CN104975105A - 用于小鼠近交系鉴定的snp标记、引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于小鼠近交系鉴定的SNP标记、引物对及其应用。利用筛出的7个SNP位点：SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6和SNP7，设计7对引物，序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:14所示；每对引物都能够在同样条件下扩增小鼠近交系的基因组序列，序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:21所示。且每对引物扩增出的序列都含有一个特定的SNP标记。SNP标记和引物对的应用可达到快速初筛和降低检测成本的目的，从而促进近交系小鼠遗传质量监测标准化进程。

Description

用于小鼠近交系鉴定的SNP标记、引物对及其应用
技术领域
本发明涉及利用全基因组生物信息分析技术优势，并用PCR扩增及sanger测序验证SNP标记，并采用质谱技术和SNP标记对生产单位小鼠近交系进行检测鉴定的应用，特别涉及用于小鼠近交系鉴定的SNP标记、引物对及其应用。
背景技术
目前国内生物医药产业迅猛发展，实验动物作为生物医药产业的重要支撑条件及生命科学研究的重要材料，其质量直接关系到实验结果的可靠性和真实性。实验动物的遗传质量是实验动物质量好坏的重要因素之一，只有应用遗传特性稳定的实验动物才能保证生物医学研究结果具有可比性及实验结果的可靠性。因此，实验动物质量标准化，尤其遗传质量的标准化将直接影响生物医药的研发水平。但由于缺乏统一的、标准化的遗传质量控制标准，实验动物的遗传质量监控也渐渐成为其生产应用中较突出的问题。就目前情况而言，筛查到国内外广泛认可的有效遗传标记是实现实验动物遗传质量监测技术突破的有途径之一。
目前，我国实验动物遗传监测主要推行国家标准(GB 14923-2010)，主要采取形态学(毛色基因测试法)、数量遗传学(下颌骨测定法)、免疫标记基因检测法(皮肤移植法)以及生化标记基因检测法等。这些方法各有优势，而且在实验动物的繁殖生产和日常监测管理工作中仍有至关重要的使用价值，但随着实验动物科学和分子生物学的飞速发展，传统的检测方法包括国标力推的生化标记基因检测法、皮肤移植法和免疫学检测法已不能完全适应多种品系实验动物的遗传监测工作。
随着DNA指纹技术、随机扩增多态性(RAPD)、微卫星和单核苷酸多态性(SNP)等一系列分子遗传标记的发现，微卫星和SNP脱颖而出已经大量应用于实验动物的遗传检测。SNP标记是继生化标记和RAPD遗传标记之后的第三代DNA分子标记。具有以下显著的优点：1)相对于生化法和免疫学方法能够鉴别那些本身很难鉴别的一些同基因型和同源品系；2)SNP检测方法比生化法方便的重要优点是不需处死动物，所有基因纯度在其生产下一代之前就得到了保证；3)SNP检测法可达到高通量、低成本及自动化，能够满足大规模的检测需求。因此，实验动物SNP标记在国内拥有较大的研究潜质和应用价值。
2002年，国际小鼠基因组测序联盟完成了经典的实验室品系C57BL/6J(B6)的全测序。同年，Celera公司也完成了另外三个近交系的全序列草图。由于SNP与微卫星数量庞大，高通量的基因分型能降低成本，故著名的实验动物公司都已使用SNP进行遗传检测。对于遗传质量检测并没有统一的标准，其位点组合和数量是根据需要和各公司的实际情况决定的。国际上知名实验动物供应商，Jackson Laboratory(JAX)，提供2000个SNP评估芯片，并采用28个SNP位点对几十种小鼠近交系进行遗传检测。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种用于小鼠近交系鉴定的SNP标记。检测SNP位点多则成本高，并且国内常用小鼠品系大约10来种，因此，本发明旨在利用已有近交系小鼠SNP数据库筛出少数几个能分离鉴定国内常用小鼠近交系的SNP标记，以达到快速初筛和降低检测成本的目的。
本发明的另一目的在于提供用于小鼠近交系鉴定的引物对。提供的引物对共7对；且每对引物扩增出的序列都含有一个特定的SNP标记。引物的应用可达到快速初筛和降低检测成本的目的，从而促进近交系小鼠遗传质量监测标准化进程。
本发明的另一目的在于提供所述的SNP标记的应用。
本发明的再一目的在于提供所述的引物对的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明首先对NCBI小鼠近交系SNP数据库进行筛查，筛出7个SNP位点，并设计引物，用设计的7对引物PCR扩增129、C3H、BALB、C57BL、CBA、DBA、FVB和ICR这8个小鼠近交系的基因组序列，然后sanger测序，得到DNA片段序列，并验证7个SNP位点，最后采用质谱的方法对国内常用的小鼠近交系这7个位点进行检测，确定7个SNP的可应用性。
所述的7个SNP位点为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6和SNP7。
所述的SNP1表示该SNP位点位于SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列的第91位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基K(G/T)；
所述的SNP2表示该SNP位点位于SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的第196位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基M(A/C)；
所述的SNP3表示该SNP位点位于SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列的第112位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基R(A/G)；
所述的SNP4表示该SNP位点位于SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列的第294位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基Y(C/T)；
