CN112098384B

CN112098384B - 一种快速预测水质是否生物稳定的简捷方法

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Publication number: CN112098384B
Application number: CN202011003367.0A
Authority: CN
Inventors: 王秋华; 张卫风; 许元龙; 王璐璐; 肖坤元; 高爱平; 龙肖霞
Original assignee: East China Jiaotong University
Current assignee: East China Jiaotong University
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112098384A

Abstract

一种快速预测水质是否生物稳定的简捷方法，其特征是，将特定细菌，等量定量加入待测水样和纯水中，然后进行ATP荧光检测，对比二者的检测结果，若有显著差异，即预测水质生物不稳定，否则即是稳定。本发明预测方法简便快捷，其评价指标应用推广价值高、实用。

Description

一种快速预测水质是否生物稳定的简捷方法

技术领域

本发明评价方法可应用于给水处理和饮用水管网水质生物稳定性分析，属于市政工程的给排水监测领域。

背景技术

饮用水的生物稳定性是指饮用水中可生物降解有机物支持异养菌生长的潜力，即当营养物质成为异养细菌生长的限制因素时，水中的有机营养物质支持细菌生长的最大可能性，它可以用与其等价的限制微生物生长的营养物质的浓度进行表示。饮用水配水***中细菌再生问题带来的危害主要有管网水质下降，管材腐蚀增加和饮用水卫生安全威胁等三个方面，当出厂水中含有一定量的有机物，水中生物生长导致色度、浊度增加，产生不好气味，随机附着于管壁的细菌将会利用水中营养基质生长而形成生物膜，并诱发管壁腐蚀与结垢；管壁腐蚀与结垢会降低管网的输水能力，使二级泵站动力消耗增加，甚至引起爆管；而生物膜与管网水中病原微生物的孳生还会对饮用者的健康构成直接的威胁。

用于饮用水生物稳定性研究的指标主要有BDOC(可生物降解溶解性有机碳)、AOC(可吸收有机碳)、BGP(细菌生长潜力)及MAP(可生物利用磷)。其中以AOC指标为主，但其测定方法复杂，一些研究也以BDOC用作水质生物稳定性评价指标，但测定时间较长仍然满足不了实际应用的要求。并且至今没有水质是否生物稳定的判断标准。

BDOC(可生物降解溶解性有机碳)测定方法可分为静态培养和动态培养两类。静态培养主要有土著菌接种的悬浮培养法和附着生物膜的砂培养法。具体步骤为先将待测水样通过膜滤去除不溶性物质，接种后在20℃及暗室条件下培养(悬浮培养法为28天，生物砂培养法为10天)，同时测定水样中DOC(溶解性有机碳)值的变化量，当DOC值恒定不变时，计算培养前后DOC值之差即为BDOC。这种方法简单易行，但却测定时间长，为了克服这个缺陷，出现了动态培养的方法，目前主要有封闭循环测定法和活塞流测定法，这些方法以生物膜为测定菌群结构，提高了降解有机物的能力，可将测定时间缩短为2-3天，甚至数小时内，但动态培养法一次仅能测定一个水样，很难满足常规研究批量试验的要求，并且BDOC所反映的只是生物生长所消耗的有机碳的量，并不能直接反映生物生长合成的生物质的量。

AOC(assimilable organic carbon，可吸收有机碳)测定法是由Van der Kooij,D.提出，主要以给水管网中常见菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)P17和螺旋菌(Spirillum sp.)NOX作为测试菌株接种水样，在特定条件下培养3-14天得到生长最大菌量，利用标准曲线将测试菌在水样中生长的最大值换算为AOC值，以标准基质乙酸钠的碳浓度形式表示。由上可知，常规AOC测定是一个很长的过程，步骤复杂，因而该法难以在实际应用中推广，怎样缩短其测试时间，简化步骤，是AOC生物测定法研究中的主要问题。

