CN114276984B - 雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用 - Google Patents
雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114276984B CN114276984B CN202111665381.1A CN202111665381A CN114276984B CN 114276984 B CN114276984 B CN 114276984B CN 202111665381 A CN202111665381 A CN 202111665381A CN 114276984 B CN114276984 B CN 114276984B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- stem cells
- bmp
- female germ
- sperm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 108
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 42
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 63
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 45
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 43
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 37
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 claims description 34
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 20
- 230000002381 testicular Effects 0.000 claims description 20
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 claims description 19
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 17
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims description 17
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 17
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 claims description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 16
- 102100026041 Acrosin Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000107 Acrosin Proteins 0.000 claims description 14
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 13
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 13
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 claims description 13
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 13
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 claims description 12
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 claims description 12
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 11
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 9
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 9
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 9
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- 102100040067 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM36 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000610402 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase TRIM36 Proteins 0.000 claims description 8
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000648184 Homo sapiens Spermatid nuclear transition protein 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 8
- 102100028899 Spermatid nuclear transition protein 1 Human genes 0.000 claims description 8
- 239000000488 activin Substances 0.000 claims description 8
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 claims description 8
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 101710134395 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027668 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 6
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 6
- 101001064774 Homo sapiens Peroxidasin-like protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101001038163 Homo sapiens Sperm protamine P1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100031894 Peroxidasin-like protein Human genes 0.000 claims description 6
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 6
- PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N n-(4-hydroxyphenyl)-2-(1,1,3-trioxo-1,2-benzothiazol-2-yl)acetamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CN1S(=O)(=O)C2=CC=CC=C2C1=O PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 6
- 101710134389 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100027667 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 5
