CN110261267A - 一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法 - Google Patents

一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，该方法综合了双层平板培养法、显微计数法和高通量测序技术等多种技术，集成建立了针对渔用光合细菌制剂产品的菌量和纯度的测定方法；同时，根据光合细菌兼性厌氧和对光照要求等生理特征，及其利用水体无机氮磷营养的功能特性，进一步研究建立了渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷作用效果的测定方法；并采用测定氮元素相关作用功能基因的方法确定菌剂的氮素转化功能潜力。

Description

一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法
技术领域
本发明属于光合细菌制剂技术领域，具体涉及一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法。
背景技术
光合细菌(Photosynthetic bacteria)是一类能在厌氧条件下进行不产氧光合作用细菌的总称(杨素萍等，2008)，能以光作为能源，利用自然界中有机物、氨、硫化氢等作为供氢体进行光合作用。光合细菌为革兰氏阴性菌，菌体形态多样，有球状、杆状、螺旋状、半环形等，在10-45℃下均可生长繁殖，最适生长温度为20-30℃，最适pH为7.0-8.5(徐良梅等，2005)。此外，该类细菌具有广盐性(李卓佳等，2007)，光照强度是影响光合细菌生长的重要因素(徐良梅等，2005)。光合细菌具有多样化的代谢方式。光合细菌在厌氧条件下可进行光合作用，在黑暗微好氧和好氧条件下进行氧化代谢(史家梁等，1995；钱大益等，2005)。在氮代谢方面，它能同化氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮等无机氮源，也可通过固氮作用将氮气转变为铵盐作为氮源(徐慧芳,2015)；在磷代谢方面，某些光合细菌具有较强的摄磷能力，但对磷的吸收能力受光照强度及pH等环境条件的影响(袁盈波等，2010)。有研究认为光合细菌具有硝化、反硝化等多种氮代谢方式(Yang,et al.,2017；Kim,et al.,1999)，其中参与硝化过程的关键酶是氨单加氧酶和亚硝酸盐氧化还原酶(刘华,2012；李敬源等,2012)，参与反硝化过程的关键酶是亚硝酸盐还原酶(王丽英,2005)。编码以上3种酶的基因分别为amoA、nxrA、nirS(李敬源等,2012)。目前将氮转化相关功能基因技术应用于光合细菌制剂质量检测与评价的报道还相对少见。
光合细菌种类繁多但仅有一小部分在渔业生产中进行应用(Brandl et al.,1989；杨莺莺等，2009)。当前用于渔用光合细菌制剂的常见细菌种类主要包括：红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)(Jian et al.,2013；Zhou et al.,2007)、红螺菌属(Rhodospirillum)(Qi et al.,2009)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)等(林启存等，2017)，其中应用最为普遍的为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)(Zhang etal.,2014；Lazaro et al.,2017)。雷爱莹等(2005)从高产对虾养殖池塘底泥中分离获得到一株沼泽红假单胞菌，研究发现它能有效去除养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐氮。此外，还有研究认为在渔用光合细菌生产中应用的主要菌种有红螺菌属、红假单胞菌属和红微菌属(201710561969.X)。
光合细菌制剂是以培养基为原料、活性光合细菌为菌种，经过现代生物工程技术研制而成的微生物制剂。因其具有去除水环境中氨氮、亚硝酸盐氮等有害物质等功能，从20世纪80年代起已逐渐被广泛应用于水产养殖业。随着水产业的快速发展，光合细菌制剂成为研究热点之一。目前，市场上常见的光合细菌制剂产品多为5L～20L的深红色菌液。另有少量光合细菌冻干粉产品，但据检测分析该类冻干粉产品的主要优势菌为芽孢杆菌而并非光合细菌。因此，非常有必要对渔用光合细菌菌剂产品进行检测。但当前市场上渔用光合细菌制剂产品质量良莠不齐，作用效果难以保证，加之光合细菌制剂的使用环境复杂，菌种类别繁多(Kim et al.,2000；Shapleigh et al.,2009)，检测光合细菌制剂产品在实际生产应用中的数量、纯度及应用效果存在一定的难度(杨官娥等，2010)。目前我国也尚无专门针对渔用微生态制剂产品的评价方法。
