CN106544296A - 促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的微生物、方法及试剂盒 - Google Patents

促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的微生物、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的微生物、方法及试剂盒。微生物为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis sp.)，于2016年9月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60074。本发明的微生物不仅可以增加冈比亚藻的生物量和光合效率，还能提高雪卡毒素的分泌量，为雪卡毒素标准品的来源获得了新方法，有助于该毒素的精细研究。

Description

促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的微生物、方法 及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的微生物、方法及试剂盒。
背景技术
雪卡鱼毒(Ciguatera fish poisoning,CFP)，又称雪卡毒素，是一种严重危害人类健康的藻类毒素，主要由底栖冈比亚藻(Gambierdiscus sp.)产生。该毒素具有食物链累积效应，有毒冈比亚藻被鱼类摄食后在鱼体内富集，鱼肉经食物链流向餐桌并最终威胁到人类健康。随着全球渔业贸易规模的扩大，中毒事件逐年增加，食用雪卡毒素容易导致神经***、心血管***和胃肠道***的功能异常，对人体的健康极其不利。加之雪卡毒素具有脂溶性特征，在体内很难代谢清除，所以治疗非常困难。目前，对雪卡毒素的检测和防控成了全球关注的热点，迫切需要建立雪卡毒素检测方法及高效治疗手段来保障食品与生命安全。
目前，制约雪卡毒素快速检测和深度研究的最大瓶颈是雪卡毒素标准品的缺乏。因为食用标准、药用规范和检测方法的制定都依赖标准品为参照。当下，雪卡毒素标准品的来源主要源于自然产毒区域的高毒性鱼类中提取毒素，但这一方式获得的毒素量非常有限，且价格昂贵(保守的市场价格约为20,000-35,000人民币/μg)，无法满足全球市场的需求。全球仅有少数实验室拥有以微克计的标准品。
作为雪卡毒素的主要生产者-冈比亚藻(Gambierdiscus sp.)，如何能够从冈比亚藻中获得高产量的雪卡毒素仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
发明人对不同雪卡毒性强度区域进行研究发现，高强度毒性的区域存在冈比亚藻共生微生物，该共生微生物能够促进冈比亚藻生长、光合作用以及产雪卡毒素。进一步地，通过对共生微生物进行筛选发现，苏云金芽孢杆菌对于冈比亚藻的生长、光合作用以及产雪卡毒素起到促进作用。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis sp.)，于2016年9月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60074。本发明的微生物不仅可以增加冈比亚藻的生物量和光合效率，还能提高雪卡毒素的分泌量，为雪卡毒素标准品的来源获得了新方法，有助于该毒素的精细研究。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制剂。根据本发明的实施例，所述制剂中含有前面所描述的微生物的代谢产物。本发明的制剂能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，所述制剂还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述代谢产物是通过下列方式获得的：将所述微生物进行活化培养，得到活化产物；将所述活化产物进行第一发酵培养，以便得到所述代谢产物；或将所述第一发酵培养所得到的第一发酵产物进行处理，以便得到所述代谢产物。由此，根据本发明实施例的制剂能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，所述第一发酵培养的温度为28～35℃。根据本发明的另一个实施例，所述第一发酵培养的时间为24～36h。根据本发明的又一个实施例，所述第一发酵培养是以200～220rpm的转速、13.5cm的旋转半径进行旋转震荡培养的。根据本发明的又一个实施例，所述第一发酵培养的培养基为LB液体培养基。由此，根据本发明实施例的制剂能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，所述处理包括：将所述第一发酵产物进行离心，收集上清液，以便得到所述代谢产物；或将所述第一发酵产物进行超声破碎，以便得到所述代谢产物。由此，根据本发明实施例的制剂能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，所述处理包括：将所述第一发酵产物进行超声破碎，以便得到所述代谢产物。由此，根据本发明实施例的制剂能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素至少之一的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述冈比亚藻进行第二发酵培养一定时间后，将前面所描述的微生物的代谢产物或前面所描述的制剂加入所述第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养。