CN102453746A - 一种专性烃氧化菌检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种专性烃氧化菌检测方法，属于应用微生物检测方法技术领域。其特征在于用基础培养基悬浮、稀释土壤样品，结合选择性培养碳源和氧化还原指示染料，3-5天短期培养后，通过气密培养管的颜色变化，最后通过计算机程序计算土壤样品中专性烃氧化菌的数量。本发明所述的一种专性烃氧化菌检测技术，操作过程简单，经济实用，短期内快速得到结果；专性强，可以有效得屏蔽其他细菌对计数的干扰；计数过程简单准确，适于样品数量较多的大规模工业勘探测量。

Description

一种专性烃氧化菌检测方法

技术领域

本发明涉及应用微生物检测方法技术领域，特别是涉及一种为地表微生物勘探技术提供微生物检测手段的专性烃氧化菌检测方法。

背景技术

微生物油气勘探是基于地下油气藏的挥发性或半挥发性烃的垂直迁移理论逐步建立起来的。伴随着表层土壤中一定浓度的烃持续供给，氧化层中的以烃作为唯一碳源的微生物得以快速生长和繁殖，其丰度差异就可以用来间接表征土壤中轻烃浓度的高低。因此，这种以烃为唯一碳源的氧化微生物(即：专性烃氧化菌)数量的测定对于油气勘探的科研和生产实际工作具有十分重要的指导作用和现实意义。但由于这种烃氧化微生物测试难度极大，其复杂的生理学特性导致先前很多研究的特异性和准确性很难得到保证，严重限制了微生物油气勘探的发展。

前苏联Kartsev等(1959)采用了一种最简单的方法来测定土壤中的烃消耗细菌。把土壤放入培养反应器，随后注入一定量的无机盐培养溶液并在顶空加入一定比例的丙烷或丁烷气体。培养一段时间后，根据培养基表面的菌膜厚度来估算细菌的数量和活性。这种方法虽然在早期取得了一些效果，但由于其受主观判断的影响较大，培养时间较长，误探率也较高，逐渐被淘汰。

另一种是气体利用检测法，其原理是测定培养过程中被烃氧化细菌消耗烃的量。Taggart等(U.S.Patent NO.2349472)构建了一系列较复杂的气体分压测试装置，监测培养时间内挥发性烃分压的变化，间接表征了土壤中的烃氧化细菌数量。这种方法的缺点在于培养时间特别长，通常需要数周时间。另外环境中很多微生物具有烃降解能力，在长期的驯化后，或多或少会表现出一定的烃消耗活性。

为了克服以上缺点，Hitzman等(U.S.Patent NO.2880142)采用了平板计数法或滚管法来直接测定土壤中的烃氧化微生物。他在培养基中加入高浓度毒性物质为唯一碳源来培养烃氧化菌，而这些毒性物质(如醇，醛等)可以抑制其他土壤微生物的生长。但是这种方法的缺点也是周期长，而且一般都是通过计数平板上的菌落数。琼脂本身也是一种碳源，不可避免地会造成假阳性，带来计数误差。

除此以外，也有研究者(U.S.Patent NO.2269889)通过测定烃氧化过程中的代谢产物来表征烃氧化菌群数量。烃代谢过程中产生的羧酸经过氧化物后会产生颜色变化，同时氧化还原电位也会发生变化。但季节变化和土壤中钙镁金属离子都会对最终结果造成较大影响。

由此可见，现有的传统测试技术和测试手段远不能满足实际生产的要求。非特异性、假阳性、培养时间过长、实验操作和设备的复杂性等都大大限制了专性烃氧化微生物计数的实际应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种专性烃氧化菌检测技术，能够快速准确地测定气态烃氧化菌数量。该技术需要满足3个条件：(1)特异性地检测烃氧化菌或其代谢中间产物；(2)大幅度缩短计数周期以适应规模化的油气勘探；(3)用液体培养基替代琼脂平板。

本发明通过如下技术方案来实现上述目的：

本发明的专性烃氧化菌检测方法，包括如下步骤：

(一)基础培养基的制备

(二)专性烃氧化菌培养管的制备

(三)专性烃氧化菌检测。

所述的专性烃氧化菌检测方法是将待测样品逐级稀释后，加入到已经注入基础培养基的专性烃氧化菌培养管进行培养，直至测试管中无菌生长为止，然后根据稀释菌液接种培养后的阳性试管数，用统计学方法计算出初始土样中的烃氧化菌数量。

