奈瑟球菌(如脑膜炎奈瑟球菌)感染的方法，包含给予哺乳动物本发明的免疫原性组合物。

本发明提供本发明多肽作为药物(例如，免疫原性组合物或疫苗)或诊断试剂的应用。本发明还提供本发明核酸、多肽或抗体在制备预防哺乳动物感染奈瑟球菌(例如脑膜炎球菌)的药物中的应用。

所述哺乳动物优选人。所述人可以是成人，或优选儿童。当疫苗用于预防时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)；当疫苗用于治疗时，人优选为成人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如用以评估安全性、剂量、免疫原性等。

所述用途和方法特别适合于预防/治疗疾病，包括但不限于脑膜炎(特别是细菌性脑膜炎，如脑膜炎球菌性脑膜炎)和菌血症。

治疗性措施的效果可通过给予本发明组合物后对奈瑟球菌感染的监测来检验。可通过监测给予该组合物后对fHBP的免疫应答检验预防性治疗的效果。本发明组合物的免疫原性可通过给予受试对象(例如，12-16月龄儿童或动物模型[14])，然后测定标准参数，包括血清杀菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)来检测。通常在给予该组合物后约4周检测这些免疫应答，并与给予该组合物前测定的值作比较。优选SBA增加至少4倍或8倍。给予一个以上剂量的该组合物时，可进行一次以上的给药后检测。

本发明的优选组合物在可接受百分比的人对象中诱导患者产生的抗体效价优于各抗原组分诱导的血清保护标准。相关抗体效价有关的抗原是众所周知的，高于该效价认为宿主对该抗原的血清抗体转阳，该类效价已由有关组织，如WHO公布。优选具有统计学显著性的80％以上对象样品血清抗体转阳，更优选90％以上，还优选93％以上，最优选96-100％转阳。

本发明的组合物通常直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙内)，或通过直肠、口服、***、外用、透皮、鼻内、眼晴、耳内、肺部或其它粘膜途径给药直接递送。优选大腿或上臂肌肉内注射给药。可通过针头(例如皮下针头)注射，但也可采用无针注射。通常的肌肉内注射剂量为约0.5ml。

本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫。

剂量治疗可以是一次剂量方案或多剂量方案。初次免疫方案和/或加强免疫方案可采用多剂量。初次方案给药后，可进行加强方案给药。可用常规方法确定初次剂量之间(例如4-16周)以及初次与加强剂量之间的适当时机。

本发明免疫原性组合物通常包含药学上可接受的运载体，可以是本身不会诱导接受该组合物的患者产生有害抗体，给药后无异常毒性的任何物质。药学上可接受的运载体包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。此类载体中也可存在辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于合适运载体的充分讨论可见参考文献15。

奈瑟球菌感染影响机体的各个区域，因此可将本发明的组合物制成各种剂型。例如，可将该组合物制成液体溶液或悬浮液的注射剂型。也可制成合适的固体剂型，在注射前溶解或悬浮于液体运载体。可将该组合物制成局部给药的剂型，例如油膏、乳膏或粉剂。可将该组合物制成口服给药的剂型，例如，片剂、胶囊或糖浆(任选加入调味剂)。可将该组合物制成肺部给药的剂型，例如采用细粉或喷雾的吸入剂。可将该组合物制成栓剂或***栓剂。可制备经鼻、经耳或眼给药的组合物，如滴剂。

该组合物优选无菌，优选无热原。优选加入缓冲剂使其例如为pH 6-pH 8，通常为约pH 7。当组该合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[16]。本发明的组合物与人体等渗。

免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原，以及任何其它所需的特定组分。“免疫有效量”指给予个体的治疗或预防有效的一次剂量或一系列剂量一部分的量。此剂量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的物种分类(例如，非人灵长动物、灵长动物等)、个体免疫***合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而不同。预计有效剂量的范围相对较宽，可通过常规试验确定。治疗剂量可以是单次剂量方案或多次剂量方案(例如包括加强剂量)。组合物可与其它免疫调节剂联合给药。

可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

A.含矿物质的组合物

可用作本发明佐剂的含矿物质组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等，[例如参见文献17的第8、9章]或不同矿物化合物的混合物，其中化合物可以是任何合适形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐颗粒[18]。

一种有用的磷酸铝佐剂是无定形羟基磷酸铝，PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92，包括0.6mg Al³⁺/ml。

B.油乳剂

适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献17第10章；也见文献19](5％鲨烯、0.5％吐温80、和0.5％Span 85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可采用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

有用的水包油乳液通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。所述乳液中的油滴直径通常小于1μm，用微流化床可制备这种小尺寸油滴而提供稳定的乳液。优选大小低于220nm的油滴，因为可过滤除菌。

这种乳液包含的油有，例如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常用的有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油，是坚果油的示范例。可采用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，最容易得到的是玉米油，但也可采用其它谷物，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等的油。可采用通过水解、分离和酯化从坚果和种籽油获得的合适原材料，制备甘油和1，2-丙二醇的含6-10个碳的脂肪酸酯，而不是天然的种籽油。自哺乳动物乳汁的脂肪和油是机体可代谢的，因此可用于实施本发明。获得动物来源纯化油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法是本领域熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼鱼肝油、鲨鱼鱼肝油和例如鲸蜡的鲸油是可用于本发明的几种示范鱼油。用生物化学方法合成的含5-碳异戊二烯单位的一些支链油统称为萜类。鲨鱼鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，本发明特别优选2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。不难从商业来源购得含角鲨烯和角鲨烷的鱼油，或可用本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(见下文)。可采用混合油。

表面活性剂可按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂HLB至少有10种，优选至少15种，更优选至少16种。本发明可用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM销售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，例如直链EO/PO嵌段共聚物；乙氧基(氧-1，2-乙二基)重复数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergitol^TM NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为布里杰(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(布里杰30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可采用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合液也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂含量(重量％)为：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，具体约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X100或曲通系列的其它洗涤剂)0.001-0.1％，具体0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，具体0.1-1％或约0.5％。

优选基本上所有(例如数量至少90％)油滴的直径小于1μm，例如，≤750nm、≤500nm、≤400nm、≤300nm、≤250nm、≤220nm、≤200nm或更小。

一种特别有用的乳液是角鲨烯、吐温80和司盘85组成的亚微米乳液。此乳液含体积量约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[19-21]，参考文献17第10章和参考文献22第12章有详细地的描述。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

C.皂苷制剂[参考文献17第22章]

皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在多种植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了可作为佐剂的得自皂皮树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。也可商品化购得丽花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)的皂苷。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。