由此，根据本发明实施例的方法能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，所述第二发酵培养的温度为26℃，光照强度为3800Lux，12h：12h光暗循环。由此，根据本发明实施例的方法能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，所述微生物的代谢产物或所述制剂促进所述冈比亚藻生长，所述方法包括：将所述冈比亚藻进行所述第二发酵培养至对数期时，将所述微生物的代谢产物或所述制剂加入所述第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养。由此，根据本发明实施例的方法能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，加入所述发酵液后，所述微生物的代谢产物或所述制剂的终浓度为5×104～5×106个细胞/mL，更优选1×106～5×106个细胞/mL。由此，根据本发明实施例的方法能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，所述微生物的代谢产物或所述制剂促进所述冈比亚藻光合作用，所述方法包括：将所述冈比亚藻进行所述第二发酵培养至对数期时，将所述微生物的代谢产物或所述制剂加入所述第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养。由此，根据本发明实施例的方法能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，加入所述发酵液后，所述微生物的代谢产物或所述制剂的终浓度为5×104～5×106个细胞/mL，更优选1×106～5×106个细胞/mL。由此，根据本发明实施例的方法能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，所述微生物的代谢产物或所述制剂促进所述冈比亚藻分泌雪卡毒素，所述方法包括：将所述冈比亚藻进行所述第二发酵培养至平台期时，将所述微生物的代谢产物或所述制剂加入所述第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养至40～55天。由此，根据本发明实施例的方法能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
根据本发明的实施例，加入所述发酵液后，所述微生物的代谢产物或所述制剂的终浓度不高于2×106个细胞/mL，更优选5×105～1×106个细胞/mL。由此，根据本发明实施例的方法能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所描述的微生物或制剂在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所描述的微生物或前面所描述的制剂的至少一种。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前面所描述的试剂盒在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensissp.GQS09)GDMCC No.60074的筛选；
图2显示了根据本发明一个实施例的冈比亚藻形态的显微镜图片，其中左侧图的放大倍数为40倍，右侧图的放大倍数为10倍；
图3显示了根据本发明一个实施例的对数期添加苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis sp.GQS09)GDMCC No.60074对冈比亚藻生长的影响；
图4显示了根据本发明一个实施例的对数期添加苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis sp.GQS09)GDMCC No.60074对冈比亚藻光合作用的影响；
图5显示了根据本发明一个实施例的平台期添加苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis sp.GQS09)GDMCC No.60074对冈比亚藻生长的影响；以及
图6显示了根据本发明一个实施例的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensissp.GQS09)GDMCC No.60074的添加对雪卡毒素产量的影响。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了一种微生物、制剂、微生物或制剂在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途、促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素至少之一的方法、试剂盒及其在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途，下面将分别对其进行详细描述。
微生物
在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物。该微生物为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis sp.)，于2016年9月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075，保藏编号为GDMCC No.60074。
