CN106755287A - 一种微生物相对含量检测计数方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种微生物相对含量检测计数方法。该方法包括：将氧化还原指示剂加入培养基，得到指示培养基；该氧化还原指示剂的变色范围包括3种或3种以上肉眼可轻易辨识的颜色；将待测样本进行稀释，设置多个稀释度，每个稀释度设置多个平行，将稀释后的待测样本采用指示培养基进行培养；培养期间和/或培养结束后读取指示培养基的颜色或吸光度；根据指示培养基的颜色变化程度或吸光度变化值，得到待测样本中微生物的相对含量。本发明方法与常规的MPN法相比，对于不同样品微生物相对含量的检测更加精确和准确，不同样品微生物相对含量的可对比性也更高，所获得的数据连续性较好，适用范围广。

Description

一种微生物相对含量检测计数方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种微生物相对含量检测计数方法。
背景技术
油气藏中的轻烃气体在油气藏压力的驱动下以微泡上浮形式或连续气相流形式沿复杂的微裂隙垂直地向上运移。轻烃运移进入表层沉积物过程中，一部分成为土壤中专性烃氧化菌的食物(碳源)而使烃氧化菌异常发育；另一部分则被黏土矿物吸附和次生碳酸盐胶结物所包裹。因此，在油藏上方表层土壤中形成了与下伏油气藏的丰度与压力有正相关系的微生物异常和吸附烃异常。采用微生物学方法(MOST)和地球化学方法(SSG)分别检测微生物异常和吸附烃异常就可以预测下伏地层中是否存在油气藏，以及油气藏的性质。MOST技术既相似于但又有别于以往的油气化探，它的主要监测目标是勘探靶区上方的土壤或沉积物中专属烃氧化菌的丰度(简称为MV值)，热成因烃是这种氧化烃菌的唯一碳源，因此，它的丰度与隐伏于探区下方油气圈闭中的烃类浓度和压力密切相关，指标体系具有地质解释的唯一性。对于烃氧化菌的丰度常采用最大可能数法进行检测。
最大可能数法(Most probable number，MPN)，该法又称稀释培养计数，是目前微生物检测领域常用的方法之一，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群(如烃氧化、氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等)的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群(如大肠菌群)的数量。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量(如lm1)的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体地说，菌液经多次10倍梯度稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3～5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度(即临界级数)中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
MPN法有一定的局限性，比如相同的MPN值可能有不同的含义，MPN值也是非连续的，MPN值的准确度随最大概率(Pmax)的减小而减小等。在读数的时候，标准的MPN法只记录培养结果是有菌生长的阳性，或者无菌生长的阴性，这种操作会降低MPN法的精确度。例如对于MPN法中某个稀释度的某个平行样，其培养出现了阳性，但是其阳性的程度却存在差异，其可能是大量微生物生长造成的阳性，也可能是少量微生物生长造成的阳性。例如两个样品，使用3个连续稀释度，每组3个管，当其阳性管数都为“3-3-2”时，对应的MPN值均为1100，但是这两个样品的阳性管可能有不同的反应程度，其真实的微生物量可能有差异，但是常规的MPN法区分不出这样的差异。
另外，在读数的时候，标准的MPN法只在培养到一定时间时进行一次读数，并记录阳性反应的个数，并查询MPN表得出结果。一次读数只能记录一定培养时间时培养基的阳性反应，其精确度不高。例如两个微生物数量有差异的样品进行液体培养，微生物数量多的样品在6小时的时候呈现阳性反应，微生物数量少的样品在12小时的时候呈现阳性反应，如果在12小时的时候读数，这两个样品都被记为阳性，实际上其微生物数量是有差别的。
