BE1022641A1 - POLYPEPTIDES MENINGOCOCCIQUES fHbp MODIFIES - Google Patents

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BE1022641A1 BE20155456A BE201505456A BE1022641A1 BE 1022641 A1 BE1022641 A1 BE 1022641A1 BE 20155456 A BE20155456 A BE 20155456A BE 201505456 A BE201505456 A BE 201505456A BE 1022641 A1 BE1022641 A1 BE 1022641A1
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Matthew Bottomley
Vega Masignani
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Glaxosmithkline Biologicals Sa
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Abstract

Les inventeurs ont identifié des résidus dans le variant lU^t 2 et le variant 3 du fHbp méningococcique qui peuvent être modifiés pour améliorer leurs propriétés bezo™

Description

POLYPEPTIDES MENINGOCOCCIQUES fHbp MODIFIES DOMAINE TECHNIQUE
Cette invention relève du domaine de l'ingénierie des protéines, et concerne en particulier la protéine méningococcique liant le facteur H (fHbp), qui est connue comme étant un immunogène vaccinal utile.
CONTEXTE
Neisseria meningitidis est une bactérie capsulée à Gram-négatif qui colonise les voies respiratoires supérieures d'environ 10 % de la population humaine. Des vaccins conjugués sont disponibles contre les sérogroupes A, C, W135 et Y, mais le seul vaccin disponible pour se protéger contre le sérogroupe B en général est le BEXSERO™ qui a été approuvé en 2013.
Un des immunogènes protecteurs dans le BEXSERO™ est fHbp, ayant également été connu sous les noms de protéine "741" (SEQ ID NO : 2536 dans la réf. 1 ; SEQ ID 1 dans la présente), "NMB1870", "GNA1870" [2-4], "P2086", "LP2086" ou "ORF2086" [5 7]. La structure 3D de cette protéine est connue [8, 9], et comporte deux tonneaux ß joints par un court lieur («linker»). De nombreuses publications ont rapporté l'efficacité protectrice de cette protéine dans les vaccins antiméningococciques, voir p. ex. les références 10-14. La lipoprotéine fHbp est exprimée dans diverses souches couvrant tous les sérogroupes. Les séquences fHbp ont été regroupées en trois variants [2] (désignés vl, v2 et v3 dans la présente), et il s'est avéré de manière générale qu'un sérum dirigé contre un variant donné est bactéricide envers les souches qui expriment ce variant, mais n'est pas actif envers les souches qui expriment l'un des deux autres variants, à savoir qu'il y a une protection croisée intra-variant, mais pas de protection croisée inter-variants (hormis quelques cas de réactivité croisée v2 et v3).
Pour accroître la réactivité croisée inter-familles, la séquence fHbp a été remaniée pour contenir des spécificités afférentes aux trois variants [15]. L'ingénierie des protéines a également été utilisée pour éliminer l'interaction de la fHbp avec des sidérophores [16] et avec le facteur H humain [17-25] . La rupture de l'interaction avec fH a été rapportée pour les trois variants et est postulée pour obtenir un immunogène vaccinal supérieur [22, 26] . Pour les polypeptides v2, toutefois, les références 23 et 24 rapportent une instabilité inhérente qui est également observée chez les mutants ayant une liaison fH rompue. L'instabilité semble émaner du domaine du ß-tonneau N-terminal, et la référence 23 avertit que toute substitution dans ce tonneau risque de favoriser l'instabilité. Des mutations visant à améliorer la stabilité des séquences v2 sont décrites dans la référence 27.
Un des objets de l'invention est de proposer des mutants v2 et v3 de fHbp ayant des propriétés améliorées.
RESUME DE L'INVENTION
Selon un aspect, la présente invention concerne un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 80 % avec SEQ ID NO : 5, dans lequel la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 5 au niveau des résidus 123 et 240 par rapport à SEQ ID NO : 5, et le polypeptide peut, après administration à un sujet humain, susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 4.
Selon un autre aspect, l'invention est un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 80 % avec SEQ ID NO : 5, dans lequel la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : .5 au niveau des résidus 32, 123 et 240 par rapport à SEQ ID NO : 5, et le polypeptide peut, après administration à un sujet humain, susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 4.
Selon un autre aspect, l'invention est un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 80 % avec SEQ ID NO : 17, dans lequel la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 17 au niveau des résidus 126 et 243 par rapport à SEQ ID NO : 17, et le polypeptide peut, après administration à un sujet humain, susciter la production d'anticorps capables- de reconnaître un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 40.
Selon un .autre aspect, l'invention est un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 80 % avec SEQ ID NO : 17, dans lequel la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 17 au niveau des résidus 32, 126 et 243 par rapport à SEQ ID NO : 17, et le polypeptide peut, après administration à un sujet humain, susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 40.
Selon un autre aspect, l'invention est un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 47, dans lequel par rapport à SEQ ID NO : 47, le résidu 123 n'est pas leucine et le résidu 240 n'est pas glutamate ; et dans lequel, quand il est administré à un sujet humain, le polypeptide peut susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v2.
Selon un autre aspect, l'invention est un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 47, dans lequel par rapport à SEQ ID NO : 47, le résidu 32 n'est pas sérine, le résidu 123 n'est pas leucine et le résidu 240 n'est pas glutamate ; et dans lequel, quand il est administré à un sujet humain, le polypeptide peut susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v2.
Selon un autre aspect, l'invention est un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 48, dans lequel par rapport à SEQ ID NO : 48, le résidu 126 n'est pas leucine et le résidu 243 n'est pas glutamate ; et dans lequel, quand il est administré à un sujet humain, le polypeptide peut susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v3.
Selon un autre aspect, l'invention est un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 48, dans lequel par rapport à SEQ ID NO : 48, le résidu 32 n'est pas sérine, le résidu 126 n'est pas leucine et le résidu 243 n'est pas glutamate ; et dans lequel, quand il est administré à un sujet humain, le polypeptide peut susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v3.
Selon un autre aspect, l'invention concerne des polypeptides de fusion qui, quand ils sont administrés à un sujet humain, suscitent une réponse en anticorps qui est bactéricide envers à la fois un méningocoque qui exprime un fHbp v2 et un méningocoque qui exprime un fHbp v3.
Selon un autre aspect, l'invention est une composition immunogène comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un polypeptide ou un polypeptide de fusion selon 1'invention.
Selon un autre aspect, l'invention est une méthode destinée à susciter une réponse en anticorps chez un sujet humain, comprenant l'administration audit sujet humain d'une composition immunogène selon l'invention.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 montre la réponse SPR du fHbp v 2 de type sauvage (courbe du haut), du mutant E266 de v2 (courbe de bas) et du mutant S58V/L149R de v2 (courbe du milieu) liés au fH immobilisé. L'axe des y indique des unités relatives, et l'axe des x, le temps (secondes, 0 correspondant à l'injection de l'échantillon).
La Figure 2 montre les résultats DSC du fHbp v2 de type sauvage et du mutant S58V/L149R de v2 . Le domaine C-terminal n'est pas affecté par la mutation, mais la Tm du domaine N-terminal a augmenté de >20 °C (matérialisée par la flèche). L'axe des y indique le Cp (kcal/mol/ °C) , et l'axe des x, la température ( °C).
La Figure 3 montre les résultats DSC du fHbp v2 de type sauvage et du mutant E266A de v2. La transition N-terminale disparaît chez le mutant, mais la Tm du domaine C-terminal a augmenté de >16 °C.
Figure 4 montre la réponse SPR des polypeptides de fusion fHbp v2-v3-vl de "type sauvage" (courbe du haut, en pointillés) et du "mutant SNB" (courbe du bas, trait plein).
La Figure 5 montre les résultats DSC des polypeptides de fusion fHbp v2-v3-vl (A) "type sauvage" et (B) "mutant SNB".
La Figure 6 montre la réponse SPR du fHbp v3, soit sous sa forme type sauvage (haut), soit portant diverses mutations.
La Figure 7 montre les structures du fHbp v2 (Figure 7a) et v3 (Figure 7b) déterminées par cristallographie aux rayons X en l'absence du facteur H après stabilisation du fHbp à l'aide des mutations S58 et L149.
La Figure 8 compare la stabilité de la fusion "type sauvage" (SEQ ID NO : 18) à celle de la fusion stabilisée non liante (SEQ ID NO : 27) dans des extraits d'E. coli analysé par transfert Western blot. La Figure 8a montre que les formes tronquées de la fusion stabilisée non liante sont moins prévalentes. La Figure 8b démontre que la fusion stabilisée non liante est moins sujette au clivage par la chymotrypsine que la fusion "type sauvage".
La Figure 9 est une représentation schématique de la fusion 231 SNB.
DESCRIPTION DETAILLEE
Le fHbp pleine longueur provenant de la souche 2996 dans v2 a la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO : 2) :
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQS VRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQ IYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKA FSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRY GSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
La lipoprotéine mature est dépourvue des 19 premiers acides aminés de SEQ ID NO : 2 (soulignés ; donne SEQ ID NO : 4, commençant par Cys-20). Elle est également connue pour produire une forme "AG" du fHbp dans laquelle l'extrémité N-terminale est tronquée jusqu'au résidu 26 (à savoir, qui élimine la portion poly-glycine et commence à la place par Val-27), donnant ainsi SEQ ID NO : 5.
Le fHbp pleine longueur provenant de la souche M1239 dans v3 a la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO : 3) :
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSL TLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTI TLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGG KAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHA VILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
La lipoprotéine mature est dépourvue des 19 premiers acides aminés de SEQ ID NO : 3 (soulignés ; donne SEQ ID NO : 40) et la forme AG de SEQ ID NO : 3 est dépourvue des 31 premiers acides aminés (SEQ ID NO : 17).
Les inventeurs ont étudié deux types différents de mutations dans v2 et v3. D'abord, ils ont identifié des résidus dans SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3 qui peuvent être modifiés pour accroître la stabilité du polypeptide. Deuxièmement, ils ont identifié des résidus qui réduisent la liaison au facteur H humain (fH) . L'invention concerne des mutants polypeptidiques fHbp portant ces deux types de mutations ayant des propriétés améliorées, pour obtenir ainsi des polypeptides fHbp ayant des propriétés améliorées. Plus spécifiquement, les mutants fHbp qui ne lient pas le facteur H mais qui conservent l'immunogénicité sont avantageux car les réponses en anticorps obtenues sont dirigées contre des épitopes sur ou à proximité du site de fixation du fH. Après vaccination avec des antigènes vaccinaux fHbp de type sauvage, ces épitopes peuvent être occultés par la liaison du facteur H.
Les acides aminés présentant le plus d'intérêt, numérotés selon les séquences pleine longueur (SEQ ID NO : 1 & 3) et également selon les séquences AG (SEQ ID NO : 5 & 17) sont les suivants :
**Quand un seul de ces résidus est muté, la préférence va à la leucine
Mutant fHbp v2
Par conséquent, selon un premier aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante, dans lequel : (a) la séquence d'acides aminés présente une identité de séquence d'au moins k % avec SEQ ID NO : 5, et/ou comprend un fragment de SEQ ID NO : 5 ; mais (b) la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 5 au niveau des résidus L123 et E240 (et éventuellement, au niveau du résidu S32) (acides aminés numérotés par rapport à SEQ ID NO : 5) .
Quand la caractéristique (a) concerne un fragment, le fragment contiendra les deux (ou éventuellement les trois) résidus indiqués en (b) , mais ces résidus différeront en termes de positions par rapport à SEQ ID NO : 5. Une séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante peut présenter une identité de séquence d'au moins k % avec SEQ ID NO : 5, et inclure plusieurs fragments de celle-ci, chacun de ces fragments ayant une longueur d'au moins 7 acides aminés. Ces fragments contiendront typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 5. L'identification et la cartographie des épitopes sont établies pour fHbp [11 ; 28-32].
La valeur de k peut être choisie parmi 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus. Elle est de préférence de 90 (à savoir, la séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante présente une identité d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 5) et plus préférablement de 95.
Le polypeptide peut, après administration à un animal hôte convenable (tel qu'une souris ou un sujet humain), susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4 . Ces anticorps comprendront certains anticorps qui ne reconnaissent pas un polypeptide vl ou v3 (p. ex. qui ne reconnaîtront pas un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 46 et un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 40), bien qu'ils puissent également comprendre certains anticorps ayant des réactions croisées avec des polypeptides vl et/ou v3. Dans l'idéal, les anticorps sont bactéricides envers une souche méningococcique qui exprime un fHbp v2, p. ex. envers la souche M2091 (voir ci-dessous).
Le polypeptide a, dans les mêmes conditions expérimentales, une stabilité supérieure au même polypeptide mais sans les différences de séquence indiquées en (b), p. ex. une stabilité supérieure à un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4. L'amélioration de la stabilité peut être évaluée par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), p. ex. comme décrit dans les références 33 & 34. La DSC a précédemment été utilisée pour évaluer la stabilité du fHbp v2 [24]. Les conditions convenables pour évaluer la stabilité par DSC peuvent comprendre 20 μΜ du polypeptide dans une solution tamponnée (p. ex. Tris 25 mM) à un pH entre 6 et 8 (p. ex. 7-7,5) avec 100-200 mM de NaCl (p. ex. 150 mM).
Dans l'idéal, l'accroissement de la stabilité est d'au moins 5 °C, p. ex. d'au moins 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C ou plus. Ces températures font référence à l'accroissement du point milieu (Tm) de la transition thermique, tel qu'il est évalué par DSC. Le fHbp de type sauvage présente deux pics DSC pendant le déploiement (un correspondant au domaine N-terminal et un correspondant au domaine C-terminal) et, quand un polypeptide selon l'invention contient ces deux domaines, l'accroissement fait référence à la stabilité du domaine N-terminal, qui peut apparaître même en-dessous de 40 °C avec les séquences v2 de type sauvage [24] (alors que les domaines C-terminaux peuvent avoir une Tm de 80 °C ou plus). Par conséquent, la séquence d'acides aminés du fHbp v2 mutant selon l'invention a de préférence un domaine N-terminal ayant une Tm d'au moins 45 °C, p. ex. >50 °C, >55 °C, >60 °C, >65 °C, >70 °C, >75 °C, voire >80 °C.
En plus de cette stabilité accrue, le polypeptide a, dans les mêmes conditions expérimentales, une plus basse affinité pour le fH humain que le même polypeptide mais sans les différences de séquence indiquées en (b) , p. ex. une plus basse affinité qu'un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4. L'altération de l'affinité peut être quantitativement évaluée par résonance plasmonique de surface (SPR), p. ex. comme décrit dans les références 18 et 21-24 avec un fH humain immobilisé. Une réduction de l'affinité (à savoir un accroissement de la constante de dissociation, Kd) d'au moins 10 fois, et dans l'idéal d'au moins 100 fois, est préférée.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide est tronqué par rapport à SEQ ID NO : 5. Comparée à la séquence mature de type sauvage, SEQ ID NO : 5 est déjà tronquée à son extrémité N-terminale jusqu'à, et y compris, la séquence polyglycine (comparer SEQ ID NO : 4 et 5), mais SEQ ID NO : 5 peut être tronquée à son extrémité C-terminale et/ou tronquée davantage encore à son extrémité N-terminale. .
Mutant fHbp v3
Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante, dans lequel : (a) la séquence d'acides aminés présente une identité de séquence d'au moins j % avec SEQ ID NO : 17, et/ou comprend un fragment de SEQ ID NO : 17 ; mais (b) la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 17 au niveau des résidus L126 et E243 (et éventuellement, au niveau du résidu S32) (acides aminés numérotés par rapport à SEQ ID NO : 17).
Quand la caractéristique (a) concerne un fragment, le fragment contiendra les deux (ou éventuellement les trois) résidus indiqués en (b) , mais ces résidus différeront en termes de positions par rapport à SEQ ID NO : 17. Une séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante peut présenter une identité de séquence d'au moins j % avec SEQ ID NO : 17, et inclure plusieurs fragments de celle-ci, chacun de ces fragments ayant une longueur d'au moins 7 acides aminés. Ces fragments contiendront typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 17. L'identification et la cartographie des épitopes sont établies pour fHbp [11 ; 28-32].
