CN116516026B - 一种与肉鸡抗体滴度相关的分子标记、检测方法及应用 - Google Patents

一种与肉鸡抗体滴度相关的分子标记、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与肉鸡抗体滴度相关的分子标记、检测方法及应用，属于家禽遗传育种技术领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷酸序列的第145位碱基为SNP位点，该位点存在A/T突变，基因型为AA和AT。本发明还提供了检测分子标记的引物对和检测方法，实验结果显示，利用该检测方法能够高效灵敏快捷的检测分子标记的核苷酸序列，以筛选鉴定高抗体滴度肉鸡品种。本发明的实施能够有效筛选抗体滴度较高的肉鸡，为肉鸡的遗传育种提供了新的技术方案，适合在肉鸡养殖产业上大规模推广应用。

Description

一种与肉鸡抗体滴度相关的分子标记、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及家禽遗传育种技术领域，特别是涉及一种与肉鸡抗体滴度相关的分子标记、检测方法及应用。
背景技术
近年来，养禽业受到多种疫病的严重威胁，禽流感、新城疫、禽白血病等疫病不仅对全球养禽业造成巨大经济损失，甚至有的疫病会影响到人类的健康安全。影响鸡免疫力的因素有遗传、营养、环境等，而高温就是主要因素之一。夏季的持续高温会降低家禽的免疫力和抗病能力，给家禽集约化生产造成严重经济损失。热应激状态下，鸡对某些病原菌易感性增加，导致疾病的发生。近年来，畜禽抗病性能的遗传育种越来越受到重视，培育出抗病力强的品种成为了育种者的目标。因为前期人们为了提高生产性能而对主要的经济性状进行了高强度的选择，可能导致了抗病力的下降。
分子标记辅助选择(MAS)是一种常用的分子育种技术。MAS可以直接根据遗传物质的多态性进行相应的分析，如单核苷酸多态性(SNP)。分子标记辅助选择技术在其他家畜的育种中已有相当长的历史，与传统育种方法相比，MAS具有存在范围广、遗传稳定、直观准确等优点，目前并未大规模的应用于鸡的育种中。其原因一方面是对于鸡的经济性状的分子标记研究和挖掘较少，可应用于实际育种中选择重要经济性状的分子标记不足；另一方面是分子标记的检测往往成本较高，在世代间隔短、育种群体大的鸡育种中应用分子标记辅助选择技术的成本较常规育种方法更高。但随着更多低成本检测技术的发展以及分子标记的开发，分子标记辅助选择技术在鸡的育种中的应用成本显著降低，因此，进一步挖掘分子水平上与鸡重要经济性状相关的候选基因，通过对其多态性的研究并建立相关分子遗传标记，可以有效推动优质鸡的育种工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种与肉鸡抗体滴度相关的分子标记、检测方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用直接测序DMA基因序列，发现其与肉鸡抗体滴度相关的SNP位点，该位点能够特异性检测具有高抗体滴度的麻黄肉鸡，为鸡的标记辅助选择提供新的分子标记资源。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种与肉鸡抗体滴度相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷酸序列的第145位碱基为SNP位点，该位点存在A/T突变。
优选的是，所述SNP位点的基因型为AA和AT。
本发明还提供用于检测所述的分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。
本发明还提供一种检测肉鸡抗体滴度的试剂盒，所述试剂盒包括检测权利要求1所述的分子标记的试剂。
优选的是，所述试剂包括检测所述分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。
本发明还提供所述的分子标记、所述的引物对或者所述的试剂盒在筛选高抗体滴度肉鸡中的应用。
本发明还提供一种利用所述的分子标记筛选高抗体滴度肉鸡的方法，包括以下步骤：以待检测鸡的基因组DNA为模板，PCR扩增所述分子标记的核苷酸序列，经测序，分析序列SNP位点的基因型，保留具有高抗体滴度基因型的鸡个体。
优选的是，所述PCR扩增的引物为如SEQ ID NO.2-3所示的引物对。
优选的是，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μg，2×M5 HiPer plus Taq HiFiPCR mix 15μL，上下游引物各1μL，ddH2O补足至30μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸15s，34个循环；72℃延伸5min。
优选的是，根据所述分子标记的SNP位点的基因型，保留具有高抗体滴度的AA型鸡个体。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以麻黄肉鸡为研究对象，以H9亚型禽流感、新城疫(ND)抗体滴度为主要目标性状，选取前期筛选的影响鸡抗原递呈的关键基因DMA，进一步分析相关基因的变异对H9、ND抗体滴度性状的影响，经实验鉴定出与麻黄鸡免疫性状关联的SNP，本发明所选择的SNP位点是独特的，具有很高的广义遗传力，能准确的筛选出高抗体滴度肉鸡。本发明揭示基因变异与免疫性状的相关性，为麻黄鸡免疫应答性状的分子标记辅助选择奠定基础。