其中：

所述的(一)基础培养基由基础无机盐，微量元素以及生长促进剂依次用蒸馏水溶解，充分混匀，pH值调整至7.2-7.4，即配置成基础培养基。

在具体实施中，

按照基础培养基中浓度(g/L)计，所述的基础无机盐可以包括下列组分：

KNO₃             1

MgSO₄·7H₂O      0.2

KH₂PO₄           0.2

K₂HPO₄           0.8

NaCl    1。

以上无机盐组成为推荐组合之一。种类的选择以满足微生物生长的基本矿质元素为标准，即含有Mg、Na、K、N、P、S以及相应的磷酸盐缓冲体系。例如，可以用MgNO₃代替MgSO₄，用NH₄NO₃代替KNO₃等。

浓度上限以不能抑制微生物的生长为标准，推荐值为0.1-1.0g/L。

按照基础培养基中浓度(mg/L)计，所述的微量元素可以包括下列组分：

NaMoO₄·2H₂O    0.5

FeSO₄·7H₂O     0.5

ZnSO₄·7H₂O     0.4

MnCl₂·7H₂O     0.02

CoCl₂·6H₂O     0.05

NiCl₂·6H₂O     0.01

H₃BO₃           0.015。

除上述微量元素种类外，还可以适量添加Cu、Cr、Se、V、Si等元素。

浓度控制在1mg/L以内。

按照基础培养基中浓度(μg/L)计，所述的生长促进剂可以包括下列组分：

叶酸          20

维生素B₁      50

泛酸钙        50

维生素B₁₂     1

核黄素        50

烟酰胺        50。

以上为推荐的微生物生长促进剂，实际操作时可以依实际情况增加维生素的种类。浓度范围控制在50μg/L以内。

所述的(二)专性烃氧化菌培养管的制备方法为

(1)用高压蒸汽灭菌锅在121℃、1.05kg/cm²条件下将培养管高温灭菌15min：

(2)培养管冷却后加入终浓度为0.5-1％的过滤除菌的C₂-C₄混合直链醇、以及终浓度为0.001％的氧化还原指示剂刃天青；

(3)用自动移液器将步骤(一)所配置的基础培养基按每管4.5ml加入已灭菌的气密性培养管中，再用丁基胶塞密封，即制成专性烃氧化菌培养管。

所述的(三)专性烃氧化菌检测方法采用采用最大或然数法；

所述的专性烃氧化菌检测方法步骤如下：

(1)水样制备：取5g土壤样在专性烃氧化菌培养液中配制成50ml水样，根据水样中烃氧化菌的大致含量，将数个培养管排成一组，依次编上序号；

(2)用无菌吸头吸取0.5ml待测水样并注入1号烃氧化菌测试管内，涡旋震荡30秒；

(3)另换无菌吸头从混匀后的1号测试管内吸取0.5ml液体注入2号烃氧化菌测试管内，涡旋震荡30秒；

(4)依次重复上述操作程序，直到最后一管为止；

(5)将上述一系列培养管置于30℃生化培养箱中培养，3-5天后观察培养管内变化，判断专性烃氧化菌的生长情况；

(6)判别依据：无菌存在的测试管中培养液为蓝色，而有菌存在的专性烃氧化菌测试管内的培养液由蓝色变为粉红色或无色，液体表层出现菌膜；因此，专性烃氧化菌测试管内出现明显颜色变化的，表示有专性烃氧化菌生长；

(7)根据同一样品系列的测试管内细菌生长情况以及平行管数量，通过计算机程序MPN Calculator计算出待测土壤样品中的专性烃氧化菌菌数。

上面所述的最大或然数法(most probable number，MPN)测定采用绝迹稀释法原理，即将欲测定样品用无菌注射器逐级注入测试管中稀释培养，直到最后一个测试管无菌生长为止，根据稀释的倍数配合概率统计计算出样品中细菌的数目。MPN Calculator为估算细菌MPN的计算机程序，可免于查表和手工计算。

以上各个操作参数，除培养温度和观察时间外，均可以按比例扩大。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