La valeur de j peut être choisie parmi 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus. Elle est de préférence de 90 (à savoir, la séquence d'acides aminés ,fHbp v3 mutante présente une identité d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 17) et plus préférablement de 95.
Le polypeptide peut, après administration à un animal hôte convenable (tel qu'une souris ou un sujet humain), susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 40. Ces anticorps comprendront certains anticorps qui ne reconnaissent pas un polypeptide vl ou v2 (p. ex. qui ne reconnaîtront pas un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 46 et un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4), bien qu'ils puissent également comprendre certains anticorps ayant des réactions croisées avec des polypeptides vl et/ou v2. Dans l'idéal, les anticorps sont bactéricides envers une souche méningococcique qui exprime un fHbp v3, p. ex. envers la souche M01-240355 (voir ci-dessous).
Le polypeptide a, dans les mêmes conditions expérimentales, une stabilité supérieure au même polypeptide mais sans les différences de séquence indiquées en (b) , p. ex. une stabilité supérieure à un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 40. L'amélioration de la stabilité peut être évaluée par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), p. ex. comme décrit dans les références 33 & 34. La DSC a précédemment été utilisée pour évaluer la stabilité du fHbp v3 [23] . Les conditions convenables pour évaluer la stabilité par DSC peuvent comprendre 20 μΜ du polypeptide dans une solution tamponnée (p. ex. Tris 25 mM) à un pH entre 6 et 8 (p. ex. 7-7,5) avec 100-200 mM de NaCl (p. ex. 150 mM).
Dans l'idéal, l'accroissement de la stabilité est d'au moins 5 °C, p. ex. d'au moins 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C ou plus. Ces températures font référence à l'accroissement du point milieu (Tm) de la transition thermique, tel qu'il est évalué par DSC. Le fHbp de type sauvage présente deux pics DSC pendant le déploiement (un correspondant au domaine N-terminal et un correspondant au domaine C-terminal) et, quand un polypeptide selon l'invention contient ces deux domaines, l'accroissement fait référence à la stabilité du domaine N-terminal, qui peut apparaître au voisinage de 60 °C ou moins avec les séquences v3 de type sauvage [24] (alors que les domaines C-terminaux peuvent avoir une Tm de 80 °C ou plus). Par conséquent, la séquence d'acides aminés du fHbp v3 mutant selon l'invention a de préférence un domaine N-terminal ayant une Tm d'au moins 65 °C p. ex. >70 °C, >75 °C, voire >80 °C.
En plus de cette stabilité accrue, le polypeptide a, dans les mêmes conditions expérimentales, une plus basse affinité pour le fH humain que le même polypeptide mais sans les différences de séquence indiquées en (b) , p. ex. une plus basse affinité qu'un polypeptide méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 40. L'altération de l'affinité peut être quantitativement évaluée par résonance plasmonique de surface (SPR), p. ex. comme décrit dans les références 18 et 21-24 avec un fH humain immobilisé. Une réduction de l'affinité (à savoir un accroissement de la constante de dissociation, Kd) d'au moins 10 fois, et dans l'idéal d'au moins 100 fois, est préférée.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide est tronqué par rapport à SEQ ID NO : 17. Comparée à la séquence mature de type sauvage, SEQ ID NO : 17 est déjà tronquée à son extrémité N-terminale jusqu'à, et y compris, la séquence polyglycine (comparer SEQ ID NO : 40 et 17), mais SEQ ID NO : 17 peut être tronquée à son extrémité C-terminale et/ou tronquée davantage encore à son extrémité N-terminale.
Mutations relatives Φ SEQ ID NO : 5 • Les polypeptides selon le premier aspect de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins k % avec SEQ ID NO : 5, et/ou comprenant un fragment de SEQ ID NO : 5. Comparée à SEQ ID NO : 5, toutefois, cette séquence d'acides aminés comporte une modification au moins au niveau des résidus acides aminés L123 et E240 (et éventuellement également au niveau du résidu S32). Ces résidus sont numérotés d'après SEQ ID NO : 5 ; pour coïncider avec la séquence de type sauvage naissante (SEQ ID NO : 2), la numérotation devra inclure +26 (à savoir Ser-32 dans SEQ ID NO : 5 est Ser-58 dans SEQ ID NO : 2), et pour coïncider avec la séquence de type sauvage mature (SEQ ID NO : 4), la numérotation devra inclure +7 (ce qui permet également une comparaison facile avec la réf. 25) .
Les trois résidus spécifiés peuvent être délétés, mais de préférence ils sont substitués par un autre acide aminé. Par exemple, Leu-123 peut être substitué par l'un quelconque des 19 autres acides aminés naturels. Quand une substitution est effectuée, l'acide aminé de substitution peut dans certains modes de réalisation être un acide aminé simple tel que glycine ou alanine. Dans d'autres cas, l'acide aminé de substitution est une substitution conservatice, p. ex. elle est effectuée au sein des quatre groupes suivants : (1) acides, à savoir aspartate, glutamate ; (2) basiques, à savoir lysine, arginine, histidine ; (3) non polaires, à savoir alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane ; et (4) polaires non chargés, à savoir glycine, asparagine, glutamine, cystéine, sérine, thréonine, tyrosine. Dans d'autres modes de réalisation, la substitution est non conservative.
Les substitutions préférées au niveau des résidus spécifiés sont les suivantes : S32V ; L123R ; et E240A.
En plus de la ou des mutations indiquées ci-dessus, visant à accroître la stabilité et à altérer la capacité du polypeptide à se lier à fH, un polypeptide peut contenir une ou plusieurs autres mutations, p. ex. pour altérer l'interaction du polypeptide avec des sidérophores. Les résidus qui interagissent avec des sidérophores peuvent être mutés, en suivant les directives dans les références 16 et 35, p. ex. par alignement de la SEQ ID NO : 5 de la présente avec la SEQ ID NO : 4 de la référence 16 pour identifier les résidues susceptibles d'interagir avec des sidérophores, p. ex. avec des catécholates, hydroxamates ou carboxylates.
La référence 24 indique que certaines substitutions dans v2 peuvent accroître son affinité pour fH, et par conséquent celles-ci devront être généralement évitées, p. ex. E85 dans SEQ ID NO : 5 (résidu 157 dans la réf. 24). D'autres résidus peuvent également être mutés à condition que, comparativement à la séquence de type sauvage (p. ex. SEQ ID NO : 4) , le polypeptide ait une stabilité plus élevée, une plus basse affinité pour fH, et quand il est administré à un mammifère convenable, qu'il puisse susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers le méningocoque.
Le polypeptide selon le premier aspect peut comprendre SEQ ID NO : 47. Dans SEQ ID NO : 47, le résidu 32 est un acide aminé quelconque, le résidu 123 n'est pas leucine, et le résidu 240 n'est pas glutamate. Une autre option est SEQ ID NO : 39, où le résidu 32 n'est pas sérine, le résidu 123 n'est pas leucine, et le résidu 240 n'est pas glutamate. Dans un mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 47, le résidu 32 est valine, le résidu 123 est arginine, et le résidu 240 est alanine (à savoir SEQ ID NO : 50) . Dans un autre mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 47, le résidu 32 est sérine, le résidu 123 est arginine, et le résidu 240 est alanine (à savoir SEQ ID NO : 53) .
Le polypeptide selon le premier aspect peut comprendre SEQ ID NO : 31. Dans SEQ ID NO : 31, le résidu 32 est un acide aminé quelconque, et le résidu 123 n'est pas leucine. Une autre option est SEQ ID NO : 37, où le résidu 32 n'est pas sérine, et le résidu 123 n'est pas leucine. Dans un mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 31, le résidu 32 est
valine, et le résidu 123 est arginine (à savoir SEQ ID NO : 45) . Dans un autre mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 31, le résidu 32 est sérine, et le résidu 123 est arginine (a savoir SEQ ID NO : 54) .
Les résidus acides aminés susceptibles de mutation dans une séquence v2 sont numérotés par rapport à SEQ ID NO : 5 qui provient d'une souche 2996. Les résidus acides aminés correspondants dans un fHbp v2 provenant de toute autre souche peuvent être facilement identifiés par alignement des séquences, étant p. ex. l'acide aminé qui, quand il est aligné avec SEQ ID NO : 5 à l'aide d'un algorithme d'alignement par paire (p. ex. l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch, décrit ci-dessous), s'aligne avec l'acide aminé mentionné dans la présente. Souvent l'acide aminé sera identique à celui présent dans SEQ ID NO : 5 (p. ex. le résidu 32 sera sérine), mais l'alignement l'identifiera facilement si ce n'est pas le cas.
Mutations relatives t SEQ ID NO : 17
Les polypeptides selon le deuxième aspect de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins j % avec SEQ ID NO : 17, et/ou comprenant un fragment de SEQ ID NO : 17. Comparée à SEQ ID NO : 17, toutefois, cette séquence d'acides aminés comporte une modification au moins au niveau des résidus acides aminés L126 et E243 (et éventuellement également au niveau du résidu S32). Ces résidus sont numérotés d'après SEQ ID NO : 17 ; pour coïncider avec la séquence de type sauvage naissante (SEQ ID NO : 3), la numérotation devra inclure +31 (à savoir Ser-32 dans SEQ ID NO : 17 est Ser-63 dans SEQ ID NO : 3) , et pour coïncider avec la séquence de type sauvage mature (SEQ ID NO : 40), la numérotation devra inclure +12.
Les deux (ou trois) résidus spécifiés peuvent être délétés, mais de préférence ils sont substitués par un autre acide aminé. Par exemple, Leu-126 peut être substitué par l'un quelconque des 19 autres acides aminés naturels. Quand une substitution est effectuée, l'acide aminé de substitution peut dans certains modes de réalisation être un acide aminé simple tel que glycine ou alanine. Dans d'autres cas, l'acide aminé de substitution est une substitution conservatice, p. ex. elle est effectuée au sein des quatre groupes suivants : (1) acides, à savoir aspartate, glutamate ; (2) basiques, à savoir lysine, arginine, histidine ; (3) non polaires, à savoir alanine, valine, leucine, . isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane ; et (4) polaires non chargés, à savoir glycine, asparagine, glutamine, cystéine, sérine, thréonine, tyrosine. Dans d'autres modes de réalisation, la substitution est non conservative.
Les substitutions préférées au niveau des résidus spécifiés sont les suivantes : S32V ; L126R ; et E243A.
En plus de la ou des mutations indiquées ci-dessus, visant à accroître la stabilité et à altérer la capacité du polypeptide à se lier à fH, un polypeptide peut contenir une ou plusieurs autres mutations, p. ex. pour altérer l'interaction du polypeptide avec des sidérophores. Les résidus qui interagissent avec des sidérophores peuvent être mutés, en suivant les directives dans les références 16 et 35, p. ex. par alignement de la SEQ ID NO : 17 de la présente avec la SEQ ID NO : 4 de la référence 16 pour identifier les résidues susceptibles d'interagir avec des sidérophores, p. ex. avec des catécholates, hydroxamates ou carboxylates.
La référence 24 indique que certaines substitutions dans v3 peuvent accroître son affinité pour fH, et par conséquent celles-ci devront être généralement évitées, p. ex. P44 dans SEQ ID NO : 17 (résidu 106 dans la réf. 24). D'autres résidus peuvent également être mutés à condition que, comparativement à la séquence de type sauvage (p. ex. SEQ ID NO : 40), le polypeptide ait une stabilité plus élevée, une plus basse affinité pour fH, et quand il est administré à un mammifère convenable, il puisse susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers le méningocoque.
Le polypeptide selon le deuxième aspect peut comprendre SEQ ID NO : 48. Dans SEQ ID NO : 48, le résidu 32 est un acide aminé quelconque, le résidu 126 n'est pas leucine, et le résidu 243 n'est pas glutamate. Une autre option est SEQ ID NO : 57, où le résidu 32 n'est pas sérine, le résidu 126 n'est pas leucine, et le résidu 243 n'est pas glutamate. Dans un mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 48, le résidu 32 est valine, le résidu 126 est arginine, et le résidu 243 est alanine (à savoir SEQ ID NO : 51) . Dans un autre mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 48, le résidu 32 est sérine, le résidu 126 est arginine, et le résidu 243 est alanine (à savoir SEQ ID NO : 55).
Le polypeptide selon le deuxième aspect peut comprendre SEQ ID NO : 32. Dans SEQ ID NO : 32, le résidu 32 est un acide aminé quelconque, et le résidu 126 n'est pas leucine. Une autre option est SEQ ID NO : 38, où le résidu 32 n'est pas sérine, et le résidu 126 n'est pas leucine. Dans un mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 32, le résidu 32 est valine, et le résidu 126 est arginine (à savoir SEQ ID NO : 44) . Dans un autre mode de réalisation préféré de SEQ ID NO : 32, le résidu 32 est sérine, et le résidu 126 est arginine (à savoir SEQ ID NO : 56).
Les résidus acides aminés susceptibles de mutation dans une séquence v3 sont numérotés par rapport à SEQ ID NO : 17 qui provient d'une souche M1239. Les résidus acides aminés correspondants dans un fHbp v3 provenant de toute autre souche peuvent être facilement identifiés par alignement des séquences, étant p. ex. l'acide aminé qui, quand il est aligné avec SEQ ID NO : 17 à l'aide d'un algorithme d'alignement par paire (p. ex. l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch, décrit ci-dessous), s'aligne avec l'acide aminé mentionné dans la présente. Souvent l'acide aminé sera identique à celui présent dans SEQ ID NO : 17 (p. ex. le résidu 32 sera sérine), mais l'alignement l'identifiera facilement si ce n'est pas le cas. SÈquences mutantes selon l'invention
Comme mentionné ci-dessus, le polypeptide selon le premier aspect de l'invention peut comprendre SEQ ID NO : 47 ou SEQ ID NO : 37, et le polypeptide selon le deuxième aspect de l'invention peut comprendre SEQ ID NO : 48 ou SEQ ID NO : 57.
Selon un troisième aspect de l'invention, qui recoupe le premier aspect, 1'.invention concerne un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins v % avec SEQ ID NO : 47, à condition que (i) le résidu 32 soit un acide aminé quelconque, mais dans certains modes de réalisation ne soit pas sérine, (i i ) le résidu 123 ne soit pas leucine, (iii) le résidu 240 ne soit pas glutamate, et à condition que (iv) comparativement à séquence de type sauvage, e.g. SEQ ID NO : 4, le polypeptide ait une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour fH et que (v) quand il est administré à un mammifère convenable, il puisse susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v2. La numérotation des résidus de (i) à (iii) est d'après SEQ ID NO : 47.
La valeur de v peut être choisie parmi 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus. Elle est de préférence de 90 (à savoir, la séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante présente une identité d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 47) et plus préférablement de 95.
Selon un quatrième aspect de l'invention, qui recoupe le deuxième aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins w % avec SEQ ID NO : 48, à condition que (i) le résidu 32 soit un acide aminé quelconque, mais dans certains modes de réalisation ne soit pas sérine, (ii) le résidu 126 ne soit pas leucine, (iii) le résidu 243 ne soit pas glutamate, et à condition que (iv) comparativement à séquence de type sauvage, e.g. SEQ ID NO : 40, le polypeptide ait une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour fH et que (v) quand il est administré à un mammifère convenable, il puisse susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v3. La numérotation des résidus de (i) à (iii) est faite d'après SEQ ID NO : 48.
La valeur de w peut être choisie parmi 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus. Elle est de préférence de 90 (à savoir, la séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante présente une identité d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 48) et plus préférablement de 95.
Selon un cinquième aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 47, modifiée à hateur de 5 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés individuelles), à condition que (i) le résidu 32 soit un acide aminé quelconque, mais dans certains modes de réalisation ne soit pas sérine, (ii) le résidu 123 ne soit pas leucine, (iii) le résidu 240 ne soit pas glutamate, et à condition que (iv) comparativement à séquence de type sauvage, e.g. SEQ ID NO : 4, le polypeptide ait une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour fH et que (v) quand il est administré à un mammifère convenable, il puisse susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v2.
