CN105349673B

CN105349673B - 一种快速检测黄牛flii基因snp的rflp方法及其应用

Info

Publication number: CN105349673B
Application number: CN201510866870.1A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 刘梅; 刘敏; 蓝贤勇; 黄永震; 白跃宇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: CN105349673A

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法及其应用：分别以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛FLII基因内含子22区，用限制性内切酶Sac II消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FLII基因内含子22区单核苷酸多态性，并且该SNP位点与黄牛的生长发育性状显著相关，可作为DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的分子遗传标记，并应用于黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，以便快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测黄牛FLII基因第9461位的单核苷酸多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的变化而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、***和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。SNP属于第三代分子标记，具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点。由于SNP具有其它标记无法比拟的优点，所以它作为一种研究工具已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。

目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs，即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、操作繁琐、假阳性的缺点。

分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关的、并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

FLII(flightless I)属于凝溶胶蛋白超家族，是凝溶胶蛋白和Ras信号转导通路的搭桥蛋白，参与信号转导、细胞凋亡等调控，在脂肪分化、肿瘤发生和创伤愈合中发挥重要作用。最新研究发现，FLII可通过竞争性结合RXRα负调控脂肪分化的关键基因PPARγ，提示FLII可能调控牛的脂肪分化关键基因的功能发挥，影响牛的生长性状。

目前，关于黄牛FLII基因遗传变异的研究，国内外尚未见相关报道。由于FLII基因功能涉及脂肪代谢、信号转导、细胞凋亡等众多进程，因此，研究该基因遗传变异及其与黄牛重要生长性状进行关联分析至关重要，可以为黄牛分子育种提供理论依据，便于黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法，包括以下步骤：以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增所述FLII基因内含子22区的部分片段，再用限制性内切酶Sac II对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果鉴定黄牛FLII基因的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物F：5′-TCACGGAGCTCTTACTGACGC-3′，

下游引物R：5′-CCGTCCAGGTCCTCGTT-3′。

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

所述的SNP位点为C/A单核苷酸多态性，位于所述FLII基因的内含子22区，是所述FLII基因的第9461位核苷酸位点。

所述琼脂糖凝胶电泳检测后，电泳条带表现为：CC基因型表现为102bp和69bp，CA基因型表现为171bp、102bp和69bp，AA基因型表现为171bp。

上述快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法在黄牛分子育种中的应用，从而加快良种选育速度。

所述FLII基因的单核苷酸多态性与24月龄黄牛的生长性状显著相关，该单核苷酸多态性所在位点具有AA、AC以及CC 3种基因型，不同基因型的黄牛个体在体长、体高、胸围、十字部高和尻长上存在显著差异，并且，优势基因型为AA型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的黄牛FLII基因单核苷酸多态性检测方法，针对第9461位C到A的颠换突变，PCR扩增FLII基因内含子22区171bp的基因片段后，当由C突变成A时，不能形成Sac II识别位点，而没有发生突变时，则含有Sac II识别位点，可以被Sac II酶切，从而能够简单、快速、成本低、精确地检测其单核苷酸的多态性，可用于黄牛的分子育种。

附图说明

图1为黄牛FLII基因第9461位点测序图，框内所示为突变位点；

图2是本发明中黄牛FLII基因酶切电泳结果图；泳道1为MarkerⅠ，表现为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp；泳道2、8、11为CC基因型，表现为102bp和69bp；泳道1、3、4、5、6、7、9、10为CA基因型，表现为171bp、102bp和69bp；泳道12为AA基因型，表现为171bp。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

本发明利用PCR-RFLP方法检测黄牛FLII基因第9461位的单核苷酸多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明对4个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛重要生长性状进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。

1、黄牛样本采集

本发明具体以4个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛(62)，陕西秦川牛(165)，河南郏县红牛(210)，晋南牛(107)；