已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优先的皂苷是QS21。制备QS21的方法参见参考文献23。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[24]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献17第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献24-26进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM不含其它洗涤剂[27]。

开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献28和29。

D.病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含任选与磷脂组合或一起配制的一种或多种病毒蛋白质。它们通常无致病性，不能复制，且通常不含任何天然病毒的基因组。这种病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。适用于病毒体或VLP的这些病毒蛋白包括流感病毒(如HA或NA)、乙肝病毒(如核心蛋白或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、***病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人***瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白质。VLP在参考文献30-35中有进一步描述。病毒体在(例如)参考文献36中有进一步描述。

E.细菌或微生物衍生物

适合用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-氧-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-氧-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献37中所述。3dMPL的这种“小颗粒”足够小可通过0.22μm滤膜过滤除菌[37]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯衍生物，例如RC 529[38，39]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。例如参考文献40和41中描述的OM-174。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有磷酸键连接的鸟苷和非甲基化胞嘧啶这二个核苷酸序列)。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。

CpG可以包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献42、43和44公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献52-54中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[51]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-BODN。参考文献52-54中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选的CpG是CpG-AODN。

优选将CpG寡核苷酸构建成其5’末端可被受体接触。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’末端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献51和55-57。

基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂是称为IC31^TM[58]的佐剂。因此，本发明所用的佐剂可包含(i)和(ii)的混合物：(i)含有至少一个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成的二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚体序列5′-(IC)13-3′(SEQ ID NO：33)的脱氧核苷酸。该聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK的肽(SEQ ID NO：34)。

细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳杆菌(“PT”)。参考文献59描述了采用脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂，参考文献60描述了将其用作胃肠道外佐剂。所述毒素和类毒素优选包含A和B亚单位的全毒素形式。A亚单位优选含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。所述佐剂优选脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献61-68描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。一种有用的CT突变体是CT-E29H[69]。氨基酸取代的参考编号优选根据参考文献70中提出的ADP-核糖基化毒素A和B亚单位的排列对比对作出，该参考文献的全部内容专门纳入本文作为参考。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调谐剂包括细胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[71]等)[72]、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。

G.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[73]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[74]。

H.微粒

微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径～100nm-～150μm，更优选直径～200nm-～30μm，最优选直径～500nm-～10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚丙交酯乙交酯共聚物，任选经处理而表面带负电(例如用SDS处理)或带正电(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

I.脂质体(参考文献17的第13和14章)。

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献75-77所述。

J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适合用作本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[78]。这种制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇[79]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[80]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

K.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂参见例如参考文献81和82的描述。

L.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(去甲-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。

M.咪唑并喹诺酮化合物。

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同类物(例如，″瑞喹莫德3M″)，见参考文献83和84所述。

本发明也可包括以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，本发明可采用以下佐剂组合物：(1)皂苷和水包油乳剂[85]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[86]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[87]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[88]；(6)SAF，含10％鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液。(7)Ribi^TM佐剂***(RAS)(Ribi免疫化学公司)，含2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，这些组分包括单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。

用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献17第7章。

特别优选采用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂，抗原通常吸附于这些盐。其它优选的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或瑞喹莫特和明矾。可采用磷酸铝和3dMPL的组合。

其它抗原组分

本发明组合物包括经修饰的fHPB多肽。该组合物应该不含复杂或不明确的抗原混合物方有用，例如，优选该组合物不含外膜囊泡。本发明的多肽优选在异源宿主中表达和纯化。

除包含fHBP多肽外，本发明组合物还可以包含一种或多种其它奈瑟菌的免疫原，因为靶向每种菌一种以上免疫原的疫苗可以降低选择逃逸突变株的可能性。因此，组合物可包含第二多肽，给予哺乳动物时可引发对脑膜炎球菌的杀菌抗体应答反应。这种第二多肽可以是脑膜炎球菌fHBP，但通常不是fHBP，例如可以是287序列、NadA序列、953序列、936序列等。

该组合物包含的抗原包括以下一种或多种多肽：

(a)参考文献89公开的446种偶数SEQ ID(即2、4、6、……、890、892)序列，

(b)参考文献90公开的45种偶数SEQ ID(即2、4、6、……、88、90)序列；

(c)参考文献3公开的1674种偶数SEQ IDs 2-3020、偶数SEQ IDs 3040-3114和所有的SEQ IDs 3115-3241；

(d)参考文献2公开的NMB0001-NMB2160的2160种氨基酸序列；

(e)任何亚型的脑膜炎球菌PorA蛋白，优选重组表达的蛋白；或

(f)(a)-(e)所述的变体、同类物、直向同源物、旁系同源物、突变体等。

任何其它奈瑟菌免疫原可作为本发明修饰的fHBP的单独多肽存在，或作为与修饰的fHBP的融合多肽存在于该组合物中。例如，已知脑膜炎球菌936多肽与fHBP多肽的融合物[100]。

本发明组合物可包含287号抗原。287号抗原的基因NMB2132包含在已公布的脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[91]的基因组序列中(GenBank登录号GI：7227388；本文的SEQ ID NO：10)。此后公布了许多菌株287号抗原的序列。例如，287号的等位基因形式可参见文献92的图5和15所示，和文献3的实施例13和图21(其中的SEQ ID 3179-3184)。已报导了287号抗原的各种免疫原性片段。可用于本发明的优选287号抗原包含的氨基酸序列是：(a)含有与SEQ ID NO：8序列50％或以上(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：10序列的至少n个连续氨基酸的片段，其中’n’是7个或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250个或更多)。(b)所述的优选片段包含SEQ ID NO：10的一个表位。本发明最有用的287号抗原给予对象后引发的抗体能结合氨基酸序列为SEQ ID NO：10的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选287号抗原给予对象后可引发抗奈瑟球菌杀菌抗体。

本发明的组合物可包含NadA抗原。NadA抗原的基因NMB1994包含在已公布的奈瑟球菌B血清群菌株MC58[91]的基因组序列中(GenBank登录号GI：7227256；本文的SEQ ID NO：11)。此后公布了许多菌株NadA抗原的序列，已详细公布了NadA抗原作为奈瑟氏菌粘附素蛋白的活性。也报导了NadA的各种免疫原性片段。可用于本发明优选的NadA抗原包含的氨基酸序列是：(a)含有与SEQID NO：11序列50％或以上(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)相同性；和/或(b)包含SEQ IDNO：11序列至少n个连续氨基酸的片段，其中’n’是7个或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250个或更多)。(b)所述的优选片段包含SEQ ID NO：11的一个表位。本发明最有用的NadA抗原给予对象后引发的抗体能结合含氨基酸序列SEQ ID NO：11的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的NadA抗原优选给予对象后可引发抗奈瑟球菌杀菌抗体。SEQ IDNO：6是这样的一个片段。

