CN101818195A - 猪miR-27a前体侧翼序列SNP作为猪产仔数性状的遗传标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪遗传标记制备与应用技术领域，具体涉及一种猪miR-27a前体侧翼基因片段作为猪产仔数性状的遗传标记，其制备方法与应用。本发明获得了一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，它包含猪miR-27a前体侧翼基因片段，它是序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；在序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5序列的461bp处有一个C461-T461的碱基突变，该突变导致PCR-HpaII-RFLP多态性。设计了扩增miR-27a前体侧翼基因片段的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。本发明公开了该遗传标记的制备方法及其在猪标记辅助选择中的应用。

Description

猪miR-27a前体侧翼序列SNP作为猪产仔数性状的遗传标记及应用

技术领域

本发明涉及猪遗传标记制备技术领域，具体涉及一种猪miR-27a前体侧翼序列SNP作为猪产仔数性状相关的遗标记及应用，它包括猪miR-27基因前体序列突变位点的检测方法与应用。

背景技术

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内生的、长度约为22个核苷酸的小RNA，定位于RNA前体的3’端或者5’端。miRNAs大都是由具有茎环结构、约70nt大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。自1993年以来，研究人员在果蝇、褐家鼠等发现了共计9539多个miRNA(http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna，2009年8月8日)，功能涉及到组织生长、细胞凋亡、脂肪代谢、***发育、***发生等重要生命过程(Brennecke et al.2003.Bantam encodes a developmentally regulatedmicroRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila.Cell.113：25-26；Yu et al.2005.MicroRNA Mirn 122a reduces expression of the post-transcriptionally regulated germ celltransition protein 2(Tnp2)messenger RNA(mRNA)by mRNA cleavage.Biology of Reproduction.73：427-433)。如Mirn122a通过mRNA清除作用对TNP2基因进行了转录后调控，从而抑制了睾丸TNP2基因的表达(Yu et al.2005.MicroRNA Mirn122a reduces expression of the post-transcriptionally regulated germcell transition protein 2(Tnp2)messenger RNA(mRNA)by mRNA cleavage.Biology of Reproduction.73：427-433)。在Romanov×Texel羊F2群体中，2号染色体双肌臀MSTN(亦称GDF8)基因附近检测一个大效应肌肉重量的QTL，并在GDF8基因3’非翻译区检测G-A突变，而造成一个mir1和mir206靶位点，这两个miRNA在骨骼肌中高效表达，该突变抑制MSTN表达，因此有益于Texel绵羊肌细胞增殖，人和小鼠研究均发现该突变可以破坏miRNA潜在靶结合位点，从而导致表型差异(Clop et al.2006.A mutationcreating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep.NatureGenetics.38：813-818)。

SNP即单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism)。存在于pri-miRNAs、pre-miRNA或成熟miRNAs基因序列中的SNPs能够潜在地影响miRNAs调节的细胞功能网络。Duan等(2007.Singlenucleotide polymorphism associated with mature miR-125a alters the processing of pri-miRNA.HumanMolecular Genetics.16：1124-1131)通过对227个人miRNAs基因SNP搜索，共发现了323个SNPs，其中12个位于miRNA前体序列，仅在miR-125a成熟序列的第8位核苷酸上存在一个G/U突变的SNP位点；miR-125a成熟序列的突变减弱了对靶基因的翻译抑制效果并干扰pri-miRNA到pre-miRNA的加工过程)。这些结果表明，miRNA基因多态性影响了miRNA的合成及对靶位点抑制效应，因此具有重要的意义。