本发明是为微生物油气勘探中所建立的特异性地检测土壤样品中专性烃氧化细菌数量的方法。此方法通过用基础培养基悬浮、稀释土壤样品，结合选择性培养底物和氧化还原指示染料，短期培养后通过气密培养管的颜色变化即可读出专性烃氧化菌的数量。特点为：

(1)操作过程简单，将培养周期缩短至3-5天，成倍地节约了时间和资源，经济实用，短期内快速得到结果，同时所产生的经济效益极其显著；

(2)以高浓度醇为微生物生长的唯一碳源，对非烃氧化微生物具有极强的毒性，可以有效得屏蔽其他细菌对计数的干扰；

(3)阳性效果对比明显，计数过程简单准确，软件辅助计数快速直接，适于样品数量较多的大规模工业勘探测量。

(4)由于本发明所述的检测技术特异性高的特点，保证了所检测烃氧化菌的专属性，为微生物勘探技术的研究提供了有效的技术手段；

(5.)在地表微生物勘探技术研究中的应用表明，所检测的专性烃氧化菌与油气田对应关系较好，对发挥微生物勘探技术的应用价值，具有很好的推动作用。

本发明应用于油气微生物勘探技术领域，可准确测定油气勘探土壤样品中的气态烃氧化菌菌数及类型。通过检测油气藏正上方的地表土壤中挥发性烃氧化菌的异常发育情况，可以预测下伏油气藏的存在，并可作为间接指标跟踪油气藏中烃类在上覆地层中的运移和分布。进一步推广，本发明还可作为油藏表征的新工具延伸到开发领域。在开采成熟区，采用紧密排列的采样网格来检测烃氧化菌异常，并将微生物信息与地质和地球物理资料结合起来，能对现有油区内布置加密井和进行扩边增储提出合理的预测。另外，在石油微生物开采和石油污染生物修复等方面也有一定的实用价值。

本发明与传统的MPN法及平板法相比，具有生长指示明显，操作极为简单，可大大提高工作效率等优点，尤其适合大规模工业化测试。

附图说明

图1专性烃氧化菌检测技术流程图

具体实施方式

本发明优选的实施方式，详细说明如下。

如图1所示：

本发明所述的一种专性烃氧化菌检测要素包括土壤样品1，基础培养基2，代谢指示剂3，专性碳源4，MPN培养***5，MPN计算软件6。

各步骤的流程土壤样品预处理(A)，专性烃氧化菌培养(B)，专性烃氧化菌计数(C)。

土壤样品预处理(A)：包括土壤平行样品混合，基础培养液悬浮、均质和梯度稀释。基础培养基2配方由基础元素、微量元素和生长促进剂组成。

专性烃氧化菌培养(B)：在基础培养基中加入代谢指示剂3(刃天青)和专性碳源4(直链混合醇)，分装后即制成专性烃氧化菌培养管。一定数量的专性烃氧化菌培养管组成MPN培养***5。将梯度稀释的土壤悬液加入MPN培养***5，培养3-5天后根据代谢指示剂3的颜色变化进行读数。

专性烃氧化菌计数(C)：根据测试管内细菌生长情况以及平行管数量，通过MPN计算软件6得出待测土壤样品中的气态烃氧化菌菌数。

实施例

已在某油气区进行了地表微生物验证性研究，使用本发明所述的检测技术对两个采样断面的烃氧化菌数量进行了测定。结果显示所检测的专性烃氧化菌数量与下伏油气田对应关系良好，具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种专性烃氧化菌检测方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：

(一)基础培养基的制备；

(二)专性烃氧化菌培养管的制备；

(三)专性烃氧化菌检测；

所述的专性烃氧化菌检测方法是将待测样品逐级稀释后，加入到已经注入基础培养基的专性烃氧化菌培养管进行培养，直至测试管中无菌生长为止，然后根据稀释菌液接种培养后的阳性试管数，用统计学方法计算出初始土样中的烃氧化菌数量。