光合细菌制剂在水产行业中没有专门性的标准，只有2个通用标准，即光合细菌制剂标准(NY 527-2002)和光合细菌制剂中沼泽红假单胞菌计数方法(SN/T3542-2013)。前者规定的是光合细菌制剂的分类、技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存等，后者为光合细菌代表种数量测定方法参考。并且光合细菌制剂作用效果的评价和测定方法也暂鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，该方法既可准确测定渔用光合细菌制剂产品中活菌与否、光合细菌菌量和纯度，还可测定渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷的作用效果和渔用光合细菌制剂产品中氮元素相关作用功能基因含量。
本发明的上述目的可以通过如下技术方案来实现：一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，该方法综合了双层平板培养法、显微镜计数法和高通量测序法，测定了渔用光合细菌制剂产品中活菌与否、菌量和纯度；待确定制剂产品中含有光合细菌后，进一步集成了渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷作用效果和渔用光合细菌制剂产品中氮元素相关作用功能基因的测定方法，具体包括以下步骤：
(1)采用双层平板培养法测定渔用光合细菌制剂产品中是否存在活菌，采用显微镜计数法测定渔用光合细菌制剂产品的总菌数，采用高通量测序法测定渔用光合细菌制剂产品的纯度；
(2)如制剂产品中含有光合细菌，则一方面测定渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷的作用效果；另一方面，对渔用光合细菌制剂产品中氮元素转化相关功能基因进行测定，确定其是否具有氮素转化功能潜力；如制剂产品中不含有光合细菌，则说明该制剂产品实际并非光合细菌菌剂产品，无需再进行该步骤。
在上述渔用光合细菌制剂产品的检测方法中：
优选的，步骤(1)具体包括以下步骤：
(1.1)选取渔用光合细菌制剂样品，采用双层平板培养法测定是否存在活菌；
(1.2)采用显微镜计数法测定菌剂中的总菌数；
(1.3)提取渔用光合细菌制剂样品的总DNA，扩增16S rRNA可变区，采用高通量测序技术测定渔用光合细菌制剂样品的细菌群落组成，确定光合细菌的相对丰度，并计算出所检测光合细菌制剂样品中光合细菌的菌量和纯度。
优选的，步骤(1.1)中采用双层平板培养法测定是否存在活菌时，包括以下步骤：选取渔用光合细菌制剂样品，制备稀释液，在30℃±1℃，光照微需氧条件下接种光合细菌培养琼脂双层平板，培养5～6d，观察双层平板上是否有菌生长，有菌生长，即说明该菌剂产品中有活菌；没有菌落生长，则说明该菌剂产品中没有活菌。
优选的，步骤(1.3)中采用Water DNA Kit(水体DNA提取试剂盒，市售，Omega)提取渔用光合细菌制剂样品的细菌总DNA，扩增16S rRNA可变区，采用高通量测序技术测定菌剂的细菌群落组成，根据伯杰氏细菌鉴定***确定检测结果中是否有光合细菌以及光合细菌的相对丰度，再根据总菌数和光合细菌的相对丰度获得光合细菌制剂样品中光合细菌的菌量和纯度。
优选的，步骤(2)具体包括以下步骤：
(2.1)对渔用光合细菌制剂样品净化养殖水体氮磷的作用效果进行检测和评价；
(2.2)通过测定氮元素相关作用功能基因确定渔用光合细菌制剂样品的氮素转化功能潜力。
优选的，步骤(2.1)中通过对渔用光合细菌制剂样品净化养殖水体氮磷的作用效果进行检测和评价包括：选择养殖水体，加入渔用光合细菌制剂样品，测试所述渔用光合细菌制剂产品对养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和磷酸盐的降解效果。
优选的，步骤(2.2)所述氮元素相关作用功能基因包括编码氨单加氧酶的amoA基因、编码亚硝酸盐氧化还原酶的nxrA基因和编码亚硝酸盐还原酶的nirS基因。