因此，需要提供一种结果准确度更高的微生物相对含量检测计数方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种微生物相对含量检测计数方法。该微生物相对含量检测计数方法与常规的MPN法相比，对于不同样品微生物相对含量的检测更加精确和准确，不同样品微生物相对含量的可对比性也更高，适用范围广。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种微生物相对含量检测计数方法，包括如下步骤：
步骤1：将氧化还原指示剂加入培养基，得到指示培养基；该氧化还原指示剂的变色范围包括3种或3种以上肉眼可轻易辨识的颜色；
步骤2：将待测样本进行稀释，设置3～15个稀释度，每个稀释度设置3～15个平行，将稀释后的待测样本采用指示培养基进行培养；
步骤3：培养期间和/或培养结束后读取指示培养基的颜色或吸光度；
步骤4：根据指示培养基的颜色变化程度或吸光度变化值，得到待测样本中微生物的相对含量。
作为优选，氧化还原指示剂为刃天青或甲基蓝。
在本发明提供的实施例中，氧化还原指示剂为刃天青。
在本发明提供的一优选方案中，步骤3为培养结束后读取指示培养基的颜色，步骤4中根据指示培养基的颜色变化程度，得到待测样本中微生物的相对含量为：
根据指示培养基的颜色与微生物含量之间的相关性，对指示培养基的颜色进行读数，读数的数字大小与微生物含量呈正相关；
采用如下公式获得待测样本中微生物的相对含量：
Z＝(X1-1+X1-2+···+X1-n)×Y1+(X2-1+X2-2+···+X2-n)×Y2+···+(Xm-1+Xm-2+···+Xm-n)×Ym
其中，Z为待测样本中微生物的相对含量；m为m号稀释度，3≤m≤15；n为n号平行样，3≤n≤15；X为读数值，X≥0；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的读数值；Y代表稀释度系数，Y＞0；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥···Y2≥Y1。
在本发明中，读数的数字大小与微生物含量呈正相关，例如：微生物不生长时，指示剂本身的颜色使用较小的数字，微生物大量生长指示剂完全变化之后的颜色使用较大的数字。例如：采用刃天青指示剂时，根据微生物含量由无到有，指示剂的颜色变化范围为蓝色-紫色-洋红色-红色-无色，读数分别为0、1、2、3、4。
在本发明提供的另一优选方案中，步骤3为培养期间和培养结束后读取指示培养基的颜色，培养期间和培养结束后读取指示培养基的颜色的次数至少为2次。培养期间读取指示培养基的颜色的次数至少为1次。
作为优选，培养期间和培养结束后每次读数时间间隔均匀或不均匀分配。对于读数时间间隔均匀分配的方案，读数时间间隔为培养总天数与读数总次数的比。对于读数时间间隔不均匀分配的方案，读数时间间隔可根据培养总天数和读数总次数进行适当调整。
在该优选方案中，步骤4中根据指示培养基的颜色变化程度，得到待测样本中微生物的相对含量为：
根据指示培养基的颜色与微生物含量之间的相关性，将指示培养基的颜色记录为数字，数字的大小与微生物含量呈正相关；
采用如下公式获得待测样本培养期间或培养结束后一次读数的最终计数数值：
Zi＝(X1-1+X1-2+···+X1-n)×Y1+(X2-1+X2-2+···+X2-n)×Y2+···+(Xm-1+Xm-2+···+Xm-n)×Ym
其中，Zi为一次读数的最终计数数值；i为培养期间和培养结束后读取指示培养基的颜色的次数，i≥2；m为m号稀释度，3≤m≤15；n为n号平行样，3≤n≤15；X为读数值，X≥0；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的读数值；Y代表稀释度系数，Y＞0；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥···Y2≥Y1；
采用如下公式获得待测样本中微生物的相对含量：
Z＝Z1+···+Zi
其中，Z为待测样本中微生物的相对含量；Zi为一次读数的最终计数数值；i为培养期间和培养结束后读取指示培养基的颜色的次数，i≥2。