表1 黄牛样本的采集

2、基因组DNA的分离、提取、纯化

参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3、扩增引物设计

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛FLII基因序列(GenBank Accession No.AC_000176)为参考序列，利用Primer 5.0设计PCR引物扩增FLII基因内含子22区171bp片段，其引物对序列信息如下：

上游引物F：5′-TCACGGAGCTCTTACTGACGC-3′(SEQ.ID.NO.1)

下游引物R：5′-CCGTCCAGGTCCTCGTT-3′(SEQ.ID.NO.2)

4、PCR克隆黄牛FLII基因内含子区171bp片段

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA(黄牛血液基因组DNA)，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表2：

表2 PCR反应体系

Taq DNA聚合酶以及2×Buffer购自MBI,Fermentas。

PCR反应程序：

对4个黄牛品种共544个样本的基因组DNA分别用引物F、R进行PCR扩增，分别获得包含FLII基因内含子22区171bp片段的DNA序列。

5、Sac II酶切消化PCR扩增的FLII基因内含子22区171bp片段

1)酶切反应消化体系(10μL)：PCR产物5μL，10×T Buffer 1.0μL，0.1％BSA1.0μL，Sac II(10U/μL)0.3μL，ddH₂O 2.7μL。

2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化8～10h。

6、限制性内切酶消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作3.5％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料)，点样后120V电压电泳40min；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析多态性。

黄牛FLII基因第9461位的单核苷酸多态性为(参见图1以及图2)：CC基因型表现为102bp和69bp，CA基因型表现为171bp、102bp和69bp，AA基因型表现为171bp。

7、黄牛FLII基因第9461位SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+……+N_Aan)/2N，式中P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种FLII基因的第9461位SNP中，基因型频率及遗传学参数如表3所示。

表3 黄牛FLII基因第9461位SNP基因型频率及遗传学参数

χ² _0.05(df＝2)＝5.99.

aχ²(HWE)，哈代温伯格平衡χ²值。

8、黄牛FLII基因第9461位SNP位点基因效应的关联分析

表4 FLII基因第9461位SNP与四个黄牛品种生长性状的关联分析

基因型数据：Sac II识别的基因型(CC、AC和AA)。

生产数据：体长、体高、胸围、十字部高、尻长。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值；再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS19软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+G_j+e_ijk，

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，G_j为第j个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijk为随机误差。

关联分析结果表明(见表4)：黄牛FLII基因第9461位的SNP位点与24月龄黄牛的生长性状显著相关，3种基因型在体长、体高、胸围、十字部高和尻长上存在显著差异。并且，在四个品种中，优势基因型非常的一致，均为AA型，其可显著提高郏县红牛的体高，晋南牛的胸围，南阳牛的体高、十字部高以及秦川牛的体高、十字部高、体长、尻长等表型值，具有非常强的影响，说明第9461位的突变可以作为一个提高黄牛生长性状的候选分子遗传标记。

Claims

1.一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法，其特征在于：包括以下步骤：以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增所述FLII基因内含子22区的部分片段，再用限制性内切酶Sac II对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果检测黄牛FLII基因的SNP位点的基因型；该SNP位点作为分子标记，具有AA、AC以及CC3种基因型，不同基因型的黄牛个体在体长、体高、胸围、十字部高和尻长上存在显著差异，并且，优势基因型为AA型；

所述的引物对P为：

上游引物F：5′-TCACGGAGCTCTTACTGACGC-3′，

下游引物R：5′-CCGTCCAGGTCCTCGTT-3′。

2.如权利要求1所述的一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

4.如权利要求1所述的一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述的SNP位点为C/A单核苷酸多态性，位于所述FLII基因的内含子22区，是所述FLII基因的第9461位核苷酸位点。

5.如权利要求1所述的一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳检测后，电泳条带表现为：CC基因型表现为102bp和69bp，CA基因型表现为171bp、102bp和69bp，AA基因型表现为171bp。

6.如权利要求1-5中任意一项权利要求所述的方法在黄牛分子育种中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述FLII基因的单核苷酸多态性与24月龄黄牛的生长性状显著相关。