优选的，步骤(2.2)中采用荧光定量PCR法(qPCR)检测氮元素相关作用功能基因的含量，判断渔用光合细菌制剂样品是否存在氮转化过程所需要关键酶的基因。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明方法综合了双层平板培养法、显微计数法和高通量测序等多种技术，集成建立了针对渔用光合细菌制剂产品菌量和纯度的***测定方法；同时，根据光合细菌兼性厌氧和对光照要求等生理特征，及其利用水体无机氮磷营养的功能特性，集成建立了渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷作用效果及其氮素转化功能潜力的测定方法；
(2)本发明方法既可准确测定菌剂中光合细菌的菌量和纯度，还可测定菌剂产品对水体氮磷的作用效果和氮元素转化相关功能基因含量；
(3)通过运用本发明方法对采集于市场上的常见渔用光合细菌制剂产品进行测试，结果显示，该方法能有效检测渔用光合细菌制剂的质量与使用效果，它不仅可准确测定菌剂产品中光合细菌的菌量和纯度，还可测定产品对水体氮磷的作用效率和氮元素转化相关功能基因含量；
(4)本发明方法具有良好的产业应用前景，可为后续进一步规范和创制我国渔用光合细菌制剂的的质量检测和效果评价标准提供有效技术支持。
附图说明
图1是实施例2中amoA基因qPCR的电泳检测结果，其中1.Marker，2.退火温度55℃，3.退火温度60℃，4.退火温度65℃，5.阴性对照；
图2是实施例2中nxrA基因qPCR的电泳检测结果，其中1.Marker，2.退火温度55℃，3.退火温度60℃，4.退火温度65℃，5.阴性对照；
图3是实施例2中nirS基因qPCR的电泳检测结果，1.Marker，2.退火温度55℃，3.退火温度60℃，4.退火温度65℃，5.阴性对照；
图4是实施例2中光合细菌制剂IPB1检测的双层平板；
图5是实施例2中光合细菌制剂IPB1原液显微镜检照片(400×)；
图6是实施例2中光合细菌制剂IPB1高通量分析测定其细菌群落组成；
图7是实施例3中光合细菌制剂IPB2检测的双层平板；
图8是实施例3中光合细菌制剂IPB2稀释100倍显微镜检照片(400×)；
图9是实施例3中光合细菌制剂IPB2高通量分析测定其细菌群落组成。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1
本实施例提供的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，包括准确测定光合细菌制剂产品中的光合细菌是否存活、光合细菌菌量和纯度，并根据是否含有光合细菌而确定是否检测其对水体氮磷的作用效果和氮元素相关作用功能基因含量。具体包括以下步骤：
一、渔用光合细菌制剂产品菌量和纯度的检测
1.渔用光合细菌制剂产品中光合细菌的培养
1.1所用培养基和试剂
1.1.1光合细菌培养琼脂
(1)基础培养基
①成分
CH3COONa·3H2O3.0g，NaHCO3 1.0g，酵母膏2.0g，K2HPO4·3H2O0.50g，NaCl 1.0g，Fe-EDTA溶液1.0mL，琼脂粉15g，蒸馏水1L。
②制法
除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，pH 7.0，加入琼脂，加热溶解，定量分装适宜容器，121℃高压灭菌15min，制成光合细菌培养琼脂。
(2)Fe-EDTA溶液
FeSO4·7H2O 557mg，Na2-EDTA 745mg，蒸馏水100mL。
1.1.2磷酸盐缓冲稀释液
(1)贮存液
①成分
磷酸二氢钾34.0g，蒸馏水500mL。
②制法
用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱中。
(2)稀释液
用蒸馏水稀释1.25mL贮存液(上面②制得)至1000mL，分装于适宜容器，121℃高压灭菌15min，获得酸盐缓冲稀释液。
1.2样品制备
以无菌吸管或移液器吸取25mL(g)市售的标明渔用光合细菌制剂产品置于盛有225mL灭菌磷酸盐缓冲稀释液的无菌锥形瓶中，振荡30min，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
用微量移液器吸取1:10稀释液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL灭菌稀释液的试管中，混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。
1.3接种培养