在本发明提供的另一优选方案中，步骤3为培养结束后读取指示培养基的吸光度，步骤4中根据指示培养基的吸光度变化值，得到待测样本中微生物的相对含量为：
根据指示培养基的吸光度变化值，采用如下公式获得待测样本中微生物的相对含量：
Z＝(X1-1+X1-2+···+X1-n)×Y1+(X2-1+X2-2+···+X2-n)×Y2+···+(Xm-1+Xm-2+···+Xm-n)×Ym
其中，Z为待测样本中微生物的相对含量；m为m号稀释度，3≤m≤15；n为n号平行样，3≤n≤15；X为读取指示培养基的吸光度变化值；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的吸光度变化值；Y代表稀释度系数，Y＞0；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥···Y2≥Y1。
在本发明提供的另一优选方案中，步骤3为培养期间和培养结束后读取指示培养基的吸光度，培养期间和培养结束后读取指示培养基的吸光度的次数至少为2次。培养期间读取指示培养基的吸光度的次数至少为1次。
在该优选方案中，步骤4中根据指示培养基的吸光度变化值，得到待测样本中微生物的相对含量为：
根据指示培养基的吸光度变化值，采用如下公式获得待测样本一次读数的最终计数数值：
Zi＝(X1-1+X1-2+···+X1-n)×Y1+(X2-1+X2-2+···+X2-n)×Y2+···+(Xm-1+Xm-2+···+Xm-n)×Ym
其中，Zi为一次读数的最终计数数值；i为培养期间和培养结束后读取指示培养基的吸光度的次数，i≥2；m为m号稀释度，3≤m≤15；n为n号平行样，3≤n≤15；X为吸光度变化值；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的吸光度变化值；Y代表稀释度系数，Y＞0；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥···Y2≥Y1；
采用如下公式获得待测样本中微生物的相对含量：
Z＝Z1+···+Zi
其中，Z为待测样本中微生物的相对含量；Zi为一次读数的最终计数数值；i为培养期间和培养结束后读取指示培养基的吸光度的次数，i≥2。
作为优选，吸光度的检测波长为氧化还原指示剂的最大吸收光波长。
本发明提供了一种微生物相对含量检测计数方法。该方法包括：将氧化还原指示剂加入培养基，得到指示培养基；该氧化还原指示剂的变色范围包括3种或3种以上肉眼可轻易辨识的颜色；将待测样本进行稀释，设置3～15个稀释度，每个稀释度设置3～15个平行，将稀释后的待测样本采用指示培养基进行培养；培养期间和/或培养结束后读取指示培养基的颜色或吸光度；根据指示培养基的颜色变化程度或吸光度变化值，得到待测样本中微生物的相对含量。本发明具有如下有益效果：
1、本发明中将变色范围包括3种或3种以上肉眼可轻易辨识的颜色的氧化还原指示剂应用于MPN法，可实现对阳性反应的程度进行区分，可有效改善MPN法所获得数据之间的可比性；
本发明在培养期进行多次读数可进一步改善MPN法所获得数据之间的可比性；
可见本发明提供的微生物相对含量检测计数方法与常规的MPN法相比，对于不同样品微生物相对含量的检测更加精确和准确，不同样品微生物相对含量的可对比性也更高，所获得的数据连续性较好，适用范围广。
2、本发明通过将本发明方法、MPN法分别与镜检计数法进行相关性分析，结果显示，本发明方法与镜检计数法的相关性更强，结果与实际更加相符。
附图说明
图1示实施例1中某海域圈闭采用标准MPN法对于烃氧化菌相对含量检测结果；
图2示实施例1中某海域圈闭采用本发明方法对于烃氧化菌相对含量检测结果；
图3示实施例2中某海域油气藏上方海洋沉积物采用标准MPN法对于烃氧化菌相对含量检测结果；
图4示实施例2中某海域油气藏上方海洋沉积物采用本发明方法对于烃氧化菌相对含量检测结果；
图5示实施例3中本发明方法及MPN法对不动杆菌的计数结果与镜检计数结果的对比图；
图6示实施例4中某海域油气藏上方海洋沉积物采用标准MPN法对于烃氧化菌相对含量检测结果；