猪的繁殖性状的遗传力一般都较低，如窝产仔数的遗传力只有0.10，采用常规选择方法进展不显著。近年来分子标记辅助选择为繁殖性状的遗传改良提供了新的途径。而采用的分子标记主要有ESR、FSHβ等基因。Rothschild研究组(1994.A major gene for litter size in pigs.Proc 5th World Congr Genet Appl LivestProd，Guelph，Canada，1994，21：225-228)研究发现ESR位点B等位基因可以显著提高梅山猪合成系的产仔数1.15头/窝，且与初生重、背膘厚等性状不存在颉抗关系，目前该标记已被PIC等猪育种公司应用，但遗憾的是通过基因组扫描法并没有发现在ESR基因附近存在产仔数性状上的QTL，这可能与样本量大小有关或者由于ESR等位基因在该资源群中没有分离。另外分子标记筛选的例外一种方法是基因组扫描法获，但是由于获得具有繁殖成绩记录的资源家系建系难，时间长、成本高，因此对繁殖性状QTL定位的报道相对少。Rathje等(1997.Evidence for quantitative trait loci affecting ovulation rate in pigs.Journal ofAnimal Sci.ence.75：1486-1494)和Milan等(1998..Current status of QTL detection in Large White×Meishancrosses in France.Proc 6th World Congr Genet Appl Livest Prod，Armidale，Australia，26：414-417)报道了8号染色体上一个影响***率和单胎产仔数的大效应QTL，该QTL线性对应于绵羊高***率Booroola基因的区域。欧、美PIC公司的学者们还发现8号染色体上骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)处的微卫星标记与产仔数有关联(Southwood et al.Genetic markers for litter size in commercial lines of pigs.Proc 6th World CongrGenet ApplLivest Prod，Armidale，Australia.26：453-456)。

目前与猪重要经济性状有关的分子标记进行了一定的研究，但其遗传效应还不明确，能真正应用于育种生产的分子标记更是屈指可数。也没有深入到调控基因表达和基因遗传效应产生的根本原因。目前人、鼠中分离出了大量miRNA，但是猪miRNA信息量相对较少。因此从miRNA调控路径入手，研究miRNA基因前体侧翼序列多态性，并与产仔数性状进行关联分析，为产仔数性状改良提供新的标记。

发明内容

本发明的目的在于获得一种一种猪产仔数性状的遗传标记，克隆猪miR-27a前体基因侧翼序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪的标记辅助提供一种选择方法。

本发明的技术方案如下：

本发明获得了一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，它包含猪(大白猪、梅山猪)miR-27a前体侧翼基因片段，它是序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；通过上述序列进行Cluster W比对提供了位于该扩增片段内部的3处碱基变异，如图2所示。其中有一个C461-T461的碱基突变，导致PCR-HpaII-RFLP多态性。

一种扩增猪(大白猪、梅山猪)miR-27a前体侧翼基因片段的引物，它是序列表SEQ ID NO：6和SEQIDNO：7所示的核苷酸序列。

一种筛选与猪产仔数性状相关的遗传标记的方法，按照以下步骤：

利用miR-27a基因在大白猪和二花脸猪卵巢组织差异表达(见图1)，确定miR-27a基因为候选基因；从猪血液中提取基因组DNA，将人miR-27a前体序列(基因片段)为种子，在猪基因组中进行比对，以同源性大于80％序列片段以及前后300bp的片段为靶序列设计引物，该引物的序列如序列表SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，用该引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，进行序列测定，得到如序列表SEQID NO：1-5所示的基因片段；进而进行序列比对，筛查SNP，然后再利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的序列进行片段扩增，将PCR扩增片段进行HpaII酶切分型及检测。

大白猪、梅山猪包括猪miR-27a前体基因侧翼序列580bp的基因组核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。通过5头猪(其中中国地方猪血缘的猪大白猪2头，梅山猪3头)的上述序列进行ClustalW比对，提供了位于该580bp扩增片段内部的3处单核苷酸多态性(SNP)，其SNP位点如图2所示。

本发明提供了鉴定上述序列461bp处C/T变异的HpaII-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。其引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段HpaII酶切分型及检测。

进一步，本发明提供了利用HpaII-RFLP方法确定猪不同基因型个体与产仔数性状间的关联分析的应用。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1：是扩增的国外血缘猪种“大白猪1”的核苷酸序列；

序列表SEQ ID NO：2：是扩增的国外血缘猪种“大白猪2”的核苷酸序列；

序列表SEQ IDNO：3：是扩增的中国血缘猪种“梅山猪1”的核苷酸序列；

序列表SEQ IDNO：4：是扩增的中国血缘猪种“梅山猪2”的核苷酸序列；

序列表SEQ IDNO：5：是扩增的中国血缘猪种“梅山猪3”的核苷酸序列；

序列表SEQ ID NO：6：是制备SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5特异基因片段所用的正向引物，也是实施猪C/T变异HpaII-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物。