Selon un sixième aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 48, modifiée à hauteur de 5 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés individuelles), à condition que (i) le résidu 32 soit un acide aminé quelconque, mais dans certains modes de réalisation ne soit pas sérine, (ii) le résidu 126 ne soit pas leucine, (iii) le résidu 243 ne soit pas glutamate, et à condition que (iv) comparativement à séquence de type sauvage, e.g. SEQ ID NO : 40, le polypeptide ait une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour fH et que (v) quand il est administré à un mammifère convenable, il puisse susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v3. La numérotation des résidus de (i) à (iii) est faite d'après SEQ ID NO : 48.
Ces divers polypeptides v2 et v3 peuvent être combinés pour former des polypeptides de fusion, permettant ainsi d'obtenir des réponses immunitaires contre les deux variants avec un seul polypeptide. Par conséquent, un septième aspect selon l'invention concerne un polypeptide comprenant une fusion constituée par : (i) un polypeptide selon les premier, troisième, ou cinquième aspects de l'invention ; et (ii) un polypeptide selon les deuxième, quatrième, ou sixième aspects de l'invention. De manière avantageuse, ces polypeptides peuvent, quand ils sont administrés à un mammifère convenable, susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers à la fois un méningocoque qui exprime un fHbp v2 et un méningocoque qui exprime un fHbp v3.
Par conséquent, selon le septième aspect, le polypeptide de fusion comprend : (I) une première séquence d'acides aminés choisie parmi : □ une séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante, dans laquelle : (a) la séquence d'acides aminés présente une identité de séquence d'au moins k % avec SEQ ID NO : 5, et/ou comprend un fragment de SEQ ID NO : 5 ; mais (b) la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 5 au niveau des résidus L123 et E240 (et, éventuellement, également au niveau du résidu S32) ; □ une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins v % avec SEQ ID NO : 47, à condition que (i) le résidu 32 soit un acide aminé quelconque, mais dans certains modes de réalisation ne soit pas sérine, (ii) le résidu 123 ne soit pas leucine, (iii) le résidu 240 ne soit pas glutamate ; ou
□ la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 47 ou SEQ ID NO : 50, éventuellement modifiée à hauteur de 5 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés individuelles), à condition que (i) le résidu 32 soit un acide aminé quelconque, mais dans certains modes de réalisation ne soit pas sérine, (ii) le résidu 123 ne soit pas leucine, (iii) le résidu 240 ne soit pas glutamate ; et (II) une seconde séquence d'acides aminés choisie parmi : □ une séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante, dans ' laquelle : (a) la séquence d'acides aminés présente une identité de séquence d'au moins j % avec SEQ ID NO : 17, et/ou comprend un fragment de SEQ ID NO : 17 ; mais (b) la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 17 au niveau des résidus L126 et E243 (et, dans certains modes de réalisation, également au niveau du résidu S32) ; □ une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins w % avec SEQ ID NO : 48, à condition que (i) le résidu 32 soit un acide aminé quelconque, mais dans certains modes de réalisation ne soit pas sérine, (ii) le résidu 126 ne soit pas leucine, (iii) le résidu 243 ne soit pas glutamate ; ou
□ la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 48 ou SEQ ID NO : 51, éventuellement modifiée à hauteur de 5 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés individuelles), à condition que (i) le résidu 32 soit un acide aminé quelconque, mais dans certains modes de réalisation ne soit pas sérine, (ii) le résidu 126 ne soit pas leucine, (iii) le résidu 243 ne soit pas glutamate, dans lequel les polypeptides de fusion (a) peuvent, quand ils sont administrés à un mammifère convenable, susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers à la fois un méningocoque qui exprime un fHbp v2 et un méningocoque qui exprime un fHbp v3 ; (b) ont une stabilité supérieure et une plus basse affinité pour fH qu'un fHbp méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 4 ; (c) ont une stabilité supérieure et une plus basse affinité pour fH qu'un fHbp méningococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 40.
Dans l'idéal, l'accroissement de la stabilité est d'au moins 5 °C, p. ex. d'au moins 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C ou plus, comme décrit ci-dessus. L'affinité plus basse est d'au moins 10 fois, et dans l'idéal d'au moins 100 fois, comme décrit ci-dessus.
Dans un mode de réalisation selon le septième aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant une première séquence d'acides aminés et une seconde séquence d'acides aminés, dans lequel la première séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 47 ou SEQ ID NO : 39 et la seconde séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 48 ou SEQ ID NO : 57.
Les première et seconde séquences d'acides aminés peuvent être dans l'un ou l'autre ordre dans le sens N-terminal à C-terminal, mais il est préférable que la première séquence soit en amont de la seconde.
Les première et seconde séquences d'acides aminés peuvent être jointes par une séquence lieur («linker») . Cette ou ces séquences lieurs («linker») seront typiquement courtes (p. ex. 20 acides aminés ou moins, à savoir 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Les exemples comprennent les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage, les lieurs («linker») poly-glycine (à savoir Glyn où n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 58)), et les étiquettes histidine (à savoir Hisn où n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 59)). D'autres séquences d'acides aminés lieurs («linker») convenables s'imposeront à l'homme du métier. Un lieur («linker») utile est GSGGGG (SEQ ID NO : 20), le dipeptide Gly-Ser étant formé à partir d'un site de restriction BamRI, facilitant ainsi le clonage et la manipulation. Un autre lieur («linker») utile est SEQ ID NO : 21, qui peut éventuellement être précédé par un dipeptide Gly-Ser (SEQ ID NO : 22, provenant de BamRI) ou par un dipeptide Gly-Lys (SEQ ID NO : 23, provenant de HindlII) .
Le polypeptide de fusion peut également inclure une séquence fHbp vl, permettant ainsi d'obtenir des réponses immunitaires contre les trois variants fHbp avec un seul polypeptide, à savoir le polypeptide peut, quand il est administré à un mammifère convenable, susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp vl, un méningocoque qui exprime un fHbp v2, et un méningocoque qui exprime un fHbp v3. Par conséquent, un polypeptide selon le septième aspect peut également inclure une séquence d'acides aminés (i) présentant une identité de séquence d'au moins i % avec SEQ ID NO : 16, et/ou (ii) comprenant un fragment de SEQ ID NO : 16. La valeur de i peut être choisie parmi 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus. Elle est de préférence de 90 (à savoir, la séquence d'acides aminés présente une identité d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 16) et plus préférablement de 95. Le fragment mentionné en (ii) comportera généralement au moins 7 acides aminés, p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 acides aminés contigus ou plus provenant de SEQ ID NO : 16. Le fragment contiendra typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 16. Le partage d'au moins 30 acides aminés contigus avec SEQ ID NO : 16 sera typique, et généralement une séquence d'acides aminés de fHbp vl contiendra plusieurs (p. ex. 2, 3, 4, 5 ou plus) fragments provenant de SEQ ID NO : 16. Dans l'ensemble, une séquence d'acides aminés de fHbp vl utilisé selon le septième aspect peut présenter une identité de séquence d'au moins i % et contenir plusieurs fragments provenant de SEQ ID NO : 16.
De manière avantageuse, la séquence fHbp vl contient une mutation qui lui confère une plus basse affinité (comme décrit ci-dessus) pour le fH humain que le même polypeptide mais sans les différences de séquence mentionnées en (b) , p. ex. une plus basse affinité qu'un polypeptide méninogococcique de type sauvage constitué par SEQ ID NO : 46. Par exemple, le résidu acide aminé Arg-34 dans SEQ ID NO : 16 (résidu Arg-60 dans SEQ ID NO : 1, et Arg-41 dans SEQ ID NO : 46) peut être muté en Ser pour altérer l'interaction fHbp/fH [19,21]. Par conséquent, une séquence fHbp vl préférée utilisable dans le cadre de l'invention comprend SEQ ID NO : 49, dans laquelle le résidu 34 n'est pas arginine (p. ex. SEQ ID NO : 52, où le résidu 34 est sérine).
Quand un polypeptide contient chacune des séquences vl, v2 et v3, celles-ci peuvent être présentes dans un ordre quelconque de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale, à savoir vl-v2-v3, vl-v3-v2, v2-vl-v3, v2-v3-vl, v3-vl-v2, ou v3-v2-vl. L'ordre préféré entre tous est v2-v3-vl.
En général, un polypeptide de fusion fHbp préféré selon l'invention a une séquence d'acides aminés de formule :
dans laquelle chaque X est une séquence de variant fHbp différente telle que définie dans la présente, L est une séquence d'acides aminés lieur («linker») facultative, A est une séquence d'acides aminés N-terminale facultative, et B est une séquence d'acides aminés C-terminale facultative.
Les trois fragments X sont une séquence vl, v2, et v3 telle que décrite dans la présente, de sorte que le polypeptide peut, quand il est administré à un mammifère convenable, susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp vl, un méningocoque qui exprime un fHbp v2, et un méningocoque qui exprime un fHbp v3. Comme mentionné ci-dessus, les trois variants sont de préférence dans l'ordre v2-v3-vl dans le sens N-terminal à C-terminal. A chaque occurrence de [-X-L-], une séquence d'acides aminés lieur («linker») -L- peut être présente ou absente. Des séquences lieurs («linker») convenables sont décrites ci- dessus. . -A- est une séquence d'acides aminés N-terminale facultative. Elle sera généralement courte (p. ex. 40 acides aminés ou moins, à savoir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . A titre d'exemples, il y a les séquences de tête («leader») qui dirigent le transport des protéines. Si Xi est dépourvu de sa propre méthionine N-terminale, -A- peut fournir ledit résidu méthionine dans le polypeptide traduit (p. ex. -A- est un
résidu Met seul). Le résidu Met peut être à l'extrémité N-terminale d'une séquence lieur («linker») telle que SEQ ID NO : 21 (à savoir SEQ ID NO : 24), ou à l'extrémité N-terminale d'une séquence courte (p. ex. SEQ ID NO : 25). -B- est une séquence d'acides aminés C-terminale facultative. Elle sera généralement courte (p. ex. 40 acides aminés ou moins,, à savoir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . A titre d'exemples, il y a les séquences qui dirigent le transport des protéines, les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage ou la purification (p. ex. comprenant les étiquettes histidine, à savoir His^ où n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 59) ) , ou les séquences qui améliorent la stabilité du polypeptide. D'autres séquences d'acides aminés C-terminales convenables s'imposeront à l'homme du métier. Un fragment -B- convenable est SEQ ID NO : 26, dans lequel Leu-Glu en amont de l'étiquette histidine provient d'un site de restriction XhoI.
Par conséquent, dans un mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 28. De l'extrémité N-terminale à C-terminale, cette séquence est constituée par les séquences d'acides aminés SEQ ID suivantes :
En ajoutant SEQ ID NO : 24 à titre de fragment -A- N-terminal, l'invention concerne également un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 27.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 30. De l'extrémité N-terminale à C-terminale, cette séquence est constituée par les séquences d'acides aminés SEQ ID suivantes :
En ajoutant SEQ ID NO : 24 à titre de fragment -A- N-terminal, l'invention concerne également un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 29.
Polypeptides
Les polypeptides selon l'invention peuvent être préparés par divers moyens, p. ex. par synthèse chimique (au moins en partie), digestion de polypeptides plus longs à l'aide de protéases, traduction à partir d'ARN, purification à partir d'une culture cellulaire (p. ex. à partir d'une expression recombinée ou d'une culture de N. meningitidis), etc. L'expression hétérologue chez un hôte E. coli est une voie d'expression préférée.
Dans l'idéal, les polypeptides selon l'invention ont une longueur d'au moins 100 acides aminés, p. ex. 150aa, 175aa, 200aa, 225aa, ou plus. Ils contiennent une séquence d'acides aminés de fHbp v2 et/ou v3 mutantes, et les séquences d'acides aminés de fHbp v2 ou v3 mutantes auront généralement une longueur similaire d'au moins 100 acides aminés, p. ex. 150aa, 175aa, 200aa, 225aa, ou plus. fHbp est naturellement une lipoprotéine chez N. meningitidis. Elle s'est également avérée être lipidée quand elle est exprimée chez E. coli avec sa séquence de tête («leader») native ou des séquences de tête («leader») hétérologues. Les polypeptides selon l'invention peuvent avoir un résidu cystéine N-terminal, qui peut être lipidé p. ex. comprendre un groupe palmitoyle, formant généralement une tripalmitoyl-S-glycéryl-cystéine. Dans d'autres modes de réalisation, les polypeptides ne sont pas lipidés.
Les polypeptides sont de préférence préparés sous une forme sensiblement pure ou sensiblement isolée (à savoir sensiblement exempte de tout autre polypeptide neisserien ou polypeptide issu de la cellule hôte) . En général, les polypeptides sont fournis dans un environnement non naturel, p. ex. ils sont séparés de leur environnement naturel. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide est présent dans une composition qui est enrichie pour le polypeptide comparativement au matériau de départ. Par conséquent, un polypeptide purifié est fourni, "purifié" signifiant que le polypeptide est présent dans une composition qui est sensiblement exempte d'autres polypeptides exprimés, "sensiblement exempte" signifiant que plus dé 50 % (p. ex. >75 %, >80 %, >90 %, >95 %, ou >99 %) du polypeptide total dans la composition est un polypeptide selon l'invention.
Les polypeptides peuvent prendre diverses formes (p. ex. natives, fusions, glycosylées, non glycosylées, lipidées, ponts disulfure, etc.).
Les SEQ ID NO : 4, 5, 17 et 40 ne contiennent pas de méthionine N-terminale. Si un polypeptide selon l'invention est obtenu par traduction chez un hôte biologique, alors un codon de départ est requis, qui fournira une méthionine N-terminale chez la plupart des hôtes. Par conséquent, un polypeptide selon l'invention comprendra, au moins à un stade naissant, un résidu méthionine en amont de ladite séquence SEQ ID No.
Le clivage des séquences naissantes signifie que la séquence d'acides aminés fHbp v2 ou v3 mutante peut elle-même constituer l'extrémité N-terminale du polypeptide. Dans d'autres modes de réalisation, toutefois, un polypeptide selon l'invention peut comprendre une séquence N-terminale en amont de la séquence d'acides aminés fHbp v2 ou v3 mutante. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide comporte une méthionine unique à l'extrémité N-terminale immédiatement suivie de la séquence d'acides aminés fHbp v2 ou v3 mutante ,' dans d'autres modes de réalisation, une séquence amont plus longue peut être utilisée. Cette séquence amont peut être courte (p. ex. 40 acides aminés ou moins, à savoir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . A titre d'exemples, il y a les séquences de tête («leader») qui dirigent le transport des protéines, ou les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage ou la purification (p. ex. une étiquette histidine, à savoir Hisn où n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 60)). D'autres séquences d'acides aminés N-terminales convenables s'imposeront à l'homme du métier, p. ex. les séquences amont natives présentes dans SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3.
Un polypeptide selon l'invention peut également comprendre des acides aminés en aval de l'acide aminé final de de la séquence d'acides aminés fHbp v2 ou v3 mutante. Ces extensions C-terminales peuvent être courtes (p. ex. 40 acides aminés ou moins, à savoir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). A titre d'exemples, il y a les séquences qui dirigent le transport des protéines, les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage ou la purification (comprenant p. ex. une étiquette histidine, à savoir Hisn où n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID NO : 60)) ou les séquences qui améliorent la stabilité du polypeptide. D'autres séquences d'acides aminés C-terminales convenables s'imposeront à l'homme du métier.
Le terme "polypeptide" désigne des polymères de type acides aminés de longueur quelconque. Le polymère peut être linéaire ou ramifié, il peut comprendre des acides aminés modifiés, et il peut être interrompu par des acides non aminés. Le terme englobe également un polymère de type acides aminés qui a été modifié naturellement ou suite à une intervention : par exemple, formation de liaisons disulfure, glycosylation, lipidation, acétylation, phosphorylation, ou toute autre manipulation ou modification, telle que conjugaison avec un composant de marquage. Sont également inclus dans la définition les polypeptides contenant, par exemple un ou plusieurs analogues d'un acide aminé (y compris, par exemple, les acides aminés non naturels, etc.), ainsi que d'autres modifications connues dans la technique. Les polypeptides peuvent se présenter sous forme de chaînes simples ou de chaînes associées.