- 101710156847 CTD small phosphatase-like protein Proteins 0.000 claims description 4
- 102100027674 CTD small phosphatase-like protein Human genes 0.000 claims description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 101000831889 Homo sapiens Stimulated by retinoic acid gene 8 protein homolog Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024169 Stimulated by retinoic acid gene 8 protein homolog Human genes 0.000 claims description 3
- 210000003794 male germ cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 3
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 abstract 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 12
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 12
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 7
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 7
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 6
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 6
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 5
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 5
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000004420 female germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000023386 male meiosis Effects 0.000 description 4
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 description 4
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 101000726252 Mus musculus Cysteine-rich secretory protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108010059574 C5a peptidase Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 101500025418 Mus musculus Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 101000942966 Mus musculus Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 101150049281 PRM1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102100036280 Sugar transporter SWEET1 Human genes 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N murodermin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N1)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC=2NC=NC=2)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N2)C(C)C)=O)CSSC1)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 description 1
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010022894 Euchromatin Proteins 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000007313 Reproductive Tract Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000469 anti-sperm effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000632 euchromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001368 germline stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000003014 totipotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002444 unipotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 201000004822 varicocele Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用。本发明首次提出体外诱导雌性生殖干细胞分化成单倍体***细胞。该方法可为动物繁殖如优质奶牛的育种提供一种新策略。
Description
技术领域
本发明属于辅助生殖技术领域,更具体地,本发明涉及雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用。
背景技术
国际卫生组织规定,男性的***每毫升不低于2千万,如果低于2千万就归为少精症。少精症的病因较多,包括内源性因素如***、隐睾、生殖道感染、自身免疫产生抗***抗体。一些外源性因素也会引起少精症。目前也有一些为病因不明的特发性少精症。少精症导致男性不育,越来越多人受此困扰,生育方面有很大影响。因此,人工诱导体外产生***,是少精症治疗的一个可行性方案。
干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞群体的总称。按干细胞的分化潜能的大小可以分为全能干细胞,多能干细胞和单能干细胞。胚胎干细胞(Embryonic Stemcell,ES/ESC细胞)是一种从早期胚胎或者原始性腺中分离出来的细胞,可以向多种组织进行分化,同时在体外还具有无限增殖的能力。胚胎干细胞作为一种未分化细胞,具有全能性,也就是发育为各种不同细胞的特性。其中人类的胚胎干细胞可以分化为多种细胞组织,包括滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。从形态上来讲,胚胎干细胞的细胞核较大而细胞质较少,且细胞结构比较简单,其中胚胎干细胞的细胞核中大多为常染色质。胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性,能分化出成体动物的所有组织和器官,包括生殖细胞。然而,由胚胎干细胞分化获得长形***细胞存在技术难度,难以获得高活性、带有完整的尾部结构的长形***细胞。
雌性生殖干细胞是从动物卵巢内分离获得的一类干细胞。以往科学家一直认定,雌性哺乳动物一出生,***就停止产生,从此只会不断减少;而本发明人此前的工作中,在成年哺乳动物的卵巢中发现了雌性生殖干细胞,可以不断分化出***。