图7示实施例4中某海域油气藏上方海洋沉积物采用本发明方法对于烃氧化菌相对含量检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种微生物相对含量检测计数方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种用于微生物相对含量检测计数的方法，包含以下步骤：
1)选择一种变色范围显著的微生物生长指示剂，并在培养基中加入该指示剂；
2)按照常规MPN法的操作，按照需要，设置多个稀释度，每个稀释度设置多个平行并进行培养；
3)培养一段时间后，进行读数，读数时记录微生物生长指示剂的变化程度；
4)根据微生物的生长时间情况，设置多个读数时间点，进行多次读数；
5)利用每次读数获得的指示剂的变化程度的数据和多次读数的结果，计算出样品中微生物的可能含量。
其中，步骤3)和步骤4)并不必须同时操作，只操作3)或者只操作4)也可以达到提高MPN法精度的效果，结合起来效果更好。
作为优选，步骤1)中变色范围显著的微生物生长指示剂包括刃天青等。
作为优选，步骤3)中微生物生长指示剂的变化程度的读取采用肉眼观察法或者使用分光光度计进行吸光度测量。
作为优选，按照肉眼可轻易辨识颜色差异的标准，把指示剂变色范围分成3种及以上的颜色，读数时记录下指示剂的颜色，并使用由小到大的数字来代替从指示剂本身颜色到完全变色之间不同的指示剂颜色。微生物不生长时，指示剂本身的颜色使用较小的数字，微生物大量生长指示剂完全变化之后的颜色使用较大的数字。
作为优选，使用指示剂的最大吸收光波长值作为测量的光线波长，使用分光光度计测量培养开始时培养液的吸光度，培养一段时间后，对培养液的吸光度进行测量，并记录下吸光度的变化值。
作为优选，步骤4)多个读数时间点为2及其以上个读数时间点。
作为优选，步骤5)计算的方法是，设置每个稀释度的系数，小的稀释度所设置的系数≤大的稀释度所设置的系数。对于肉眼观察法，将权利要求4中所述某一稀释度每个平行样所读取的数字均乘以该稀释度所对应的系数并相加，可以得到该稀释度的结果。将每个稀释度的结果相加，可以得到该读数点的结果。将所有读数点该样品的结果相加，可以得到该样品的最终结果。
作为优选，步骤5)计算的方法是，设置每个稀释度的系数，小的稀释度所设置的系数≤大的稀释度所设置的系数。对于吸光度测量法，将权利要求5中所述某一稀释度每个平行样测量所得到的吸光度变化值均乘以该稀释度所对应的系数并相加，可以得到该稀释度的结果。将每个稀释度的结果相加，可以得到该读数点的结果。将所有读数点该样品的结果相加，可以得到该样品的最终结果。
本发明提供的微生物相对含量检测计数方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
该实施例样品采集于某海域含油气圈闭上方，取海洋沉积物对其中的烃氧化菌进行检测，以期研究海域含油气圈闭上方烃氧化菌发育情况。
本发明微生物相对含量检测计数的方法具体实施步骤如下：
1.根据地球物理方法发现的圈闭构造，采取均匀网格的方式布设采样点，采集了42个样品，样品采集间距为500m，采集深度为20cm。样品采集后迅速冷冻，并保持冷冻状态运送到检测实验室，在实验室内储存于冷冻状态下。
2.称取5g样品置于20mL烃氧化菌培养液中，混匀，制成样品原液。培养液参考U.S.patent 5093236(Victoria Gonzales-Prevatt,1992)中的实施例。微生物生长指示剂为刃天青。
3.吸取1mL步骤2中的样品原液到9mL灭菌的培养液中，混匀，制成小稀释度培养液。再从小稀释度培养液中取1mL到另一个9mL灭菌的培养液中，混匀，制成中稀释度培养液。再从中稀释度培养液中取1mL到另一个9mL灭菌的培养液中，混匀，制成大稀释度培养液。每种稀释度培养液设置三个平行样，这样，形成三稀释度，每稀释度三平行样的MPN检测体系。
4. 42个样品均按照步骤2和3所述方法设置MPN检测体系。接种完毕后，置于24℃培养15天。
5.每间隔3天进行一次读数。读数时观察培养液的颜色，蓝色记为0，紫色记为1，洋红色记为2，红色记为3，无色记为4。
6.对于每次读数，按照以下公式进行计算：
Z＝(X1-1+X1-2+···+X1-n)*Y1+(X2-1+X2-2+···+X2-n)*Y2+···+(Xm-1+Xm-2+···+Xm-n)*Ym