采用双层平板培养法。选择1.2中制备的3个合适的稀释度，取0.1mL的样品匀液均匀涂布于光合细菌培养琼脂上，晾置15min，再将冷至45℃～50℃的光合细菌培养琼脂约15mL倾注于每个平皿中，待琼脂凝固后翻转平皿，用封口膜将平板口封住，为菌体提供一个低氧的环境。将平板置于约3000Lx，30℃光照培养5d-6d，观察平板菌落的生长情况。每个稀释度接种3个无菌平皿。
1.4记录结果
记录并拍照，双层平皿上是否有菌生长。有菌生长，即说明该菌剂产品中有活菌；没有菌落生长，则说明该菌剂产品中没有活菌。
2.渔用光合细菌制剂中总菌数的测定
2.1取样
取清洁的血球计数板，将洁净的专用盖玻片置于血球计数板的两条嵴上。
选择合适的稀释度，用无菌滴管吸取少许摇匀的稀释菌液(1.2样品制备中稀释菌液)，从盖玻片的边缘滴入一小滴，使菌液自行渗入计数室。加菌液时注意不得有气泡，滴加菌液后，静置约5min。在低倍镜下找到方格网后，转换高倍镜观察计数。
2.2计数方法
(1)不同规格的计数板的计数方法略有差异。16×25规格的计数板，需要按对角线方位，计算左上、左下、右上和右下4个大格(共100小格)的菌数。若是25×16规格的计数板，除统计上述4个大格外，还须统计中央一大格(共80个小格)的菌数。
(2)每个样品重复计数3次(每次数值不应相差过大，否则重新操作)，取其平均值。
(3)按下述公式计算出每毫升菌液所含的菌数。
①16×25规格的计数板：
总菌数/mL＝(100个小格内的菌数/100)×400×10000×菌液稀释倍数。
②25×16规格的计数板：
总菌数/mL＝(80个小格内的菌数/80)×400×10000×菌液稀释倍数。
3.渔用光合细菌制剂产品纯度的测定
以真空过滤的方式，将100mL光合细菌制剂样品过滤在0.2μm的微孔滤膜(Millipore)上，把滤膜剪碎放入Water DNA Kit(水体DNA提取试剂盒)(市售，Omega)的提取管中，按照试剂盒提供的操作方法提取菌剂样品的细菌DNA。然后把所得DNA样品送至高通量测序公司，以引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3’)，扩增16S V4可变区，用高通量测序技术分析样品菌群结构，根据伯杰氏细菌鉴定***确定检测结果中是否有光合细菌以及光合细菌的相对丰度(即光合细菌制剂产品纯度)。
4.渔用光合细菌制剂中光合细菌菌量的计算
光合细菌制剂中的光合细菌菌量＝总菌数×光合细菌的相对丰度。
如市售的标明渔用光合细菌制剂产品中含有光合细菌，则进行如下步骤二；如制剂产品中不含有光合细菌，则说明该制剂产品实际并非光合细菌菌剂，无需再进行步骤二。
二、渔用光合细菌制剂产品作用效果的检测
1.渔用光合细菌制剂的作用效果测定
1.1饲料浸出液的制备
将配合饲料烘干、粉碎，取100g粉碎的饲料，加入1L纯净水25℃浸泡24h，取上清，制成饲料浸出液原液。
1.2实验水体的制备
取适量饲料浸出液原液加入养殖池塘水中，根据设置初始氮磷条件的不同，加入适量铵盐、亚硝酸盐等，调节实验水体总无机氮(包括氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮)的初始浓度。将配制好的实验水体以600mL/瓶的量分装于1L的三角瓶，121℃灭菌15-20min。
1.3作用条件设置
设置菌剂组和对照组，菌剂组按照施菌量103-106cfu/mL添加市售的标明渔用光合细菌制剂产品，对照组不加菌，加入相同体积的无菌生理盐水，每组设置三个平行。分别置于低氮弱光、高氮弱光、高氮强光条件下进行测试(表1)。将各组放于28℃培养7天，于实验的第0天、第3天、第5天、第7天取样测定水体的氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和活性磷酸盐含量(GB17378.4-2007)，分别计算降解率。
表1作用条件设置
菌剂组 低氮弱光组 高氮弱光组 高氮强光组
总无机氮浓度(mg/L) 1-3mg/L 8-13mg/L 8-13mg/L
光照强度 100Lx 100Lx 3000-50000Lx
光暗比 10-12：12-14 10-12：12-14 24:0
是否振荡 是 是 否
1.4降解率的计算
降解率＝(实验水体的初始营养盐值-培养n天实验水体的营养盐值)/实验水体的初始营养盐值(n＝3,5,7)
2渔用光合细菌制剂对氮元素相关作用的功能基因测定
以氨氧化、硝化、反硝化步骤中的关键酶氨单加氧酶、亚硝酸盐氧化还原酶、亚硝酸盐还原酶三种酶的基因(amoA基因、nxrA基因、nirS基因)为靶目标，通过荧光定量PCR(qPCR)法检测菌剂中以上三种基因的含量，判断菌剂是否存在氮转化过程所需要关键酶的基因。