本发明的组合物可包含NspA抗原。NspA抗原的基因NMB0663包括在已公布的脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[91]基因组序列中(GenBank登录号GI：7225888；本文中的SEQ ID NO：12)。先前文献93和94已知道该抗原。之后公布了许多菌株的NspA抗原序列。也报导了NspA的各种免疫原性片段。可用于本发明的优选NspA抗原包含的氨基酸序列是：(a)含有与SEQ ID NO：12序列50％或以上(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：12序列有至少n个连续氨基酸的片段，其中’n’是7个或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250个或更多)。(b)所述的优选片段包含SEQ ID NO：12的一个表位。本发明最有用的NspA抗原给予对象后引发的抗体能结合含氨基酸序列SEQ ID NO：12的脑膜炎球菌多肽。可用于本发明的NspA抗原优选给予对象后能引发抗奈瑟球菌杀菌抗体。

本发明的组合物可包含脑膜炎球菌HmbR抗原。全长HmbR序列的基因NMB1668包含在已公布的脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[91]的基因组序列中(GenBank登录号GI：727246；本文的SEQ ID NO：13)。本发明可采用包含HmbR全长序列的多肽，但常用含部分HmbR序列的多肽。因此在一些实施方式中，本发明可用的HmbR序列包含与SEQ ID NO：13至少i％序列相同的氨基酸序列，其中i值是50，60，70，80，90，95，99个或以上。在其它实施方式中，本发明可用的HmbR序列包含SEQ ID NO：13序列的至少j个连续氨基酸的片段，其中j值是7，8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250个或以上。在其它实施方式中，本发明可用的HmbR序列包含的氨基酸序列是：(i)含有与SEQ IDNO：13序列i％相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：13序列的至少j个连续氨基酸的片段。优选的j个氨基酸的片段包含SEQ ID NO：13的一个表位。这些表位通常含位于HmbR表面的氨基酸。有用的表位包括参与HmbR结合血凝素的氨基酸，因为结合这些表位的抗体能阻断细菌结合宿主血凝素的能力。HmbR的拓扑学及其关键的功能性残基研究可参见文献95所述。本发明最有用的HmbR抗原给予对象后引发的抗体能结合含氨基酸序列SEQ ID NO：13的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的HmbR抗原优选给予对象后能引发抗奈瑟球菌杀菌抗体。

本发明的组合物可包含NhhA抗原。NhhA抗原的基因NMB0992包含在已公布的奈瑟球菌B血清群菌株MC58[91]的基因组序列中(GenBank登录号GI：7226232；本文的SEQ ID NO：14)。文献92和96后已公布了许多菌株的NhhA抗原序列，也已报导NhhA的各种免疫原性片段，也称为Hsf。可用于本发明的优选NhhA抗原包含的氨基酸序列是：(a)含有与SEQ ID NO：14序列50％或以上(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：14序列的至少n个连续氨基酸的片段，其中’n’是7个或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250个或更多)。(b)所述的优选片段包含SEQ ID NO：14序列的一个表位。本发明最有用的NhhA抗原给予对象后引发的抗体能结合含氨基酸序列SEQ ID NO：14的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的NhhA抗原优选给予对象后能引发抗脑膜炎球菌杀菌抗体。

本发明的组合物可包含App抗原。App抗原的基因NMB1985包含在已公布的奈瑟球菌B血清群菌株MC58[91]的基因组序列中(GenBank登录号GI：7227246；本文的SEQ ID NO：15)。之后公布了许多菌株的App抗原序列。已报导了App的各种免疫原性片段。可用于本发明的优选App多肽包含的氨基酸序列是：(a)含有与SEQ ID NO：15序列50％或以上(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：15序列的至少n个连续氨基酸的片段，其中’n’是7个或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250个或更多)。(b)所述的优选片段包含SEQ ID NO：15序列的一个表位。本发明最有用的App抗原给予对象后引发的抗体能与结合含氨基酸序列SEQ ID NO：16的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的App抗原优选给予对象后能引发抗奈瑟球菌杀菌抗体。

本发明的组合物可包含Omp85抗原。Omp85抗原的基因NMB0182包含在已公布的奈瑟球菌B血清群菌株MC58[91]的基因组序列中(GenBank登录号GI：7225401；本文的SEQ ID NO：16)。之后公布了许多菌株的Omp85抗原序列。Omp85的其它信息可参见文献97和98。已报导了Omp85的各种免疫原性片段。可用于本发明的优选Omp抗原包含的氨基酸序列是：(a)含有与SEQ ID NO：16序列50％或以上(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：16序列至少n个连续氨基酸的片段，其中’n’是7个或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250个或更多)。(b)所述的优选片段包含SEQ ID NO：16序列的一个表位。本发明最有用的Omp85抗原给予对象后引发的抗体能结合含氨基酸序列SEQ ID NO：16的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的Omp85抗原优选给予对象后能引发抗奈瑟球菌杀菌抗体。

本发明的组合物可包含936号抗原。936号抗原的基因NMB2091包含在已公布的脑膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的基因组序列中(本文的SEQ ID NO：17)。可用于本发明的优选936号抗原包含的氨基酸序列是：(a)含有与SEQ ID NO：17序列50％或以上(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或以上)相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：17序列至少n个连续氨基酸的片段，其中’n’是7个或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250个或更多)。(b)所述的优选片段包含SEQ ID NO：17序列的一个表位。本发明最有用的936号抗原给予对象后引发的抗体能结合含氨基酸序列SEQ ID NO：17的脑膜炎球菌多肽。936号抗原是fHBP的优良融合伴侣(例如见文献99和100)。

一种组合物可包含：含SEQ ID NO：18的多肽、含SEQ ID NO：19的多肽；和/或含SEQ ID NO：17的多肽和本发明的fHBP(参见文献99和100)。

一种组合物可包含：含SEQ ID NO：18的多肽、含SEQ ID NO：19的氨基酸24-350的多肽和含SEQ ID NO：17的多肽及本发明的fHBP(参见文献99和100)。

除奈瑟球菌多肽抗原外，所述组合物可包括用于其它疾病或感染免疫接种的抗原。例如，所述组合物可包括一种或多种下列其它抗原：

-脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)A、C、W135和/或Y血清群的糖抗原，如参考文献101[也见参考文献102]或参考文献103所述的C血清群的糖抗原。

-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如文献104、105、106]。

-甲型肝炎病毒如灭活病毒的抗原[例如107、108]

-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如108、109]。

--白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献110第3章]，如CRM₁₉₇突变蛋白[例如111]。

--破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如参考文献110第4章]。

-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合[例如参考文献112和113]。

-流感嗜血杆菌B的糖抗原[如102]。

-脊髓灰质炎抗原[如114、115]，例如IPV。

-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献110第9、10和11章]。

-流感抗原[例如参考文献110第19章]，如血凝素和/或神经酰胺酶表面蛋白。

-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[例如116]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)的蛋白抗原[例如117、118]。，].