发明人对不同雪卡毒性强度区域进行研究发现，高强度毒性的区域存在冈比亚藻共生微生物，该共生微生物能够促进冈比亚藻生长、光合作用以及产雪卡毒素。
近年来的研究证明，细菌之间存在信息交流，许多细菌都能合成并释放一种被称为自诱导物质(autoinducer,AI)的信号分子，胞外的AI浓度能随细菌密度的增加而增加，达到一个临界浓度时，AI能启动菌体中相关基因的表达，调控细菌的生物行为。如产生毒素、形成生物膜、产生抗生素、生成孢子、产生荧光等，以适应环境的变化，这一现象称为群体感应调节(quorum sensing.QS)。这一感应现象只有在细菌密度达到一定阈值后才会发生，所以也将这一现象称为细胞密度依赖的基因表达(cell density dependent controlof gene expression)。
研究证实微生物生态作用的体现依赖于一定的数量和生态位(如生物被膜Biofilm)，而菌群数量和Biofilm受群体感应信号(quorum sensing,QS)的调节。在藻菌共生体中，微生物生态功能的体现依赖一定的群体结构和数量，而群体密度由QS信号来调节。
有鉴于此，发明人研究发现，可以通过筛选能够产生QS信号的菌体，然后将其与冈比亚藻共生培养，进一步筛选能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的菌株。进而，发明人经过大量实验得到促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的共生菌—苏云金芽孢杆菌，该菌通过产生QS信号，从而调节群体密度，使菌体产生的大量代谢产物作用于冈比亚藻，以促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素。
制剂
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制剂。根据本发明的实施例，制剂中含有前面描述的微生物的代谢产物。发明人发现，前面所描述的微生物是通过其代谢产物促进冈比亚藻的生长、光合作用和/或产雪卡毒素。由此，根据本发明实施例的制剂能够促进冈比亚藻的生长、光合作用和/或产雪卡毒素。
根据本发明的实施例，代谢产物是通过下列方式获得的：将微生物进行活化培养，得到活化产物；将活化产物进行第一发酵培养，以便得到代谢产物；或将第一发酵培养所得到的第一发酵产物进行处理，以便得到代谢产物。发明人发现，促进冈比亚藻的生长、光合作用和/或产雪卡毒素的物质是通过发酵获得的。由此，通过对微生物进行发酵处理，从而获得所需代谢产物。
根据本发明的实施例，第一发酵培养的温度为28～35℃，优选30℃。根据本发明的另一个实施例，第一发酵培养的时间为24～36h。根据本发明的又一个实施例，第一发酵培养是以200～220rpm的转速、13.5cm的旋转半径进行旋转震荡培养的，优选220rpm。根据本发明的又一个实施例，第一发酵培养的培养基为LB液体培养基。发明人发现，发酵培养条件显著影响后续冈比亚藻的生长、光合作用以及分泌雪卡毒素能力。进一步地，发明人经过大量实验得到上述最优发酵条件，在此条件下能够得到大量促进冈比亚藻的生长、光合作用以及分泌雪卡毒素的代谢产物。在其他发酵条件下，苏云金芽孢杆菌无法产生或产生少量的代谢产物，或者活性较低，导致冈比亚藻的生物量较低、光合作用效率较低和/或分泌的雪卡毒素量较少。
根据本发明的实施例，处理包括：将第一发酵产物进行离心，收集上清液，以便得到代谢产物；或将第一发酵产物进行超声破碎，以便得到所述代谢产物。
根据本发明的优选实施例，处理包括：将所述第一发酵产物进行超声破碎，以便得到所述代谢产物。由此，根据本发明实施例的微生物能够促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一。
发明人发现，通过将发酵产物离心并收集上清液，能够得到代谢产物，但是对于冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的促进作用偏低。经过深入研究发现，有利于促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的代谢产物极可能不仅存在于细胞外，还存在于细胞内。进而，通过将发酵产物进行细胞超声破碎，得到胞外代谢产物的同时，还能够释放出胞内的代谢产物，使其对冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的促进作用较好。
一种促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素至少之一的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素至少之一的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将冈比亚藻进行第二发酵培养一定时间后，将前面所描述的微生物的代谢产物或前面所描述的制剂加入第二发酵培养的发酵液中，继续进行第二发酵培养。
根据本发明的实施例，第二发酵培养的温度为26℃，光照强度为3800Lux，12h：12h光暗循环。发明人经过大量实验得到上述最优发酵条件，在此条件下冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的效果较好。
根据本发明的实施例，微生物的代谢产物或制剂促进冈比亚藻生长，方法包括：将冈比亚藻进行第二发酵培养至对数期时，将微生物的代谢产物或制剂加入第二发酵培养的发酵液中。