然而,雌性生殖干细胞能否在体外发育为功能性***细胞及其体外发育特征尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用
在本发明的第一方面,提供一种体外制备功能性***的方法,包括:以雌性生殖干细胞为出发细胞,将之与睾丸体细胞混合,进行预培养以及诱导分化;从诱导分化产物中生成功能性***。
在一个或多个实施方式中,所述预培养包括:将雌性生殖干细胞与睾丸体细胞以1:10~10:1,较佳地1:5~5:1,更佳地1:2~2:1的比例混合,在细胞培养基中进行培养;较佳地所述细胞培养基为含血清的培养基;较佳地所述细胞培养基包括DMEM培养基。
在一个或多个实施方式中,用于混合培养的培养基为液体培养基(培养液)。
在一个或多个实施方式中,用于混合培养的培养基中含有5%~15%胎牛血清。
在一个或多个实施方式中,所述雌性生殖干细胞与睾丸体细胞诱导分化包括:第1阶段诱导:以Knockout血清替代物、BMP-2、BMP-4、BMP-7、全反式维甲酸和activin A诱导;第2阶段诱导:以Knockout血清替代物、睾酮、FSH和垂体提取物诱导。
在一个或多个实施方式中,第1阶段中,各组分用量包括:Knockout血清替代物20±4%(v/v)、BMP-2 20±5ng/mL、BMP-4 20±5ng/mL、BMP-7 20±5ng/mL、全反式维甲酸1±0.4μM和activin A 100±40ng/mL。
在一个或多个实施方式中,第2阶段中,各组分用量包括:Knockout血清替代物20±4%,睾酮10±3mM、FSH 200±30ng/mL和垂体提取物50±15mg/mL。
在一个或多个实施方式中,各个组分被添加于细胞培养基中;更佳地,所述细胞培养基为MEMα培养基。
在一个或多个实施方式中,用于诱导的培养基为液体培养基(培养液)。
在一个或多个实施方式中,第1阶段中,适时更换新鲜培养基;较佳地1-2天更换一次新鲜培养基;更佳地每天更换一次新鲜培养基。
在一个或多个实施方式中,第2阶段中,适时更换新鲜培养基;较佳地1-2天更换一次新鲜培养基;更佳地每天更换一次新鲜培养基。
在一个或多个实施方式中,所述的分离后睾丸体细胞中不含有生殖细胞,其不会产生***细胞。
在一个或多个实施方式中,在动物实验时,所述的睾丸体细胞分离自KITw/wv小鼠。
在一个或多个实施方式中,第1阶段中,Knockout血清替代物优选为20±3%、更优选为20±2%,更优选为20±1%。
在一个或多个实施方式中,第1阶段中,BMP-2优选为20±4ng/mL,更优选为20±3ng/mL,优选为20±2ng/mL,优选为20±1ng/mL。
在一个或多个实施方式中,第1阶段中,BMP-4优选为20±4ng/mL,更优选为20±3ng/mL,优选为20±2ng/mL,优选为20±1ng/mL。
在一个或多个实施方式中,第1阶段中,BMP-7优选为20±4ng/mL,更优选为20±3ng/mL,优选为20±2ng/mL,优选为20±1ng/mL。
在一个或多个实施方式中,第2阶段中,Knockout血清替代物优选为20±3%、更优选为20±2%,更优选为20±1%。
在一个或多个实施方式中,第2阶段中,睾酮优选为10±2mM,更优选10±1mM。
在一个或多个实施方式中,第2阶段中,FSH优选为200±20ng/mL,更优选为FSH200±15ng/mL,更优选为FSH 200±10ng/mL,更优选为FSH 200±5g/mL。
在一个或多个实施方式中,第2阶段中,垂体提取物优选50±12mg/mL,更优选50±10mg/mL,更优选50±5mg/mL,更优选50±3mg/mL。
在一个或多个实施方式中,所述的从诱导分化产物中生成功能性***包括:观测诱导分化产物,从中分离末端携带尾部结构的功能性***。
在一个或多个实施方式中,所述雌性生殖干细胞包括如下方法培养(扩增):将雌性生殖干细胞置于胚胎成纤维细胞(STO细胞)饲养层,在含有丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、表皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞生长因子、白血病抑制因子的细胞培养基中培养;较佳地,所述细胞培养基包括MEMα培养基;较佳地所述细胞培养基为含血清的培养基。
在一个或多个实施方式中,各个组分的用量包括:1±0.3mM丙酮酸钠、2±0.6mML-谷氨酰胺、50±15μMβ-巯基乙醇、1±0.3mM非必需氨基酸,20±5ng/mL表皮生长因子,10±3ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子,10±3ng/mL神经胶质细胞生长因子,10±3ng/mL白血病抑制因子;
较佳地,各个组分被添加于细胞培养基中;更佳地,所述细胞培养基为MEMα培养基;更佳地,所述的细胞培养基为含血清培养基。
在一个或多个实施方式中,用于雌性生殖干细胞培养的细胞培养基为液体培养基(培养液)。
在一个或多个实施方式中,用于雌性生殖干细胞培养的细胞培养基中含有5%~15%胎牛血清。
在一个或多个实施方式中,丙酮酸钠为1±0.2mM丙酮酸钠,更优选的1±0.1mM。
在一个或多个实施方式中,L-谷氨酰胺为2±0.4mM,更优选的2±0.2mM,更优选的2±0.1mM。
在一个或多个实施方式中,β-巯基乙醇为50±12μM,优选地50±10,更优选地50±5;更优选地50±2。
在一个或多个实施方式中,非必需氨基酸1±0.2mM,优选地1±0.1mM。
在一个或多个实施方式中,表皮生长因子20±3ng/mL,优选地20±1ng/mL。
在一个或多个实施方式中,人碱性成纤维细胞生长因子10±2ng/mL,优选地10±1ng/mL。
在一个或多个实施方式中,神经胶质细胞生长因子10±2ng/mL,优选地10±1ng/mL。
在一个或多个实施方式中,白血病抑制因子10±2ng/mL,优选地10±1ng/mL。
在本发明的另一方面,提供一种雌性生殖干细胞诱导与睾丸体细胞混合诱导培养的产物或由其产生的功能性***,其由前面所述的方法制备获得;较佳地,其具有选自下组的特征:所述的功能性***末端携带尾部结构;诱导体系中雄性生殖细胞减数***标志物呈现阳性:STRA8,SCP1,SCP2,SCP3;***形成标志物呈现阳性;较佳地所述标志物包括:PRM1,ACROSIN,TNP1,HAPRIN和/或ACROSIN;所述的功能性***为单倍体核型;和/或,注射至卵胞浆中后,所述的功能性***启动发育,移植活体子宫能生产子代。
在一个或多个实施方式中,该雌性生殖干细胞诱导与睾丸体细胞混合诱导培养的产物或由其产生的功能性***本身不能独立地繁殖为动物。
在本发明的另一方面,提供雌性生殖干细胞和睾丸体细胞的应用,用于体外制备功能性***。
在本发明的另一方面,提供一种制备动物子代的方法,包括:(1)以前面所述的方法制备功能性***;(2)将(1)的功能性***引入到***胞浆内(ICSI),使卵子受精,体外发育(如发育至2细胞期、4细胞期或囊胚期);较佳地,在体外发育至适当阶段移植至子宫、着床、发育为健康后代。
在一个或多个实施方式中,所述的动物包括人。
在一个或多个实施方式中,所述的动物包括非人哺乳动物,较佳地包括(但不限于):啮齿类动物(包括小鼠,大鼠,仓鼠等),非人灵长类动物(如猴,猩猩等),家畜(如牛,羊,狗,猪,兔等)。
在一个或多个实施方式中,所述的动物包括濒危动物。
在本发明的另一方面,提供一种用于体外制备功能性***的试剂盒,其中包括:雌性生殖干细胞;睾丸体细胞;预培养剂,包括细胞培养基;较佳地所述细胞培养基为含血清的培养基;较佳地所述细胞培养基包括DMEM培养基;第1阶段诱导剂,包括Knockout血清替代物、BMP-2、BMP-4、BMP-7、视黄酸和activin A;较佳地各组分用量包括:Knockout血清替代物20±4%(v/v)BMP-2 20±5ng/mL、BMP-4 20±5ng/mL、BMP-7 20±5ng/mL、视黄酸1±0.4μM和activin A 100±40ng/mL;第2阶段诱导剂,包括Knockout血清替代物(KSR)、睾酮(T)、***(FSH)和垂体提取物(BPE);较佳地各组分用量包括:Knockout血清替代物20±4%,睾酮10mM、FSH200ng/mL和垂体提取物50mg/mL。
在一个或多个实施方式中,诱导剂的各个组分被添加于细胞培养基中。