所述的SNP5表示该SNP位点位于SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列的第188位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基R(A/G)；
所述的SNP6表示该SNP位点位于SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列的第244位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基Y(C/T)；
所述的SNP7表示该SNP位点位于SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的第217位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基Y(C/T)；
所述的引物对共7对，序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：14所示。
所述的DNA片段，序列如SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：21所示。
所述的7个SNP位点可应用于国内常用小鼠近交系的鉴定。
所述的引物对可应用于国内常用小鼠近交系的鉴定。
所述的7个SNP位点在制备试剂盒或检测方法中的应用；所述试剂盒或检测方法的用途为小鼠近交系鉴定或物种鉴定。
所述的引物对在制备试剂盒或检测方法中的应用；所述试剂盒或检测方法的用途为小鼠近交系鉴定或物种鉴定。
所述的DNA片段在辅助进行小鼠近交系或物种鉴定中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用生物信息技术优势开发出少数几个能用于国内常用近交系小鼠鉴定SNP标记，SNP标记的应用可大大降低近交系小鼠鉴定的成本和简化操作，促进近交系小鼠遗传质量监测标准化和进程化。
(2)本发明提供的7对引物对，每对引物扩增出的序列都含有一个特定的SNP标记；引物的应用可达到快速初筛和降低检测成本的目的，从而促进近交系小鼠遗传质量监测标准化进程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、实验动物样本
小鼠近交系：129、C3H、BALB、C57BL、CBA、DBA、FVB、ICR。
2、动物组织来源：广东省实验动物监测所、暨南大学和南方医科大学等。
3、目标SNP的筛选
利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term＝mouse数据库结合相关文献报道，筛出7个SNP位点。详细见表1。
表1 SNP标记及在每个小鼠近交系中的基因型
SNP ID Chr SEQ ID 位置 129 C3H BALB/cJ C57BL/6 C57BL/10 CBA/C CBA/J DBA/1 FVB ICR
SNP1 7 NO:15 91 G G G T T G G G G G
SNP2 11 NO:16 196 A C C A C A A A A C
SNP3 15 NO:17 112 A A G G G A A A G G
SNP4 X NO:18 294 C T T T T T C C C T
SNP5 17 NO:19 188 A G A A A G G G G G
SNP6 3 NO:20 244 C C T T T C C C T C
SNP7 1 NO:21 217 C C T T T T T C C C
4、引物设计
目标SNP筛选完成后，截取SNP上下游各500bp的片段，利用引物设计软件Priemer 5.0进行引物设计。保证引物扩增片段含有目标SNP，引物长度在18～22bp之间，退火温度55℃。共设计7对引物，引物序列如表2，序列表中序列编号为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:14。所有引物设计完成后委托北京华大基因公司合成。
表2 引物序列信息
5、目标片段PCR扩增
用设计的7对引物扩增129、C3H、BALB、C57BL、CBA、DBA、FVB和ICR基因序列。
基因组DNA提取参照普博欣生物科技有限公司生产制造的动物基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)的说明书进行操作。以上合成的引物进行短暂离心，加入无菌去离子水充分溶解到浓度为10μM，室温静置30分钟，4℃保存。
以每个动物样本的基因组DNA作为模板进行PCR反应，PCR反应体系(20μL)如表3。
表3 PRC反应体系
名称 浓度 体积
基因组DNA 10ng/μL 5μL
上游引物 10μM 0.8μL
下游引物 10μM 0.8μL
PCR kit(2×) 10μL
ddH2O 3.4μL
混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为：
上述PCR反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
称取0.5g琼脂糖加到50mL TAE反应液中加热溶解，待温度降至60℃时，加入溴化乙锭类似物3μL混匀，倒入插有2mm梳子的电泳槽内，等待凝固后使用。每孔加5μL PCR产物，采用121V恒压，电泳15min后在紫外线透射仪下观察结果，目标条带全部单一明亮。
所有扩增成功的PCR产物以4℃保存，直接进行DNA测序，全部测序工作由北京华大基因公司测序部完成。
6、测序序列分析
6.1测序序列拼接
由于Sanger测序的序列起始端测序质量较低，准确性相对较差，采用正向引物和反向引物分别进行测序，根据测序峰图，序列相互补充，拼接成完整的测序序列。8个近交系通用的序列信息见序列表SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:21所示。
6.2PCR序列鉴定和SNP位点
把测序得到的序列与原基因组上序列比对，通过与原始序列的Identity(同源性)来确定用该引物PCR扩增得到的序列是否是目标序列，7对引物PCR产物测序结果与原始基因组序列比对同源性都在99％以上，序列全部很好的比对回对应的基因组序列，并且涵盖了目的SNP位点，见序列SEQ ID NO:15～SEQID NO:21。表明设计的引物确实可以准确的扩增出目标区域并涵盖目标SNP位点。
7、采用质谱方法对不同近交系的7个SNP位点进行分型
采用质谱法MassArray对广东省实验动物监测所、暨南大学和南方医科大学等单位采集的小鼠近交系129、C3H、BALB、C57BL、CBA、DBA、FVB、ICR进行7个SNP位点的分型，结果见表4。初步结果基本与预期一致，但也有少数样品不是预期结果。
表4 SNP标记在实际小鼠近交系中的基因型
SNP ID Chr SEQ ID 位置 129 C3H BALB C57BL CBA DBA FVB ICR
SNP1 7 NO:15 91 G G G TG G G G G
SNP2 11 NO:16 196 A C C A A A A C(CA)
SNP3 15 NO:17 112 A A G G A A G G
SNP4 X NO:18 294 C T T T C C C T
SNP5 17 NO:19 188 A G A A G G G G
SNP6 3 NO:20 244 C C T T C C T C
SNP7 1 NO:21 217 C C T T或C T C C C或T或CT
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于小鼠近交系鉴定的SNP标记，其特征在于包括7个SNP位点，为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6和SNP7；
所述的SNP1表示该SNP位点位于SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列的第91位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基K；
所述的SNP2表示该SNP位点位于SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的第196位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基M；
所述的SNP3表示该SNP位点位于SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列的第112位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基R；
所述的SNP4表示该SNP位点位于SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列的第294位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基Y；
所述的SNP5表示该SNP位点位于SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列的第188位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基R；
所述的SNP6表示该SNP位点位于SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列的第244位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基Y；
所述的SNP7表示该SNP位点位于SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的第217位，并且该位置处核苷酸序列为简并碱基Y。
2.根据权利要求1所述的用于小鼠近交系鉴定的SNP标记，其特征在于：所述的小鼠近交系为129、C3H、BALB、C57BL、CBA、DBA、FVB和ICR中的至少一种。
3.一种用于小鼠近交系鉴定的引物对，其特征在于：包括引物对SNP1F/R、引物对SNP2F/R、引物对SNP3F/R、引物对SNP4F/R、引物对SNP5F/R、引物对SNP6F/R和引物对SNP7F/R中的至少一对；
引物对SNP1F/R的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
引物对SNP2F/R的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
引物对SNP3F/R的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
引物对SNP4F/R的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
引物对SNP5F/R的序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
引物对SNP6F/R的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
引物对SNP7F/R的序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。
4.根据权利要求3所述的用于小鼠近交系鉴定的引物对，其特征在于：所述的小鼠近交系为129、C3H、BALB、C57BL、CBA、DBA、FVB和ICR中的至少一种。
5.利用权利要求3或4所述的引物对扩增得到的DNA序列，其特征在于：所述的DNA序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:21所示。
6.权利要求1或2所述的SNP标记在小鼠近交系的鉴定中的应用。
7.权利要求1或2所述的SNP标记在制备试剂盒或检测方法中的应用，其特征在于：所述的试剂盒或检测方法的用途为小鼠近交系鉴定或物种鉴定。
8.权利要求3或4所述的引物对在小鼠近交系的鉴定中的应用。
9.权利要求3或4所述的引物对在制备试剂盒或检测方法中的应用，其特征在于：所述的试剂盒或检测方法的用途为小鼠近交系鉴定或物种鉴定。
10.权利要求5所述的DNA序列在辅助进行小鼠近交系或物种鉴定中的应用。
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