发明人意外地发现，加入代谢产物或制剂的时间显著影响冈比亚藻的生长。当冈比亚藻发酵至对数期时(例如细胞数量不超过1000个细胞/mL)，加入代谢产物或制剂，继续发酵后，能够有效地促进冈比亚藻生长。与此相比，当冈比亚藻发酵至平台期时，加入代谢产物或制剂，继续发酵后，冈比亚藻的产量相对偏低。
根据本发明的实施例，加入发酵液后，微生物的代谢产物或制剂的终浓度为5×104～5×106个细胞/mL，更优选1×106～5×106个细胞/mL。发明人发现，加入量显著影响冈比亚藻的产量。具体地，当加入量为5×104～5×105个细胞/mL时对藻的促进有限，未能比对照有明显提高；而当提高到1×106～5×106个细胞/mL时对冈比亚藻的生长促进显著，但是当加入量高于5×106个细胞/mL，则会出现抑制作用，导致冈比亚藻的产量降低。
需要说明的是，本发明所使用的术语“终浓度”是指基于加入微生物的代谢产物或制剂后发酵液的总体积，微生物的代谢产物或制剂的细胞浓度。
还需要说明的是，针对经超声破碎所得到的代谢产物，本发明所使用的术语“细胞浓度”主要是就破碎前的细胞数而言的。
根据本发明的实施例，微生物的代谢产物或制剂促进冈比亚藻光合作用，方法包括：将冈比亚藻进行第二发酵培养至对数期时，将微生物的代谢产物或制剂加入第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养。
发明人意外地发现，加入代谢产物或制剂的时间显著影响冈比亚藻的光合作用。当冈比亚藻发酵至对数期时(例如细胞数量不超过1000个细胞/mL)，加入代谢产物或制剂，继续发酵后，能够有效地促进冈比亚藻光合作用。与此相比，当冈比亚藻发酵至平台期时，加入代谢产物或制剂，继续发酵后，光合作用效率相对偏低。
根据本发明的实施例，加入发酵液后，微生物的代谢产物或制剂的终浓度为5×104～5×106个细胞/mL，更优选1×106～5×106个细胞/mL。发明人发现，加入量显著影响冈比亚藻的光合作用。具体地，当加入量为5×104～5×106个细胞/mL，对冈比亚藻的光合作用有不同程度的促进显作用，当加入量为1×106～5×106个细胞/mL，对冈比亚藻的光合作用促进显著，但是当加入量高于5×106个细胞/mL，则会出现抑制作用，导致冈比亚藻的光合作用降低。
根据本发明的实施例，微生物的代谢产物或制剂促进冈比亚藻分泌雪卡毒素，方法包括：将冈比亚藻进行第二发酵培养至平台期时，将微生物的代谢产物或制剂加入第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养至40～55天。
发明人意外地发现，加入代谢产物或制剂的时间显著影响冈比亚藻分泌雪卡毒素。当冈比亚藻发酵至平台期时(例如细胞数量6000-8000个细胞/mL)，加入代谢产物或制剂，继续发酵后，能够有效地促进冈比亚藻分泌雪卡毒素，所得到的雪卡毒素产量较高。与此相比，当冈比亚藻发酵至对数期时，加入代谢产物或制剂，继续发酵后，雪卡毒素的产量相对偏低。
根据本发明的实施例，加入发酵液后，微生物的代谢产物或制剂的终浓度不高于2×106个细胞/mL，更优选5×105～1×106个细胞/mL。发明人发现，加入量显著影响雪卡毒素的产量。具体地，当加入量不高于2×106个细胞/mL，对冈比亚藻分泌雪卡毒素促进显著，但是当加入量高于2×106个细胞/mL，则会出现抑制作用，导致雪卡毒素产量降低。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物和制剂所描述的特征和优点，同样适用于促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素至少之一的方法，在此不再赘述。
微生物或制剂在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前面所描述的微生物或制剂在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物及制剂所描述的特征和优点，同样适用于该微生物或制剂在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途，在此不再赘述。
试剂盒
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所描述的微生物或制剂的至少一种。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物和制剂所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
试剂盒在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前面所描述的试剂盒在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
根瘤菌报告菌株(A136)由中国科学院南海海洋研究所王晓雪研究员惠赠。
冈比亚藻藻种(Gambierdiscus 1022M2C12，M2)由香港城市大学海洋污染国家重点实验室分离并惠赠。
LB固体培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，去离子水100ml，琼脂1.5g，pH7.0。
LB液体培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，去离子水100ml，pH7.0。