-无乳链球菌(B型链球菌)的糖抗原。

-化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)的抗原[例如118、119、120]。

-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原[例如121]。

所述组合物可包含这些其它抗原的一种或多种。

必需时，可使毒性蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方法使百日咳毒素脱毒[113])。

当所述组合成物包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，在包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。

糖抗原优选偶联形式。下文中将更详细地讨论用于偶联物的载体蛋白。

所述组合物中各抗原的浓度一般至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。

本发明的免疫原性组合物可用于治疗(即治疗已有的感染)或预防(即防止将来的感染)。

作为本发明免疫原性组合物所用蛋白质抗原的一种替代，可采用编码该抗原的核酸(优选DNA，例如质粒形式的DNA)。

在一些实施方式中，本发明的组合物除fHBP序列外还包含脑膜炎球菌A、C、W135和Y血清群的1、2、3或4群的偶联的荚膜糖抗原。在其它实施方式中，本发明的组合物除fHBP序列外还包含至少一种偶联的肺炎球菌荚膜糖抗原。

脑膜炎球菌Y、W135、C和Y血清群

现有的C血清群疫苗(Menjugate^TM[122，101]，Meningitec^TM和NeisVac-C^TM)含有偶联糖。Menjugate^TM和Meningitec^TM含有与CRM₁₉₇载体偶联的寡糖抗原，而NeisVac-C^TM采用与破伤风类毒素载体偶联的完整多糖(脱-氧-乙酰化)。Menactra^TM疫苗含有Y、W135、C和A各血清群组的偶联荚膜糖抗原。

本发明的组合物可包含脑膜炎球菌Y、W135、C和A血清群的一群或多群的荚膜糖抗原，其中所述抗原与载体蛋白和/或寡糖偶联。例如，所述组合物可包含：C血清群；A和C血清群；A、C和W135血清群；A、C和Y血清群；C、W135和Y血清群；或所有A、C、W135和Y四种血清群的荚膜糖抗原。

每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的典型用量为1μg-20μg，例如，约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(表达的糖)。

当混合物包含血清群A和C的荚膜糖时，MenA糖与MenC糖的比例(w/w)大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。当混合物包含血清群Y和血清群C与W135之一或二者的荚膜糖时，MenY糖与MenW135糖的比例(w/w)大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)，和/或MenY糖与MenC糖的比例(w/w)小于1(例如，1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。血清群A∶C∶W135∶Y的糖优选比例(w/w)为：1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。血清群C∶W135∶Y的糖优选比例(w/w)为：1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1；和2∶1∶1。优选采用质量基本上相等的各种糖。

采用的荚膜糖是寡糖形式。通过片段化纯化的荚膜多糖(例如水解)可方便地形成寡糖，片段化后通常经过纯化得到所需大小的片段。

优选进行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30(例如，血清群A寡糖为10-20，优选约10；血清群W135和Y寡糖15-25，优选约15-20；血清群C寡糖12-22等)。可用离子交换色谱或比色试验方便地测定DP[123]。

如果水解，通常要按分子大小分级水解产物去除较短寡糖[102]。可用各种方法如超滤然后离子交换层析实现。对于血清群A，优选去除聚合度低于或等于约6的寡糖；对于血清群W135和Y，优选去除聚合度低于4左右的寡糖。

参考文献122描述了在Menjugate^TM中使用的优选MenC糖抗原。

可化学修饰糖抗原。这对减少血清群A糖的水解特别有用[124；见下文]。可进行脑膜炎球菌糖的脱-氧-乙酰化。可在解聚之前或之后进行对寡糖修饰。。

当本发明的组合物包含MenA糖抗原时，优选该抗原为天然糖的一个或多个羟基被封闭基团取代的修饰糖[124]。这种修饰可改善对水解的抗性。

共价偶联

通常将本发明组合物中的荚膜糖与载体蛋白偶联。一般而言，偶联可以增强糖的免疫原性，因为偶联可使糖由T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，而能引发免疫记忆。偶联对儿科疫苗特别有用，是一项众所周知的技术。

典型的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或其类毒素或突变体。可采用CRM₁₉₇白喉毒素突变体[125]，它是PREVNAR^TM产品中的载体。其他合适的载体蛋白包括：脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[126]、合成肽[127，128]、热激蛋白[129，130]、百日咳蛋白[131，132]、细胞因子[133]、淋巴因子[133]、激素[133]、生长因子[133]、含有病原体衍生抗原人CD4⁺T细胞多个表位的人造蛋白[134]如N19[135]、流感嗜血杆菌的D蛋白[136-138]、肺炎球菌溶血素[139]或其无毒衍生物[140]、肺炎球菌表面蛋白PspA[141]、铁摄取蛋白[142]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[143]、重组金黄色葡萄球菌胞外蛋白A(rEPA)[144]等等。

可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。

一般在偶联前活化或功能化所述糖。例如，活化包括采用氰化试剂如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[145，146等])。其它合适的技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU等。

可用任何已知方法，如参考文献147和148所述的方法，通过接头基团进行连接。一种连接类型包括多糖的还原性胺化，将产生的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于该己二酸接头基团的另一端[149，150]。其它接头包括：B-丙酰胺基[151]、硝基苯基-乙基胺[152]、卤代酰基卤化物[153]、配糖键[154]、6-氨基己酸[155]、ADH[156]、C₄-C₁₂接头[157]等。作为采用接头的替代方法，可采用直接连接法。直接连接蛋白质的方法包括氧化多糖，然后与蛋白质还原性胺化，例如见参考文献158和159所述。

方法优选包括：将氨基引入糖中(例如用-NH₂取代末端＝O基团)，用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生后与载体蛋白反应。对于MenA或MenC，另一种优选的反应采用CDAP活化D载体蛋白。

外膜囊泡

优选本发明组合物不含复杂或不明确的混合抗原，此为OMV的典型特征。然而，本发明可联用OMV，因为发现fHBP能增强其效果[6]，特别是用于制备OMV的菌株过量表达本发明多肽时。

该方法通常用于改善脑膜炎奈瑟球菌血清群B微囊泡[160]、“天然OMV”[161]、水泡和外膜囊泡[例如参考文献162-167等]的制备。这些可采用经遗传工程改造的细菌制备[168-171]，例如，以提高免疫原性(例如超量表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。这些可采用高发泡菌株制备得到[172-175]。可包括非病原性奈瑟球菌的囊泡[176]。制备OMV时可不用洗涤剂[177，178]。这些细菌可表面表达非奈瑟球菌蛋白[179]，可以是LPS被删除的细菌。可将OMV与重组抗原混合[162，180]。可采用含有I类外膜蛋白不同亚型的细菌囊泡，例如，采用两种不同的遗传工程改造囊泡群每种显示三种亚型的六种不同亚型[181，182]；或采用三种不同的遗传工程改造囊泡群每种显示三种亚型的九种不同亚型，等等。可用的亚型包括：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1；P1.18-1，3，6。

更多的细节在下文中给出。

蛋白质表达

细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是能结合细菌RNA聚合酶启动下游(3’端)编码序列(例如结构基因)转录为mRNA的任何DNA序列。启动子含有通常位于靠近编码序列5’末端处的转录起始区。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可含称为操纵基因的第二结构域，其可能与相邻的启动RNA合成的RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子可负调节(可诱导地)转录，因为基因阻抑蛋白可结合操纵基因从而抑制特定基因的转录。组成性表达可在负调节元件如操纵基因不存在时发生。此外，正调节可通过基因激活蛋白结合序列(如果存在，通常靠近(5’)RNA聚合酶结合序列}而实现。基因激活蛋白的一个例子是分解代谢激活蛋白(CAP)，它在大肠杆菌(E.coli)中协助乳糖操纵子启动转录[Raibaud等(1984)Annu.Rev.Genet.18：173]。因此，受调节的表达可以是正调或负调，从而增强或减弱转录。

代谢途径酶的编码序列可提供特别有用的启动子序列。例子包括糖，如半乳糖、乳糖(lac)和麦芽糖代谢酶的启动子序列[Chang等(1977)Nature 198：1056]。其它例子包括生物合成酶的启动子，例如色氨酸(trp)[Goeddel等(1980)Nuc.AcidsRes.8：4057；Yelverton等(1981)Nucl.Acids Res.9：731；美国专利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775]。β-内酰胺酶(bla)启动子***[Weissmann(1981)″干扰素克隆和其他失误.″刊登于(干扰素3(I.Gresser编)]，噬菌体λPL[Shimatake等(1981)Nature 292：128]和T5[美国专利4,689,406]启动子***也提供了有用的启动子序列。另一个感兴趣的启动子是可诱导的***糖启动子(pBAD)。

此外，自然界不存在的合成启动子也具有细菌启动子一样的功能。例如，可将一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列与另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子连接，产生合成的杂交启动子[美国专利4,551,433]。例如，tac启动子是trp-lac杂交启动子，由trp启动子和lac阻抑蛋白调控的lac操纵子序列组成[Amann等(1983)Gene 25：167；de Boer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源，能结合细菌RNA聚合酶启动转录的天然启动子。也可将非细菌来源的天然启动子与相容的RNA聚合酶偶联，以在原核生物中产生一些基因的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子***是偶联启动子***的一个例子[Studier等(1986)J.Mol.Biol.189：113；Tabor等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：1074]此外，杂交启动子也可包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区域(EP-A-0267851)。

除功能性启动子序列外，也利用有效的核糖体结合位点在原核生物中表达外源基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgarno(SD)序列，包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处长3-9个核苷酸的序列。认为通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3’末端之间碱基配对SD序列能促进mRNA与核糖体结合[Steitz等(1979)“信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列”，刊登在[于生物调控和发育：基因表达(R.F.Goldberger编)]。为表达含弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等(1989)“大肠杆菌中克隆基因的表达”刊登在[分子克隆：实验手册].

可将启动子序列与DNA分子直接连接，在这种情况下，N-末端的第一个氨基酸总是起始密码子ATG编码的甲硫氨酸。如果需要，可与溴化氰体外培育或与细菌甲硫氨酸N-末端的肽酶体内或体外培育，切去蛋白质N-末端的甲硫氨酸(EP-A-0219237)。

细菌识别的转录终止序列通常位于翻译终止密码子3’端的调控区域，与启动子一起侧接编码序列。这些序列指导mRNA的转录，使DNA翻译成其编码的多肽。转录终止序列通常包括能形成有助于终止转录的茎-环结构的约50个核苷酸的DNA序列。例子包括含强启动子的基因的转录终止序列，如大肠杆菌的trp基因以及其它生物合成的基因。

上述组分通常包括启动子、信号序列(如果需要)、感兴趣的编码序列和转录终止序列，一起组成表达构建物。表达构建物通常保持在复制子中，如能够稳定保持在宿主如细菌中的染色体外元件(例如质粒)。复制子含有复制***，能保持在原核宿主中表达或克隆扩增。此外，复制子可以是高拷贝或低拷贝数质粒。高拷贝数质粒一般有约5-200个拷贝，通常约10-150个。包含高拷贝数质粒的宿主优选含至少约10个质粒，更优选至少约20个质粒。可根据载体和外源蛋白对宿主的效力选择高拷贝数或低拷贝数载体。

或者，可用整合载体将表达构建物整合入细菌基因组中。整合载体通常包含至少一段与细菌染色体同源允许载体整合的序列。整合看来是载体的同源DNA与细菌染色体之间的重组所致。例如，构建的含各种杆菌菌株DNA的整合载体都能整合入该杆菌的染色体(EP-A-0127328)中。整合载体也可包含噬菌体序列或转座子序列。

染色体外和整合表达构建物通常包含可选择性标记基因，而允许选择转化的细菌菌株。可选择性标记基因可在细菌宿主中表达，可包括赋予细菌产生对药物，如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环霉素抗性的基因[Davies等(1978)Annu.Rev.Microbiol.32：469]。可选择性标记基因也包括生物合成基因，如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成通路中的基因。

或者，可将上述组分的一些一起放置到转化载体中。转化载体通常包含保持在复制子中或构建入上述整合载体中的可选择性标记基因。

已开发出可转化许多细菌的表达和转化载体，染色体外复制子或整合载体。例如，已开发出可用于转化以下细菌的表达载体：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[Palva等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0036259和EP-A-0063953；WO84/04541]，大肠杆菌[Shimatake等(1981)Nature 292：128；Amann等(1985)Gene40：183；Studier等(1986)J.Mol.Biol.189：113；EP-A-0 036 776，EP-A-0 136 829和EP-A-0 136 907]，乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)[Powell等(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]；变青链球菌(Streptococcus lividans)[Powell等(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]，变青链霉菌[美国专利4,745,056].

将外源DNA引入细菌宿主的方法是本领域众所周知的，通常包括转化经CaCl₂或其它试剂，如二价阳离子和DMSO处理的细菌。也可通过电穿孔将DNA引入细菌细胞。转化步骤通常随转化的细菌种类而不同。参见例如[Masson等(1989)FEMS Microbiol.Lett.60：273；Palva等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0036259和EP-A-0063953；WO84/04541，杆菌]，[Miller等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：856；Wang等(1990)J.Bacteriol.172：949，Campylobacter]，[Cohen等(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.69：2110；Dower等(1988)Nucleic Acids Res.16：6127；Kushner(1978)“用ColE1-衍生质粒转化大肠杆菌的改进方法”，刊登在[遗传工程：遗传工程国际研讨会论文集](H.W.Boyer和S.Nicosia编)；Mandel等(1970)J.Mol.Biol.53：159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949：318；埃希菌]，[Chassy等(1987)FEMS Microbiol.Lett.44：173乳杆菌]；[Fiedler等(1988)Anal.Biochem170：38，假单胞菌]；[Augustin等(1990)FEMS Microbiol.Lett.66：203，葡萄球菌]，[Barany等(1980)J.Bacteriol.144：698；Harlander(1987)“用电穿孔转化乳酸链球菌”刊登在[链球菌遗传学](J.Ferretti和R.Curtiss III编)；Perry等(1981)Infect.Immun.32：1295；Powell等(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655；Somkuti等(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1：412，链球菌]。

宿主细胞

本发明提供一种可表达本发明多肽的细菌。这种细菌可以是脑膜炎球菌。这种细菌可组成性表达所述多肽，但在一些实施方式中，在可诱导型启动子调控下表达。所述细菌可以高表达该多肽(参见文献183)。该多肽的表达不随时相的变化表达。

本发明也提供由本发明细菌制备的外膜囊泡。还提供制备本发明细菌所产生的囊泡的方法。制备的这些菌株的囊泡优选包含本发明的多肽，囊泡中的多肽应为免疫反应可触及形式，即可结合本发明纯化多肽的抗体也应能结合存在于囊泡中的多肽。

这些外膜囊泡包括通过破坏或发泡脑膜炎球菌外膜形成含外膜蛋白组分的囊泡而获得的脂蛋白体囊泡。因此该术语包括OMV(有时称为“小泡”)、微囊泡(MV[160])和“天然OMV”(“NOMV”[161]))。

MV和NOMV是天然的膜囊泡，在细菌生长时自发形成释放到培养基中。可通过以下方法获得MV：在肉汤培养基中培养奈瑟球菌，分离全细胞与肉汤培养基中较小的MV(例如过滤或低速离心，只沉淀细胞不沉淀较小囊泡)，然后收集去除细胞培养基中的MV(例如过滤、差速离心或聚集MV，高速离心沉淀MV)。通常可根据培养基中产生的MV量选择用于生产MV的菌株，例如文献174和175描述了高产MV的奈瑟菌。

人工制备细菌OMV，可利用洗涤剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或非洗涤剂方法(例如参见文献178)进行制备。形成OMV的技术包括用胆酸盐去污剂(例如石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选脱氧胆酸钠[184和185]处理奈瑟球菌)在不会沉淀去污剂的足够高pH下[186]处理细菌。其它技术是在基本上不用洗涤剂情况下[178]，采用例如超声、均化、微流体化、空化、渗透压休克、研磨、弗细胞压碎法(French press)、搅拌等技术。不用或用低浓度洗涤的方法可以保留有用的抗原，如NspA[178]。因此一种方法采用含0.5％或更低，如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或0浓度的脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液。

参考文献187描述了一种制备OMV的有用方法，涉及超滤粗制OMV代替高速离心。该方法包括超滤后进行超离心步骤。

可用任何脑膜炎球菌菌株制备本发明用的囊泡。所述囊泡通常为血清群B菌株囊泡，但也可制备B血清群外，如A、C、W135或Y血清群菌株的囊泡(例如，文献186描述了血清群A囊泡的一种制备方法)。所述菌株可以属于任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如，L1；L2；L3；L3，3，7；L10等)。所述脑膜炎球菌可以是任何合适的谱系，包括高侵袭性与超毒力谱系，如以下7种：I亚群、III亚群、IV 1亚群、ET 5复合物、ET 37复合物、A4簇、谱系3超毒力谱系中的任何一种。

除编码本发明的多肽外，本发明的细菌还可含有一个或多个其他修饰。例如，可含有修饰的fur基因[188]。nspA表达上调可伴随porA和cps敲除。参考文献193描述了用于生产OMV的脑膜炎奈瑟球菌的其他敲除突变体。参考文献189描述了采用经修饰能表达6种不同PorA亚型的菌株构建的囊泡。也可采用通过敲除参与LPS生物合成的酶而获得的内毒素水平低的奈瑟球菌突变株[190，191]。这些或其它突变株可用于本发明。

因此在一些实施方式中本发明所用的菌株可表达一种以上的PorA亚型。之前已构建了6价和9价PorA菌株。这种菌株表达的2、3、4、5、6、7、8或9种PorA亚型是：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.121.13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1和/或P1.18-1，3，6。在其它实施方式中，采用PorA表达下调的菌株，例如，PorA含量比野生型菌株水平(例如相对于H44/76菌株)低至少20％(例如，≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％等)，或甚至被敲除的菌株。

在一些实施方式中，菌株可高表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白质。例如，菌株可高表达NspA、287号蛋白[162]、fHBP[183]、TbpA和/或TbpB[180]、铜、锌超氧化物歧化酶、HmbR等。

可将编码本发明多肽的基因整合入细菌染色体中，或以游离形式存在，例如在质粒中。

对于囊泡生产，宜对脑膜炎球菌进行遗传工程改造，以确保多肽的表达不会发生时相变化。参考文献192描述了减少或消除脑膜炎球菌基因表达时相变化的方法。例如，将基因置于组成型或诱导型启动子控制下，或去除或转换负责时相变化的DNA基序。

在一些实施方式中，脑膜炎球菌菌株可包含一个或多个参考文献166、168、172和193描述的敲除突变和/或高表达突变。要下调和/或敲除的优选基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；和(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC。

采用突变菌株时，在一些实施方式中，这种菌株具有一种或多种或全部下列特征：(i)LgtB和/或GalE下调或敲除以截短脑膜炎球菌的LOS；(ii)TbpA上调；(iii)NhhA上调；(iv)Omp85上调；(v)LbpA上调；(vi)NspA上调；(vii)PorA敲除；(viii)FrpB下调或敲除；(ix)Opa下调或敲除；(x)Opc下调或敲除；(xii)cps基因复合体删除。截短的LOS可以不包含唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，可以是半乳糖缺陷型LOS。所述LOS可以没有α链。

取决于制备囊泡所用的脑膜炎球菌菌株，可包括或不括含天然fHBP抗原的菌株[194]。

如果LO S存在于囊泡中，可处理该囊泡使之连接LOS和蛋白质组分(“内泡”偶联[193])。

概述

术语“包含”包括“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”任选是平均值，例如x±10％。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含“Y的组合物可以完全不含Y。需要时，可从本发明定义中删除该词“基本上”。

优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性检索算法，利用仿射缺口搜索测定“序列相同性”，参数为缺口开放罚分＝12，缺口延伸罚分＝1。

脑膜炎球菌的分类，在血清群之后包括血清型、血清亚型和免疫型，标准命名法包括血清群、血清型、血清亚型和免疫型，彼此之间用冒号隔开，例如B：4：P1.15：L3，7，9。在血清群B中，一些谱系经常引起疾病(高侵袭性)，一些谱系引起比其它谱系更严重形式的疾病(超毒力)，其余很少引起疾病。识别出7种超毒力谱系，即I、III和IV-1亚群、ET-5复合体、ET-7复合体、A4簇和谱系3。这些谱系已通过多个基因座酶电泳(MLEE)作了定义，但也可利用多基因座序列分型(MLST)对脑膜炎球菌分类。4种主要的超毒力簇是ST32、ST44、ST8和ST11复合体。

总之，本发明不包括参考文献4，5，7，8，9，195，196，197，198，199，200和201中具体公开的各种fHBP序列。

实施本发明的方式

fHBP突变

参考文献10公开的一个突变fHBP称为‘E283A，E304A’，其中SEQ ID NO：1237和238位谷氨酸残基突变为丙氨酸。表面等离振子共振显示，该双突变蛋白的亲和力比未突变蛋白至少降低了两个数量级以上，当采用50nM试剂时，几乎没有可检测的相互作用。作者没有报道该突变蛋白的任何免疫原性。

用FACS研究人fH与活脑膜炎球菌的结合。该实验证实fH能结合所有测试菌株细菌。剂量相关的结合很明显。与多克隆抗-fHBP抗体(1∶100)一起培育可抑制这种结合。

制备的突变菌株中天然fHBP基因被双谷氨酸突变基因取代。FACS证实了文献10的发现，即这些突变菌株并不适合结合fH。结合fH在该突变菌株与ΔfHBP敲除菌株中相似。相反，抗-fHBP血清能结合野生型菌株和突变菌株，但不结合ΔfhBP菌株。

用SBA试验测试了用文献100公开的疫苗接种病人获得的血清对重组菌株的杀菌抗体效力。含(i)野生型fHBP或(ii)突变fHBP的重组菌株之间SBA灵敏度没有显著不同。这些数据提示，fH结合并不影响杀菌抗体效力。

因此，可将fHBP结合fH的能力与其免疫原性分开。该发现意味着可改进fHBP用作抗原。可工程改造该蛋白以最大程度减弱其与fH的相互作用，同时保留其免疫原性。例如，fH结合能力减弱意味该蛋白质的表位在体内不会被fH遮蔽，例如，可优化该蛋白使其递呈给免疫***而不受fH干扰。

NMR研究

文献10采用X射线晶体图研究了fHBP与fH的互补对照蛋白(CCP)结构域6和7之间的相互作用。相反，用NMR研究了在溶液中fHBP与CCP结构域5-7之间的相互作用。用HSQC分析了¹⁵N标记的fHBP(含或不含人fH的CCP结构域5-7，分子比1∶1)。这些实验鉴定到与fH相互作用的残基或由于该相互作用改变的残基。

残基37，38，41，42，43，45，56，80，82，83，84，86，89，91，95，112，115，116，119，121，122，124，126，127，128，129，130，139，141，143，160，163，188，198，199，207，210，211，213，219，220，221，223，237，241，242和248(根据SEQID NO：4编号)是表面暴露的残基，受到fH/fHBP相互作用的干扰。残基31，32，36，39，40，44，57，64，74，76，78，80，93，96，97，98，99，101，103，107，109，110，111，129，132，135，152，165，177，179，196，198，206，212，224，225，226，236，238，248，249，250和251也受到干扰但被埋藏。

这些残基确定了包括fHBP的-N和C-末端结构域的广泛区域。值得注意的是，位于连接fHBP的N-和C-结构域接头中的表面暴露残基(Thr139，Phe141，Asp142和Lys143)和几个位于fHBP结构域-结构域界面的埋藏的残基(Gln97，Tyr99，Gln101，His103，Phe129，Gly132，Ala135，Ile226，Gly236，Ser237，His248，Ile249，Gly250和Leu251)受到干扰，提示在该复合物形成过程中发生fHbp分子重排。

在溶液中受干扰的表面暴露残基总数确定了比文献10中所见的更大的接触区域，但是仍然包含该文中所见的全部残基。两个重要的例外是Glu218和Glu239，在NMR实验中似乎受到的影响很小。

可以解释这种差别，假设是该分子发生了构象改变。可利用fHBP-fH复合物相互作用模型判定更多数目的受干扰残基，如果与游离fHBP的结构相比，fHBP的N-和C-结构域彼此朝向发生了改变。其它差别可归因于fHbp与fH结构域7之间的接触增加。

突变fHBP序列

NMR结构研究提供了fHBP中可能突变导致降低该蛋白与fH相互作用的残基。可逐个突变或组合突变这些残基，然后用常规试验测试得到的蛋白质(i)与fH相互作用和(ii)引发杀菌抗体的能力。例如，将MC58抗原中的下列残基：43，45，56，83，112，116，119，122，127，139，141，142，143，198，211，219，221，241突变成丙氨酸然后测试。因此，例如该方法提供了包含23-27的蛋白质。

这些残基分成四簇A-D：

A：残基112，116，119，122，127.

B：残基43，45，56，83.

C：残基211，219，221，241.

D：残基139，141，142，143，198.