2.1qPCR条件的优化
设置不同的退火温度，优化qPCR反应条件。具体扩增引物和反应程序如表2所示。反应体系为：qPCR Mix 15μL，Mg2+(25mmoL/L)2μL，目的基因引物(10μmol/L)各0.5μL，DNA模板2μL，加dd H2O补足至30μL。
表2荧光定量PCR的扩增引物及反应条件设置
amoA基因不同退火温度下qPCR的电泳检测结果如图1所示，其中Marker，2.退火温度55℃，3.退火温度60℃，4.退火温度65℃，5.阴性对照。
nxrA基因不同退火温度下qPCR的电泳检测结果如图2所示，其中1.Marker，2.退火温度60℃，3.退火温度55℃，4.退火温度65℃，5.阴性对照。
nirS基因不同退火温度下qPCR的电泳检测结果如图3所示，其中1.Marker，2.退火温度55℃，3.退火温度60℃，4.退火温度65℃，5.阴性对照。
qPCR完成后用电泳图对比不同退火温度下的扩增效果(图1-图3)，以明亮条带的对应的退火温度作为后续定量检测的反应条件。优化后确定的amoA基因、nxrA基因、nirS基因的退火温度分别为65℃、60℃、55℃。
2.2标准曲线的制作
标准曲线利用含有qPCR目的片段的质粒为标准基因，具体步骤如下：
(1)选用克隆文库中含有目标基因质粒的大肠杆菌进行37℃摇瓶培养；
(2)利用Axygen plasmid miniprep Kit(Axygen)试剂盒提取质粒；
(3)利用Qubit 3.0(Life Biotech)测定质粒浓度；
(4)质粒拷贝数的计算；
(5)将质粒DNA按10倍梯度稀释制作标准样品进行扩增，得出标准曲线。
2.3目的功能基因检测
采用qPCR检测目的功能基因含量，将提取的菌剂细菌DNA作为PCR扩增模板，引物(Feng et al.,2016；Faulwetter et al.,2011)和反应条件参照下表3。qPCR体系为30μL，其中，qPCR Mix 15μL，染料(eva)0.3μL，目的基因的正反向引物(10μmol/L)各0.3μL，Mg2+(25mmoL/L)2.5μL，DNA模板2μL，用dd H2O补足至30μL。实验设置阴性对照，并与按10倍梯度稀释好的5个标准样品进行定量扩增检测。根据标准曲线计算出目的功能基因含量。
表3优化后的qPCR反应条件
实施例2
从海南省海口市水产养殖主产区市场中采集常见的渔用光合细菌制剂产品IPB1(其标签主要成分为红螺菌、微量元素、活性酶及促生长因子；该产品标称具有转化水中氨氮、亚硝酸盐等功效)，在广州市海珠区中国水产科学研究院南海水产研究所利用实施例1中的方法进行了光合细菌制剂产品中光合细菌菌量、纯度的检测，及其对氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和活性磷酸盐等主要水质因子的作用效果和氮转化功能基因的测定。
1、光合细菌制剂产品IPB1的光合细菌菌量和纯度测定
取样渔用光合细菌制剂产品IPB1，采用实施例1中的双层平板培养法，检测光合细菌制剂产品中是否存在活菌；然后，根据上述的显微计数法，测定菌剂产品中的总菌数；再提取菌剂样品的总DNA，特异性扩增16S V4可变区，分析样品菌群结构，确定光合细菌的相对丰度。最后根据公式计算出光合细菌制剂中光合细菌菌量和纯度。
光合细菌制剂IPB1检测的双层平板如图4所示。
光合细菌制剂IPB1原液显微镜检照片(400×)如图5所示。
光合细菌制剂IPB1高通量分析测定其细菌群落组成如图6所示。
由图4-6可以看出，光合细菌制剂产品IPB1中有活菌检出；显微镜检结果表明其细菌总数为3.25×108cells/mL，根据高通量测序结果，光合细菌制剂产品IPB1的主要优势菌属于红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)，其相对丰度(纯度)为50.58％，由此计算获得该菌剂IPB1中光合细菌的光合细菌菌量为1.64×108cells/mL。
由于光合细菌制剂产品IPB1中有光合细菌检出，因此进行以下步骤2。
2、渔用光合细菌制剂产品IPB1的养殖水体净化效果测定