其中，Z为该次读数的最终计数数值；m为m号稀释度，n为n号平行样；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的读数；Y代表稀释度系数；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥···Y2≥Y1。
例如某次读数，将1号稀释度(小稀释度)所有平行样读取的数字相加，之后乘以1号稀释度的系数1；将2号稀释度(中稀释度)所有平行样读取的数字相加，之后乘以2号稀释度的系数2；将3号稀释度(大稀释度)所有平行样读取的数字相加，之后乘以3号稀释度的系数3，之后将所有稀释度和平行检测样品乘以系数之后所得的数字相加，得到该次读数的结果。
1号稀释度(小稀释度)三个平行样分别读为3-3-2，2号稀释度(中稀释度)三个平行样分别读为2-2-1，3号稀释度(大稀释度)三个平行样分别读为1-1-0，那么该次读数的结果应计算为(3+3+2)×1+(2+2+1)×2+(1+1+0)×3＝24。
7.将每隔三天读数一次，共计五次读数的结果按照步骤6处理，之后将五次读数的结果相加，得到该样品的相对微生物含量结果。
8.作为对照的常规MPN法，只取最后一次，即第15天的读数结果，且只记培养液阳性(紫、洋红、红或无色)和培养液阴性(蓝色)。记录之后查MPN表求得MPN值。
9.将本发明所述经过上述步骤5到7读数并处理的数据和按照上述步骤8所述读数并处理的数据成图进行对比，结果见图1、2。其中，图1示某海域圈闭采用标准MPN法烃氧化菌检测结果，图2示某海域圈闭采用本发明方法烃氧化菌检测结果。
从图1、2可以看出，使用本发明所述方法所得到的结果更加连续，且准确度更高。如使用标准的MPN法测得的四个3.6，使用本发明方法所得到的结果分别为12、7、22、1，显示本发明方法的结果更加连续。在使用本发明在钻井处所得结果为22，这与该钻井为油气井的事实更加相符，显示本发明方法的准确度更高。
实施例2
该实施例样品采集于某海域通过钻探证实的油气藏上方，取海洋沉积物对其中的烃氧化菌进行检测，以期研究海域含油气圈闭上方烃氧化菌发育情况。
本发明所述微生物相对含量检测计数的方法具体实施步骤如下：
1.某海域经过钻探证实的油气藏，采取测线的方式布设采样点，采集了23个样品，样品采集间距为500m，采集深度为20cm。样品采集后迅速冷冻，并保持冷冻状态运送到检测实验室，在实验室内储存于冷冻状态下。
2.称取5g样品置于20mL烃氧化菌培养液中，混匀，制成样品原液。培养液参考U.S.patent 5093236(Victoria Gonzales-Prevatt,1992)中的实施例。微生物生长指示剂为刃天青。
3.吸取1mL步骤2中的样品原液到9mL灭菌的培养液中，混匀，制成小稀释度培养液。再从小稀释度培养液中取1mL到另一个9mL灭菌的培养液中，混匀，制成中稀释度培养液。再从中稀释度培养液中取1mL到另一个9mL灭菌的培养液中，混匀，制成大稀释度培养液。每种稀释度培养液设置三个平行样，这样，形成三稀释度，每稀释度三平行样的MPN检测体系。
4. 23个样品均按照步骤2和3所述方法设置MPN检测体系。接种完毕后，置于24度培养15天。
5. 15天培养完毕后进行一次读数。读数时观察培养液的颜色，蓝色记为0，紫色记为1，洋红色记为2，红色记为3，无色记为4。
6.对于第15天的读数结果，按照以下方法进行计算：
将小稀释度所有平行样读取的数字相加，之后乘以小稀释度的系数1；将中稀释度所有平行样读取的数字相加，之后乘以中稀释度的系数2；将大稀释度所有平行样读取的数字相加，之后乘以大稀释度的系数3，之后将所有稀释度和平行检测样品乘以系数之后所得的数字相加，得到该次读数的结果，即为该样品的相对微生物含量结果。
1号稀释度(小稀释度)三个平行样分别读为3-3-2，2号稀释度(中稀释度)三个平行样分别读为2-2-1，3号稀释度(大稀释度)三个平行样分别读为1-1-0，那么该次读数的结果应计算为(3+3+2)×1+(2+2+1)×2+(1+1+0)×3＝24
7.作为对照的常规MPN法，只取最后一次，即第15天的读数结果，且只记培养液阳性(紫、洋红、红或无色)和培养液阴性(蓝色)。记录之后查MPN表求得MPN值。
8.将本发明所述经过上述步骤5到6读数并处理的数据和按照上述步骤7所述读数并处理的数据成图进行对比，结果见图3、4。