在一个或多个实施方式中,所述的试剂盒中还含有培养和繁殖雌性生殖干细胞的培养基/试剂,和/或用于分离和维持睾丸体细胞的培养基/试剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明的由雌性生殖干细胞分化为***细胞的分化体系示意图。
图2、雌性生殖干细胞体外***发生;
A)体外转分化体系中雌性生殖干细胞发育特征形态图;
B)免疫荧光法观察联会复合体的形成(SCP1/SCP3)及减数***过程(细线期,偶线期,粗线期,双线期);
C)RT-PCR检测培养产物表达雄性减数***(STRA8,SCP1,SCP2,SCP3)、***形成标志物(PRM1,ACROSIN,TNP1,HAPRIN)的情况。
D)流式细胞仪分析单倍体;
E)核型分析单倍体;
F)免疫荧光***形成标志物ACROSIN。
图3、***细胞(雌性生殖干细胞体外分化而来的)的功能鉴定。
A),B),C),D),E),F),G),H)从***样细胞注射至卵胞浆中体外发育过程(2细胞,4细胞,囊胚);
I)2细胞移植至小鼠子宫可出生后代,移植后出生小鼠自然分娩;
J)Sourthern blot法鉴定出生后代含GFP序列;
K)重亚硫酸盐甲基化测序鉴定出生后代印迹基因甲基化状态未有改变。
具体实施方式
本发明人在深入研究的基础上,建立了一种在体外诱导雌性生殖干细胞分化的方法体系,从而获得***细胞(较佳地其为单倍体的***细胞)。本发明首次提出体外诱导雌性生殖干细胞,其能够分化成单倍体***细胞。该方法可为临床及科研提供***细胞源,为辅助生殖技术领域提供了新的途径。
术语
如本文所用,术语“细胞培养基”在本发明中为“基础培养基”,其为普遍适合于细胞(干细胞)培养的,能为细胞(干细胞)提供足够营养成分的、满足细胞生长所需的培养基。
如本文所用,所述的“雌性生殖干细胞”或“卵巢雌性生殖干细胞”可互换使用。
如本文所用,所述的“哺乳动物”是脊索动物门(Chordata)脊椎动物亚门(Vertebrata)哺乳纲(Mammalia)的动物。所述的哺乳动物包括但不限于灵长类动物(包括人),偶蹄目动物,食肉目动物,啮齿目动物等。本发明所述的哺乳动物包括人,也包括非人哺乳动物。所述的非人哺乳动物例如但不限于包括啮齿类动物(具体如小鼠、大鼠),灵长类动物(具体如猿、猴、猩猩),家畜(具体如兔、狗、兔、猪、牛、羊、马)等等。
在本发明的一些实施方式中,以鼠作为模式生物,和人类相比,它无论在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等都和人类非常接近;因此,本发明列举的一些适用于鼠的情况可以毫无疑义地适用于人等其它哺乳动物。
如本文所用,所述的“含有”,“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用,“功能性”是指根据所描述的方法获得的***具有与所预期的相同或相似的功能。
培养及诱导方法
本发明中首次以雌性生殖干细胞作为出发细胞、与睾丸体细胞混合,成功诱导产生***细胞。根据雌性生殖干细胞的特点,本发明人进行了深入研究实验,诱导的培养及诱导的方案。本发明的培养及诱导方法,包含雌性生殖干细胞的以及睾丸体细胞的分离,混合,预培养,第1阶段诱导及第2阶段诱导。在睾丸体细胞组成的微环境、细胞因子(激活素、BMP2、BMP4、BMP7、FSH、BPE、睾酮)、全反式维甲酸(RA)等体外培养条件的作用下,无Y染色体的雌性生殖干细胞的表观遗传状态和基因表达发生显著性改变,可完成雄性减数***,发育成功能性***样细胞。本发明的由雌性生殖干细胞分化为***细胞的分化体系示意图如图1。
因此,本发明提供了一种体外制备功能性***的方法,包括:以雌性生殖干细胞为出发细胞,将之与睾丸体细胞混合,进行预培养以及诱导分化;从诱导分化产物中生成功能性***。在培养期间,还可以根据培养情况,更换新鲜的培养基。
本发明中,所述的雌性生殖干细胞可以是来自动物体的雌性生殖干细胞,也可以来自本领域在先技术已经扩增培养/传代的雌性生殖干细胞。例如,本发明人的在先研究中已经扩增了雌性生殖干细胞,可以应用这些体外扩增获得的雌性生殖干细胞。优选地,运用来自动物体的雌性生殖干细胞及其传代的细胞。
作为本发明的优选方式,所述雌性生殖干细胞包括如下方法培养(扩增)获得的雌性生殖干细胞:将雌性生殖干细胞置于胚胎成纤维细胞(STO细胞)饲养层,在含有丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、表皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞生长因子、白血病抑制因子的细胞培养基中培养。
本发明中,所述的睾丸体细胞优选地为分离后维持稳定、来自无生殖细胞的动物。所述的睾丸体细胞分离自KITw/wv小鼠。
在本发明的优选方式中,所述预培养包括:将雌性生殖干细胞与睾丸体细胞以1:10~10:1,较佳地1:5~5:1,更佳地1:2~2:1的比例混合,进一步更佳地以1:1的比例混合。在细胞培养基中进行培养;较佳地所述细胞培养基为含血清的培养基。较佳地,用于混合培养的培养基为液体培养基(培养液)。较佳地,用于混合培养的培养基中含有胎牛血清。本发明人发现,根据雌性生殖干细胞的特点,这一阶段的混合培养非常显著地促进后续诱导培养阶段的效率;而若是直接进行诱导培养,则转化效率相对低、诱导阶段耗时更长。
在本发明的优选方式中,所述雌性生殖干细胞与睾丸体细胞诱导分化包括:第1阶段诱导:以Knockout血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、BMP-2、BMP-4、BMP-7、全反式维甲酸和activin A诱导;第2阶段诱导:以Knockout血清替代物、睾酮、FSH和垂体提取物诱导。根据雌性生殖干细胞的特点,本发明人优化了组分的用量,例如,Knockout血清替代物优选地为20±4%,本发明人发现了Knockout血清替代物若是在10%或更低时,其诱导阶段后的细胞产物***形成标志物的表达几乎无法测得。又例如,垂体提取物优选地为50±15mg/mL,若是其在较低的水平时,则导致诱导效率很低。
除非另外说明,本发明中用于培养或用于诱导的培养基为液体培养基(培养液)。
所述的从诱导分化产物中生成功能性***包括:观测诱导分化产物,从中分离末端携带尾部结构的功能性***。可以理解的是,带有尾部结构的***与天然的***在形态上更为接近,活力更好。
较佳地,各个组分的用量包括:1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、50μMβ-巯基乙醇、1mM非必需氨基酸,20ng/mL小鼠表皮生长因子,10ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子,10ng/mL神经胶质细胞生长因子,10ng/mL小鼠白血病抑制因子;
较佳地,各个组分被添加于细胞培养基中;更佳地,所述细胞培养基为MEMα培养基;更佳地,所述的细胞培养基为含血清培养基。
运用本发明的培养方法以及培养基,可以通过二维或三维培养体系培养。
在本发明的具体实施例中,首先获得雌性生殖干细胞以及睾丸体细胞、将它们混合,然后通过预培养以及分阶段调整培养基中的细胞生长因子及其他组分实现雌性生殖干细胞转分化为***细胞。分阶段培养的前期(第1阶段)是用以促进增殖以及诱导分化为主的成分发挥作用,后期是用以成熟分化为主的成分发挥作用。本发明在体外培养约16-18天(优选地17天)内将雌性生殖干细胞诱导分化为***细胞,并通过一系列体外实验(细胞染色,RT-PCR、流式鉴定单倍体细胞,免疫荧光法观察联会复合体的形成及减数***过程等)以及动物体内实验验证所获***细胞的特征和功能。
本发明还提供了一种制备动物的方法,包括:(1)如前述方法制备功能性***;(2)将(1)的功能性***引入到***胞浆内,使卵子受精,体外发育(如发育至2细胞期、4细胞期或囊胚期);较佳地,在体外发育至适当阶段移植至子宫、着床、发育为动物。
在本发明的具体实施例中,成功地从雌性生殖干细胞诱导分化出功能性的***(***样细胞)。体外转分化体系中雌性生殖干细胞可表达雄性减数***、***形成标志物STRA8,SCP1,SCP2,SCP3,PRM1,ACROSIN,TNP1,HAPRIN等,免疫荧光法可观察到联会复合体的形成(SCP1/SCP3)及减数***过程(细线期,偶线期,粗线期,双线期)。***样细胞注射至卵胞浆中体外发育可致囊胚,2细胞移植至小鼠子宫可出生后代。移植后出生小鼠自然分娩。Sourthern blot法鉴定出生后代含GFP序列。重亚硫酸盐甲基化测序鉴定出生后代印迹基因甲基化状态未有改变。