Les polypeptides selon l'invention peuvent être fixés ou immobilisés sur un support support.
Les polypeptides selon l'invention peuvent comprendre un marqueur détectable, p. ex. un marqueur radioactif, un marqueur fluorescent, ou un marqueur biotine, qui sont particulièrement utiles dans les techniques d'immunodosage.
Comme décrit dans la référence 162, fHbp peut être divisé en trois domaines, désignés A, B et C. En prenant SEQ ID NO : 1, les trois domaines sont (A) 1-119, (B) 120-183 et (C) 184-274 :
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQS
VRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQ
VYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGT
AFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVL
YNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
La forme mature du domaine "A", depuis Cys-20 à son extrémité N-terminale jusqu'à Lys-119, est appelée "Araature".
De multiples séquences fHbp sont connues et peuvent être facilement alignées à l'aide de méthodes standards. Grâce à ces alignements, l'homme du métier peut identifier (a) les domaines "A" (et 'Amature' ) , "B" et "C" dans toute séquence fHbp donnée par comparaison avec les coordonnées dans la séquence MC58, et (b) les résidus individuels dans de multiples séquences fHbp, p. ex. pour identifier des substitutions. Pour faciliter la référence, toutefois, les domaines sont définis ci-dessous : - Le domaine "A" dans une séquence fHbp donnée est le fragment
de cette séquence qui, quand il est aligné avec SEQ ID NO : 1 à l'aide d'un algorithme d'alignement par paire, commence par l'acide aminé aligné sur Met-1 de SEQ ID NO : 1 et finit par l'acide aminé aligné sur Lys-119 de SEQ ID NO : 1.
- Le domaine "Amature" dans une séquence fHbp donnée est le fragment de cette séquence qui, quand il est aligné avec SEQ ID NO : 1 à l'aide d'un algorithme d'alignement par paire, commence par l'acide aminé aligné sur Cys-20 de SEQ ID NO : 1 et finit par l'acide aminé aligné sur Lys-119 de SEQ ID NO : 1. - Le domaine "B" dans une séquence fHbp donnée est le fragment
de cette séquence qui, quand il est aligné avec SEQ ID NO : 1 à l'aide d'un algorithme d'alignement par paire,
commence par l'acide aminé aligné sur Gln-120 de SEQ ID NO : 1 et finit par l'acide aminé aligné sur Gly-183 de SEQ ID NO : 1. - Le domaine "C" dans une séquence fHbp donnée est le fragment
de cette séquence qui, quand il est aligné avec SEQ ID NO : 1 à l'aide d'un algorithme d'alignement par paire,
commence par l'acide aminé aligné sur Lys-184 de SEQ ID NO : 1 et finit par l'acide aminé aligné sur Gln-274 de SEQ ID NO : 1. L'algorithme d'alignement par paire préféré pour définir les domaines est l'algorithme d'alignement global de
Needleman-Wunsch [156], en utilisant les paramètres par défaut (p. ex. avec une pénalité d'ouverture de gap = 10.0, et une pénalité d'extension de gap = 0.5, en utilisant la matrice de notation EBLOSUM62). Cet algorithme est facile à mettre en œuvre dans l'outil "needle" du logiciel EMBOSS [157].
Dans certains modes de réalisation, une séquence d'acides aminés fHbp v2 ou v3 mutante selon l'invention est tronquée pour éliminer son domaine A. En général, il est toutefois préférable que la séquence d'acides aminés fHbp v2 ou v3 mutante contienne à la fois un ß-tonneau N-terminal et un ß-tonneau C-terminal.
Dans certains modes de réalisation, un polypeptide comprend une séquence d'acides aminés telle que décrite ci-dessus, à ceci près que jusqu'à 10 acides aminés (à savoir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) à l'extrémité N-terminale et/ou jusqu'à 10 acides aminés (à savoir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) à l'extrémité C-terminale sont délétés.
Acides nuclÈiques L'invention concerne des acides nucléiques codant pour un polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés de nombreuses façons, p. ex. par synthèse chimique (p. ex. synthèse d'ADN par la méthode phosphoramidite) en tout ou partie, par digestion d'acides nucléiques plus longs à l'aide de nucléases (p. ex. enzymes de restriction), par assemblage d'acides nucléiques ou de nucléotides plus courts (p. ex. à l'aide de ligases ou de polymérases) , à partir de banques d'ADN génomique ou d'ADNc, etc.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent prendre diverses formes, p. ex. simple brin, double brin, vecteurs, amorces, sondes, marquées, non marquées, etc.
Les acides nucléiques selon l'invention sont de préférence sous une forme isolée ou sensiblement isolée.
Le terme "acide nucléique" comprend l'ADN et l'ARN, et également leurs analogues, tels que ceux contenant des squelettes modifiés, et également des acides nucléiques peptidiques (PNA), etc. L'acide nucléique selon l'invention peut être marqué, p. ex. avec un marqueur radioactif ou fluorescent. L'invention concerne également des vecteurs (tels que des plasmides) comprenant des séquences de nucléotides selon l'invention (p. ex. vecteurs de clonage ou d'expression, tels que ceux pouvant être utilisés pour une immunisation par acide nucléique) et des cellules hôtes transformées par ces vecteurs. RÈponses bactÈricides
Les polypeptides préférés selon l'invention peuvent susciter des réponses en anticorps qui sont bactéricides envers les méningocoques. Les réponses en anticorps bactéricides sont commodément mesurées chez la souris et sont un indicateur standard de l'efficacité du vaccin (voir p. ex. note de bas de page 14 de la réf. 36 ; également la réf. 37). Par conséquent, les anticorps seront bactéricides envers une souche d'essai dans un dosage de l'activité bactéricide sérique convenable (SBA).
Les polypeptides selon le premier aspect de l'invention peuvent de préférence susciter une réponse en anticorps, p. ex. chez la souris, qui est bactéricide envers une souche de N. meningitidis qui exprime une séquence fHbp v2, p. ex. une ou plusieurs des souches 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013), e32, ml090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, cil, m986, m2671, 1000, ml096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, et/ou L93/4286. Les réponses bactéricides peuvent par exemple être évaluées contre la souche M2091 var2 (ATCC 13091).
Les polypeptides préférés selon le premier aspect de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps chez la souris qui sont bactéricides envers la souche M2091 dans un dosage bactéricide sérique.
Les polypeptides selon le deuxième aspect de l'invention peuvent de préférence susciter une réponse en anticorps, p. ex. chez la souris, qui est bactéricide envers une souche de N. meningitidis qui exprime une séquence fHbp v3, p. ex. une ou plusieurs des souches M1239, 16889, gb355 (=M01-240355), m3369, m3813, ngpl65. Les réponses bactéricides peuvent par exemple être évaluées contre la souche M01-240355 var3, qui est une souche de référence MLST de Neisseria (id 19265 dans la réf. 38) qui a été entièrement séquencée (voir EMBL ID CP002422 [39]).
Les polypeptides préférés selon le deuxième aspect de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps chez la souris qui sont bactéricides envers la souche M01-240355 dans un dosage bactéricide sérique.
Par exemple, une composition immunogène comprenant ces polypeptides peut fournir un titre bactéricide sérique ^1:4 par le dosage de Goldschneider avec comme source de complément du sérum humain [40-42], et/ou fournir un titre bactéricide sérique ^1:128 avec comme source de complément du sérum de bébé lapin.
Immunisation
Les polypeptides selon l'invention peuvent être utilisés à titre de principe (s) actif(s) dans des compositions immunogènes, et par conséquent l'invention concerne une composition immunogène (p. ex. un vaccin) comprenant un polypeptide selon l'invention. L'invention concerne également une méthode destinée à susciter une réponse en anticorps chez un mammifère, p. ex. une souris ou un sujet humain, comprenant l'administration d'une composition immunogène selon l'invention audit mammifère. De préférence, la réponse en anticorps est une réponse en anticorps protecteurs et/ou bactéricides. L'invention concerne également des polypeptides selon l'invention pouvant être utilisés dans ces méthodes. L'invention concerne également une méthode destinée à protéger un mammifère, p. ex. une souris ou un sujet humain, contre une infection à Neisseria (p. ex. méningococcique) comprenant l'administration audit mammifère d'une composition immunogène selon l'invention. L'invention concerne des polypeptides selon l'invention utilisables à titre de médicaments (p. ex. sous forme de compositions immunogènes ou de vaccins) ou à titre de réactifs diagnostiques. Elle concerne également l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un polypeptide selon l'invention dans la fabrication d'un médicament destiné à prévenir l'infection à Neisseria (p. ex. méningococcique) chez un mammifère, p. ex. une souris ou un sujet humain.
Le mammifère est de préférence un sujet humain. Le sujet humain peut être un adulte ou, de préférence, un enfant. Quand le vaccin est à usage prophylactique, le sujet humain est de préférence un enfant (p. ex. un tout petit ou un nourrisson) ; quand le vaccin est à usage thérapeutique, le sujet humain est de préférence un adulte. Un vaccin destiné à des enfants peut également être administré à des adultes, p. ex. pour évaluer son innocuité, son dosage, son immunogénicité, etc.
Les utilisations et les méthodes sont particulièrement utiles pour prévenir/traiter des maladies comprenant, entre autres, la méningite (en particulier la méningite bactérienne, telle que la méningite à méningocoques) et la bactériémie. Par exemple, elles se prêtent à une immunisation active des individus contre une maladie à méningocoques invasive provoquée par N. meningitidis (par exemple de sérogroupe B). L'efficacité du traitement thérapeutique peut être testée en surveillant l'infection à Neisseria après administration de la composition selon l'invention. L'efficacité du traitement propylactique peut être testée en surveillant les réponses immunitaires dirigées contre fHbp, après administration de la composition. L'immunogénicité des compositions selon l'invention peut être déterminée par administration desdites compositions à des sujets d'essai (p. ex. enfants de 12 à 16 mois, ou modèles animaux), puis détermination des paramètres standards comprenant les anticorps bactéricides sériques (SBA) et les titres ELISA (GMT). De manière générale, ces réponses immunitaires seront déterminées environ 4 semaines après l'administration de la composition, et comparées aux valeurs déterminées avant administration de la composition. Un accroissement SBA d'au moins 4 à 8 fois des SBA est préféré. Quand plus d'une dose de la composition est administrée, plus d'une détermination post-administration peut être pratiquée.
Les compositions préférées selon l'invention peuvent conférer un titre d'anticorps à un patient humain qui est supérieur au critère de séroprotection de chaque composant antigénique chez un pourcentage acceptable de sujets humains. Les antigènes associés à un titre d'anticorps au-dessus duquel un hôte est considéré comme séroconverti contre l'antigène sont bien connus, et ces titres sont publiés par des organisations telles que l'OMS. De préférence, plus de 80 % d'un échantillon statistiquement significatif de sujets est séroconverti, plus préférablement plus de 90 %, mieux encore plus de 93 % et de manière préférée entre toutes de 96 à 100 %. L'invention peut être utilisée pour conférer une immunité systémique et/ou muqueuse.
De manière générale, les compositions selon l'invention seront administrées directement à un patient humain. L'administration directe peut être effectuée par injection parentérale (p. ex. sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par voie rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou autre administration par voie muqueuse. L'administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras est préférée. L'injection peut se faire par l'intermédiaire d'une aiguille (p. ex. une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut être pratiquée en variante. Une dose intramusculaire typique est d'environ 0,5 ml (p. ex. comme observé dans le BEXSERO™).
La posologie peut être un schéma unidose ou multidose. Les multidoses peuvent être utilisées dans un schéma de primovaccination et/ou un schéma de doses de rappel. Un schéma de primovaccination peut être suivi d'un schéma de doses de rappel. L'intervalle de temps convenable entre les doses de primovaccination (p. ex. entre 4 et 16 semaines) , et entre la primovaccination et le (s) rappel (s) peut être déterminé à chaque fois. Par exemple, le BEXSERO™ est administré en deux ou trois doses à des intervalles d'au moins 1 mois ou d'au moins 2 mois, en fonction du sujet (p. ex. nourrissons ou autres).
La composition immunogène selon l'invention contiendra généralement un véhicule pharmaceutiquement acceptable, qui peut être toute substance qui n'induit pas elle-même la production d'anticorps nocifs pour le patient recevant la composition, et qui peut être administrée sans toxicité indue. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent comprendre les liquides tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol et l'éthanol. Des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou émulsifiants, des substances de tamponnage de pH, et autres, peuvent également être présentes dans ces véhicules. Une discussion approfondie concernant les véhicules convenables figure dans la réf. 43. Par exemple, le BEXSERO™ contient du chlorure de sodium, de l'histidine, du saccharose, de 1'hydroxyde d'aluminium, et de l'eau pour préparations inj ectables.
Les infections à Neisseria affectent diverses parties du corps, de sorte que les compositions selon l'invention peuvent être préparées sous diverses formes. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous forme de préparations injectables, de type soit solution liquide, soit suspension. Des formes solides pour une mise en solution ou une mise en suspension dans des véhicules liquides avant injection peuvent également être préparées. Les compositions se prêtant à une injection par voie parentérale (p. ex. dans le muscle) sont préférées entre toutes.
La composition est de préférence stérile. Elle est de préférence apyrogène. Elle est de préférence tamponnée, p. ex. à un pH entre pH 6 et pH 8, généralement autour de pH 7. Quand une composition comprend un sel d'hydroxyde d'aluminium, il est préférable d'utiliser un tampon histidine [44]. Les compositions selon l'invention peuvent être isotoniques vis-à-vis des sujets humains.
Les compositions immunogènes comprennent une quantité immunologiquement efficace d'immunogène, ainsi que de tout autre composant spécifié, comme nécessaire. Par "quantité immunologiquement efficace", on entend que l'administration de cette quantité à un individu, soit sous forme d'une unidose, soit dans le cadre d'une série, est efficace à des fins de traitement ou de prévention. Cette quantité varie en fonction de la santé et de la condition physique de l'individu à traiter, de son âge, du groupe taxonomique auquel appartient l'individu à traiter (p. ex. primate non humain, primate, etc.), de la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, du degré de protection recherché, de la formulation du vaccin, de l'avis du médecin traitant sur le cas médical, et autres facteurs pertinents. Cette quantité devrait s'inscrire dans une plage relativement large qui peut être déterminée par des essais réguliers. Le traitement posologique peut être un schéma à une seule dose ou à multidose (comprenant p. ex. des doses de rappel) . La composition peut être administrée conjointement à d'autres agents immunorégulateurs.
Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans les compositions selon l'invention comprennent, entre autres, les sels métalliques insolubles, les émulsions huile dans l'eau (p. ex. MF59 ou AS03, contenant toutes les deux du squalène) , les saponines, les dérivés non toxiques du LPS (tels que le lipide A monophosphorylé ou le MPL 3-0-désacylé), les oligonucléotides immunostimulateurs, les toxines bactériennes détoxifiées ADP-ribosylantes, les microparticules, les liposomes, les imidazoquinolones, ou leurs mélanges. D'autres substances capables d'agir comme des agents immunostimulateurs sont décrites dans le chapitre 7 de la réf. 45. L'utilisation d'un adjuvant de type hydroxyde d'aluminium et/ou phosphate d'aluminium est particulièrement préférée, et les polypeptides sont généralement adsorbés sur ces sels. Ces sels comprennent les oxyhydroxydes et les hydroxyphosphates (voir p. ex. les chapitres 8 &amp; 9 de la réf. 45) . Les sels peuvent prendre toute forme convenable (p. ex. gel, forme cristalline, amorphe, etc.). Al+++ devrait être présent à <1 mg/dose. L'adjuvant préféré entre tous est 1'hydroxyde d'aluminium, tel qu'il est utilisé dans le BEXSERO™. Les polypeptides dans une composition selon l'invention peuvent être adsorbés sur cet adjuvant, comme dans le BEXSERO™. Il peut être incorporé à raison d'environ 1 mg/ml d'Al+++ (à savoir 0,5 mg par dose de 0,5 ml) .