结果显示，经过钻探证实，样品号7到17所在位置为油气藏区。从本发明方法计数结果和MPN法计数结果来看，本发明方法的计数结果能更好地反映出7到17号样品之间的油气藏区。MPN计数法7、8、10、13、14、15号样品都处于相对低值，而本发明上述样品都处于相对高值，这与实际的情况是相符的。
实施例3
1.将分离自海洋的不动杆菌进行活化，活化步骤为：先将菌种在海洋烃氧化菌的固体培养进行划线分离，然后挑取单菌落接种至海洋烃氧化菌液体培养基上进行富集培养。
2.将富集培养的不动杆菌用无菌水稀释，制备一系列共15种不同浓度的不动杆菌稀释液，并在显微镜下用血球计数板统计这一系列不同浓度菌液的细胞个数，可以得到这一系列15种不同浓度不动杆菌稀释液的浓度，用单位个/mL表示。
3.吸取1mL步骤2中不动杆菌液到9mL灭菌的培养液中，混匀，制成小稀释度培养液。再从小稀释度培养液中取1mL到另一个9mL灭菌的培养液中，混匀，制成中稀释度培养液。再从中稀释度培养液中取1mL到另一个9mL灭菌的培养液中，混匀，制成大稀释度培养液。每种稀释度培养液设置三个平行样，这样，形成三稀释度，每稀释度三平行样的MPN检测体系。培养液参考U.S.patent 5093236(Victoria Gonzales-Prevatt,1992)中的实施例。微生物生长指示剂为刃天青。
4. 15种不同浓度不动杆菌液均按照步骤3所述方法设置MPN检测体系。接种完毕后，置于24度培养15天。
5.每间隔3天进行一次读数。读数时观察培养液的颜色，蓝色记为0，紫色记为1，洋红色记为2，红色记,3，无色记为4。
6.对于每次读数，按照以下公式进行计算：Z＝(X1-1+X1-2+···+X1-n)*Y1+(X2-1+X2-2+···+X2-n)*Y2+···+(Xm-1+Xm-2+···+Xm-n)*Ym
其中，Z为该次读数的最终计数数值；m为m号稀释度，n为n号平行样；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的读数；Y代表稀释度系数；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥···Y2≥Y1。
例如某次读数，将1号稀释度(小稀释度)所有平行样读取的数字相加，之后乘以1号稀释度的系数1；将2号稀释度(中稀释度)所有平行样读取的数字相加，之后乘以2号稀释度的系数2；将3号稀释度(大稀释度)所有平行样读取的数字相加，之后乘以3号稀释度的系数3，之后将所有稀释度和平行检测样品乘以系数之后所得的数字相加，得到该次读数的结果。
1号稀释度(小稀释度)三个平行样分别读为3-3-2，2号稀释度(中稀释度)三个平行样分别读为2-2-1，3号稀释度(大稀释度)三个平行样分别读为1-1-0，那么该次读数的结果应计算为(3+3+2)×1+(2+2+1)×2+(1+1+0)×3＝24
7.将每隔三天读数一次，共计五次读数的结果按照步骤6处理，之后将五次读数的结果相加，得到该样品的相对微生物含量结果。
8.作为对照的常规MPN法，只取最后一次，即第15天的读数结果，且只记培养液阳性(紫、洋红、红或无色)和培养液阴性(蓝色)。记录之后查MPN表求得MPN值。
同时采用显微计数法对上述样品的不动杆菌进行计数。
9. 15种不同浓度不动杆菌液显微计数、本发明计数、MPN法计数的结果对比见表1、图5。
表1各方法对不动杆菌的计数结果
从上述图表可以看出，本发明方法得到的结果明显优于MPN法，与镜检得到的不动杆菌细胞数结果更加相符，两者相关系数达到0.9734，而标准的MPN法相关系数只有0.8218。
实施例4
该实施例样品采集于某海域通过钻探证实的油气藏上方，取海洋沉积物对其中的烃氧化菌进行检测，以期研究海域含油气圈闭上方烃氧化菌发育情况。
本发明所述微生物相对含量检测计数的方法具体实施步骤如下：
1.某海域经过钻探证实的油气藏，采取测线的方式布设采样点，采集了23个样品，样品采集间距为500m，采集深度为20cm。样品采集后迅速冷冻，并保持冷冻状态运送到检测实验室，在实验室内储存于冷冻状态下。
2.称取5g样品置于20mL烃氧化菌培养液中，混匀，制成样品原液。培养液参考U.S.patent 5093236(Victoria Gonzales-Prevatt,1992)中的实施例。烃氧化菌培养液中微生物生长指示剂为刃天青。调节刃天青的用量，使培养液在600纳米波长下吸光度为1.000。