序列表SEQ ID NO：7：是制备SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5特异基因片段所用的反向引物，也是实施猪C/T变异HpaII-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。

图1是miR-27a基因在大白猪和二花脸猪卵巢组织差异表达。

图2：是中国地方猪血缘的五头猪miR-27a前体侧翼序列片段比对结果和SNP位点。

图3：是包括猪miR-27a前体侧翼序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.5％；图中：M泳道为DNA Marker DL2,000；泳道1-6为序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为580bp。

图4：是猪miR-27a基因侧翼序列片段HpaII-RFLP检测结果。琼脂糖胶浓度为2.0％；图中：泳道M为DL 2000Markers；1、3泳道为AB基因型，片段大小分别为319bp，261bp，141bp，120bp；2、4泳道为AA基因型，片段大小为319bp，261bp；5泳道为BB基因型，片段大小为319bp，141bp，120bp。

根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。

具体实施方式

实施例1：基因在国外猪血缘大白猪和中国地方猪血缘二花脸猪卵巢表达水平检测

根据miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)已经预测的miRNA成熟序列及Shi等(2005)检测植物miRNAs的设计方案，设计引物RTmiR27a：TTCACAGTGGCTAAGTTCCG。利用Poly(A)对大白猪(国外猪血缘)和二花脸猪(中国地方猪血缘)卵巢RNA进行加尾处理，利用引物Poly(T)adapter：GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG(T)12VN*进行反转录，最后利用RTmiR27a和Reverse primer：GCGAGCACAGAATTAATACGAC进行real-time PCR，以18S为对照，其引物序列18SFbc：TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG；18SRbc：TTCGGAACTGAGGCCATGAT。采用TOYOBO公司的SYBRGreen realtime PCR masterMix，用BioRad公司的实时定量PCR仪iQ^TM5Multicolor Real-Time PCR DetectionSystem进行PCR扩增。PCR反应总体系为25μL：0.5μM特异引物，12.5μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，300-500ng cDNA模板，加超纯水至终体积。PCR扩增程序：95℃预变性2min，94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s，74℃读板，共40个循环，每个基因做3个复管。分析大白猪和二花脸猪卵巢组织中差异表达情况。结果见图1。可以看出在二花脸和大白猪中是差异表达的(p＜0.05)。

实施例2：基因片段的获得及多态性检测方法的建立

根据国内外报道的miRNA分离的信息(http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna)，结合miRNA在相近物种的高度保守性特征，利用生物信息学及计算机技术在miRNA database中查询到miR-27a前体的在人和鼠中的序列信息，并根据前体序列为种子，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi？taxid＝9823中与猪基因组信息库HTGS和WGS中序列进行比对，搜索同源序列，将序列相似性大于80％确认为同源序列。以包括前体miRNA以及其5’和3’侧翼区200-400bp片段作为设计引物的靶序列，利用Primer2软件在线设计引物。引物序列如下：正向引物Mir-27a-snp-f：TGGTGGTCCAGCTTCTCTCT，Mir-27a-snp-r：TGAGCCAGTCTGCACAAATC。PCR扩增包含目的miRNA前体序列及其侧翼序列片段。PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.4μmol/L，3U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去离子水至总体积25μl；PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性50s、64℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经纯化(UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司)，克隆后，进行序列测定，序列测定由上海生工生物工程技术有限公司完成。不同猪种的PCR产物序列经ClustalW软件进行序列比对，序列间比对结果见图2。上述扩增片段大小为580bp，共存在3个碱基变异(等位碱基突变)，其中位于该片段的461bp处的C461-T461变异表现了大白猪和梅山猪种间差异，并引起了HpaII酶切位点(C↓CGG)多态性。