BRP(bacterial regrowth potential，细菌生长潜力)指标是Sathasivan等基于AOC生物测定提出的，与传统AOC生物测定法的主要不同，是用天然水土著菌替换特定纯种菌接种，以细菌生长的最大值表示BRP值，因此也需要至少3天左右的时间完成测定。相比特定纯种菌，采用天然土著菌落作为测试菌，更易适应本地水样，对可同化有机碳的吸收能力更强；用细菌生长的最大值代替AOC值，可避免建立标准曲线、计算生长因子，节省时间和人力。从BRP的测定方法和机理看，其本质是AOC生物测定法的衍生，这种方法的局限在于可比性差。

MAP(microbially available phosphorus，可生物利用磷)指标由Lehtola等提出，用以评价水中可生物利用磷的水平，该法通过分批培养，建立磷酸氢二钠标准基质浓度与P17菌株生长的最大值之间的标准曲线，其斜率即生长因子，通过对补充非含磷无机盐溶液和足量的有机碳的水样进行P17菌株接种及培养，测定P17菌株生长的最大值，利用生长因子将生长的最大值转换为相对标准磷酸氢二钠的浓度形式表现，即MAP值。MAP测定法是将传统AOC生物测定中的标准基质乙酸碳换成了磷酸二氢钠，将用可同化有机碳换成了可生物利用磷评价水质生物稳定性，主要反映磷源对水质生物稳定性的影响，但是其测定菌量生长最大值仍需要很长时间，测定步骤繁琐。

发明内容

本发明目的在于克服现今测定饮用水水质生物稳定性方法的局限和不足，解决没有水质是否生物稳定的判断标准问题。传统方法测定生物生长最大菌量，需要长时间培养，存在测定步骤繁琐、时间长、成本高、不宜实用推广等缺陷，其测定的结果往往不能及时应用于给水处理和饮用水管网水质生物稳定性的监测和分析。

本发明给出的技术方案为：

一种快速预测水质是否生物稳定的简捷方法，将特定细菌，等量定量加入待测水样和纯水中，然后进行ATP荧光检测，对比二者的检测结果，若有显著差异，即预测水质生物不稳定，否则即是稳定。

所述特定细菌，指常温培养1个月，处于维持生长阶段的细菌。

所述待测水样，为供水***的终端——龙头水；或者纯水等。

所述显著差异，是指对比3次以上重复测试值范围时，在不同水样间其测试值范围没有重叠且有明显间距；若重叠或相邻很近即非显著差异。

所述检测结果，其检测方法对水样是否生物稳定的判断标准为：水样是否会令加入其中的细菌繁殖增多(细菌再生长)，若发生再生长即为生物不稳定，不发生再生长即为生物稳定。

本发明预测方法简便快捷，其评价指标应用推广价值高、实用。

附图说明

图1水质细菌活力变化原理图(等菌量活力ATP测试结果)

图2不同营养物质浓度水质细菌活力变化原理图

图3实施例1的ATP荧光测试水样结果图

图4实施例2的ATP荧光测试水样结果图

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步说明。

本领域公知，细菌在营养丰富的水中会繁殖生长，总体数量增加；营养较少的水中会降低代谢速度，仅供细菌维持生长，较长时间段内维持细胞总数不变；营养极少的水中不能维持生长，会导致代谢异常，甚至产生内源性能量代谢的现象。

当细菌在水体中，其生长数量不会增加的时候，则认为这个水质是生物稳定的。

本发明技术方案是基于以下发现和研究成果：

经试验研究，本发明以超纯水作为水质生物稳定的样本，在试验测试条件下得出超纯水中细菌活力变化特征，并发现符合此特征的水质也具有生物稳定性，与此特征有显著差异的水质是生物不稳定的。(方法建立原理如图1及图2)