2.如权利要求1所述的专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

所述的(一)基础培养基由基础无机盐，微量元素以及生长促进剂依次用蒸馏水溶解，充分混匀，pH值调整至7.2-7.4，即配置成基础培养基。

3.如权利要求2所述的一种专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

按照基础培养基中浓度g/L计，所述的基础无机盐包括下列组分：

KNO₃                   1

MgSO₄·7H₂O            0.2

KH₂PO₄                 0.2

K₂HPO₄                 0.8

Na                     1。

4.如权利要求2所述的专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

按照基础培养基中浓度mg/L计，所述的微量元素包括下列组分：

NaMoO₄·2H₂O     0.5

FeSO₄·7H₂O      0.5

ZnSO₄·7H₂O      0.4

MnCl₂·7H₂O      0.02

CoCl₂·6H₂O      0.05

NiCl₂·6H₂O      0.01

H₃BO₃            0.015。

5.如权利要求2所述的专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

按照基础培养基中浓度μg/L计，所述的生长促进剂包括下列组分：

叶酸         20

维生素B₁     50

泛酸钙       50

维生素B₁₂    1

核黄素       50

烟酰胺       50。

6.如权利要求5所述的专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

按照基础培养基中浓度g/L计，所述的基础无机盐包括下列组分：

KNO₃           1

MgSO₄·7H₂O    0.2

KH₂PO₄       0.2

K₂HPO₄       0.8

NaCl         1；

按照基础培养基中浓度mg/L计，所述的微量元素包括下列组分：

NaMoO₄·2H₂O    0.5

FeSO₄·7H₂O     0.5

ZnSO₄·7H₂O     0.4

MnCl₂·7H₂O     0.02

CoCl₂·6H₂O     0.05

NiCl₂·6H₂O     0.01

H₃BO₃           0.015。

7.如权利要求2所述的专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

所述的(二)专性烃氧化菌培养管的制备方法为

(1)用高压蒸汽灭菌锅在121℃、1.05kg/cm²条件下将培养管高温灭菌15min；

(2)培养管冷却后加入终浓度为0.5-1％的过滤除菌的C₂-C₄混合直链醇、以及终浓度为0.001％的氧化还原指示剂刃天青；

(3)用自动移液器将步骤(一)所配置的基础培养基按每管4.5ml加入已灭菌的气密性培养管中，再用丁基胶塞密封，即制成专性烃氧化菌培养管。

8.如权利要求2所述的专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

所述的(三)专性烃氧化菌检测方法采用采用最大或然数法。

9.如权利要求6所述的专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

所述的(二)专性烃氧化菌培养管的制备方法为

(1)用高压蒸汽灭菌锅在121℃、1.05kg/cm²条件下将培养管高温灭菌15min：

(2)培养管冷却后加入终浓度为0.5-1％的过滤除菌的C₂-C₄混合直链醇、以及终浓度为0.001％的氧化还原指示剂刃天青；

(3)用自动移液器将步骤(一)所配置的基础培养基按每管4.5ml加入已灭菌的气密性培养管中，再用丁基胶塞密封，即制成专性烃氧化菌培养管；

所述的(三)专性烃氧化菌检测方法采用采用最大或然数法。

10.如权利要求1～9之一所述的专性烃氧化菌检测方法，其特征在于：

所述的专性烃氧化菌检测方法步骤如下：

(1)水样制备：取5g土壤样在专性烃氧化菌培养液中配制成50ml水样，根据水样中烃氧化菌的大致含量，将数个培养管排成一组，依次编上序号；

(2)用无菌吸头吸取0.5ml待测水样并注入1号烃氧化菌测试管内，涡旋震荡30秒；

(3)另换无菌吸头从混匀后的1号测试管内吸取0.5ml液体注入2号烃氧化菌测试管内，涡旋震荡30秒；

(4)依次重复上述操作程序，直到最后一管为止；

(5)将上述一系列培养管置于30℃生化培养箱中培养，3-5天后观察培养管内变化，判断专性烃氧化菌的生长情况；

(6)判别依据：无菌存在的测试管中培养液为蓝色，而有菌存在的专性烃氧化菌测试管内的培养液由蓝色变为粉红色或无色，液体表层出现菌膜；因此，专性烃氧化菌测试管内出现明显颜色变化的，表示有专性烃氧化菌生长；

(7)根据同一样品系列的测试管内细菌生长情况以及平行管数量，通过计算机程序MPN Calculator计算出待测土壤样品中的专性烃氧化菌菌数。

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