CN106755422B

CN106755422B - 一种与黄牛生长性状相关的meg3基因snp的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN106755422B
Application number: CN201611219653.4A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 李波; 刘梅; 白跃宇; 蓝贤勇; 黄永震; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: CN106755422A

Abstract

本发明公开了一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法及其应用，根据黄牛MEG3基因外显子区单核苷酸突变位点所在位置，采用PCR‑RFLP、Tetra‑primer ARMS‑PCR技术对黄牛个体进行分型，分型结果与生长数据关联分析。本发明提供的检测方法是在DNA水平上检测与黄牛生产性状密切相关的SNP标记，可用于中国黄牛品种生长性状标记辅助选择中，加快建立优良黄牛种群。

Description

一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种检测中国黄牛品种生长发育性状相关的MEG3基因SNP的方法与应用。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指因单个核苷酸的改变而导致基因组水平上的DNA序列多态性。1个SNP在基因组某个位点上，有单个核苷酸的改变，多数由两种情形呈现：一是单碱基的转换所致，即以一种嘧啶换成另一种嘧啶，或一种嘌呤替换为另一种嘌呤；另外一种情形是颠换，即嘌呤与嘧啶的交换。按照对生物遗传性状的作用，也可将SNP分为蛋白编码SNP和非蛋白编码SNP，其中蛋白编码SNP位于转录序列中，非蛋白编码SNP位于非转录序列。在蛋白编码SNP中，若不引起所编码氨基酸序列的改变，则称为同义蛋白编码SNP，反之称为非同义蛋白编码SNP，通常影响对应蛋白质的功能。

一般检测SNPs的方法有：PCR-RFLP法、Tetra-primer ARMS-PCR、PCR-SSCP法、直接测序法等。直接测序法简单、方便，通过直接检测不同个体的PCR扩增片段，发现SNPs位点，然而当SNPs多、样本大时，试验预算也会大，甚至测序有时错误，导致增加重复，进一步使成本增加。PCR-RFLP主要是通过限制性内切酶，特异性识别DNA的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即出现限制性片段的特异序列，然而，此法可能会在识别序列上受限，最好用来检测和发现微少SNPs。Tetra-primer ARMS-PCR技术，即四引物扩增受阻突变体系PCR，是一种在普通PCR基础上发展起来的并专门用于检测单核苷酸多态性的衍生技术。该技术是在扩增受阻突变体系基础上发展起来并综合了四引物PCR技术的优点，对单核苷酸突变检测具有快速、简便、可以区分等位基因型以及费用低廉等优点。但此方法同样不适合多位点SNP的同时检测。PCR-SSCP为单链构象多态性，是基于单链DNA构象差别的、点突变的检测办法。单碱基的差异、单链DNA序列迥异，即使片段一样长，其电泳时迁移的速率不同，二级结构构象也不同。该检测法存在的缺点是不能用于大规模地检测SNPs，因为当立体构象的变化无作用或作用微小时，聚丙烯酰胺凝胶电泳不能辨别。

分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

母系表达基因3(maternally expressed 3，MEG3)，是一种父本印记基因，又称Gtl2基因，长度约为58kb，位于牛的第21号染色体上，具有类mRNA结构，但是不具备编码蛋白的能力。目前已经证实MEG3属于长链非编码RNA，也是目前研究比较多，比较深入的长链非编码RNA。

MEG3在人类脑垂体中高表达，但是在***细胞诱导的垂体腺体肿瘤以及人类其他多种肿瘤细胞系中低表达或不表达，在肿瘤中表达MEG3使细胞生长受到抑制，而p53蛋白表达量上升，并且激活p53的一些下游靶基因。有研究表明，敲除MEG3基因的小鼠在出生前就会死亡并且伴有严重的肌肉发育缺陷。在畜禽研究中，已发现多个变异位点对生长性状产生显著影响，但是在中国黄牛中未见报道。因此，研究该基因SNP变异并将其与中国黄牛品种重要生长性状关联分析至关重要，可以为我国黄牛分子育种提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法及其应用，便于中国地方黄牛生长性状的早期标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明中与黄牛生长性状相关的SNP标记，是指定位于黄牛MEG3基因候选区域Chr21:AC_000178.1(67377727-67395997)的单核苷酸多态。具体地，所述的SNP标记位于牛MEG3基因(GenBank Accession No.AC_000178.1)的外显子区域内。