3.吸取1mL步骤2中的样品原液到9mL灭菌的培养液中，混匀，制成小稀释度培养液。再从小稀释度培养液中取1mL到另一个9mL灭菌的培养液中，混匀，制成中稀释度培养液。再从中稀释度培养液中取1mL到另一个9mL灭菌的培养液中，混匀，制成大稀释度培养液。每种稀释度培养液设置三个平行样，这样，形成三稀释度，每稀释度三平行样的MPN检测体系。
4. 23个样品均按照步骤2和3所述方法设置MPN检测体系。接种完毕后，置于24度培养15天。
5. 15天培养完毕后进行一次读数。读数时记录培养液对600纳米可见光的吸光度，并用初始吸光度1.000减去培养结束后测得的吸光度，得到吸光度变化值。
6.对于第15天的读数结果，按照以下方法进行计算：
将小稀释度所有平行样读取的吸光度变化值相加，之后乘以小稀释度的系数10；将中稀释度所有平行样读取的吸光度变化值相加，之后乘以中稀释度的系数20；将大稀释度所有平行样读取的吸光度变化值相加，之后乘以大稀释度的系数30，之后将所有稀释度和平行检测样品乘以系数之后所得的数字相加，得到该次读数的结果，即为该样品的相对微生物含量结果。
1号稀释度(小稀释度)三个平行样吸光度变化值分别为0.752-0.733-0.509，2号稀释度(中稀释度)三个平行样吸光度变化值分别读为0.560-0.480-0.376，3号稀释度(大稀释度)三个平行样吸光度变化值分别读为0.224-0.269-0.109，那么该次读数的结果应计算为(0.752+0.733+0.509)×10+(0.560+0.480+0.376)×20+(0.224+0.269+0.109)×30＝66.32
7.作为对照的常规MPN法，只取最后一次，即第15天的读数结果，且只记培养液阳性(紫、洋红、红或无色)和培养液阴性(蓝色)。记录之后查MPN表求得MPN值。
8.将本发明所述经过上述步骤5到6读数并处理的数据和按照上述步骤7所述读数并处理的数据成图进行对比，结果见图6、7。
结果显示，经过钻探证实，样品号7到17所在位置为油气藏区。从本发明方法计数结果和MPN法计数结果来看，本发明方法的计数结果能更好地反映出7到17号样品之间的油气藏区。MPN计数法7、8、10、13、14、15号样品都处于相对低值，而本发明上述样品都处于相对高值，这与实际的情况是相符的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将氧化还原指示剂加入培养基，得到指示培养基；所述氧化还原指示剂的变色范围包括3种或3种以上肉眼可轻易辨识的颜色；
步骤2：将待测样本进行稀释，设置3～15个稀释度，每个稀释度设置3～15个平行，将稀释后的待测样本采用所述指示培养基进行培养；
步骤3：培养期间和/或培养结束后读取指示培养基的颜色或吸光度；
步骤4：根据指示培养基的颜色变化程度或吸光度变化值，得到待测样本中微生物的相对含量。
2.根据权利要求1所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，所述氧化还原指示剂为刃天青或甲基蓝。
3.根据权利要求1至3中任一项所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，步骤3为培养结束后读取指示培养基的颜色。
4.根据权利要求3所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，步骤4中根据指示培养基的颜色变化程度，得到待测样本中微生物的相对含量为：
根据指示培养基的颜色与微生物含量之间的相关性，对指示培养基的颜色进行读数，所述读数的数字大小与微生物含量呈正相关；
采用如下公式获得待测样本中微生物的相对含量：
Z＝(X1-1+X1-2+…+X1-n)×Y1+(X2-1+X2-2+…+X2-n)×Y2+…+(Xm-1+Xm-2+…+Xm-n)×Ym
其中，Z为待测样本中微生物的相对含量；m为m号稀释度，3≤m≤15；n为n号平行样，3≤n≤15；X为读数值，X≥0；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的读数值；Y代表稀释度系数，Y＞0；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥…Y2≥Y1。