本发明的方法的几个主要特点和优势如下:第一,本发明在整个培养体系采用人源细胞生长因子、化学分子,不引入涉及重编程或转分化功能的外源性基因(但可以引入报告基因),因此可以避免外源基因对原干细胞的基因组稳定性的干扰和外源细胞相关的移植安全隐患。第二,用雌性生殖干细胞制备获得的***细胞带有尾巴状结构、活性良好。
培养基
本发明人提供了用于预培养以及各阶段诱导培养的培养基,包括:预培养培养基,其可为基础培养基,其中添加血清;第1阶段培养基,其在细胞培养基基础上,添加KSR、BMP-2、BMP-4、BMP-7、视黄酸和activin A;第2阶段培养基,其在细胞培养基基础上,添加KSR、睾酮、FSH和垂体提取物。
除了本发明实施例中所列举的具体细胞因子或化学组分以外,本领域公知的与它们具有相同或相近功能的细胞因子或化学组分也可被应用于本发明中。所述具体列举的成分的类似物、同功能蛋白(如生长因子的同功能蛋白)或化合物、诱导相同靶点的等效化合物、类似物、衍生物和/或它们的盐、水合物或前体,也可用于替换上述具体列举的成分,以实现同样的技术效果。这些类似物、同功能蛋白或化合物也应被包含在本发明中。化合物的类似物包括但不限于:化合物的异构体、外消旋体。化合物具有一个或多个不对称中心。所以,这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。所述的“化合物的前体”指当用适当的方法施用或处理后,该化合物的前体在培养基中可转变成上述任一化合物的一种化合物,或上述任一化合物的一种化合物所组成的盐或溶液。
作为本发明的优选方式,所述的培养基中还加入用于预防细胞培养的细菌污染,特别是革兰氏阳性和阴性细菌污染的成分,例如一些抗生素。
所述的细胞培养基(基础培养基)例如可以是但不限于:DMEM/F12、MEM、DMEM、RPMI1640、Neuronal basal或Fischers等。应理解,本领域技术人员熟悉所述的基础细胞培养基的配制或购买途径。而本发明的实施例中则提供了的优选的细胞培养基。
本发明还提供了一种试剂盒,其中含有本发明所述的预培养培养基,第1阶段培养基,第2阶段培养基;其中还含有出发细胞,包括雌性生殖干细胞和睾丸体细胞。较佳地,在需要的情况下,所述的试剂盒中还含有培养和扩增雌性生殖干细胞的培养基/试剂,以及用于分离和维持睾丸体细胞的培养基/试剂。较佳地,所述试剂盒中还包含使用说明书,从而便于本领域人员在研究中或在临床上应用。
基于本发明的新发现,本发明还提供了一种由本发明所述的方法获得的雌性生殖干细胞培养产物以及由其产生的***细胞。本发明人发现,本发明的方法获得的功能性***末端携带尾部结构,呈现了良好的状态。同时,所述***细胞具有典型的***形成标志物,包括:PRM1,ACROSIN,TNP1,HAPRIN和/或ACROSIN等;且所述的功能性***为单倍体核型。
从细胞培养物中富集或分离纯化细胞的方法也是本领域人员熟知的,例如可基于***细胞的形态特征来进行富集;或基于***细胞所表达的特殊蛋白(如Albumin等)或分子标记来选择收集(例如采用特异性抗体或配体)。作为一种可选的实施方式,可利用流式细胞分选技术,通过***细胞表面的分子标记,将细胞分离纯化出来。
本发明培养的***细胞可应用于辅助生殖。根据本发明的实施例,其在注射至卵胞浆中后,可顺利地继续体外发育过程,在适当的时间移植受体动物子宫后,可以顺利产生后代。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、实验动物
KITw/wv小鼠购自杰克逊实验室(美国)。
C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
2、RT-PCR
从细胞中抽提总RNA,使用II Q RT SuperMix(+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme,R223-01)按照说明书进行反转录。使用Taq聚合酶(Takara,R10T1M)进行RT-PCR,引物见表1,进行35个循环。PCR扩增的GAPDH基因用作内参。使用2%琼脂糖凝胶进行电泳,DNA条带用溴化乙锭(EB)染色。获得PCR产物,通过测序确定该条带是否为相应的基因。
表1、用于分析雌性生殖干细胞向***分化基因表达情况PCR引物
3、***细胞表面铺展技术
***细胞表面铺展技术用于鉴定体外***发生过程中产生的***细胞。用0.05%胰蛋白酶(Gibco)将细胞消化成单细胞悬液,然后用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)在室温下洗涤。然后将细胞置于新鲜制备的缓冲液(30mM tris,PH 8.2,50mM蔗糖,17mM柠檬酸,5mMEDTA,0.5mM DTT,0.1mM PMSF,ph 8.2-8.4)中30-60min。细胞经离心(350g,5min)后加入100mM蔗糖(ph8.2)20min。最后将细胞悬浮液置于含有1%多聚甲醛PFA(PH 9.2)和0.15%triton X-100PBS的载玻片上,并将载玻片置于高湿度的密闭箱中过夜干燥。
4、免疫荧光染色
用4%PFA固定培养细胞30min,用0.1%Tween 20洗涤3次(PBST),然后在1%triton X-100PBS中孵育15min(对于用PMSF铺展的细胞,省略了这一步骤)。用5%山羊血清在PBS中室温下封闭细胞或载玻片30min,然后用PBS稀释的一抗在4℃孵育过夜。一抗稀释比例:MVH(1:200;Abcam),FRAGILIS(1:100,Abcam),OCT4(1:100,Abcam),SCP3(1:200,Santa cruz),SCP1(1:100,Abcam)和ACR(1:200,Santa cruz)。
孵育过夜后,用PBS洗3次,然后在37℃下用二抗(1:200)孵育,用PBS洗3次,接着用DAPI染细胞核,并用荧光显微镜观察荧光信号。
5、卵胞浆单***显微注射(ICSI)
用BDF1小鼠作为***供体。采用流式细胞分选法对***样细胞(GFP阳性细胞或者单倍体细胞)进行分选。将这些分选后的***样细胞去除细胞质后,注射到无卵丘***中。荧光显微镜观察荧光蛋白在不同发育阶段的变化。将培养24h后达到2细胞阶段的胚胎移植到胚胎期0.5天CD1假妊娠母鼠输卵管中或在KSOMaa培养基中进一步培养至囊胚期(37℃,5%CO2。移植后出生小鼠自然分娩。Sourthern blot法鉴定出生后代含GFP序列。重亚硫酸盐甲基化测序鉴定出生后代印迹基因甲基化状态未有改变。
实施例1、雌性生殖干细胞诱导分化为***
1、小鼠雌性生殖干细胞分离
从新生小鼠卵巢(出生后6天,C57BL/6)中分离、纯化、体外培养雌性生殖干细胞;从β-ACTIN-GFP转基因小鼠中分离、纯化雌性生殖干细胞(方法参考:Zou,K.,Z.Yuan,Z.Yang,et al.,Production of offspring from a germLine stem cell line derivedfrom neonatal ovaries.Nat Cell Biol,2009.11(5):p.631-636)。雌性生殖干细胞可以获得野生型小鼠;在需要的情况下,以带有GFP的小鼠用于体外分化细胞的示踪或后代小鼠的示踪。
将雌性生殖干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞(STO细胞)饲养层上,在含有10%胎牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠(Amresco)、2mM L-谷氨酰胺(Amresco)、50μMβ-巯基乙醇(Biotech)、1mM非必需氨基酸(NEAA)(invitrogen),20ng/mL小鼠表皮生长因子(Peprotech),10ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Peprotech),10ng/mL小鼠神经胶质细胞生长因子(GDNF)(Peprotech),10ng/mL小鼠白血病抑制因子(LIF)(Santa cruz)的MEMα培养基中培养。
通过免疫荧光和RT-PCR鉴定雌性生殖干细胞。
2、KITw/wv小鼠睾丸体细胞分离
收集并提取出生后2-7天KITw/ww小鼠睾丸体细胞(KITw/ww雄性睾丸中缺乏生殖细胞,可确保分化***样细胞并非来源于KITw/ww雄性小鼠的睾丸细胞)。小鼠颈椎脱臼处死,无菌取其睾丸,去囊,切成小片,用胶原酶Ⅳ(1mg/mL,Sigma)在37℃水浴中消化10min,再0.05%胰蛋白酶(Gibco)消化6min。