Autres composants antigÈniques
Les compositions selon l'invention comprennent la séquence fHbp v2 et/ou v3 mutante. Il est utile que la composition ne contienne pas de mélanges d'antigènes complexes ou indéfinis, p. ex. il est préférable qu'elle ne contienne pas de vésicules de membrane externe. Les polypeptides selon l'invention sont de préférence exprimés par des moyens recombinants chez un hôte hétérologue, puis purifiés.
En plus d'un polypeptide fHbp, une composition selon l'invention peut également contenir un ou plusieurs autres immunogènes neisseriens, dans la mesure où un vaccin qui cible plus d'un immunogène par bactérie réduit la possibilité de sélectionner des mutants d'échappement. Par conséquent, une composition peut contenir un second polypeptide qui, quand il est administré à un mammifère convenable, suscite une réponse en anticorps qui est bactéricide envers le méningocoque. Le second polypeptide peut être un fHbp méningococcique, mais sera souvent un polypeptide autre que fHbp, p. ex. une séquence NHBA, une séquence NadA, etc.
Une composition selon l'invention peut contenir un antigène NHBA. L'antigène NHBA a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [46] sous forme de gène NMB2132 (Numéro d'accès GenBank GI :7227388 ; SEQ ID NO : 6 dans la présente) . Des séquences de l'antigène NHBA provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis. Par exemple, on peut voir des formes alléliques de NHBA sur les Figures 5 et 15 de la référence 47, et dans l'exemple 13 et sur la figure 21 de la référence 1 (SEQ ID 3179 à 3184 dans la présente) . Divers fragments immunogènes de l'antigène NHBA ont également été rapportés. Les antigènes 287 préférés pour une utilisation dont fait l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 50 % ou plus (p. ex. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 6 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 6, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments mentionnés en (b) préférés comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 6. Les antigènes NHBA les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6. Les antigènes NHBA avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps antiméningococciques bactéricides après administration au sujet.
Une composition selon l'invention peut contenir un antigène NadA. L'antigène NadA a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [46] sous forme de gène NMB1994 (Numéro d'accès GenBank GI :7227256 ; SEQ ID NO : 7 dans la présente) . Des séquences de l'antigène NadA provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis, et l'activité de la protéine à titre d'adhésine de Neisseria est bien documentée. Divers fragments immunogènes de l'antigène NadA ont également été rapportés. Les antigènes NadA préférés utilisables dans le cadre de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 50 % ou plus (p. ex. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 7 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 7, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 7. Les antigènes NadA les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7. Les antigènes NadA avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps antiméningococciques bactéricides après administration à un sujet. SEQ ID NO : 15 est l'un de ces fragments.
Une composition selon l'invention peut contenir un antigène NspA. L'antigène NspA a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [46] sous forme de gène NMB0663 (Numéro d'accès GenBank GI :7225888 ; SEQ ID NO : 8 dans la présente) . L'antigène était déjà connu d'après les références 48 &amp; 49. Des séquences de l'antigène NspA provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis. Divers fragments immunogènes de NspA ont également été rapportés. Les antigènes NspA préférés utilisables dans le cadre de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 50 % ou plus (p. ex. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 8 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 8, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 8. Les antigènes NspA les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8. Les antigènes NspA avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps anti-méningococciques bactéricides après administration à un sujet.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir un antigène méningococcique HmbR. La séquence HmbR pleine longueur a été incluse dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [46] sous forme de gène NMB1668 (SEQ ID NO : 9 dans la présente) . L'invention peut utiliser un polypeptide qui comprend une séquence HmbR pleine longueur, mais elle utilisera souvent un polypeptide qui comprend une séquence HmbR partielle. Par conséquent, dans certains modes de réalisation, une séquence HmbR utilisée selon l'invention peut comprendre une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins i % avec SEQ ID NO : 9, où la valeur de i est 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 ou plus. Dans d'autres modes de réalisation, une séquence HmbR utilisée selon l'invention peut comprendre un fragment constitué d'au moins j acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 9, où la valeur de j est 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus. Dans d'autres modes de réalisation, une séquence HmbR utilisée selon l'invention peut comprendre une séquence d'acides aminés (i) présentant une identité de séquence d'au moins i % avec SEQ ID NO : 9, et/ou (ii) comprenant un fragment constitué d'au moins j acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 9. Les fragments préférés de j acides aminés comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 9. Ces épitopes comprendront généralement des acides aminés qui se trouvent à la surface du HmbR. Les épitopes utiles comprennent ceux qui comportent des acides aminés impliqués dans la liaison du HmbR à l'hémoglobine, dans la mesure où les anticorps qui se lient à ces épitopes peuvent bloquer la capacité d'une bactérie à se lier à l'hémoglobine de l'hôte. La topologie du HmbR, et de ses résidus fonctionnels critiques, a été étudiée dans la référence 50. Les antigènes HmbR les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9. Les antigènes HmbR avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps anti-méningococciques bactéricides après administration à un sujet.
Une composition selon l'invention peut contenir un antigène NhhA. L'antigène NhhA a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [46] sous forme de gène NMB0992 (Numéro d'accès GenBank GI :7226232 ; SEQ ID NO : 10 dans la présente) . Des séquences de l'antigène NhhA provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis, p. ex. réfs. 47 &amp; 51, et divers fragments immunogènes de NhhA ont été rapportés. L'antigène est également connu sous le nom de Hsf. Les antigènes NhhA préférés utilisables dans le cadre de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 50 % ou plus (p. ex. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 10 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 10, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus). Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 10. Les antigènes NhhA les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10. Les antigènes NhhA avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps anti-anti-méningococciques bactéricides après administration à un sujet.
Une composition selon l'invention peut contenir un antigène App. L'antigène App a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [46] sous forme de gène NMB1985 (Numéro d'accès GenBank GI :7227246 ; SEQ ID NO : 11 dans la présente) . Des séquences de l'antigène App provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis. Divers fragments immunogènes d'App ont également été rapportés. Les antigènes App préférés utilisables dans le cadre de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 50 % ou plus (p. ex. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 11 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 11, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus). Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 11. Les antigènes App les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 11. Les antigènes App avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps anti-anti-méningococciques bactéricides après administration à un sujet. '
Une composition selon l'invention peut contenir un antigène Omp85. L'antigène Omp85 a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [46] sous forme de gène NMB0182 (Numéro d'accès GenBank GI :7225401 ; SEQ ID NO : 12 dans la présente) . Des séquences de l'antigène Omp85 provenant de nombreuses souches ont été publiées depuis. D'autres informations concernant Omp85 figurent dans les références 52 et 53. Divers fragments immunogènes d'Omp85 ont également été rapportés. Les antigènes Omp85 préférés utilisables dans le cadre de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 50 % ou plus (p. ex. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 12 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 12, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 12. Les antigènes Omp85 les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12. Les antigènes Omp85 avantageux utilisables dans le cadre de l'invention peuvent susciter la production d'anticorps anti-anti-méningococciques bactéricides après administration à un suj et.
Une composition selon l'invention peut contenir un antigène 936. L'antigène 936 a été inclus dans la séquence du génome publiée de la souche méningococcique de sérogroupe B MC58 [46] sous forme de gène NMB2091 (SEQ ID NO : 13 dans la présente) . Les antigènes 936 préférés utilisables dans le cadre de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant une identité de 50 % ou plus (p. ex. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,
95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 13 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins "n" acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 13, où "n" vaut 7 ou plus (p. ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments
préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 13. Les antigènes 936 les plus utiles selon l'invention peuvent susciter la production d'anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13. L'antigène 936 est un bon partenaire de fusion pour fHbp (p. ex. voir références 54 &amp; 55).
Une composition peut comprendre : un polypeptide comprenant SEQ ID NO : 14 ; un polypeptide comprenant SEQ ID NO : 15 ; et un polypeptide selon l'invention comprenant une séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante et SEQ ID NO : 13 (cf. les réfs. 54 &amp; 55) .
Une composition peut comprendre : un polypeptide comprenant SEQ ID NO : 14 ; un polypeptide comprenant SEQ ID NO : 15 ; et un polypeptide selon l'invention comprenant une séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante et SEQ ID NO : 13 (cf. réfs. 54 &amp; 55) .
Dans certains modes de réalisation, un polypeptide selon l'invention est combiné à une autre séquence fHbp méningococcique. En particulier, un polypeptide v2 peut être combiné à un polypeptide vl et/ou v3 pour accroître le spectre de couverture des souches [160]. Par conséquent, une composition peut comprendre : (i) un polypeptide selon l'invention comprenant une séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante ; et (ii) un polypeptide fHbp vl et/ou un polypeptide -fHbp v3. Dans d'autres modes de réalisation, un polypeptide selon l'invention peut comprendre (i) une séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante et (ii) une séquence d'acides aminés fHbp vl et/ou une séquence d'acides aminés fHbp v3. Par conséquent, les séquences vl et/ou v3 peuvent être combinées à la séquence v2 mutante sous forme d'entités séparées dans une composition (ou dans un polypeptide de fusion, comme décrit ci-dessus).
De manière similaire, un polypeptide v3 peut être combiné à un polypeptide vl et/ou v2 pour accroître le spectre de couverture des souches [160]. Par conséquent, une composition peut comprendre : (i) un polypeptide selon l'invention comprenant une séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante ; et (ii) un polypeptide fHbp vl et/ou un polypeptide fHbp v2. Dans d'autres modes de réalisation, un polypeptide selon l'invention peut comprendre (i) une séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante et (ii) une séquence d'acides aminés fHbp vl et/ou une séquence d'acides aminés fHbp v2. Par conséquent, les séquences vl et/ou v2 peuvent être combinées à la séquence v3 mutante sous forme d'entités séparées dans une composition (ou dans un polypeptide de fusion, comme décrit ci-dessus). Dé plus les polypeptides v2 et v3 mutants peuvent être combinés l'un à l'autre pour accroître la couverture des souches. Par conséquent, une composition peut comprendre : (i) un polypeptide selon l'invention comprenant une séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante ; (ii) un polypeptide selon l'invention comprenant une séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante ; et (iii) un polypeptide fHbp vl. Dans d'autres modes de réalisation, un polypeptide selon l'invention peut comprendre (i) une séquence d'acides aminés fHbp v2 mutante, (ii) une séquence d'acides aminés fHbp v3 mutante et (iii) une séquence d'acides aminés fHbp vl. Par conséquent, les séquences v2 et v3 mutantes peuvent être combinées à une séquence vl sous forme d'entités séparées dans une composition (ou dans un polypeptide de fusion, comme décrit ci-dessus). La séquence vl peut être une séquence de type sauvage ou une séquence mutante.
Un fHbp vl peut comprendre (a) une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins k % avec SEQ ID NO : 16, et/ou (b) un fragment de SEQ ID NO : 16. Des informations concernant "k" et les fragments sont fournies ci-dessus. Le fragment contiendra typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 16, et le polypeptide fHbp vl contiendra au moins un épitope qui n'est pas présent dans la séquence d'acides aminés v2 ou v3 selon l'invention, pour que les anticorps dont la production a été suscitée par fHbp vl puissent reconnaître les souches vl. Dans l'idéal, fHbp vl peut susciter la production d'anticorps qui sont bactéricides envers les souches vl, p. ex. envers la souche MC58 (disponible auprès de 1'ATCC sous la référence "BAA-335"). Le fHbp vl peut contenir une mutation d'acide aminé qui altère sa capacité de liaison à fH.
Un fHbp v2 peut comprendre (a) une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins k % avec SEQ ID NO : 5, et/ou (b) un fragment de SEQ ID NO : 5. Des informations concernant "k" et les fragments sont fournies ci-dessus. Le fragment contiendra typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 5, et le polypeptide fHbp v2 contiendra au moins un épitope qui n'est pas présent dans la séquence d'acides aminés v3 selon l'invention, pour que les anticorps dont la production a été suscitée par fHbp v2 puissent reconnaître les souches v2. Dans l'idéal, fHbp v2 peut susciter la production d'anticorps qui sont bactéricides envers les souches v2, p. ex. envers la souche M2091 (ATCC 13091) . Le fHbp v2 peut être un polypeptide selon le premier aspect de l'invention.
Un fHbp v3 peut comprendre (a) une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins k % avec SEQ ID NO : 17, et/ou (b) un fragment de SEQ ID NO : 17. Des informations concernant "k" et les fragments sont fournies ci-dessus. Le fragment contiendra typiquement au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 17, et le polypeptide fHbp v3 contiendra au moins un épitope qui n'est pas présent dans la séquence d'acides aminés v2 selon l'invention, pour que les anticorps dont la production a été suscitée par fHbp v3 puissent reconnaître les souches v3. Dans l'idéal, fHbp v3 peut susciter la production d'anticorps qui sont bactéricides envers les souches v3, p. ex. envers la souche M01-240355. Le fHbp v3 peut être un polypeptide selon le deuxième aspect de 1'invention.
En plus des antigènes polypeptidiques de Neisseria, la composition peut comprendre des antigènes pour immuniser contre d'autres maladies ou infections. Par exemple, la composition peut comprendre un ou plusieurs des autres antigènes suivants : - un antigène saccharidique de N. meningitidis sérogroupe A, C, W135 et/ou Y, tel que le saccharide décrit dans la réf. 56 de sérogroupe C (voir également la réf. 57) ou dans la réf. 58. - un antigène saccharidique de Streptococcus pneumoniae [p. ex. 59, 60, 61]. - un antigène du virus de l'hépatite A, tel qu'un virus inactivé [p. ex. 62, 63]. - un antigène du virus de l'hépatite B, tel que des antigènes de surface et/ou de cœur [p. ex. 63, 64]. - un antigène diphtérique, tel que l'anatoxine diphtérique [p. ex. chapitre 3 de la réf. 65] p. ex. le mutant CRM197 [p. ex. 66] . - un antigène tétanique, tel que l'anatoxine tétanique (p. ex. chapitre 4 de la réf. 65) . - un antigène de Bordetella pertussis, tel que 1'holotoxine pertussique (PT) et 1'hémagglutinique filamenteuse (FHA) de B. pertussis, éventuellement également en combinaison avec la pertactine et/ou les agglutinogènes 2 et 3 (p. ex. la réf. 67 &amp; 68). - un antigène saccharidique d'Haemophilus influenzae B [p. ex. 57] . - un ou des antigènes polio [p. ex. 69,70] tels que l'IPV. - des antigènes des virus de la rougeole, des oreillons et/ou de la rubéole (p. ex. chapitres 9, 10 &amp; 11 de la réf. 65). - un ou des antigènes du virus influenza (p. ex. chapitre 19 de la réf. 65), tels que 1'hémagglutinine et/ou les protéines de surface de type neuraminidase. - un antigène de Moraxella catarrhalis [p. ex. 71]. - un antigène protéique de Streptococcus agalactiae (streptocoque de groupe B) [p. ex. 72, 73]. - un antigène saccharidique de Streptococcus agalactiae (streptocoque de groupe B). - un antigène de Streptococcus pyogenes (streptocoque de groupe A) [p. ex. 73, 74, 75] . - un antigène de Staphylococcus aureus [p. ex. 76].
La composition peut comprendre un ou plusieurs de ces autres antigènes.
Les antigènes protéiques toxiques peuvent être détoxifiés si nécessaire (p. ex. détoxification de la toxine pertussique par des moyens chimiques et/ou génétiques [68]) .
Quand un antigène diphtérique est incorporé dans la composition, il est préférable d'inclure également des antigènes tétaniques et pertussiques. De manière similaire, quand un antigène tétanique est incorporé, il est préférable d'inclure également des antigènes diphtériques et pertussiques. De manière similaire, quand un antigène pertussique est incorporé, il est préférable d'inclure également des antigènes diphtériques et tétaniques. Les combinaisons DTP sont par conséquent préférées.
Les antigènes saccharidiques sont de préférence sous la forme de conjugués. Les protéines porteuses pour les conjugués sont décrites plus en détails ci-dessous.
Les antigènes dans la composition seront typiquement présents à une concentration d'au moins 1 pg/ml chaque. En général, la concentration de tout antigène donné sera suffisante pour susciter une réponse immunitaire contre cet antigène.
Les compositions immunogènes selon l'invention peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques (à savoir pour traiter une infection existante) ou prophylactiques (à savoir pour prévenir une infection future).
Comme alternative à l'utilisation d'antigènes protéiques dans les compositions immunogènes selon l'invention, un acide nucléique (qui pourrait être l'ARN, tel qu'un ARN à autoréplication, ou l'ADN, tel qu'un plasmide) codant pour l'antigène peut être utilisé.
Dans certains modes de réalisation, une composition selon l'invention comprend, en plus de la séquence fHbp, des antigènes de saccharides capsulaires conjugués provenant de 1, 2, 3 ou 4 des sérogroupes A, C, W135 et Y du méningocoque. Dans d'autres modes de réalisation, une composition selon l'invention comprend, en plus de la séquence fHbp, au moins un antigène de saccharide capsulaire pneumococcique conjugué.
Méningocoques de sérogroupes Y, W135, C et A
Les actuels vaccins contre le méningocoque de sérogroupe C (MENJUGATE™ [56, 77], MENINGITEC™ et NEISVAC-C™) comprennent des saccharides conjugués. MENJUGATE™ et MENINGITEC™ contiennent des antigènes oligosaccharidiques conjugués à une protéine porteuse CRM197, tandis que NEISVAC-C™ utilise le polysaccharide complet (dés-O-acétylé) conjugué à une protéine porteuse de type anatoxine tétanique. Le vaccin MENACTRA™ contient des antigènes de saccharides capsulaires conjugués provenant de chacun des sérogroupes Y, W135, C et A.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir des antigènes saccharidiques capsulaires provenant d'un ou de plusieurs des sérogroupes Y, W135, C et A du méningocoque, dans lesquelles les antigènes sont conjugués à une ou plusieurs protéines porteuses et/ou sont des oligosaccharides. Par exemple, la composition peut contenir un antigène saccharidique capsulaire provenant du : sérogroupe C ; sérogroupes A et C ; sérogroupes A, C et W135 ; sérogroupes A, C et Y ; sérogroupes C, W135 et Y ; ou provenant des quatre sérogroupes A, C, W135 et Y.
Une quantité typique de chaque antigène saccharidique méningococcique par dose est entre 1 et 20 pg, p. ex. environ 1 pg, environ 2,5 pg, environ 4 pg, environ 5 pg, ou environ 10 pg (exprimés en termes de saccharide).
Quand un mélange comprend des saccharides capsulaires provenant des deux sérogroupes A et C, le rapport (p/p) saccharide MenA:saccharide MenC peut être supérieur à 1 (p. ex. 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou plus). Quand un mélange comprend des saccharides capsulaires provenant du sérogroupe Y et d'un ou des deux sérogroupes C et W135, le rapport (p/p) saccharide MenY:saccharide MenW135 peut être supérieur à 1 (p. ex. 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou plus) et/ou le rapport (p/p) saccharide MenY:saccharide MenC peut être inférieur à 1 (p. ex. 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, ou moins). Les rapports (p/p) préférés pour les saccharides provenant des sérogroupes A:C:W135:Y sont : 1:1:1:1 ; 1:1:1:2 ; 2:1:1:1 ; 4:2:1:1 ; 8:4:2:1 ; 4:2:1:2 ; 8:4:1:2 ; 4:2:2:1 ; 2:2:1:1 ; 4:4:2:1 ; 2:2:1:2 ; 4:4:1:2 ; et 2:2:2:1. Les rapports (p/p) préférés pour les saccharides provenant des sérogroupes C:W135:Y sont : 1:1:1 ; 1:1:2 ; 1:1:1 ; 2:1:1 ; 4:2:1 ; 2:1:2 ; 4:1:2 ; 2:2:1 ; et 2:1:1. L'utilisation d'un poids eessentiellement égal de chaque saccharide est préférée.
Les saccharides capsulaires peuvent être utilisés sous la forme d'oligosaccharides. Ceux-ci sont commodément formés par fragmentation du polysaccharide capsulaire purifié (p. ex. par hydrolyse) , normalement suivie par la purification des fragments ayant la taille recherchée.
La fragmentation des polysaccharides est de préférence réalisée pour obtenir un degré moyen final de polymérisation (DP) dans l'oligosaccharide inférieur à 30 (p. ex. entre 10 et 20, de préférence d'environ 10 pour le sérogroupe A ; entre 15 et 25 pour les sérogroupes W135 et Y, de préférence d'environ 15-20 ; entre 12 et 22 pour le sérogroupe C ; etc.) . Le DP peut être commodément mesuré par une chromatographie d'échange d'ions ou par des dosages colorimétriques [78].
Si une hydrolyse est effectuée, l'hydrolysat sera généralement dimensionné afin d'éliminer les oligosaccharides de courte longueur [57]. Ceci peut être effectué de diverses façons, comme par une ultrafiltration suivie d'une chromatographie d'échange d'ions. Les oligosaccharides ayant un degré de polymérisation inférieur ou égal à environ 6 sont de préférence éliminés du sérogroupe A, et ceux ayant un degré de polymérisation inférieur à environ 4 sont de préférence éliminés des sérogroupes W135 et Y.
Les antigènes saccharidiques MenC préférés, utilisés dans MENJUGATE™, sont décrits dans la référence 77. L'antigène saccharidique peut être chimiquement modifié. Ceci est particulièrement utile pour réduire l'hydrolyse du sérogroupe A [79]. Une dés-O-acétylation des saccharides ménongococciques peut être effectuée. Pour les oligosaccharides, la modification peut être effectuée avant ou après la dépolymerisation.
Quand une composition selon l'invention contient un antigène saccharidique MenA, l'antigène est de préférence un saccharide modifié dans lequel un ou plusieurs des groupes hydroxyle sur le saccharide natif a ou ont été remplacés par un groupe bloquant [79] . Cette modification améliore la résistance à 1'hydrolyse.
Conjugaison covalente
De manière générale, les saccharides capsulaires dans les compositions selon l'invention seront conjugués à des protéines porteuses. En général, la conjugaison améliore l'immunogénicité des saccharides dans la mesure où elle les convertit d'antigènes T-indépendants en antigènes T-dépendants, permettant ainsi l'amorçage d'une mémoire immunologique. La conjugaison est particulièrement utile pour les vaccins pédiatriques et est une technique très connue.
Les protéines porteuses typiques sont des toxines bactériennes, telles que les toxines diphtériques ou tétaniques, ou les anatoxines ou mutants de celles-ci. Le mutant toxine diphtérique CRM197 [80] est utile, et est la protéine porteuse du PREVNAR™. D'autres protéines porteuses convenables comprennent le complexe protéique de membrane externe de N. meningitidis [81], les peptides synthétiques [82, 83] , les protéines de choc thermique [84, 85], les protéines pertussiques [86, 87], les cytokines [88], les lymphokines [88], les hormones [88], les facteurs de croissance [88], les protéines artificielles comprenant de multiples épitopes T CD4+ humains provenant de divers antigènes dérivés de pathogènes [89] tels que N19 [90], la protéine D de H. influenzae [91-93], la pneumolysine [94] ou ses dérivés non toxiques [95], la protéine de surface pneumococcique PspA [96], les protéines absorbant le fer [97], la toxine A ou B de C. difficile [98], 1'exoprotéine recombinée A de P. aeruginosa (rEPA) [99], etc.
Toute réaction de conjugaison convenable peut être utilisée, avec tout lieur («linker») convenable, là où c'est nécessaire.
Le saccharide sera typiquement activé ou fonctionnalisé avant conjugaison. L'activation peut impliquer, par exemple, des réactifs de cyanylation tels que CDAP (p. ex. tétrafluoroborate de l-cyano-4-diméthylamino-pyridinium [100, 101, etc.)]. D'autres techniques convenables utilisent des carbodiimides, des hydrazides, des esters actifs, du norborane, de l'acide p-nitrobenzoïque, du N-hydroxy-succinimide, S-NHS, EDC, TSTU, etc.
Les liaisons par l'intermédiaire d'un groupe lieur («linker») peuvent être formées à l'aide de toute procédure connue, par exemple, les procédures décrites dans les références 102 et 103. Un type de liaison implique l'amination réductrice du polysaccharide, le couplage du groupe amino obtenu à une extrémité du groupe lieur («linker») acide adipique, puis le couplage d'une protéine à l'autre extrémité du groupe lieur («linker») acide adipique [104, 105]. D'autres lieurs («linker») comprennent le B-propionamido [106], la nitrophényl-éthylamine [107], les halogénures halogénoacyle [108], les liaisons glycosidiques [109], l'acide 6-aminocaproïque [110], 1'ADH [111], les fragments CU à C12 [112], etc. Comme alternative à l'utilisation d'un lieur («linker»), la liaison directe peut être utilisée. Les liaisons directes à la protéine peuvent comprendre l'oxydation du polysaccharide, suivie de l'amination réductrice avec la protéine, comme décrit, par exemple, dans les références 113 et 114.
Un procédé impliquant l'introduction de groupes amino dans le saccharide (p. ex. par remplacement des groupes =0 terminaux par -NH2) , suivie de la formation de dérivés avec un diester adipique (p. ex. N-hydroxysuccinimidodiester d'acide adipique) et réaction avec la protéine porteuse est préféré. Une autre réaction préférée utilise l'activation de CDAP à l'aide d'une protéine porteuse D, p. ex. pour MenA ou MenC. Vésicules de membrane externe (OMV)
Il est préférable que les compositions selon l'invention ne contiennent pas de mélanges d'antigènes complexes ou indéfinis, qui sont des caractéristiques typiques des OMV. Toutefois, l'invention peut être utilisée conjointement avec des OMV, dans la mesure où le fHbp s'est avéré améliorer leur efficacité [4], soit par simple mélange, soit par surexpression des polypeptides selon l'invention dans les souches utilisées pour la préparation des OMV.
De manière générale, cette approche peut être utilisée pour améliorer des préparations de microvésicules de N. meningitïdis sérogroupe B [115], d'OMV "natives" [116], de "boursouf f lures " ou vésicules de membrane externe (p'. ex. réfs. 117 à 123, etc.).
Les vésicules de membrane externe typiques sont préparées artificiellement à partir de bactéries, et peuvent être préparées par un traitement détergent (p. ex. au désoxycholate) , ou par des moyens non détergents (voir p. ex. référence 127). Les techniques pour former des OMV comprennent le traitement des bactéries avec un détergent de type sel d'acide biliaire (p. ex. sels d'acide lithocholique, d'acide chenodésoxycholique, d'acide ursodésoxycholique, d'acide désoxycholique, d'acide cholique, d'acide ursocholique, etc., le désoxycholate de sodium [124 &amp; 125] étant préféré pour traiter Neisseria) à un pH suffisamment élevé pour ne pas précipiter le détergent [126] . D'autres techniques peuvent être utilisées essentiellement en l'absence de détergent [127, 128] telles que des techniques de sonication, homogénéisation, microfluidisation, cavitation, choc osmotique, broyage, presse de French, mélange, etc. Les méthodes n'utilisant pas ou peu de détergent permettent de conserver des antigènes utiles tels que NspA et fHbp [127]. Par conséquent, les OMV utilisées dans le cadre de l'invention peuvent être préparées à l'aide d'un tampon d'extraction d'OMV contenant environ 0,5 % de désoxycholate ou moins, p. ex. environ 0,2 %, environ 0,1 %, <0,05 % voire pas du tout.
Les vésicules connues sous les noms de MV (vésicules de membrane) et NOMV (vésicules de membrane externe natives) sont des vésicules de membrane naturelles qui se forment spontanément pendant la croissance bactérienne et sont libérées dans le milieu de culture. Les MV peuvent être obtenues par culture de Neisseria dans un milieu de culture de type bouillon, séparation des cellules entières des MV plus petites dans le milieu de culture de type bouillon (p. ex. par filtration ou centrifugation à basse vitesse pour ne former que des culots de cellules et pas de vésicules plus petites) , puis collecte des MV à partir du milieu appauvri en cellules (p. ex. par filtration, précipitation différentielle ou agrégation des MV, par centrifugation à grande vitesse pour former des culots de MV). De manière générale, les souches utilisables dans la production de MV peuvent être choisies en fonction de la quantité de MV produites en culture, les réfs 135 &amp; 136 décrivant p. ex. Neisseria comme une bactérie à production élevée de MV.
Les vésicules peuvent être préparées à partir de bactéries qui ont été génétiquement manipulées [139-132] p. ex. pour accroître l'immunogénicité (p. ex. immunogènes hyperexprimés) , réduire la toxicité, inhiber la synthèse du polysaccharide capsulaire, sous-réguler l'expression de PorA, etc. Elles peuvent être préparées à partir de souches hyperproductrices de vésicules [133-136]. Des vésicules provenant de bactéries ayant des sous-types de protéines de membrane externe de classe I différentes peuvent être utilisées, p. ex. six sous-types différents [137, 138] obtenus à partir de deux populations de vésicules génétiquement modifiées différentes comportant chacune trois sous-types, ou neuf sous-types différents obtenus à partir de trois populations de vésicules génétiquement modifiées différentes comportant chacune trois sous-types, etc. Les sous-types utiles comprennent : PI.7,16 ; PI.5-1,2-2 ; PI.19,15-1 ; PI. 52,10 ; PI.12-1,13 ; PI.7-2,4 ; PI.22,14 ; PI.7-1,1 ; PI.18-1,3,6. En général, toutefois, il est préférable pour la présente invention de préparer les OMV à partir d'une souche de méningocoque de type sauvage.
Les vésicules utilisables dans le cadre de l'invention peuvent par conséquent être préparées à partir de toute souche méningococcique de type sauvage. Les vésicules proviendront généralement d'une souche de sérogroupe B, mais il est possible de les préparer à partir de sérogroupes autres que B (la référence 126 décrit p. ex. un procédé pour le sérogroupe A), tels que A, C, W135 ou Y. La souche peut être de tout sérotype (p. ex. 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), de tout séro-sous-type (p. ex. PI.4), et de tout immunotype (p. ex. Ll ; L2 ; L3 ; L3,7 ; L3,7,9 ; L10 ; etc.). Les méningocoques peuvent provenir de toute lignée convenable, y compris de lignées hyperinvasives et hypervirulentes, p. ex. de l'une quelconque des sept lignées hypervirulentes suivantes : sous-groupe I ; sous-groupe III ; sous-groupe IV-1 ; complexe ET-5 ; complexe ET-37 ; cluster A4 ; lignée 3. De manière préférée entre toutes, les OMV sont préparées à partir de la souche NZ98/254, ou autre souche de séro-sous-type PI. 4 PorA.
De manière avantageuse, l'invention utilise les mêmes OMV que celles utilisées dans le BEXSERO™ et MENZB™, préparées à partir de la souche NZ98/254.
De manière générale, les vésicules contiendront des lipooligosaccharides (LOS, également connus sous le nom de LPS, lipopolysaccharides), mais l'effet pyrogène des LOS dans les OMV est bien plus faible, à quantité égale, à celui des LOS purifié, et l'adsorption des OMV sur 1'hydroxyde d'aluminium réduit en outre leur pyrogénicité. Les niveaux de LOS sont exprimés en Unités Internationales (IU) d'endotoxine et peuvent être déterminés par le dosage LAL (lysat d'amœbocytes de limule). De préférence, les LOS sont présents à moins de 2000 IU par pg de protéine OMV.
Quand des LOS sont présents dans une vésicule, il est possible de traiter la vésicule de façon à lier ses composants LOS et protéines (conjugaison "intra-bleb" [139]).
Un procédé utile de purification d'OMV est décrit dans la référence 140 et implique l'ultrafiltration sur OMV brutes, plutôt qu'une centrifugation à grande vitesse. Le procédé peut impliquer une étape d'ultracentrifugation après l'ultrafiltration. Les OMV peuvent également être purifiées par le procédé de filtration par exclusion de taille à deux étapes décrit dans la réf. 152.
De manière utile, les OMV peuvent être mises en suspension dans une solution de saccharose une fois qu'elles ont été préparées.