在超纯水测试下的且以特定条件下细菌(处于维持生长阶段的细菌)活力变化特征，作为水质是否生物稳定的界定标准，由此预测被测水体的水质生物稳定。理论解释：

将定量处于维持生长阶段的特定细菌培养液加入到超纯水中，形成细菌超纯水溶液。利用ATP荧光检测技术，分别测试等量定量的原细菌培养液和细菌超纯水溶液的生长活力(确保两种所测样品中含有相同的细菌量)，测试结果表明原细菌培养液与细菌超纯水溶液间的测试结果具有明显差异。说明细菌进入超纯水后，由于新环境中水质与原生存环境中的水质有很大差异，细菌生长活力也随之产生明显变化。

测试结果表明原细菌培养液与细菌超纯水溶液间的测试结果具有明显差异，如图1所示：等菌量活力ATP测试结果；JC：加入细菌培养液的超纯水ATP测试结果；J：原细菌培养液ATP测试结果。

进一步应用方面的探索和验证：

将细菌加入不同稀释倍数的饮用水水样中(其中超纯水作为稀释剂)，也做了与上相同的ATP测试试验。通过对比加入细菌后立即测试、3小时后测试、6日后测试及14日后测试的结果(图2)，发现在短时段内(3h)，由于龙头水的营养物质导致所有含龙头水的水样都发生了细菌活力增长，试验中将3h测试值作为起始细菌量。6d曲线和14d曲线结果表明培养后期超纯水(C)、0.05倍稀释自来水(0.05S)、0.1倍稀释自来水(0.1S)及0.2倍稀释自来水(0.2S)水样中细菌量降至3h起始细菌量以下，没有发生细菌量增多，因此可判断是生物稳定的；0.4倍稀释自来水(0.4S)、0.6倍稀释自来水(0.6S)、0.8倍稀释自来水(0.8S)、原自来水(S)的测试结果中细菌量大于或等于3h测试值，明显发生了细菌量增多，因此可以判断是生物不稳定的。立即测试结果(0曲线)表明生物稳定水样与生物不稳定水样之间，其细菌活力测试结果有显著差异(指对比3次重复测试值范围时，不同水样间，其测试值范围没有重叠且有明显间距，即是显著差异；若重叠或相邻很近即非显著差异)。立即测试结果(0曲线)中，发现与超纯水C对比，生物稳定水样(0.05S、0.1S及0.2S)的细菌活力变化没有显著差异，生物稳定性差的水样(0.4S、0.6S、0.8S及S)测试结果变化范围与以上水样的具有显著差异，并且0.4S、0.6S、0.8S及S水样的测试值随龙头水比例增大而呈现下降的规律。

图2为不同营养物质浓度水质细菌活力变化原理图。加入细菌后如图2所示的不同时间点进行细菌活力测试获得的四条曲线：

立即测试(0曲线)；

3小时后测试(3hr曲线)；

6日后测试(6d曲线)；

14日后测试(14d曲线)。

每条曲线，其横坐标表示不同的试验水样，包括1个超纯水水样和7个不同稀释倍数龙头水水样，分别是：

超纯水(C)；

稀释倍数为0.05的龙头水(0.05S)；

稀释倍数为0.1的龙头水(0.1S)；

稀释倍数为0.2的龙头水(0.2S)；

稀释倍数为0.4的龙头水(0.4S)；

稀释倍数为0.6的龙头水(0.6S)；

稀释倍数为0.8的龙头水(0.8S)；

原龙头水水样，稀释倍数为1(1S)；

其纵坐标轴是细菌活力(ATP值)的相对发光强度值(单位：RLU)。

根据如上所述的试验及理论基础，建立了预测水质是否生物稳定的界定标准，并发明一种快速预测水质是否生物稳定的简捷方法，即分别将特定细菌(特定细菌，指常温培养1个月，处于维持生长阶段的细菌)，等量加入待测水样(例如供水***的终端——龙头水)和超纯水中，然后进行ATP荧光检测，对比二者的检测结果，若有显著差异(指对比3次重复测试值范围时，不同水样间，其测试值范围没有重叠且有明显间距，即是显著差异；若重叠或相邻很近即非显著差异)，即预测水质生物不稳定，否则即是稳定。

进一步的，给出实施例。

实施例1

方法说明

测定仪器、器皿和材料

恒温培养箱；无菌操作台；酒精灯；ATP测定仪；40ml无碳采样瓶；移液器(2--200μl，1ml，10ml)；milli-Q超纯水仪及纯水仪。

测试菌

实施例所用菌为P17(Pseudomonas fluorescense)及NOX(Spirillum sp.)

测试准备

1、1000╳标准碳溶液的配制(乙酸碳浓度为1000mg/L)

NaAc:5.67g/L

2、1000╳缓冲溶液的配制

FeSO₄: 1mg/L

K₂HPO₄: 7g/L

KH₂PO₄: 3g/L

MgSO₄·7H₂O:0.1g/L

(NH4)₂SO₄: 1g/L

NaCl: 0.1g/L

3、2╳标准碳溶液的配制(乙酸碳浓度为2000μg/L)

1000╳标准碳溶液:2ml/L

1000╳缓冲溶液:1ml/L

4、测试中接种细菌母液的培养

将P17与NOX菌落接种到2╳标准碳溶液中30℃恒温培养一个月左右，在4℃条件下冷藏保存。

测试步骤：

1、取出提前准备好的测试细菌液(饮用水中的细菌，主要是P17和NOX)。

2、水样的准备：制备待测超纯水，并采集待测龙头水(若有余氯，则硫代硫酸钠中和余氯)。每个龙头水水样都分作两份，一份加菌、一份不加菌。案例采集地：某校园住宅用水管网末端龙头水。

3、接菌水样的制备：向1ml待测水样中加入50μl的细菌测试液。

4、ATP荧光检测：在室温条件下，测试等量接菌水样并记录结果。试验重复设为3次。

5、结果分析：接菌龙头水折算值JL-L(由JL测试值减去L测试值得出)与接菌超纯水JC测试结果对照，得出两者试验结果属于显著差异(两者各自3次重复测试数据变化幅度不重叠，且有明显间距。如图3)。

如图3所示的ATP荧光测试水样结果图，注：每个样重复3次。L为未接菌龙头水；JL为接菌龙头水；JC为接菌超纯水；JL-L为折算接菌龙头水测试值。

实施例1的预测结论：显著差异结果表明该测样是生物不稳定的。

图3中JL-L与JC的3次重复试验结果有明显差异，故预测该龙头水的水质不稳定。

本发明相对于以往饮用水生物稳定性检测的优点是快速简便，不局限特定的异养菌菌种和接种培养条件，提供的信息紧扣水质生物稳定性的特点，能够及时有效地应用于饮用水水厂及管网***的水质调控中。

实施例2

方法说明、测定仪器、器皿和材料等都参照实施例1。

该测定方法具体包括如下步骤：

(1)测试细菌液的准备：特定细菌培养液作为测试细菌液。特定细菌，指常温培养1个月，处于维持生长阶段的细菌；细菌的种类为NOX(Spirillum sp.)。

(2)水样的准备：以超纯水(JC)作为对照水样，并制备纯水(CS)(纯水中不含有细菌，因此不用折算)。

(3)接菌水样的制备：向待测水样中加入同量(50μl菌液/ml水样)的细菌测试液。

(4)ATP荧光检测：在室温条件下，测试接菌纯水(CS)和接菌超纯水(JC)，记录结果(见图4)。试验重复设为3次。

(5)结果分析：比较分析超纯水(JC)与纯水(CS)3次重复试验结果特点(图4)，根据该发明中发现并制定的水质生物稳定预测标准，进行分析，差异不显著(两个水样的范围有所重叠，没有明显间距)故得出水质稳定预测结论。

所述样品ATP测定中，ATP试剂与测样比例为50μl：50μl。

其它实验过程和判断方法都参照实施例1。

本实施例说明，本发明方法也适用于对纯水水质的生物稳定性预测。

Claims

1.一种快速预测水质是否生物稳定的简捷方法，其特征是，将特定细菌，等量定量加入待测水样和超纯水中，然后立即进行ATP荧光检测，对比二者的检测结果，若有显著差异，即预测水质生物不稳定，否则即是稳定；