本发明筛选方法操作简便，速度快、成本低、准确度高。本发明的实施能够有效筛选高抗体滴度肉鸡，为肉鸡的遗传育种提供了新的技术方案，适合在肉鸡养殖产业上大规模推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为琼脂糖凝胶电泳结果，其中M为DNAMarker II的Marker(自上而下分别为1200、900、700、500、3000、100bp)；1为PCR产物；
图2为DMA基因多态位点不同基因型。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1SNP位点筛选
1、实验对象
选择SNP分型实验群体为麻黄肉鸡405只，由江丰实业股份有限公司提供，饲养在花都标准化养殖示范场的全封闭负压通风鸡舍，11、21日龄时均注射鸡新城疫(ND)和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗，31日龄时采血测定抗体滴度。
405只鸡的抗体滴度测定数据统计如表1所示。
表1用于筛选SNP位点的信息
注：某些个体抗体滴度为0，在统计的时候已筛选掉，导致总数没有405只。
2、候选基因的选择
根据前期研究选择与抗原递呈相关的候选基因DMA。
3、基因组DNA的提取
使用血液DNA提取试剂盒提取鸡基因组DNA，根据血液DNA提取说明书操作，提取血液样品的基因组DNA后，检测DNA样本浓度和OD值，将DNA浓度大于25ng/μL、OD260/OD280之比值在1.7-1.8之间的样品储存于-20℃中备用。
4、候选基因引物
根据NCBI中发表的鸡候选基因组序列，利用NCBI在线引物设计工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计引物扩增候选基因片段，从5’端开始扩增大小约928bp的基因片段，具体引物如表2所示：
表2候选基因PCR扩增引物
5、候选基因片段的PCR扩增及序列分析
PCR反应体系如下：DNA模板1μg，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 15μL，上下游引物各1μL，ddH2O补足至30μL。
PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸15s，34个循环；72℃延伸5min；12℃保存。
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判定结果：
用含EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产品进行检测，所述电泳条件为电压100V，时间为20min，在凝胶成像***中观察条带(约900bp，如图1所示)，并进行回收和纯化，最后进行测序，分析序列碱基，筛查候选SNP位点(部分测序峰图如图2所示)。
实施例2飞行时间质谱分析
采用北京六合华大基因科技有限公司的飞行时间质谱分型技术，在405只麻黄肉鸡群体中对通过直接测序得到的候选SNP位点进行基因分型，通过SPSS 26.0软件对SNP分型结果与抗体滴度值结合进行关联分析，鉴定出与麻黄肉鸡抗体滴度显著相关的SNP，如下表3所示。
表3SNP信息表
实施例3与抗体滴度显著相关SNP的基因型之间的差异分析
通过SPSS 26.0软件，对与抗体滴度显著相关的SNP位点的不同基因型与H9、ND抗体滴度的分析结果如表4。
表4与抗体滴度显著相关SNP的基因型的差异分析
注：基因型后括号内数字表示基因型的样本数；2种基因型间相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)，
上述结果可以看出，AA型的鸡个体H9抗体滴度和ND抗体滴度都明显高于AT型鸡个体。因此，可以通过DMA基因标记辅助选择，在肉鸡育种中选择抗体滴度较高的肉鸡，推动优质鸡的育种工作。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种与麻黄肉鸡抗体滴度相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷酸序列的第145位碱基为SNP位点，该位点存在A/T突变。
2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述SNP位点的基因型为AA和AT。
3.如权利要求1-2任一项所述的分子标记在筛选高抗体滴度肉鸡中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的分子标记筛选高抗体滴度麻黄肉鸡的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待检测鸡的基因组DNA为模板，PCR扩增所述分子标记的核苷酸序列，经测序，分析序列SNP位点的基因型，保留具有高抗体滴度基因型的鸡个体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物为如SEQ ID NO.2-3所示的引物对。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μg，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 15μL，上下游引物各1μL，ddH2O补足至30μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸15s，34个循环；72℃延伸5min。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，根据所述分子标记的SNP位点的基因型，保留具有高抗体滴度的AA型鸡个体。
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