以灭菌养殖池塘水为基础，添加适量的无菌饲料浸出液原液，达到养殖池塘常见营养水平。设置菌剂组和对照组，菌剂组按照施菌量103-106cfu/mL添加菌剂产品IPB1，对照组不加菌剂IPB1而是加入相同体积的无菌生理盐水，每组均设置三个平行。将它们分别置于低氮弱光、高氮弱光、高氮强光条件下28℃培养7天，于实验的第0天、第3天、第5天、第7天取样测定水体的氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和磷酸盐含量(GB17378.4-2007)，分别计算降解率。
结果显示，在低氮弱光条件下，实验水体的磷酸盐、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的最大降解率分别为40.98％、28.28％、20.12％；在高氮弱光条件下对氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和磷酸盐的最大降解率分别为33.18％、26.77％、24.16％和45.24％；在高氮强光条件下对氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和磷酸盐的最大降解率分别为18.13％、48.07％、62.97％和8.78％(表4)。
表4光合细菌制剂IPB1在不同条件下对无机氮磷的最大降解率
氨氮 亚硝酸盐氮 硝酸盐氮 磷酸盐
低氮弱光 / 20.12％ 28.28％ 40.98％
高氮弱光 33.18％ 26.77％ 24.16％ 45.24％
高氮强光 18.13％ 48.07％ 62.97％ 8.78％
3、渔用光合细菌制剂产品IPB1的氮转化功能基因的测定
采用qPCR法检测目的功能基因含量，引物和反应条件参照表1。将提取的菌剂细菌总DNA作为PCR扩增模板。荧光定量扩增体系为30μL，其中，qPCR Mix 15μL，染料(eva)0.3μL，目的基因的正反向引物(10μmol/L)各0.3μL，Mg2+(25mmoL/L)2.5μL，DNA模板2μL，用ddH2O补足至30μL。根据标准曲线，计算出功能基因的含量。
结果显示，光合细菌制剂产品IPB1中编码亚硝酸盐还原酶的nirS基因拷贝数为5.33×103copies/μL，编码氨单加氧酶的amoA基因和编码亚硝酸盐氧化还原酶的nxrA基因检测值很低，无法以qPCR检出(表5)。
表5光合细菌制剂IPB1中3种基因(amoA，nxrA，nirS)qPCR检测值
以上结果表明，菌剂IPB1为包含多菌种的复合菌剂，其优势菌为红假单胞菌属，其相对丰度(纯度)为50.58％，菌剂中总菌量为3.25×108cells/mL，而光合细菌菌量为1.64×108cells/mL。该菌剂产品具有降解无机氮磷的功能，且在高氮强光条件下对亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的降解效果良好。此外，该菌剂产品含有编码亚硝酸盐还原酶的nirS基因，其拷贝数为5.33×103copies/μL，编码氨单加氧酶的amoA基因和编码亚硝酸盐氧化还原酶的nxrA基因检测值低。
结果表明，本实施例方法能够准确检测渔用光合细菌制剂产品IPB1中光合细菌的菌量、纯度，还可科学测定其对水体氮磷的净化作用效果和氮元素相关作用功能基因含量。
实施例3
从江苏省南京市水产养殖主产区市场中采集常见的渔用光合细菌制剂产品IPB2(其标签主要成分为光合细菌及其代谢产物等；该产品标称具有快速降解水中氨氮、亚硝酸盐等有害物质的功效)，在广州市海珠区中国水产科学研究院南海水产研究所利用实施例1中的方法进行了光合细菌制剂产品的光合细菌菌量、纯度测定。
1、光合细菌制剂产品IPB2的光合细菌菌量和纯度测定
取样渔用光合细菌制剂产品IPB2，采用实施例1中的双层平板培养法，检测光合细菌制剂产品中是否存在活菌；然后，根据上述的显微计数法，测定菌剂产品中的总菌数；再提取菌剂样品的细菌总DNA，特异性扩增16SV4可变区，分析样品菌群结构，确定光合细菌的相对丰度(纯度)。最后根据公式计算出光合细菌制剂中光合细菌菌量。
光合细菌制剂IPB2检测的双层平板如图7所示。
光合细菌制剂IPB2稀释100倍显微镜检照片(400×)如图8所示。
光合细菌制剂IPB2高通量分析测定其细菌群落组成如图9所示。
由图7-9可以看出，光合细菌菌剂IPB2中有活菌检出；显微镜检结果表明其细菌总数为7.25×109cells/mL；根据高通量测序结果，菌剂IPB2的主要优势菌属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其相对丰度为97.00％，无光合细菌检出。因此，菌剂IPB2中光合细菌的菌量为0。