K medium藻培养液：硝酸钠溶液1.0ml(75克硝酸钠固体溶于1升双蒸水中，表示为75g/L ddH20)；氯化铵，1.0ml(2.68g/L ddH2O)；β-甘油磷酸钠，1.0ml(2.16g/L ddH2O)；九水硅酸钠，1.0ml(30.0g/L ddH2O)；***，1.0ml(1.29g/L ddH2O)；Tris-Base(pH 7.2)，1.0ml(121.1g/L ddH2O)；K微量金属溶液，1.0ml；f/2维生素溶液，0.5ml；过滤陈海水，定容至1L；混匀后121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
Zobell 2216E培养基：酵母提取物Yeast Extract，5.0g；胰蛋白胨Tryptone，1.0g；三氯化铁FeCl3，0.01g；陈海水seawater，1.0L；技术琼脂粉，15g(固体培养基)；混匀后115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
实施例1菌株的分离与鉴定
一、菌株的分离
选择基里巴斯共和国马拉凯环礁(Marakei)四个毒性不同的采样点进行采样，包括两个强雪卡毒性区域M1(2°01.394'N,173°15.383'E)和M2(1°59.879'N,173°15.032'E)，以及两个弱雪卡毒性区域M3(1°58.246'N,173°16.268'E)和M4(2°00.150'N,173°18.010'E)。从大型藻、珊瑚、海藻等冈比亚藻易附着的区域收集样品，用于藻类分离培养和细菌筛选。所采样本无菌保存带回实验室后(清华大学深圳研究生院海洋生态实验室)无菌操作涂布于12cm中号含2216E固体培养基平板上，30℃过夜静置培养，直至长出清晰可见的单克隆。
随后从培养平板上挑取约200株单克隆于2ml EP管中，EP管中含1ml LB液体培养基，将这200株单克隆放入恒温摇床中30℃，220r/min培养过夜。分别进行QS信号的筛选，具体过程如下：
初筛：在96孔板中将A136报告菌株(A.tumefaciens 136)与待测200株单克隆菌株按照1︰1比例混合，30℃震荡培养6h，每孔滴加5μL的X-GAL(20μg mL–1)，30℃避光培养3h，若菌液变蓝，则为可能的QS菌株。
复筛：配置100mL半固体LB培养基，高压蒸汽灭菌之后，待冷却到45℃左右(注意避免琼脂凝结成块)，无菌操作将1mL A136菌株接入半固体培养基，摇匀后倒入90mm直径的无菌平皿。待培养基在平皿中冷却之后，以1.5cm为间隔，铺上半径为0.3cm的无菌滤纸片。用移液器把初筛得到的可能的QS菌株的菌液5μL滴加到滤纸片上，30℃培养6h。在每个滤纸片上滴加5μL的X-GAL(20μg mL–1)，30℃避光培养3h后观察结果，待测菌株菌苔周边产生蓝色现象的说明其产生AHL信号(QS信号中的一种)。
实验结果如图1所示，在所筛选的200株菌株中，大约有10％的QS阳性菌株，我们从中挑选了一株显色能力较强的，即GQS09进行后续实验。
二、菌株GQS09菌的鉴定
从形态和16s rDNA序列同源性两个方面对步骤一获得的菌株GQS09进行鉴定。
1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离得到的菌株GQS09进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。
结果表明：上述步骤一分离得到的菌株为革兰氏阴性菌，菌落成淡黄色，表面湿润、边缘平坦。
2、16s rDNA序列同源性分析
常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株GQS09，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，采用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′扩增细菌16S rRNA基因保守区。25μL扩增体系包括：1×PCR反应缓冲液，200μmol/L dNTPs，上游及下游引物各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％凝胶电泳检测，阳性结果用27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行双向测序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。
菌株GQS09的16s rDNA的序列详见表1。
表1核酸序列表
鉴于上述形态特征和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离筛选得到的菌株GQS09鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis serovar konkukian)。该苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis serovar konkukian)已于2016年9月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075，保藏编号为GDMCC No.60074。
实施例2、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis serovar konkukian)GDMCCNo.60074促进冈比亚藻生长及光合作用的检测
1、实验藻种的准备