Cellules hùtes L'invention. concerne une bactérie qui exprime un polypeptide selon l'invention. La bactérie peut être un méningocoque ou un E. coli. La bactérie peut exprimer le · polypeptide de manière constitutive, mais dans certains modes de réalisation, l'expression peut être sous le contrôle d'un promoteur inductible. La bactérie peut hyper-exprimer le polypeptide (cf. la réf. 141). Dans l'idéal, l'expression du polypeptide n'est pas variable en phases. L'invention concerne également des vésicules de membrane externe préparées à partir d'une bactérie selon l'invention (en particulier, à partir d'un méningocoque). Elle concerne également un procédé de production de vésicules à partir d'une bactérie selon l'invention. Les vésicules préparées à partir de ces souches contiennent de préférence le polypeptide selon l'invention, qui sera sous une forme immunoaccessible dans les vésicules, à savoir un anticorps capable de se lier à un polypeptide purifié selon l'invention doit également pouvoir se lier au polypeptide qui est présent dans les vésicules.
Les bactéries selon l'invention peuvent, en plus de coder pour un polypeptide selon l'invention, comporter une ou plusieurs autres modifications. Par exemple, elles peuvent contenir un gène fur modifié [142] . L'expression de nspA peut être sur-régulée avec inactivation concomitante de porA et cps. D'autres souches mutantes de N. meningitidis pour la production d'OMV et qui ont été obtenues par des techniques d'inactivation de gènes sont décrites, p. ex. dans la référence 139. La référence 143 décrit la construction de vésicules à partir de souches modifiées pour exprimer six sous-types PorA différents. Des souches mutantes de Neisseria à bas niveau d'endotoxine, obtenues par inactivation des enzymes impliquées dans la biosynthèse des LPS, peuvent également être utilisées [144, 145], Des souches mutantes de Neisseria manipulées pour réduire, voire neutraliser l'expression d'au moins un gène impliqué dans la toxification de la partie lipide A des LPS, en particulier du gène lpxl 1, peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention [146]. De manière similaire, des souches mutantes de Neisseria manipulées pour réduire, voire neutraliser l'expression d'au moins un gène impliqué dans la synthèse ou l'export des polysaccharides capsulaires, en particulier des gènes synX et/ou ctrA, peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention. Ces mutants ou autres peuvent tous être utilisés dans le cadre de l'invention.
Dans certains modes de réalisation, une souche peut avoir été sous-régulée pour l'expression de PorA, p. ex. de façon que l'expression de PorA soit réduite d'au moins 20 % (p. ex. >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95%, etc.), voire inactivée, par rapport aux niveaux du type sauvage (p. ex. par rapport à la souche H44/76).
Dans certains modes de réalisation, une souche peut hyper-exprimer certaines protéines (par rapport à la souche de type sauvage correspondante). Par exemple, des souches peuvent hyper-exprimer NspA, la protéine 287 [117], fHbp [141] (y compris le fHbp selon l'invention), TbpA et/ou TbpB [147], la Cu,Zn-superoxyde dismutase, HmbR, etc.
Un gène codant pour un polypeptide selon l'invention peut être intégré au chromosome de la bactérie ou peut être présent sous une forme épisomale, p. ex. dans un plasmide.
De manière avantageuse pour la production de vésicules, un méningocoque peut être génétiquement modifié pour garantir que l'expression du polypeptide n'est pas soumise à une variation de phases. Des méthodes permettant de réduire, voire d'éliminer la variabilité des phases de l'expression génique chez le méningocoque sont décrites dans la référence 148. Par exemple, un gène peut être placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif ou inductible, ou le motif ADN qui est responsable de la variabilité des phases peut être éliminé ou remplacé.
Dans certains modes de réalisation, une souche peut inclure une ou plusieurs des mutations d'inactivation et/ou d'hyper-expression décrites dans les références 122, 129, 133, et 139. Par exemple, d'après les directives et la nomenclature dans ces quatre documents, les gènes utiles pour la sous-régulation et/ou l'inactivation comprennent : (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, et/ou TbpB ; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, et/ou TbpB ; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Ope, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, and/or TbpB; ou (d) CtrA, CtrB,
CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX et/ou SynC.
Quand une souche mutante est utilisée, dans certains modes de réalisation, il peut y avoir une ou plusieurs, voire toutes, les caractéristiques suivantes : (i) LgtB et/ou GalE sous-régulés ou inactivés pour tronquer les LOS méningococciques ; (ii) TbpA sur-régulé ; (iii) NhhA surrégulé ; (iv) Omp85 sur-régulé ; (v) LbpA sur-régulé ; (vi) NspA sur-régulé ; (vii) PorA inactivé ; (viii) FrpB sous-régulé ou inactivé ; (ix) Opa sous-régulé ou inactivé ; (x) Ope sous-régulé ou inactivé ; (xii) complexe génique eps délété. Un LOS tronqué peut être du type qui ne contient pas d'épitope sialyl-lacto-N-néotétraose, et peut être p. ex. un LOS déficient en galactose. Le LOS peut être dépourvu de chaîne a.
Suivant la souche méningococcique utilisée pour préparer les vésicules, elles peuvent contenir ou pas l'antigène fHbp natif de la souche [149] .
Dans un mode de réalisation préféré, un méningocoque n'exprime pas de protéine Mit A fonctionnelle. Comme expliqué dans réfs 150 &amp; 151, chez le méningocoque, l'inactivation de MltA (transglycosylase lytique liée à la membrane, également connue sous le nom de GNA33) donne des bactéries qui libèrent spontanément de grandes quantités de vésicules de membrane dans le milieu de culture, à partir duquel elles peuvent être facilement purifiées. Par exemple, les vésicules peuvent être purifiées à l'aide du procédé de filtration par exclusion de tailles à deux étapes de la réf. 152, comprenant : (i) une première étape de filtration dans laquelle les vésicules sont séparées des bactéries en fonction de leurs différences de tailles, les vésicules passant dans le filtrat ; et (ii) une seconde étape de filtration dans laquelle les vésicules sont retenues dans le rétentat. La mutation MltA (sous-régulation ou inactivation) a été utilisée dans les vaccins "GMMA" [153], et peut commodément être combinée à d'autres sous-régulations ou inactivations, en particulier, d'au moins un gène impliqué dans la toxification de la partie lipide A des LPS, notamment du gène lpxll et/ou d'au moins un gène impliqué dans la synthèse ou l'export des polysaccharides capsulaires, notamment des gènes synX et/ou ctrA.
Une souche méningococcique préférée pour un vaccin "GMMA" (modules généralisés pour les antigènes membranaires) utilisant cette approche exprime un fHbp mutant v2 selon le premier, le troisième ou le cinquième aspect et/ou un fHbp mutant v3 selon le deuxième, le quatrième ou le sixième aspect selon l'invention, et l'expression peut être régulée par des promoteurs forts. Les vésicules libérées par cette souche contiennent les protéines du fHbp v2 et/ou v3 mutant sous une forme immunogène, et l'administration des vésicules peut susciter une réponse en anticorps bactéricides comme décrit dans la référence 153. La souche peut également exprimer un fHbp vl, ou à la place, un fHbp vl peut être fourni à titre de protéine recombinée séparée sous une forme soluble (et le fHbp vl peut être une séquence de type sauvage ou mutante, p. ex. mutée pour altérer sa capacité de liaison au fH, comme décrit ci-dessus). L'invention concerne ces souches, et concerne également les vésicules libérées par ces souches, p. ex. sous forme purifiée à partir du milieu de culture après croissance des souches. Un mutant v2 préféré pour l'expression dans ces souches porte une mutation au niveau des résidus L123 et E240 (et éventuellement S32) comme décrit dans la présente, et un mutant v3 préféré pour l'expression dans ces souches porte une mutation au niveau des résidus L126 et E243 (et éventuellement S32) comme décrit dans la présente. Par conséquent, les vésicules préparées à partir de méningocoques exprimant ces séquences fHbp v2 et v3 mutantes sont des immunogènes particulièrement préférés pour une utilisation dans les vaccins selon l'invention. Une séquence v2 de type sauvage utile pour ce type de mutagenèse comprend SEQ ID NO : 35 ou SEQ ID NO : 33 (comprenant SEQ ID NO : 34, forme AG), et une séquence v3 de type sauvage utile pour ce type de mutagenèse comprend SEQ ID NO : 36.
Les promoteurs utiles pouvant être utilisés dans ces souches comprennent ceux décrits dans les références 154 et 155. Par exemple, les promoteurs peuvent être : (a) les promoteurs des gènes de la porine, de préférence porA ou porB, en particulier de N. meningitidis ; ou (b) un promoteur du gène rRNA (tel qu'un gène 16S rRNA) , en particulier de N. meningitidis. Quand un promoteur de porine méningococcique est utilisé, il est de préférence issu de porA, et plus particulièrement encore d'une région -10 d'un promoteur de gène porA méningococcique, et/ou d'une région -35 d'un · promoteur de gène porA méningococcique (de préférence dans lequel la région -10 et la région -35 sont séparées par une séquence intercalaire de 12-20 nucléotides, et dans lequel la séquence intercalaire soit ne contient pas de séquence poly-G, soit contient une séquence poly-G ne comportant pas plus de huit nucléotides G) . Quand un promoteur de gène rRNA est utilisé, il peut comprendre plus particulièrement (i) une région -10 provenant d'un promoteur du gène rRNA méningococcique et/ou (i i) une région -35 provenant d'un promoteur du gène rRNA méningococcique. Il est également possible d'utiliser un hybride de (a) et (b), contenant par exemple une région -10 provenant d'un promoteur de porA et une région -35 provenant d'un promoteur de rRNA (qui peut être une région -35 consensus). Un promoteur utile peut par conséquent être un promoteur qui contient soit (i) une région -10 provenant d'un gène rRNA (en particulier, méningococcique) et une région -35 provenant d'un gène porA (en particulier, méningococcique), soit (ii) une région -10 provenant d'un gène porA (en particulier, méningococcique) et une région -35 provenant d'un gène rRNA (en particulier, méningococcique). GÈnÈralitÈs
Le terme "comprenant" englobe "contenant" ainsi que "constitué par", p. ex. une composition "comprenant"'X peut être exclusivement constituée par X ou peut contenir quelquechose d'autre, p. ex. X + Y. Les références à "comprenant" (ou "comprend", etc.) peuvent éventuellement être remplacées par des références à "constitué par" (ou "constitué de", etc.).
Le terme "environ" en relation avec une valeur numérique x est facultatif et désigne, par exemple, x ± 10 %.
Le terme "sensiblement" n'exclut pas "complètement", p. ex. une composition qui est "sensiblement exempte" de Y peut être complètement exempte de Y. Là où c'est nécessaire, le terme "sensiblement" peut être omis de la définition de 1'invention. "L'identité de séquence" est de préférence déterminée par l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch [156], en utilisant les paramètres par défaut (p. ex. avec une pénalité d'ouverture de gap = 10,0, et une pénalité d'extension de gap = 0,5, en utilisant la matrice de notation EBLOSUM62). Cet algorithme est facile à mettre en œuvre dans l'outil needle du logiciel EMBOSS [157]. Quand l'application fait référence à une identité de séquence avec une SEQ ID particulière, l'identité doit être calculée sur toute la longueur de cette SEQ ID.
Après le sérogroupe, la classification des méningocoques inclut le sérotype, le séro-sous-type, puis 1'immunotype, et la nomenclature standard liste le sérogroupe, le sérotype, le séro-sous-type, et 1'immunotype, chacun séparé par un deux-points, p. ex. B : 4 : PI. 15 : L3, 7, 9 . Au sein du sérogroupe B, certaines lignées provoquent la maladie souvent (hyperinvasives), certaines lignées provoquent des formes plus sévères de la maladie que d'autres (hypervirulentes), et d'autres provoquent rarement la maladie. Sept lignées hypervirulentes sont reconnues, à savoir les sous-groupes I, III et IV-1, le complexe ET-5, le complexe ET-37, le cluster A4 et la lignée 3. Elles ont été définies par électrophorèse multilocus des enzymes (MLEE), mais le typage multilocus des séquences (MLST) a également été utilisé pour classifier les méningocoques. Les quatre principaux clusters hypervirulents sont les complexes ST32, ST44, ST8 et ST11.
De manière générale, l'invention n'englobe pas les diverses séquences fHbp spécifiquement décrites dans les références 2, 3, 5, 6, 7, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 et 165.
EXEMPLES
Exemple 1 : MutagenËse pour la liaison Φ fH
La protéine v2 de type sauvage (SEQ ID NO :2) montre une forte liaison à fH quand elle est évaluée par résonance plasmonique de surface (SPR) avec un fH humain immobilisé (Figure 1, courbe du haut). Pour altérer la capacité du fHbp à se lier à fH, Glu-266 dans v2 (E240 dans SEQ ID NO : 5 ; correspond à E248 dans les références 19 &amp; 25) et Glu-274 dans v3 (E243 dans SEQ ID NO : 17) ont été mutés à Ala. La mutation E266A dans v2 a fortement réduit la liaison à fH (Figure 1, courbe du bas).
De manière similaire, la mutation "R41S" connue du fHbp vl a été introduite (SEQ ID NO : 52).
Exemple 2 : MutagenËse pour l'accroissement de la stabilitÈ fHbp v2 et v3 sont tous deux significativement moins stables que vl, en particulier dans leurs domaines N-terminaux, et v2 est le moins stable des trois. Pour améliorer la stabilité dans v2, deux résidus ont été mutés : Ser-58 de
SEQ ID NO : 2 (S32 dans SEQ ID 'N0 : 5) et Leu-149 de SEQ ID NO : 2 (L123 dans SEQ ID NO : 5) ont été mutés à Val et Arg, respectivement. La protéine v2 mutante (SEQ ID NO : 19) a été analysée par DSC et, comparativement à la séquence SEQ ID NO : 2 de type sauvage, la Tm du domaine C-terminal n'a pas été affectée par la mutation. L'accroissement de la Tm du domaine N-terminal est >20°C (Figure 2, accroissement matérialisé par la flèche). Les mutations équivalentes ont également été introduites dans v3 (SEQ ID NO : 44).
De manière surprenante, bien que les mutations S58V et L149R aient été introduites pour améliorer la stabilité, et ont bel et bien rempli cette fonction, la Figure 1 (courbe du milieu) montre que le polypeptide mutant (SEQ ID NO : 19) (même sans la mutation E266A) a également manifesté une liaison très réduite à fH. De plus, dans un dosage bactéricide sérique, ce mutant a pu entrer en compétition pour la liaison à des anticorps humains qui étaient dirigés contre SEQ ID NO : 18:
La mutation stabilisante S58V/L149R dans v2 a eu un effet surprenant sur la liaison à fH, de sorte que l'effet de E266A sur la stabilité a également été étudié. Contre toute attente, cette mutation a réduit la stabilité du domaine N-terminal, mais augmenté celle du domaine C-terminal de >15°C (de 83 à 99°C, comme illustré sur la Figure 3), comparativement au type sauvage, suggérant ainsi une stabilistation potentielle du bêta-tonneau.
Les effets des mutations S58V et L149R individuelles sur la liaison à fH ont été étudiés dans v3. Par conséquent, numérotée d'après SEQ ID NO : 17, la mutation S32V ou L126R a été introduite dans la séquence v3. Ces deux mutants ont été comparés à deux séquences v3 de type sauvage différentes, et également au mutant "E313A" qui est connu pour altérer la liaison à fH dans v3 [23].
Comme illustré sur la Figure 6, les deux v3 de type sauvage lient fH (les deux courbes du haut). La mutation S58V, qui était conçue pour améliorer la stabilité, a réduit le pic SPR d'environ 2 fois. Plus surprenant encore, la mutation L149R (là encore, conçue pour améliorer la stabilité) a réduit l'affinité envers fH à un niveau similaire à celui du mutant E313A connu (les deux courbes du bas).
Les mutations S58V et L14 9R dans v3 ont également été étudiées par DSC, et se sont avérées accroître la Tm N-terminale de 5,5°C (S58V) ou de 6,7°C (L149R). La Tm de chaque mutant était supérieure à celle observée dans le double mutant S58V/L149R v2. Le mutant L149R v3 a également présenté une valeur Tm supérieure pour son domaine C-terminal, alors qu'il n'y a pratiquement pas eu de décalage pour le mutant S58V v3.