上述结果显示，该菌剂产品IPB2中光合细菌的菌量为0，实际非光合细菌制剂产品。后续不再检测其对氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和活性磷酸盐等主要水质因子的作用效果和氮转化功能基因含量。
结果表明，本实施例方法能够准确检测产品IPB2中光合细菌的菌量、纯度，真实判别产品中是否有光合细菌存在。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：该方法综合了双层平板培养法、显微镜计数法和高通量测序法，测定了渔用光合细菌制剂产品中活菌与否、菌量和纯度；待确定制剂产品中含有光合细菌后，进一步集成了渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷作用效果和渔用光合细菌制剂产品中氮元素相关作用功能基因的测定方法，具体包括以下步骤：
(1)采用双层平板培养法测定渔用光合细菌制剂产品中是否存在活菌，采用显微镜计数法测定渔用光合细菌制剂产品的总菌数，采用高通量测序法测定渔用光合细菌制剂产品的纯度；
(2)如制剂产品中含有光合细菌，则一方面测定渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷的作用效果；另一方面，对渔用光合细菌制剂产品中氮元素转化相关功能基因进行测定，确定其是否具有氮素转化功能潜力；如制剂产品中不含有光合细菌，则说明该制剂产品实际并非光合细菌菌剂产品，无需再进行该步骤。
2.根据权利要求1所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(1)具体包括以下步骤：
(1.1)选取渔用光合细菌制剂样品，采用双层平板培养法测定是否存在活菌；
(1.2)采用显微镜计数法测定菌剂中的总菌数；
(1.3)提取渔用光合细菌制剂样品的总DNA，扩增16S rRNA可变区，采用高通量测序技术测定渔用光合细菌制剂样品的细菌群落组成，确定光合细菌的相对丰度，并计算出所检测光合细菌制剂样品中光合细菌的菌量和纯度。
3.根据权利要求2所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(1.1)中采用双层平板培养法测定是否存在活菌时，包括以下步骤：选取渔用光合细菌制剂样品，制备稀释液，在30℃±1℃，光照微需氧条件下接种光合细菌培养琼脂双层平板，培养5～6d，观察双层平板上是否有菌生长，有菌生长，即说明该菌剂产品中有活菌；没有菌落生长，则说明该菌剂产品中没有活菌。
4.根据权利要求2所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(1.3)中采用WaterDNAKit提取渔用光合细菌制剂样品的细菌总DNA，扩增16S rRNA可变区，采用高通量测序技术测定菌剂的细菌群落组成，根据伯杰氏细菌鉴定***确定检测结果中是否有光合细菌以及光合细菌的相对丰度，再根据总菌数和光合细菌的相对丰度获得光合细菌制剂样品中光合细菌的菌量和纯度。
5.根据权利要求1所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(2)具体包括以下步骤：
(2.1)对渔用光合细菌制剂样品净化养殖水体氮磷的作用效果进行检测和评价；
(2.2)通过测定氮元素相关作用功能基因确定渔用光合细菌制剂样品的氮素转化功能潜力。
6.根据权利要求5所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(2.1)中通过对渔用光合细菌制剂样品净化养殖水体氮磷的作用效果进行检测和评价包括：选择养殖水体，加入渔用光合细菌制剂样品，测试所述渔用光合细菌制剂产品对养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和磷酸盐的降解效果。
7.根据权利要求5所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(2.2)所述氮元素相关作用功能基因包括编码氨单加氧酶的amoA基因、编码亚硝酸盐氧化还原酶的nxrA基因和编码亚硝酸盐还原酶的nirS基因。
8.根据权利要求5所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(2.2)中采用荧光定量PCR法检测氮元素相关作用功能基因的含量，判断渔用光合细菌制剂样品是否存在氮转化过程所需要关键酶的基因。
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