所述特定细菌，指常温培养1个月，处于维持生长阶段的细菌；

所述显著差异，是指对比三次重复测试值范围时，不同水样间，其测试值范围没有重叠且有明显间距；若重叠或相邻很近即为非显著差异；

该方法还包括以下实验：

以超纯水作为水质生物稳定的样本，在试验测试条件下得出超纯水中细菌活力变化特征，符合所述特征的水质具有生物稳定性，与所述特征有显著差异的水质是生物不稳定的；

在超纯水测试下的且以处于维持生长阶段的细菌活力变化特征，作为水质是否生物稳定的界定标准，由此预测被测水体的水质生物稳定；

将定量处于维持生长阶段的特定细菌培养液加入到超纯水中，形成细菌超纯水溶液；利用ATP荧光检测技术，分别测试等量定量的原细菌培养液和细菌超纯水溶液的生长活力，确保两种所测样品中含有相同的细菌量，测试结果表明原细菌培养液与细菌超纯水溶液间的测试结果具有明显差异；细菌进入超纯水后，由于新环境中水质与原生存环境中的水质有很大差异，细菌生长活力也随之产生明显变化；

探索和验证：

将定量细菌加入不同稀释倍数的饮用水水样中，其中超纯水作为稀释剂，做ATP测试试验；通过对比加入细菌后立即测试、3小时后测试、6日后测试及14日后测试的结果，发现在3 h时段内，由于龙头水的营养物质导致所有含龙头水的水样都发生了细菌活力增长，试验中将3 h测试值作为起始细菌量；6日后测试及14日后测试的结果表明培养后期超纯水、0.05倍稀释自来水、0.1倍稀释自来水及0.2倍稀释自来水水样中细菌量降至3 h起始细菌量以下，没有发生细菌量增多，判断是生物稳定的；0.4倍稀释自来水、0.6倍稀释自来水、0.8倍稀释自来水、原自来水的测试结果中细菌量大于或等于3 h测试值，发生了细菌量增多，判断是生物不稳定的；立即测试结果表明生物稳定水样与生物不稳定水样之间，其细菌活力测试结果有显著差异，立即测试结果中，与超纯水对比，生物稳定水样即0.05倍稀释自来水、0.1倍稀释自来水及0.2倍稀释自来水的细菌活力变化没有显著差异，生物不稳定的水样即0.4倍稀释自来水、0.6倍稀释自来水、0.8倍稀释自来水及原自来水测试结果变化范围具有显著差异，并且水样的测试值随龙头水比例增大而呈现下降的规律；

所述特定细菌为P17和NOX, 所述P17为Pseudomonas fluorescense，所述NOX为Spirillum sp；

测试准备：

1)1000╳标准碳溶液的配制，乙酸碳浓度为1000mg/L

NaAc: 5.67g/L

2)1000╳缓冲溶液的配制

FeSO₄: 1mg/L

K₂HPO₄: 7g/L

KH₂PO₄: 3g/L

MgSO₄·7H₂O: 0.1g/L

(NH4)₂SO₄: 1g/L

NaCl: 0.1g/L

3)2╳标准碳溶液的配制,乙酸碳浓度为2000μg/L

1000╳标准碳溶液: 2ml/L

1000╳缓冲溶液: 1ml/L

4)测试中接种细菌母液的培养

将P17与NOX菌落接种到2╳标准碳溶液中30℃恒温培养一个月，在4℃条件下冷藏保存；

测试步骤：

1）取出提前准备好的测试细菌液；

2）水样的准备：制备待测超纯水，并采集待测龙头水；每个龙头水水样都分作两份，一份加菌、一份不加菌；

3）接菌水样的制备：向1ml待测水样中加入50μl的细菌测试液；

4）ATP荧光检测：在室温条件下，测试等量接菌水样并记录结果；试验重复设为三次；

5）结果分析。