5.根据权利要求1或2所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，所述步骤3为培养期间和培养结束后读取指示培养基的颜色，所述培养期间和培养结束后读取指示培养基的颜色的次数至少为2次。
6.根据权利要求5所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，步骤4中根据指示培养基的颜色变化程度，得到待测样本中微生物的相对含量为：
根据指示培养基的颜色与微生物含量之间的相关性，将指示培养基的颜色记录为数字，所述数字的大小与微生物含量呈正相关；
采用如下公式获得待测样本一次读数的最终计数数值：
Zi＝(X1-1+X1-2+…+X1-n)×Y1+(X2-1+X2-2+…+X2-n)×Y2+…+(Xm-1+Xm-2+…+Xm-n)×Ym
其中，Zi为一次读数的最终计数数值；i为培养期间和培养结束后读取指示培养基的颜色的次数，i≥2；m为m号稀释度，3≤m≤15；n为n号平行样，3≤n≤15；X为读数值，X≥0；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的读数值；Y代表稀释度系数，Y＞0；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥…Y2≥Y1；
采用如下公式获得待测样本中微生物的相对含量：
Z＝Z1+…+Zi
其中，Z为待测样本中微生物的相对含量；Zi为一次读数的最终计数数值；i为培养期间和培养结束后读取指示培养基的颜色的次数，i≥2。
7.根据权利要求1或2所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，所述步骤3为培养结束后读取指示培养基的吸光度，步骤4中根据指示培养基的吸光度变化值，得到待测样本中微生物的相对含量为：
根据指示培养基的吸光度，采用如下公式获得待测样本中微生物的相对含量：
Z＝(X1-1+X1-2+…+X1-n)×Y1+(X2-1+X2-2+…+X2-n)×Y2+…+(Xm-1+Xm-2+…+Xm-n)×Ym
其中，Z为待测样本中微生物的相对含量；m为m号稀释度，3≤m≤15；n为n号平行样，3≤n≤15；X为读取指示培养基的吸光度变化值；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的吸光度变化值；Y代表稀释度系数，Y＞0；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥…Y2≥Y1。
8.根据权利要求1或2所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，所述步骤3为培养期间和培养结束后读取指示培养基的吸光度，所述培养期间和培养结束后读取指示培养基的吸光度的次数至少为2次。
9.根据权利要求8所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，步骤4中根据指示培养基的吸光度变化值，得到待测样本中微生物的相对含量为：
根据指示培养基的吸光度变化值，采用如下公式获得待测样本一次读数的最终计数数值：
Zi＝(X1-1+X1-2+…+X1-n)×Y1+(X2-1+X2-2+…+X2-n)×Y2+…+(Xm-1+Xm-2+…+Xm-n)×Ym
其中，Zi为一次读数的最终计数数值；i为培养期间和培养结束后读取指示培养基的吸光度的次数，i≥2；m为m号稀释度，3≤m≤15；n为n号平行样，3≤n≤15；X为吸光度变化值；Xm-n代表m号稀释度n号平行样的吸光度变化值；Y代表稀释度系数，Y＞0；Ym代表m号稀释度系数，并且取Ym≥Ym-1≥Ym-2≥…Y2≥Y1；
采用如下公式获得待测样本中微生物的相对含量：
Z＝Z1+…+Zi
其中，Z为待测样本中微生物的相对含量；Zi为一次读数的最终计数数值；i为培养期间和培养结束后读取指示培养基的吸光度的次数，i≥2。
10.根据权利要求1、2、7至9中任一项所述的微生物相对含量检测计数方法，其特征在于，所述吸光度的检测波长为氧化还原指示剂的最大吸收光波长。
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