本发明用于检测上述与黄牛生长性状相关的SNP标记的试剂包括2×Taq PCRMaster Mix、限制性内切酶AvaI、琼脂糖、TBE、溴化乙锭核酸染料和去离子水。

本发明所述SNP标记可在早期分子标记辅助选择生长性状优秀的黄牛品种中应用。

(1)提取待测中国黄牛3个品种(夏南牛、皮南牛和秦川牛)的基因组DNA；

(2)以待测3个黄牛品种基因组DNA池(每个品种(群体)选择50头个体混合)为模版，利用表2中的引物对进行PCR扩增，扩增产物进行测序。

(3)将测序结果与NCBI提供的MEG3基因序列进行比对，确定两个SNP(SNP1和SNP2、)位点；基于PCR-RFLP，用表2-1中的引物对分别对SNP1位点进行扩增、酶切以及琼脂糖凝胶电泳分型；基于Tetra-primer ARMS-PCR，用表2-2中的引物对对SNP2 位点进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分型。

步骤(2)中进行PCR所用的扩增体系为50μL，其中：50ng/μL模板DNA 2.5μL，10pmol/L的上、下游引物(F、R)各2.5μL，2×Taq PCR Master Mix 25μL，去离子水17.5μL。

步骤(3)中SNP1位点所用的扩增体系为10μL，其中：50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pmol/L的上、下游引物(F1、R1)各0.5μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，去离子水3.5μL。

步骤(3)中SNP2位点所用的扩增体系为10μL，其中：50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pmol/L的内引物上、下游引物(F2、R2)各0.4μL，10pmol/L的外引物上、下游引物(F3、R3)各0.2μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，去离子水3.3μL。

步骤(3)中SNP1位点所用的酶切体系为10μL，其中：PCR产物5μL，限制性内切酶0.3μL，限制性内切酶缓冲液Buffer 1μL，去离子水3.7μL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的中国黄牛MEG3基因单核苷酸变异检测方法，不受年龄的限制，可用于黄牛的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择。

(2)检测黄牛MEG3基因SNP变异的方法基于PCR-RFLP、Tetra-primer ARMS-PCR，准确可靠、操作简便、成本更为低廉。

(3)黄牛MEG3基因的SNP的检出，为黄牛生长发育的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

图1为黄牛MEG3基因两个位点测序图，框内所示为突变位点。

图2为本发明中黄牛MEG3基因SNP1位点酶切电泳结果图。

图3为本发明中黄牛MEG3基因SNP2位点PCR产物电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是限定。

本发明的实施例中，以牛MEG3基因候选区域Chr 21:67377727-67395997为候选位点：

(1)采用测序技术检测候选位点在黄牛群体中的SNP变异情况，利用PCR-RFLP和Tetra-primer ARMS-PCR技术对不同个体的不同SNP位点进行分型。

(2)利用SPSS 20.0软件将SNP类型与黄牛生长性状进行关联分析。

(3)根据SNP类型进行生长性状优异的黄牛个体的选育。

1.黄牛样本采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群，即陕西秦川牛(106)、河南泌阳县夏南牛(241)和河南新野县皮南牛(372)作为检测对象，具体采集样本(采集时间2015年8月)见表1。

表1.黄牛样本的采集

2.基因组DNA的分离、提取、纯化

参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3.目标序列的扩增及测序

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛MEG3基因序列(GenBank Accession No.AC_000178.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计测序PCR引物，其引物对序列信息如表2所示。

(1)提取待测中国黄牛3个品种(夏南牛、秦川牛、皮南牛)的基因组DNA；

(2)以待测3个黄牛品种的基因组DNA池(每个品种(群体)选择50头个体混合)为模版，利用表2中的引物对进行PCR扩增，扩增产物进行测序。

其中，PCR所用的扩增体系(50μL)：50ng/μL模板DNA 2.5μL，10pM的上、下游引物(F、R)各2.5μL，2×Taq PCR Master Mix 25μL，去离子水17.5μL。

其中，PCR扩增的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

测序结果如图1所示，以3个品种的中国黄牛(夏南牛、秦川牛、皮南牛)的血液基因组DNA池为模版，以E1-E5为引物，通过Town-down PCR技术扩增，将扩增产物进行测序，测序结果与NCBI提供的MEG3基因序列比对后确定2个SNP位点(SNP1：g.67384378C>T；SNP2：g.67395814G>T)。

表2.测序PCR引物设计信息

4.SNP位点分型的引物设计

SNP1、SNP2的位点扩增引物设计参见表2-1、表2-2：

表2-1.分型PCR引物设计信息

表2-2.分型PCR引物设计信息

5.SNP1位点PCR扩增及酶切消化(PCR-RFLP)

1)SNP1位点所用的扩增体系为10μL，其中：50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pmol/L的上、下游引物(F1、R1)各0.5μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，去离子水3.5μL。

2)PCR扩增的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

针对SNP1的扩增片段长度为218bp。

3)酶切反应消化体系(10μL)：PCR产物5μL，10×T Buffer 1.0μL，AvaI(10U/μL)0.3μL，去离子水3.7μL。

4)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化10～12h。

6.SNP2位点PCR扩增(Tetra-primer ARMS-PCR)

1)扩增体系(10μL)：50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pmol/L的内引物上下游引物(F2、R2)各0.4μL，10pmol/L的外引物上下游引物(F3、R3)各0.2μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，去离子水3.3μL。

针对SNP2的扩增片段如表3所示：

表3.SNP2的扩增片段

7.SNP1位点限制性内切酶消化PCR产物及SNP2位点PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作3.0％的琼脂糖凝胶(已经加入溴化乙锭核酸染料)，点样后120V电压电泳40min；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析多态性。

黄牛MEG3基因两个SNP位点的分型结果如图2、图3所示。

SNP1琼脂糖凝胶电泳结果出现三种基因型：CC基因型表现为218bp条带，CT基因型表现为218bp、147bp和71bp条带，TT基因型表现为147bp和71bp条带；71bp在琼脂糖电泳分析中不易观察到。

SNP2琼脂糖凝胶电泳结果出现三种基因型：GG基因型表现为237bp和161bp条带，GT基因型表现为237bp、161bp和132bp条带，TT基因型表现为237bp和132bp条带。

8.黄牛MEG3基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+……+N_Aan)/2N，式中P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种MEG3基因的不同SNP中，基因型频率如表4所示。

表4.MEG3基因单核苷酸多态信息

9.黄牛MEG3SNP位点基因效应的关联分析

MEG3基因两个SNP与黄牛生长性状的关联分析结果如表5、表6、表7所示。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值；再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS20.0软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+G_j+e_ijk，

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，G_j为第j个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijk为随机误差。

性状指标：体高、十字部高、体斜长、体长、胸围、胸宽、腰腹围、胸深、尻长、管围、坐骨端宽、腰角宽、体重

分析结果显示，MEG3的不同SNP基因型对不同的黄牛品种的部分生长发育有显著影响。其中在夏南牛中，SNP2与体斜长和管围呈显著相关；在皮南牛中，SNP1与十字部高、腰角宽显著相关；SNP2与体斜长和尻长呈极显著相关，与胸围呈显著相关；在秦川牛中，胸围与SNP1和SNP2呈显著相关，胸深与SNP2显著相关。说明MEG3基因的两个位点突变可以作为一个提高黄牛生长性状的候选分子遗传标记，可用于中国黄牛品种生长性状标记辅助选择中，加快建立优良黄牛种群。