每簇主要由NMR实验所鉴定的残基组成，每簇限定该蛋白质表面的一个不同区域。

初步实验显示A簇中的突变影响了fH/fHBP结合。

鉴定到的残基不仅适合用于野生型序列修饰。例如，文献201公开了经过修饰提高了引发家族间抗fHBP杀菌抗体能力的fHBP类型(例如本文中的SEQ IDNOs：20-22)。可按照NMR鉴定到的残基进一步修饰这些蛋白，以降低其fH结合能力同时保留其有用的免疫原性。例如，SEQ ID NO：20包括SEQ ID NO：4的Asp-37(SEQID NO：20自己的编号为Asp-30)。可将该残基突变成(例如甘氨酸而提供SEQ IDNO：28)，(i)其与fH相互作用的亲和力可用文献10的方法测试，和(ii)可用文献4的方法测试其引发杀菌抗体的能力。

铁载体结合

fHBP包含的β-桶结构域与脂质运载蛋白在结构上强烈同源。将脑膜炎球菌fHBP与四种不同的铁载体蛋白(肠菌素、沙门菌亲铁蛋白(salmochelin)、耶尔森菌素、气菌素)混合后用胰蛋白酶消化。所有样品的消化模式与对照相似，除了肠菌素和沙门菌亲铁蛋白的混合物中仍有痕量未消化的蛋白外。分子大小排阻层析显示fHBP与肠菌素共同洗脱，但用阴性对照观察不到这种共同洗脱。天然PAGE也表明fHBP与肠菌素之间有相互作用。

fHBP的含有β-桶的BC片段也能与肠菌素相互作用。

与肠菌素或沙门菌亲铁蛋白培育24小时后，SDS-PAGE可见高分子量条带，表明铁载体介导了fHBP形成二聚体(或三聚体)。

NMR研究揭示了肠菌素存在下信号受干扰的残基。根据SEQ ID NO：4的编号，这些残基是：102，136-138，148-154，166，205，230和254位残基。这些残基都位于一个明确的区域，表明特定的相互作用。与在β-桶内部结合肠菌素的铁载体不同，fHBP的相互作用发生在该桶的外表面。具体说，涉及Arg和Lys残基(Arg-149，Arg-153，Lys-230，Lys-254)。

与肠菌素相互作用的残基和与fH相互作用的残基不同。因此，fHBP可能同时结合fH和铁载体。

采使固定fHBP的Biacore试验也证实了与离子载体肠菌素的相互作用。肠菌素以剂量依赖方式和微摩尔亲和力结合fHBP。还观察到fHBP与沙门菌亲铁蛋白(另一种儿茶酚配合物)的结合，但不与耶尔森菌素或气菌素结合。

在血清抗体杀菌实验中测试了fHBP与或不与肠菌素预培育的结果肠菌素的存在不影响杀菌抗体滴度。

为了消除铁载体的相互作用，可突变氨基酸残基102，136-138，148-154，230和/或254。该编号根据SEQ ID NO：4，在SEQ ID NO：5和6中的相应氨基酸残基通过排列比对不难鉴定。用SEQ ID NO：4作为起点，例如残基Arg-149，Tyr-152，Arg-153，和/或Lys-254可用丙氨酸取代而提供SEQ ID NO：29-32。

应理解，仅通过上述实施例描述了本发明，可对其进行修改而仍在本发明的范围和思路内。

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[200]WO2007/060548

[201]WO2009/104097.

Claims

1.一种多肽，其特征在于，包含：(a)与SEQ ID NO：4，5或6任一序列至少90％相同的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO：4，5或6的片段；但(b)其中以下所示SEQ ID NO：4、5或6序列的一个或多个氨基酸残基缺失或被不同氨基酸取代：

SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：5 SEQ ID NO：6 Asp-37 Asp-37 Glu-42 Lys-45 Lys-45 Thr-50 Thr-56 Thr-56 Thr-61 Glu-83 Glu-83 Glu-91 Glu-95 Glu-95 Glu-103 Glu-112 Glu-112 Glu-120 Lys-122 Ser-122 Ser-130 Val-124 Ile-124 Ile-132 Arg-127 Arg-127 Arg-135 Thr-139 Thr-139 Thr-147 Phe-141 Phe-141 Phe-149 Asp-142 Asn-142 Asn-150 Lys-143 Gln-143 Gln-151 Ile-198 Leu-197 Leu-205 Ser-211 Asp-210 Asp-218 Leu-213 Arg-212 Arg-220 Lys-219 Lys-218 Lys-226 Asn-43 Asn-43 Asn-48 Asp-116 Asn-116 Asn-124 His-119 Lys-119 Lys-127 Ser-221 Thr-220 Thr-228 Lys-241 Lys-240 Lys-248

该多肽(i)给予宿主动物后可引发能识别含SEQ ID NO：4，5或6序列的野生型脑膜炎多肽的抗体，和(ii)这种抗体对人H因子的亲和力低于对相同但不含(b)所述修饰的多肽的亲和力。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，包含与SEQ ID NO：4具有至少90％相同的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO：4的片段，和给予宿主动物后可引发能识别含SEQ ID NO：4序列的野生型脑膜炎多肽的抗体。

3.一种设计修饰的fHBP氨基酸序列的方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供起始氨基酸序列，其中含有该起始氨基酸序列或由其组成的蛋白能结合人H因子；(ii)采用配对序列比对算法鉴定该起始氨基酸序列内与权利要求1表格中所列SEQID NO：4、5或6的残基相对的氨基酸残基；(iii)删除步骤(ii)所述鉴定的氨基酸或用不同的氨基酸置换，从而提供修饰的fHBP氨基酸序列。

4.一种多肽，其特征在于，包含(i)用权利要求3所述方法设计的修饰的fHBP氨基酸序列，或(ii)选自SEQ ID NO：23-32序列的氨基酸序列。

5.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1、权利要求2或权利要求4所述的多肽。

6.一种包含编码权利要求1、2或4任一项所述多肽的核苷酸序列的质粒。

7.一种用权利要求6所述的质粒转化的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是脑膜炎球菌。

9.权利要求8所述宿主细胞制备的膜囊泡，其特征在于，所述囊泡包含权利要求1、2或4任一项所述的多肽。

10.一种免疫原性组合物，其特征在于，包含权利要求1、2或4所述的多肽，或权利要求9所述的囊泡。

11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，包括佐剂。

12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述佐剂包括铝盐。

13.如权利要求10-12任何一项所述的组合物，其特征在于，还包含第二多肽，在给予哺乳动物时，可引发对脑膜炎球菌的杀菌抗体应答反应，限制条件是所述第二多肽不是脑膜炎球菌的fHBP。

14.如权利要求10-13任何一项所述的组合物，其特征在于，还包含脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的偶联荚膜糖。

15.如权利要求10-14任何一项所述的组合物，其特征在于，还包含偶联的肺炎球菌荚膜糖。

16.一种引发哺乳动物抗体应答的方法，其特征在于，包括给予权利要求10-15任何一所述的免疫原性组合物。