PCR扩增，取8.5μl PCR产物加入0.5μl(10U/μl)限制性内切酶和1μl 10×buffer(含10×BSA)，37℃HpaII酶切4h，取5μl酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。此扩增片段大小为580bp，在319bp和461bp处均有HpaII酶切位点，但是多态性位点位于该片段的461bp处，若461bp处的碱基为T，则不存在HpaII酶切位点，用HpaII酶切检测结果有319bp和261bp两条片段(A等位基因)，当该位点为C时，结果导致一个HpaII酶切位点的产生，酶切得到三个片段，长度分别为319bp，141bp和120bp(B等位基因)。

实施例3：本发明制备的遗传标记在不同猪群中的多态性分布

在5个群体猪，其中1个国外血缘猪群(大白猪)和1个中国地方血缘猪群(梅山猪)、3个合成系中检测猪miR-27a前体侧翼序列PCR-HpaII-RFLP多态性，检测结果如表1所示。在所检测的几个猪种中，国外学院猪大白猪群占优势的A等位基因的基因频率分别为0.919，而中国地方猪血缘猪梅山猪中A等位基因的基因频率仅为0.222(见表1)。

表1miR-27a前体侧翼序列PCR-HpaII-RFLP在不同猪种中的分布结果

表1说明：中国瘦肉猪新品系DIV系和湖北白猪优质系为国外猪与中国地方猪杂交选育的合成系。

实施例4：本发明制备的遗传标记与产仔数性状的关联分析

为了确定猪miR-27a PCR-HpaII-RFLP与猪表型差异是否相关，选择本申请人的农业部猪遗传育种重点实验室组建的120头中国瘦肉猪新品系DIV系(为中国全国推广的新品种)和湖北省农业科学院畜牧兽医研究所的142头大白猪群为试验材料，采用实施例2建立的HpaII-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪HpaII-RFLP不同基因型与猪产仔数性状的相关关系。采用SAS统计软件(SAS Institute Inc，Version 8.0)GLM程序进行单标记方差分析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ijk＝μ+G_i+Y_j+P_k+e_ijk

Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表AA、AB和BB基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA、AB和BB基因型)；Y_j、P_k为固定效应，分别为年度和胎次效应；e_ijk为残差效应。

在中国瘦肉猪新品系DIV系和大白猪中进行了不同基因型与产仔数性状间关联分析，统计分析结果总结于表2。

由表2可以看出，PCR-HpaII-RFLP基因型不同时，中国瘦肉猪新品系DIV系AA基因型头胎产仔数显著高于AB和BB高于BB基因型；在所有胎次中，AA基因型产仔数和产活仔数都显著高于AB和BB基因型。基因作用效应，在头胎中主要以加性效应作用方式为主，效应为1.170头/胎(p＜0.01)，而在所有胎次中以显性效应为主，效应为0.618头/胎(p＜0.05)。大白猪中各种基因型差异不显著。

表2猪miR-27a前体侧翼序列PCR-HpaII-RFLP基因型产仔数性状的统计分析表

注：以上数值为最小二乘均值±标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著；加性效应负值表示A等位基因降低性状表型值；^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01。

序列表

<110>华中农业大学

<120>猪miR-27a前体侧翼序列SNP作为猪产仔数性状的遗传标记及应用

<130>

<141>2009-10-26

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

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<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<400>7

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Claims (5)

1.一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，包含猪miR-27a前体侧翼基因片段，它是序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；在序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5序列的461bp处有一个C461-T461的碱基突变，该突变导致PCR-HpaII-RFLP多态性。

2.一种扩增猪miR-27a前体侧翼基因片段的引物，它是序列表SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的DNA序列。

3.一种筛选与猪与产仔数性状相关的遗传标记的方法，按照以下步骤：

利用miR-27a基因在大白猪和二花脸猪卵巢组织差异表达，确定miR-27a基因为候选基因；从猪血液中提取基因组DNA，将人miR-27a前体侧翼基因片段为种子，在猪基因组中进行比对，以同源性大于80％序列片段以及前后300bp的片段为靶序列设计引物，该引物的序列如序列表SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，用SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示引物在猪基因组DNA中PCR扩增、序列测定，得到如序列表SEQ ID NO：1-5所示的基因片段，通过序列比对，筛查SNP，再利用SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行HpaII酶切分型及检测。

4.权利要求1所述的遗传标记在猪标记辅助选择中的应用。

5.权利要求2所述的引物在猪标记辅助选择中的应用。

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