根据分离所得的冈比亚藻藻种的来源和毒性，选择了产雪卡毒素较强的冈比亚藻M2作为实验对象，研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis serovar konkukian)GDMCC No.60074对冈比亚藻生长的促进作用。
藻类的培养：使用40倍光学显微镜观察96孔板各孔中冈比亚藻的生长情况。将成功繁殖且生长状况良好的冈比亚藻转移至10ml新鲜K medium中扩大培养。培养10天后，将5ml冈比亚藻转移至装有20ml新鲜K medium的康宁25cm2透气细胞培养瓶中进行扩大培养，每三天对藻细胞浓度计数一次。
计数方法如下：轻摇细胞培养瓶使冈比亚藻均匀分布在藻液中，移液器吸取100μL藻液平铺于20×20mm浮游植物计数板上，在传统光学显微镜Leica MA 16 FA下利用计数器对冈比亚藻进行计数。藻类形态与生长状态如图2所示。可以看到藻细胞形态完整、色泽均匀、个体大小一致，体现较好的生理状态。
当藻细胞浓度超过2000cell/ml时，将20ml冈比亚藻藻液转移至装有80ml新鲜Kmedium的康宁75cm2透气细胞培养瓶扩大培养培养72小时，最后将培养后的菌液全部转移至装有400ml新鲜K medium的康宁225cm2的透气培养瓶中进行培养，该冈比亚藻培养体系用于后续试验。
2、细菌添加实验—生长
发酵产物获得方式：
1)发酵培养刺激细菌(苏云金芽孢杆菌)，培养体系为500mL锥形瓶，装液量为200mL，培养温度为30度，转速为220转/分钟。
2)将菌液在冰浴条件下在细胞破碎仪中超声处理5分钟，获得发酵产物。
根据实验设计，将刺激实验分为两部分，分别为早期刺激实验和中期刺激实验。早期刺激实验中，发酵产物加入的时间为冈比亚藻生长的对数期(细胞浓度不超过1000cells/mL)；中期刺激实验中，加入的时间为冈比亚藻的平台期(细胞浓度为6000～8000cells/mL)，此时，藻细胞浓度基本保持稳定。微生物早期刺激实验中将刺激浓度设置为低、中、高三组，其中各个浓度刺激组中添加菌的终浓度分别为5×104cells/mL，5×105cells/mL和5×106cells/mL。
3、细菌添加实验—光合作用
实验条件同上述步骤2。
叶绿素含量的测定采用叶绿素荧光分析仪Phytoplankton Analyzer(PHYTO-PAM,Walz)进行。具体步骤如下：
小心晃动藻液，迅速转移3ml藻液到玻璃比色皿中，放置于PHYTO-PAM内。打开PHYTO-PAM配套软件，在Report-window中记录叶绿素参数，获得光合作用的数据。
对数期添加细菌对藻类生长的影响结果如图3所示。从图中可以看出，细菌在低浓度组5×104cells/mL和中浓度组5×105cells/mL，对藻类的生长促进作用有限，未能显示出比对照组有明显优势。而当浓度增加到5×106cells/mL时，则表现出明显的促进作用，这表明在刺激藻类生长时，菌的最适添加量需保证在106cells/mL数量级，当浓度为1～5×106cells/mL时为最佳。
对数期添加细菌对藻类光合作用的影响结果如图4所示。从图中可以看出，细菌在低浓度组5×104cells/mL和中浓度组5×105cells/mL，在27天时分别比对照组提高1.7和2.1倍(P<0.05)。当细菌浓度提高到5×106cells/mL，对光合作用的促进作用更为明显，从17天开始全面超过对照组，一直延续到第52天，且最高值为对照组的4.2倍。
4、细菌添加实验及刺激物的制备(中期刺激)
在中期刺激实验中，将刺激浓度设置为高浓度组、双倍高浓度组和四倍高浓度组。刺激细菌加入冈比亚藻培养液后的终浓度分别为5×105cells/mL、1×106cells/mL和2×106cells/mL。中期刺激实验中设计了三种不同的微生物刺激物：
第一种为活细菌培养液，制备方法：
1)将10μL苏云金芽孢杆菌接种于1ml LB培养基，在温度为30摄氏度、转速为220转/分钟的条件下过夜活化。
2)使用50ml液体2216E扩大培养活化后的苏云金芽孢杆菌，培养条件为30摄氏度、转速为220转/分钟，得到活细菌培养液。
第二种为细菌发酵物，制备方法：
将上述得到的活细菌培养液在冰浴条件下在细胞破碎仪中超声处理5分钟，获得细菌发酵物。
第三种为细菌培养液上清，制备方法：
将上述得到的活细菌培养液在12000rpm离心20分钟，使细菌沉淀，收集的上清液为细菌培养液上清。
藻细胞计数方法
1)小心晃动细胞培养瓶，使贴壁的冈比亚藻脱离并均匀分布。
2)迅速用移液器吸取100μL藻液，平铺于自制圆形凹槽载玻片上。
3)在立体解剖显微镜下对藻液进行拍照，获得JPEG格式照片，三次重复。
4)使用图片格式转换软件将所有照片转换成无压缩版TIFF格式。
5)打开Bio-Rad Quantity one软件，载入TIFF格式照片。
6)点击Analysis-Colony counting，将Sensitivity设置为8.0，点击count进行计数。
7)计算并记录每毫升藻细胞浓度，三次重复。
8)绘制冈比亚藻的生长曲线。
细菌中期刺激实验结果如图5所示，可以看到在冈比亚藻生长第15天时(此时冈比亚藻刚进入生长平台期)加入刺激物，生长曲线在两天内即出现分化，且不同的刺激物有不同的效果。
对添加活细菌培养液而言，对照组(指没有加入任何菌、菌液、或者额外营养的冈比亚藻)藻细胞密度浓度维持在3000cells/mL，添加高浓度细菌(5×105cells/mL)时藻细胞密度可提高到6500cells/mL，而双倍高浓度(1×106cells/mL)和四倍高浓度(2×106cells/mL)对藻细胞的生长有一定的抑制作用，藻细胞密度降至800～1200cells/mL的水平。这说明为了获得大量冈比亚藻，需要控制细菌的添加量，不宜超过5×105cells/mL。
对添加细菌培养液上清而言，添加浓度分别为5×105cells/mL和2×106cells/mL时，在培养32天后，藻细胞密度分别上升至8200和7500cells/mL水平，与对照组(3000cells/mL)相比分别提高了2.07和1.5倍(图5)。
添加细菌发酵物而言，同样可以看到对藻细胞的刺激作用，添加浓度分别为5×105cells/mL和2×106cells/mL时，藻细胞密度可达6000cells/mL以上，为对照组的两倍；最为明显的是添加1×106cells/mL剂量组，在培养32天时藻细胞浓度可升至11000cell/mL，为对照组的3.67倍。
为了消除营养物对实验的干扰，本发明设置了营养盐组，即添加100倍浓度的Kmedium藻培养液于藻液中。营养盐组在25天培养后藻细胞数量达到4100cells/mL，为对照组的两倍。然而，与细菌添加物相比，营养盐组对藻细胞的生长促进依然有限，仅为菌上清(2×106cells/mL)和菌发酵产物(1×106cells/mL)的40-50％。表明藻细胞的生长促进主要是来源于细菌及其产物的作用。
实施例3、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis serovar konkukian)GDMCCNo.60074增加雪卡毒素分泌的检测
1.雪卡毒素的提取
1)使用0.22μm水相微孔滤膜对藻液进行过滤，将滤膜转移至50ml离心管中。
2)向离心管中加入25ml无水甲醇，摇晃以使滤膜充分沉浸。
3)将离心管在冰浴条件下放置于超声破壁仪中，预先润洗探头。
4)设置Pulse为5秒开，1秒关，功率为40％，每管超声处理5分钟。
5)将超声处理后的样品转移至超速离心管中，12000rpm离心10分钟。
6)转移上清到250ml圆底烧瓶中，向离心管中加入25ml无水甲醇吹打沉淀。
7)将离心管置于超声水浴锅中，超声处理30分钟。
8)重复步骤5-7两次。
9)将圆底烧瓶中收集的上清旋转蒸发处理，旋蒸温度设置为45℃，转速120rpm。
10)蒸干后加入30ml无水甲醇重新溶解。
11)将溶液转移至预先润洗的250ml分液漏斗中，加入20ml双蒸水，摇晃混匀。
12)向分液漏斗中加入50ml二氯甲烷，反复摇晃并排气2分钟，静置分液。
13)液体出现分层后，收集下层的二氯甲烷有机相，加入30ml二氯甲烷再次萃取。
14)收集下层二氯甲烷有机相后，加入20ml二氯甲烷第三次萃取。
15)收集下层二氯甲烷相，旋转蒸发处理。旋蒸温度设置为40℃，转速120rpm。
16)使用无水甲醇收集蒸干的样品，分三次收集，每次2ml润洗，共6ml。
17)将6ml样品装于15ml无菌离心管中，编号记录。
18)置于-20℃低温保存。
2.雪卡毒素测定方法
雪卡毒素定量测定基于液相色谱和细胞实验来进行。
1)细胞系和基本维护
在研究中使用的细胞株系是小鼠的成神经细胞瘤细胞，Neuro-2a。它是在美国典型细胞培养中心(ATCC)中被编以CCL131的号码的一种标准细胞系。由香港大学(PokfulamRoad，HKSAR,China)动物学系Billy Chow博士惠赠。细胞常规使用C-RPMI培养基培养，并且在监控下确保不会超过其总体的80％。在37℃下含有5％CO2的湿润空气中培养细胞。再次培养需用胰蛋白酶消化。先用10ml PBS缓冲液冲洗单层细胞，再加入3ml胰蛋白酶-EDTA，然后在37℃下培养。周期使用倒置显微镜检测细胞，直到发现细胞脱离并聚集。通过向培养瓶中加入10mlC-RPMI可以阻断胰蛋白酶消化，可向已加入10ml C-RPMI的新组织培养瓶中加入1ml重悬浮细胞。在台盼蓝不相容实验中细胞的生存能力常超过90％。
2)细胞密度测定
细胞密度可用血球计测定。将稀释后的成分加入PBS制成细胞悬液。再将混合液加入到带有适当滑动的盖玻片的血球计数器的两个室中。计算五个格子中的细胞数目，再以如下公式来确定最后的细胞浓度：
每ml细胞数＝每个格子中的平均数×稀释倍数×104。
3)细胞生存能力测定
细胞的生存能力由台盼蓝不相容实验检测，原理是活细胞不能透过像台盼蓝一类的染料，而死细胞可透过。实验通过将细胞悬液(50μL)直接与台盼蓝溶液(50μL中加入0.4％PBS缓冲液)相混合，再将混合液加入到血球计中在30分钟内使用光学显微镜下观察。在近百个细胞中，被染成蓝色的细胞可以识别出来。使用如下公式计算细胞生存力：
存活率(％)＝总的存活细胞数(未染色的)÷总细胞数×100
4)通过MTT实验评估细胞存活能力
细胞存活能力可以通过Mosmann T和Hansen描述的在96孔板中以3-(4，5-二甲基噻唑-2-y)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)染色法评估。这种方法基于活细胞可将MTT转换成蓝色的甲瓒的原理。MTT溶液(5mg/ml)使用PBS制备。用96孔板培养细胞，以C-RPMI溶液作为对照。在培养末期，从96孔板中吸出培养基，再向每个孔中加入50μL(将其与C-RMPI以1：10进行稀释)MTT溶液。在37℃下培养了1个小时后，深色的晶体形成，向其中加入100μL含有1M的HCl的异丙醇以终止反应。每一个孔的光密度值(OD)可以用Bio-Rad 550酶标仪以655nm作为参考波长而在595nm下读出。活细胞数通过与对照组的波长比值换算而得。各种毒素的毒力通过与无毒对照组的比值来标准化。
5)细胞形态观察
使用显微镜(20×物镜，10×目镜)观察细胞形态并拍照。可检测到细胞形态变化诸如细胞皱缩和胀大，出膜泡等。
6)药品制备
乌苯苷和藜芦啶溶解于0.01M HCl中分别配成10mM和1mM的储藏液。将短褐甲藻毒素标准液溶解于甲醇中配成10μg/ml的储藏溶液。
7)小鼠成神经细胞瘤细胞试验(MNA)
小鼠成神经细胞瘤细胞悬浮液重悬成浓度为2.5×105细胞/ml。悬浮细胞(200μL，5×104细胞)可以被重新分配到96孔板(平底孔、组织培养级)，并在具有5％CO2的潮湿环境里于37℃培养24小时。在孵化之后，更换成200μL含0.2mM乌苯苷和0.02mM藜芦啶的C-RPMI。对照孔中加入不含乌苯苷和藜芦啶的C-RPMI。向对照组合实验组中加入10μL毒素样品或毒素标样。样品和标样做3-4次重复。为了防止边缘效应产生，96孔板外部的行与列的孔中的细胞将不被用于试验，并且会向其中加入300ul PBS。96孔板于37℃下培养18小时。再次将培养基吸出，向每个孔中加入50ul MTT溶液(用C-RPMI以1：10的比例稀释)检测细胞活性。在37℃培养了45-60分钟后，再向其中加入100μL含0.1M的HCl的异丙醇。光密度值以Bio-Rad 550酶标仪在655nm为参照波长在595nm下读出。
检测结果如图6所示，在冈比亚藻生长初始期加入细菌发酵物，观察不同添加浓度下(高剂量组浓度为5×106cells/mL、中剂量组为5×105cells/mL、低剂量组为5×104cells/mL)冈比亚藻不同时期的产毒情况。从图上可以看出添加苏云金芽孢杆菌后，能不同程度的增加冈比亚藻的产毒能力。至末期时在最高剂量组能将毒性增加直至15×10- 4pg P-CTX-1eq/cell以上，为对照组毒性的2.2倍；且这种毒素刺激作用随细菌浓度的增加而增加。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种微生物，其为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis sp.)，于2016年9月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60074。
2.一种制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述微生物的代谢产物，
任选地，
所述代谢产物是通过下列方式获得的：
将所述微生物进行活化培养，得到活化产物；
将所述活化产物进行第一发酵培养，以便得到所述代谢产物；或
将所述第一发酵培养所得到的第一发酵产物进行处理，以便得到所述代谢产物，任选地，所述处理包括：
将所述第一发酵产物进行离心，收集上清液，以便得到所述代谢产物；或
将所述第一发酵产物进行超声破碎，以便得到所述代谢产物，
优选地，
所述第一发酵培养的温度为28～35℃；或
所述第一发酵培养的时间为24～36h；或
所述第一发酵培养是以200～220rpm的转速、13.5cm的旋转半径进行旋转震荡培养的；或
所述第一发酵培养的培养基为LB液体培养基；或
所述处理包括：将所述第一发酵产物进行超声破碎，以便得到所述代谢产物。
3.一种促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素至少之一的方法，其特征在于，包括：
将所述冈比亚藻进行第二发酵培养一定时间后，将权利要求1所述微生物的代谢产物或权利要求2所述制剂加入所述第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二发酵培养的温度为26℃，光照强度为3800Lux，12h：12h光暗循环。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物的代谢产物或所述制剂促进所述冈比亚藻生长，所述方法包括：
将所述冈比亚藻进行所述第二发酵培养至对数期时，将所述微生物的代谢产物或所述制剂加入所述第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养，
优选地，
加入所述发酵液后，所述微生物的代谢产物或所述制剂的终浓度为5×104～5×106个细胞/mL，更优选1×106～5×106个细胞/mL。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物的代谢产物或所述制剂促进所述冈比亚藻光合作用，所述方法包括：
将所述冈比亚藻进行所述第二发酵培养至对数期时，将所述微生物的代谢产物或所述制剂加入所述第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养，
优选地，
加入所述发酵液后，所述微生物的代谢产物或所述制剂的终浓度为5×104～5×106个细胞/mL，更优选1×106～5×106个细胞/mL。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物的代谢产物或所述制剂促进所述冈比亚藻分泌雪卡毒素，所述方法包括：
将所述冈比亚藻进行所述第二发酵培养至平台期时，将所述微生物的代谢产物或所述制剂加入所述第二发酵培养的发酵液中，继续进行所述第二发酵培养至40～55天，
优选地，
加入所述发酵液后，所述微生物的代谢产物或所述制剂的终浓度不高于2×106个细胞/mL，更优选5×105～1×106个细胞/mL。
8.权利要求1所述微生物或权利要求2所述制剂在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述微生物或权利要求2所述制剂的至少一种。
10.权利要求9所述试剂盒在促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的至少之一中的用途。
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