Exemple 3 : Polypeptides de fusion
Les mutations de stabilité et de liaison du fHbp ont été combinées dans des formes mutantes de v2 (SEQ ID NO : 50) et v3 (SEQ ID NO : 51). Elles ont été fusionnées à la séquence vl mutante (SEQ ID NO : 52) dans l'ordre v2-v3-vl et jointes à l'aide de lieurs («linker»), pour obtenir SEQ ID NO : 27 ("SNB"). Par conséquent, comparé aux trois séquences de type sauvage, ce polypeptide de fusion contient un total de 7 mutations ponctuelles (Figure 9) . La fusion SNB a été comparée à un polypeptide de fusion de "type sauvage" dénué de ces mutations ponctuelles (SEQ ID NO : 18 ; SEQ ID NO : 36 dans la référence 163) . Des extraits de E. coli exprimant ces deux formes de la protéine ont été analysés par transfert Western blot, et les formes de dégradation de la protéine étaient beaucoup moins visibles avec les formes non liantes stabilisées de la fusion (SEQ ID NO : 27) (Figure 8).
La liaison de la fusion SNB à fH a été étudiée par SPR, et comparée à la fusion "type sauvage". La Figure 4 montre que la fusion "type sauvage" manifeste une forte liaison à fH (courbe du haut), alors que le mutant SNB n'interagit pas significativement avec fH (courbe du bas).
La stabilité des deux polypeptides de fusion a été étudiée par DSC (Figure 5). Le thermogramme de la fusion "type sauvage" (Figure 5A) ne contenait aucune transition N-terminale attributable à v3, suggérant que ce domaine n'était pas correctement replié. Par contre, avec le mutant "SNB", le thermogramme a montré des transitions pour les 6 domaines (3 de chaque pour les extrémités N- et C-terminales), indiquant qu'ils étaient tous correctement repliés, (Figure 5B). Séparément, les mutations de stabilité dans v2 (SEQ ID NO : 45) et v3 (SEQ ID NO : 44) ont été fusionnées à la séquence vl mutante "R41S" (SEQ ID NO : 52) dans l'ordre v2-v3-vl et jointes à l'aide de lieurs («linker»), pour obtenir SEQ ID NO : 29. Par conséquent, comparé aux trois séquences de type sauvage, ce polypeptide de fusion contient un total de 5 mutations ponctuelles.
La capacité des formes non liantes de fHbp à susciter des titres SBA a été testée chez la
souris transgéniques (Tg) :
Ces données indiquent que les formes non liantes de fHbp peuvent être plus immunogènes.
Exemple 4 : Structures 3D
Jusqu'ici, la structure du fHbp var.3 n'a été dédoublée qu'en complexe avec fH. Pour le complexe fHbp v2-fH, seul le domaine C-terminal du fHbp était détectable dans les études précédentes.
Des cristaux des mutants fHbp V2 et V3 ont été préparés comme suit : les expériences de cristallisation ont été menées à l'aide d'un robot de cristallisation Gryphon (Art Robbins Instruments) . Les données de diffraction des rayons X ont été collectées par les faisceaux de rayons X X06DA sur détecteur Pilatus 2M du SLS (Swiss Light Source, Paul Scherrer Institute, Villigen, Suisse) ou par les faisceaux de rayons X BM30A de l'installation européenne de rayonnement synchroton (ESRF) de Grenoble, France. Toutes les données de diffraction ont été traitées avec iMosflm, mises à l'échelle avec Aimless et les manipulations cristallographiques ont été mises en œuvre à l'aide du logiciel CCP4
.
Les mutations de stabilisation potentialisent la détermination de la structure du domaine N-terminal de var.2 et la structure par rayons X du fHbp var.3 S58V a été dédoublée en l'absence de fH. fHbp var.2 et var.3 sont caractérisés par un repliement moins stable comparativement à var.l. Compte tenu de cette observation, la structure complète de fHbp var2 et var3 a été difficile à déterminer. La stabilisation de la protéine se traduit par la conservation à la fois de la structure et de la fonctionnalité, couplée à l'établissement d'un meilleur équilibre thermodynamique avec le (micro)environnement. Par conséquent, la stabilisation de la protéine permet souvent d'obtenir des cristaux se prêtant à la détermination de la structure. Les substitutions S58V et L149R stabilisées ont permis la détermination de la structure cristalline complète de fHbp var.3 et le dédoublement du segment 81-254 du fhbp var.2. En introduisant des mutations stabilisantes, la structure quasi complèe du domaine N- terminal a été obtenue en l'absence de fH (Figure 7).
Exemple 5 : Analyse par résonance plasmonique de surface (SPR)
La SPR a été utilisée pour analyser la liaison de protéines chimériques 231 à des protéines fH. Toutes les expériences SPR ont été réalisées sur un Biacore T200 à 25°C (GE Healthcare). Brièvement, un biodétecteur fonctionnalisé au dextrane carboxyméthylé (CM-5 ; GE Healthcare) a été préparé sur lequel des densités similaires (~400-500 unités de réponse (RUs)) de protéines 231 ont été immobilisées par couplage amine. Les protéines immobilisées étaient : -231 wt (SEQ ID NO : 18) purification MenB 547 (0,26 mg/ml) immobilisée sur cellule d'écoulement 2 -231 S, comprenant R41S, S58V et L149 pour à la fois v2 et v3, (SEQ ID NO : 29) purification MenB 532 (0,68 mg/ml) immobilisée sur cellule d'écoulement 3 -231 SNB, comprenant R41S, S58V et L149 pour à la fois v2 et v3, E252A et E255A (SEQ ID NO : 27) purification MenB 512 (0,78 mg/ml) immobilisée sur cellule d'écoulement 4
Ces protéines ont été diluées à 5 ug/ml dans de l'acétate pH 5,5 et un protocole de couplage amine a été suivi pour atteindre la densité cible. La cellule d'écoulement 1 a été préparée comme les autres mais aucune protéine n'a été utilisée. Elle a ensuite été utilisée comme cellule de référence et le signal obtenu a été retranché du signal provenant des autres cellules d'écoulement. Le tampon de migration contenait 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,05 % (vol/vol) de tensioactif P20, pH 7,4 (HBS-P-GE-Healthcare) . Puis les protéines fH ont été injectées en plage de cinq injections ayant une concentration croissante d'analyte dans des dilutions de 2 fois (62,5 nM à 1 DM) pour les expériences de liaison. Les constructions fH suivantes ont été testées : facteur H pleine longueur (Calbiochem) et facteur H comprenant uniquement les domaines 6-7 (Schneider et al., Nature 458, 890-893) fourni par C. Tang.
Après chaque injection, les surfaces ont été régénérées par une injection de 20 secondes de 10 mM glycine pH 1,7. Une injection à blanc uniquement constituée par le tampon a été retranchée de chaque courbe, et les sensorgrammes de référence ont été retranchés des sensorgrammes expérimentaux pour obtenir les courbes représentant la liaison spécifique. Les données illustrées représentent deux expériences indépendantes. Les données SPR ont été analysées à l'aide du logiciel d'évaluation Biacore T200 (GE Healthcare). Les sensorgrammes obtenus ont été ajustés à l'aide du modèle de liaison 1:1 de Langmuir, comportant un terme pour tenir compte d'un transfert de masse potentiel, et obtenir les constantes cinétiques kon et koff individuelles ; les valeurs individuelles ont ensuite été combinées pour dériver les valeurs KD moyennées individuelles (Kd = K0ff/K0n) rapportées. Une analyse à l'état d'équilibre a également été utilisée pour obtenir les constantes de dissociation thermodynamiques (KD) à pH 7,4. Les résultats du titrage avec les injection des domaines 6-7 du fH sont indiqués ci-dessous :
D'après les tests de liaison, une forte réduction d'au moins 90 % de la liaison à fH a été observée pour la protéine 231 S comparée à 231 wt et d'au moins 98 % pour la protéine 231 SNB comparée à 231 wt.
Les résultats du titrage avec le fH pleine longueur sont indiquées ci-dessous :_ ____ _
D'après les tests de liaison, une forte réduction d'au moins 90 % de la liaison à fH a été observée pour la protéine 231 S comparée à 231 wt et de 98 % pour la protéine 231 SNB comparée à 231 wt.
On comprendra que l'invention n'est décrite ci-dessus que par le biais d'exemples et que des modifications peuvent être apportées tout en restant dans la portée et l'esprit de 1'invention.
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Claims (18)

  1. REVENDICATIONS
    1. Polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 80 % avec SEQ ID NO : 5, dans lequel (a) la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 5 au niveau des résidus 123 et 240 par rapport à SEQ ID NO : 5 ; (b) le polypeptide peut, après administration à un sujet humain, susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 4 ; (c) le polypeptide a une stabilité plus élevée qu'un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 4 ; et (d) le polypeptide a une plus basse affinité pour le fH humain qu'un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 4.
  2. 2. Polypeptide selon la revendication 1, dans lequel la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 5 également au niveau du résidu 32 par rapport à SEQ ID NO : 5 ; par exemple, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 47.
  3. 3. Polypeptide selon la revendication 2, portant des substitutions S32V, L123R, et E240A par rapport à SEQ ID NO : 5, p. ex. SEQ ID NO : 50.
  4. 4. Polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 80 % avec SEQ ID NO : 17, dans léquel (a) la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 17 au niveau des résidus 126 et 243 par rapport à SEQ ID NO : 17 ; (b) le polypeptide peut, après administration à un sujet humain, susciter la production d'anticorps capables de reconnaître un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 40 ; (c) le polypeptide a une stabilité plus élevée qu'un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 40 ; et (e) le polypeptide a une plus basse affinité pour le fH humain qu'un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 40.
  5. 5. Polypeptide selon la revendication 4, dans lequel la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 17 également au niveau du résidu 32 par rapport à SEQ ID NO : 17 ; par exemple, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 48.
  6. 6. Polypeptide selon la revendication 4 ou la revendication 5, portant des substitutions S32V, L126R, et E243A par rapport à SEQ ID NO : 17, p. ex. SEQ ID NO : 51.
  7. 7. Polypeptide comprenant : une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 47, dans lequel par rapport à SEQ ID NO : 47, le résidu 123 n'est pas leucine et le résidu 240 n'est pas glutamate ; et dans lequel (i) comparé à SEQ ID NO : 4, le polypeptide a une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour fH ; et (ii) quand il est administré à un sujet humain, le polypeptide peut susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v2, ou : la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 47, modifiée à hauteur de 5 substitutions d'acides aminés individuelles, à condition que (i) le résidu 123 ne soit pas leucine, (ii) le résidu 240 ne soit glutamate, (iii) comparé à la séquence de type sauvage, p. ex. SEQ ID NO : 4, le polypeptide ait une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour fH, et (iv) quand il est administré à un sujet humain, le polypeptide puisse susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v2.
  8. 8. Polypeptide selon la revendication 7, dans lequel le résidu 32 par rapport à SEQ ID NO : 47 n'est pas sérine.
  9. 9. Polypeptide comprenant : une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 48, dans lequel par rapport à SEQ ID NO : 48, le résidu 126 n'est pas leucine et le résidu 243 n'est pas glutamate ; et dans lequel (i) comparé à SEQ ID NO : 40, le polypeptide a une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour fH ; et (ii) quand il est administré à un sujet humain, le polypeptide peut susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v3, ou : la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 48, modifiée à hauteur de 5 substitutions d'acides aminés individuelles, à condition que (i) le résidu 126 ne soit pas leucine, (ii) le résidu 243 ne soit glutamate, (iii) comparé à la séquence de type sauvage, p. ex. SEQ ID NO : 40, le polypeptide ait une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour fH, et (iv) quand il est administré à un sujet humain, le polypeptide puisse susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp v3.
  10. 10. Polypeptide selon la revendication 9, dans lequel le résidu 32 par rapport à SEQ ID NO : 48 n'est pas sérine.
  11. 11. Polypeptide de fusion comprenant : (i) un polypeptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 7, ou 8 ; et (ii) un polypeptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 4, 5, 6, 9, ou 10.
  12. 12. Polypeptide de fusion qui (a) peut, quand il est administré à un sujet humain, susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers à la fois un méningocoque qui exprime un fHbp v2 et un méningocoque qui exprime un fHbp v3 ; (b) a une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour le fH humain qu'un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 4 ; (c) a une stabilité plus élevée et une plus basse affinité pour le fH humain qu'un polypeptide constitué par SEQ ID NO : 40, dans lequel le polypeptide comprend : (I) une première séquence d'acides aminés choisie parmi : (a) une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins k % avec SEQ ID NO : 5, et/ou comprenant un fragment de SEQ ID NO : 5 ; dans lequel la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 5 au niveau des résidus L123 et E240 (et éventuellement au niveau de S32) par rapport à SEQ ID NO : 5 ; (b) une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins v % avec SEQ ID NO : 47, dans laquelle, par rapport à SEQ ID NO : 47, (i) le résidu 123 n'est pas leucine, (ii) le résidu 240 n'est pas glutamate, (iii) éventuellement le résidu 32 n'est pas sérine ; et la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 47 ou SEQ ID NO : 50, éventuellement modifiée à hauteur de 5 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, délétions et/ou insertions individuelles), dans laquelle (i) éventuellement le résidu 32 n'est pas sérine, (ii) le résidu 123 n'est pas leucine, et (iii) le résidu 240 n'est pas glutamate ; et (II) une seconde séquence d'acides aminés choisie parmi : une séquence d'acides aminés dans laquelle : (a) la séquence d'acides aminés présente une identité de séquence d'au moins j % avec SEQ ID NO : 17, et/ou comprend un fragment de SEQ ID NO : 17 ; dans laquelle (b) la séquence d'acides aminés diffère de SEQ ID NO : 17 au niveau des résidus L126 et E243 (et éventuellement au niveau de S32) par rapport à SEQ ID NO : 17 ; une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins w % avec SEQ ID NO : 48, dans laquelle (i) le résidu 126 n'est pas leucine, (ii) le résidu 243 n'est pas glutamate, et (iii) éventuellement le résidu 32 n'est pas sérine ; ou la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 48 ou SEQ ID NO : 51, éventuellement modifiée à hauteur de 5 changements d'acides aminés individuels (à savoir 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, délétions et/ou insertions individuelles), dans laquelle (i) le résidu 32 est un acide aminé quelconque, éventuellement différent de sérine, (ii) le résidu 126 n'est pas leucine, et (iii) le résidu 243 n'est pas glutamate.
  13. 13. Polypeptide de fusion selon la revendication 12, dans lequel soit (A) la première séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 47 (p. ex. SEQ · ID NO : 50) et la seconde séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 48 (p. ex. SEQ ID NO : 51), soit (B) la première séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 31 (p. ex. SEQ ID NO : 45) et la seconde séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 32 (p. ex. SEQ ID NO : 44).
  14. 14. Polypeptide de fusion selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, comprenant également une séquence fHbp vl, dans lequel le polypeptide peut, quand il est administré à un sujet humain, susciter une réponse en anticorps qui est bactéricide envers un méningocoque qui exprime un fHbp vl, un méningocoque qui exprime un fHbp v2, et un méningocoque qui exprime un fHbp v3 ; et dans lequel, éventuellement, la séquence fHbp vl contient une mutation qui lui confère une plus basse affinité pour le fH humain qu'un polypeptide méningococcique constitué par SEQ ID NO : 46, p. ex. dans lequel la séquence fHbp vl a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 49 ou 52.
  15. 15. Polypeptide de fusion selon la revendication 14, comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, ou SEQ ID NO : 30.
  16. 16. Composition immunogène comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un polypeptide choisi parmi les polypeptides selon les revendications 1 à 10 et les polypeptides de fusion selon les revendications 11 à 15.
  17. 17. Composition immunogène selon la revendication 16, comprenant en outre un adjuvant.
  18. 18. Méthode destinée à susciter une réponse en anticorps chez un sujet humain, comprenant l'administration au sujet humain d'une composition immunogène selon la revendication 16.
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