用72μm细胞筛过滤后获得单细胞悬液,离心收集细胞。
3、转分化
3-1转分化1
从第0天至第6天,用含20%Knockout血清替代物(简称血清替代物或KSR)(Gibco)、BMPs-2/4/7(各20ng/mL,R&D)、全反式维甲酸(1μM,Sigma)和activin A(100ng/mL,R&D)的MEMα培养基中诱导转分化,每天换液一次。
紧接着,从第7天到第14天,在含有20%血清替代物(KSR)(Gibco)、10mM睾酮、200ng/mL FSH、50mg/mL垂体提取物(BPE,Stem cell)的MEMα培养液中诱导分化,每天换液一次。细胞在5%CO2中培养,37℃诱导分化。
该过程将小鼠睾丸体细胞与雌性生殖干细胞进行直接分阶段诱导。然而本发明人发现,在诱导过程中转化效率低、耗时长,14天后的细胞产物***形成标志物PRM1,ACROSIN,TNP1,HAPRIN的表达比较低。
3-2转分化2
(1)混合培养
将KITw/wv小鼠睾丸体细胞与雌性生殖干细胞按1:1的比例直接混合,在含10%FBS的DMEM培养液中培养3天。
(2)诱导分化
从第0天至第6天,用含10%血清替代物(KSR)(Gibco)、BMPs-2/4/7(各20ng/mL,R&D)、全反式维甲酸(1μM,Sigma)和activin A(100ng/mL,R&D)的MEMα培养基中诱导转分化,每天换液一次。
紧接着,从第7天到第14天,在含有10%血清替代物(KSR)(Gibco)、10mM睾酮、200ng/mL FSH、50mg/mL垂体提取物(BPE,Stem cell)的MEMα培养液中诱导分化,每天换液一次。细胞在5%CO2中培养,37℃诱导分化。
该过程将小鼠睾丸体细胞与雌性生殖干细胞先进行预培养,之后进行分阶段诱导。然而,本发明人发现14天后的细胞产物***形成标志物PRM1,ACROSIN,TNP1,HAPRIN的表达比较低。
3-3、转分化3
(1)混合培养
将KITw/wv小鼠睾丸体细胞与雌性生殖干细胞按1:1的比例直接混合,在含10%FBS的DMEM培养液中培养3天。
(2)诱导分化
从第0天至第6天,用含20%血清替代物(KSR)(Gibco)、BMPs-2/4/7(各20ng/mL,R&D)、全反式维甲酸(1μM,Sigma)和activin A(100ng/mL,R&D)的MEMα培养基中诱导转分化,每天换液一次。
紧接着,从第7天到第14天,在含有20%血清替代物(KSR)(Gibco)、10mM睾酮、200ng/mL FSH、50ug/mL垂体提取物(BPE,Stem cell)的MEMα培养液中诱导分化,每天换液一次。细胞在5%CO2中培养,37℃诱导分化。
该过程将小鼠睾丸体细胞与雌性生殖干细胞先进行预培养,之后进行分阶段诱导。然而,本发明人发现,在诱导过程中转化效率相对低,分化过程中产生的细胞不带有尾巴。
3-4、转分化4
(1)混合培养(与培养)
将小鼠睾丸体细胞与雌性生殖干细胞按1:1的比例直接混合,在含10%FBS的DMEM培养液中培养3天。
(2)诱导分化
从第0天至第6天,用含20%血清替代物(KSR)(Gibco)、BMPs-2/4/7(各20ng/mL,R&D)、全反式维甲酸(1μM,Sigma)和activin A(100ng/mL,R&D)的MEMα培养基中诱导转分化,每天换液一次。
紧接着,从第7天到第14天,在含有20%血清替代物(KSR)(Gibco)、10mM睾酮、200ng/mL FSH、50mg/mL垂体提取物(BPE,Stem cell)的MEMα培养液中诱导分化,每天换液一次。细胞在5%CO2中培养,37℃诱导分化。
该过程将小鼠睾丸体细胞与雌性生殖干细胞先进行预培养,之后进行分阶段诱导。诱导过程转化效率高且***形成标记物非常显著,能够高效形成功能性***,具体见后续实施例2。
实施例2、实施例1中3-4诱导分化产物的验证
(1)细胞形态
体外转分化体系中雌性生殖干细胞发育形态图如图2A。尤其出乎意料的是,本发明的方法诱导后形成的***,其存在明晰的尾巴结构,这是现有的技术中无法实现的。
(2)联会复合体的形成及减数***过程
获取分化过程中(D6-D10)的细胞,利用免疫荧光法观察联会复合体的形成及减数***过程。
结果如图2B,可观察到联会复合体的形成(SCP1/SCP3)及减数***过程(细线期,偶线期,粗线期,双线期)。
(3)***形成标志物分析
在诱导培养起的D1、D3、D6、D8、D10、D14天,从细胞中抽提总RNA,利用RT-PCR分析表达雄性减数***(STRA8,SCP1,SCP2,SCP3)、***形成标志物(PRM1,ACROSIN,TNP1,HAPRIN)等。
RT-PCR检测结果如图2C,可见随着诱导时间的增加,***形成标志物相继呈现阳性,证明本发明的方法能够很好地诱导雌性生殖干细胞体外***形成。
(4)单倍体分析
对于雌性生殖干细胞体外产生的***(***样细胞),本发明人利用流式细胞仪分析其倍性,并以STO细胞、FGSC细胞、fSLC细胞,Sertoli细胞为对照。结果如图2D,可见所产生的***为单倍体。
对于雌性生殖干细胞体外产生的***(***样细胞),本发明人也进行了核型分析,结果呈现单倍体核型,如图2E。
雌性生殖干细胞的核型为XX,可以确定所述***为X***,从而可以获得雌性后代。
(5)免疫荧光分析***形成标志物
除了在mRNA水平上以RT-PCR分析***形成标志物,对于雌性生殖干细胞体外产生的***(***样细胞),本发明人也利用免疫荧光来检测***形成标志物ACROSIN的存在情况。
结果如图2F,可见ACROSIN呈现阳性。
实施例3、实施例1中3-4诱导分化后获得的***细胞的功能鉴定
本发明人将雌性生殖干细胞体外分化而来的***细胞注射至卵胞浆中,观测其体外发育过程。
如图3A~H所示,***样细胞注射至卵胞浆中后,细胞可起始发育,包括从2细胞、4细胞发育至囊胚。
本发明人将处于2细胞时期的细胞移植至小鼠子宫。结果,小鼠可产生后代,移植后小鼠自然分娩,出生后代小鼠,如3I(图中TG指TransGene小鼠)。
利用Sourthern Blot法鉴定出生后代,结果可见其含有GFP序列,如图3J。
利用重亚硫酸盐甲基化测序鉴定出生后代印迹基因的甲基化状态。结果显示其甲基化状态未有改变,如图3K。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时,在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用
<130> 218900
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcacagcctc aaagtggcag g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcaacagagt ggaggaggag t 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gacaacggcc caggaggca 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tctgcggttt cacggcgga 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gacactgaaa ccgaatgtgg a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tgtgggtctt ggttgtcctt t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gagccgctga gcaaacatct a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atatccagtt cccactgctg c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tatgcgttcc gagtgagagc 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aggtgctcag tgttgtagcc c 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
agccgcaagc taaagactca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ctctcttgac gcccttgtga 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