表5.夏南牛MEG3基因SNP位点基因效应的关联分析

注：标有不同字母(a,b)表示差异显著

表6.皮南牛MEG3基因SNP位点基因效应的关联分析

注：标有不同字母(a,b)表示差异显著，标有不同字母(A,B)表示差异极显著。

表7.秦川牛MEG3基因SNP位点基因效应的关联分析

注：标有不同字母(a,b)表示差异显著。

核苷酸序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法及其应用

<160> 16

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gaggtgtcag tctttctcag tcc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

taacataggc acagaacata caa 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtctgacaca gtaaagggag aggag 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctaggagagg ttaagaagga ggagg 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

actcgctttg tcgtccttct aac 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcctgatgaa atcgtggtgt ctc 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cgtgagtgag tgtaaagagg agag 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gtagaatccc tttgccacag ag 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

catctctgtg gcaaagggat tctac 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

taccctctct cccatctgtt cactt 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cgtccttcta acgttctgcc tgt 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gcctgatgaa atcgtggtgt ctc 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aaggaggact atgtcaggtt attatgag 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cgtatttgga ttaatcctaa tgcttaga 28

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

aaaatggaaa gatgcaaatt aatatgtaa 29

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gttaaagtta aatctcatct ctggttcc 28

Claims

1.一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛MEG3基因片段，然后利用限制性内切酶AvaI对根据引物对P扩增得到的产物进行酶切，再对酶切后的产物片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶电泳结果鉴定黄牛MEG3基因上单核苷酸多态性位点SNP1的基因型；以待测黄牛全基因组DNA为模板，以内引物对I和外引物对U为引物，PCR扩增黄牛MEG3基因片段，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶电泳结果鉴定黄牛MEG3基因上单核苷酸多态性位点SNP2的基因型；所述单核苷酸多态性位点SNP1的凝胶电泳结果为：CC基因型表现为218bp条带，CT基因型表现为218bp、147bp和71bp条带，TT基因型表现为147bp和71bp条带；所述单核苷酸多态性位点SNP2的凝胶电泳结果为：GG基因型表现为237bp和161bp条带，GT基因型表现为237bp、161bp和132bp条带，TT基因型表现为237bp和132bp条带；

在夏南牛中，SNP2与体斜长和管围呈显著相关，基因型GG为提高夏南牛体斜长和管围的候选分子遗传标记；在皮南牛中，SNP1与十字部高、腰角宽显著相关，基因型TT为提高皮南牛十字部高和腰角宽的候选分子遗传标记，SNP2与体斜长和尻长呈极显著相关，与胸围呈显著相关，基因型GT为提高皮南牛体斜长、尻长和胸围的候选分子遗传标记；在秦川牛中，胸围与SNP1和SNP2呈显著相关，胸深与SNP2显著相关，杂合型TC和GT为提高秦川牛胸深和胸围的候选分子遗传标记；

所述的引物对P为：

上游引物F1：5’-CGTCCTTCTAACGTTCTGCCTGT-3’

下游引物R1：5’-GCCTGATGAAATCGTGGTGTCTC-3’；

所述的内引物对I为：

上游引物F2：5’-AAGGAGGACTATGTCAGGTTATTATGAG-3’

下游引物R2：5’-CGTATTTGGATTAATCCTAATGCTTAGA-3’；

所述的外引物对U为：

上游引物F3：5’-AAAATGGAAAGATGCAAATTAATATGTAA-3’

下游引物R3：5’-GTTAAAGTTAAATCTCATCTCTGGTTCC-3’。

2.根据权利要求1所述一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为10μL，其中：50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pmol/L的P对应的上、下游引物各0.5μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，以及去离子水3.5μL。

3.根据权利要求1所述一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为10μL，其中：50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pmol/L的内引物对I的上、下游引物各0.4μL，10pmol/L的外引物对U的上、下游引物各0.2μL，2×Taq PCRMaster Mix 5μL，以及去离子水3.3μL。

4.根据权利要求1所述一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法，其特征在于，所述酶切的反应体系为10μL，其中：PCR产物5μL，限制性内切酶0.3μL，限制性内切酶缓冲液1μL，以及去离子水3.7μL。

5.根据权利要求1所述一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增均采用以下反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求1所述一种与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度3％的琼脂糖凝胶。

7.一种如权利要求1所述的与黄牛生长性状相关的MEG3基因SNP的检测方法在黄牛分子标记辅助选择中的应用。