agcaaaagca ggagcagatg 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
cttgctattc tgtgcatcta g 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cggagtctac acagccacct 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gcatgagtga tgaggaggtt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
aactccagca ggaccatgtg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
atggccgaca agcagaagaa 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gtaaggagat tatgtttatt tttgg 25
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
cctcattaat cccataacta t 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gagtatttag gaggtataag aatt 24
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
atcaaaaact aacataaacc cct 23
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gtaaagtgat tggttttgta tttttaagtg 30
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
ttaattactc tcctacaact ttccaaatt 29
Claims (15)
1.一种体外制备功能性***的方法,其特征在于,所述方法包括:以雌性生殖干细胞为出发细胞,将之与睾丸体细胞混合为雌性生殖干细胞与睾丸体细胞比例1 : 10~10 : 1,进行预培养以及诱导分化;从诱导分化产物中生成功能性***;预培养用细胞培养基为含5~15%胎牛血清的DMEM培养基;
其中,雌性生殖干细胞与睾丸体细胞诱导分化包括:
第1阶段诱导:以Knockout血清替代物20±4%(v/v)、BMP-2 20±5 ng/mL、BMP-4 20±5ng/mL、BMP-7 20±5 ng/mL、全反式维甲酸1±0.4μM和activin A 100±40 ng/mL诱导;各组分被添加于MEMα细胞培养基中;
第2阶段诱导:第1阶段诱导后,以Knockout血清替代物20±4%,睾酮10±3 mM、FSH 200±30ng/mL和垂体提取物50±15mg/mL诱导;各组分被添加于MEMα细胞培养基中。
2. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述预培养包括:将雌性生殖干细胞与睾丸体细胞以1 : 5~5 : 1的比例混合,进行预培养以及诱导分化。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,雌性生殖干细胞与睾丸体细胞诱导分化包括:
第1阶段诱导:以Knockout血清替代物20±3%(v/v)、BMP-2 20±4 ng/mL、BMP-4 20±4ng/mL、BMP-7 20±4、全反式维甲酸1±0.4μM和activin A 100±40 ng/mL诱导;
第2阶段诱导:以Knockout血清替代物20±3%、睾酮10±2 mM、FSH 200±20ng/mL和垂体提取物50±12mg/mL诱导。
4. 如权利要求3所述的方法,其特征在于,第1阶段中,各组分用量包括:Knockout血清替代物20±2%(v/v)、BMP-2 20±3 ng/mL、BMP-4 20±3 ng/mL、BMP-7 20±3 ng/mL、全反式维甲酸1±0.4μM和activin A 100±40 ng/mL。
5. 如权利要求3所述的方法,其特征在于,第2阶段中,各组分用量包括:Knockout血清替代物20±2%,睾酮10±1 mM、FSH 200±15 ng/mL和垂体提取物50±10mg/mL。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的从诱导分化产物中生成功能性***包括:观测诱导分化产物,从中分离末端携带尾部结构的功能性***。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述雌性生殖干细胞包括如下方法培养:将雌性生殖干细胞置于胚胎成纤维细胞饲养层,在含有丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、表皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞生长因子、白血病抑制因子的细胞培养基中培养;所述细胞培养基为MEMα培养基。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述细胞培养基为含血清的培养基。
9. 如权利要求7所述的方法,其特征在于,各个组分的用量包括:1±0.3 mM 丙酮酸钠、2±0.6 mM L-谷氨酰胺、50±15μMβ-巯基乙醇、1±0.3mM 非必需氨基酸,20±5ng/mL表皮生长因子,10±3ng/mL 人碱性成纤维细胞生长因子,10±3ng/mL 神经胶质细胞生长因子,10±3ng/mL 白血病抑制因子。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的功能性***具有下组的特征:
末端携带尾部结构;
诱导体系中雄性生殖细胞减数***标志物呈现阳性:STRA8,SCP1,SCP2,SCP3;
***形成标志物呈现阳性;所述标志物包括:PRM1,ACROSIN,TNP1,HAPRIN和/或ACROSIN;
所述的功能性***为单倍体核型;和/或
注射至卵胞浆中后,所述的功能性***启动发育,移植活体子宫能生产子代。
11. 雌性生殖干细胞和睾丸体细胞的应用,用于体外制备功能性***;所述体外制备包括:以雌性生殖干细胞为出发细胞,将之与睾丸体细胞混合为雌性生殖干细胞与睾丸体细胞比例1 : 10~10 : 1,进行预培养以及诱导分化;从诱导分化产物中生成功能性***;预培养用细胞培养基为含5~15%胎牛血清的DMEM培养基;其中,雌性生殖干细胞与睾丸体细胞诱导分化包括:
第1阶段诱导:以Knockout血清替代物20±4%(v/v)、BMP-2 20±5 ng/mL、BMP-4 20±5ng/mL、BMP-7 20±5 ng/mL、全反式维甲酸1±0.4μM和activin A 100±40 ng/mL诱导;各组分被添加于MEMα细胞培养基中;
第2阶段诱导:第1阶段诱导后,以Knockout血清替代物20±4%,睾酮10±3 mM、FSH 200±30ng/mL和垂体提取物50±15mg/mL诱导;各组分被添加于MEMα细胞培养基中。
12.一种制备动物子代的方法,其特征在于,包括:
(1)以权利要求1~9任一所述的方法制备功能性***;
(2)将(1)的功能性***引入到***胞浆内,使卵子受精,体外发育。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,在体外发育至适当阶段移植至子宫、着床、发育为健康后代。
14.一种用于体外制备功能性***的试剂盒,其特征在于,其中包括:
雌性生殖干细胞;
睾丸体细胞;
预培养剂,包括细胞培养基;所述细胞培养基为含5~15%胎牛血清的DMEM培养基;
第1阶段诱导剂,包括Knockout血清替代物20±4%(v/v)BMP-2 20±5 ng/mL、BMP-4 20±5 ng/mL、BMP-7 20±5 ng/mL、视黄酸1±0.4μM和activin A 100±40 ng/mL;
第2阶段诱导剂,包括Knockout血清替代物20±4%,睾酮10 mM、FSH 200ng/mL和垂体提取物50mg/mL。
15.如权利要求14所述的用于体外制备功能性***的试剂盒,其特征在于,诱导剂的各个组分被添加于细胞培养基中。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111665381.1A CN114276984B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111665381.1A CN114276984B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114276984A CN114276984A (zh) | 2022-04-05 |
CN114276984B true CN114276984B (zh) | 2024-01-16 |
Family
ID=80879511
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111665381.1A Active CN114276984B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114276984B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115851578B (zh) * | 2022-12-23 | 2023-11-21 | 华南理工大学 | 一种3d悬浮诱导持续扩增肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009021151A1 (en) * | 2007-08-07 | 2009-02-12 | Primegen Biotech Llc | Isolation, characterization and propagation of germline stem cells |
CN102533764A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-07-04 | 西北农林科技大学 | Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用 |
CN106554938A (zh) * | 2015-09-30 | 2017-04-05 | 中国科学院动物研究所 | 一种体外完成细胞减数***的方法 |
-
2021
- 2021-12-31 CN CN202111665381.1A patent/CN114276984B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009021151A1 (en) * | 2007-08-07 | 2009-02-12 | Primegen Biotech Llc | Isolation, characterization and propagation of germline stem cells |
CN102533764A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-07-04 | 西北农林科技大学 | Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用 |
CN106554938A (zh) * | 2015-09-30 | 2017-04-05 | 中国科学院动物研究所 | 一种体外完成细胞减数***的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114276984A (zh) | 2022-04-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11773368B2 (en) | Culture method for differentiating primordial germ cells into functionally mature oocytes | |
Fang et al. | Rabbit embryonic stem cell lines derived from fertilized, parthenogenetic or somatic cell nuclear transfer embryos | |
US9476064B2 (en) | Neuro-progenitor produced from an SCNT-derived ES cell | |
JP2013176400A (ja) | ラットおよび他種由来の多能性細胞 | |
US20070020759A1 (en) | Therapeutic reprogramming of germ line stem cells | |
US20050239201A1 (en) | Methods of inducing differentiation of stem cells into a specific cell lineage | |
AU2006269884A1 (en) | Therapeutic reprogramming of germ line stem cells | |
CN113025565A (zh) | 马口鱼精原干细胞系的建立及其诱导分化方法 | |
CN114276984B (zh) | 雌性生殖干细胞转分化至功能***的方法及应用 | |
JP2007501625A (ja) | 鳥類精原幹細胞の培養方法及びこれにより収得した鳥類精原幹細胞 | |
WO2004039965A1 (ja) | 多能性幹細胞培養用の組成物とその使用 | |
US20170088816A1 (en) | Mammalian embryonic stem cell isolated from a homogeneous pluripotent outgrowth of a mammalian pre-implantation embryo | |
CN106085951B (zh) | 一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法 | |
WO2013159313A1 (zh) | 一种动物胚胎干细胞系及其制备方法和应用 | |
CN112852711A (zh) | 刀鲚性腺体细胞系的建立及其应用 | |
JP2005523685A (ja) | 体細胞由来胚幹細胞及びそれらの分化子孫 | |
WO2023173370A1 (en) | Media and methods for producing human cells and tissues from teratoma, organoids and embryoid bodies | |
KR101631172B1 (ko) | 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법 | |
KR101446328B1 (ko) | 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물 및 이의 제조방법 | |
今井裕 et al. | Establishment of Long-Term Culture of Bovine Undifferentiated Germ Cells Isolated from Adult and Immature Testes | |
CN114369567A (zh) | 牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法及培养液 | |
Jung-Jin et al. | Establishment of a simple and effective method for isolating male germline stem cells (GSCs) from testicular cells of neonatal and adult mice | |
AU2005202687A1 (en) | Methods of generating germ cells from stem cells and uses thereof | |
Shafa et al. | Expansion of iPSCs in Stirred Suspension Bioreactors | |
KR20140043260A (ko) | 수정란에 골수세포의 주입을 통한 조류 체세포 카이메라의 제조 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |