CN106661585A

CN106661585A - 微生物麦角硫因生物合成

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Publication number: CN106661585A
Application number: CN201580023207.3A
Authority: CN
Inventors: J.韩; H.陈; X.于
Original assignee: Kenagen Co
Current assignee: Kenagen Co; Conagen Inc
Priority date: 2014-04-29
Filing date: 2015-04-28
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2035-04-28
Also published as: US20200224232A1; CN106661585B; WO2015168112A1; EP3137611A4; EP3137611A1; CA2975238C; CA2975238A1; EP3137611B1; MX2016014235A; US10544437B2; US20170051325A1

Abstract

公开了用于麦角硫因生物合成的方法。更具体地，本公开涉及用于微生物麦角硫因生物合成的方法。本公开总体涉及用于生产麦角硫因的工程改造的宿主细胞和方法。更具体地，本公开涉及工程改造的宿主细胞和用于使用所述工程改造的宿主细胞的微生物麦角硫因生物合成的方法。

Description

微生物麦角硫因生物合成

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公开背景

本公开总体涉及用于麦角硫因生物合成的方法。更具体地，本公开涉及用于微生物麦角硫因生物合成的方法。

麦角硫因(ET)是具有连接至咪唑环的C₂原子的巯基的组氨酸甜菜碱衍生物。作为硫酮互变异构体，ET是具有独特性质的非常稳定的抗氧化剂。不同于谷胱甘肽和抗坏血酸，ET可以清除不是自由基的氧化物质。ET是放线菌诸如耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和丝状真菌诸如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中产生的天然化合物。其他细菌物种，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)和链球菌(Streptococcus)，以及属于子囊菌纲(Ascomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)的真菌不能产生麦角硫因。动物和植物也不能产生麦角硫因，并且必须从膳食来源或在植物的情况下从它们的环境中获得麦角硫因。

尽管ET在微生物细胞中的功能尚未充分理解，但其据信在人生理学中是至关重要的。人从膳食来源吸收ET，并且ET在特定组织和细胞诸如肝、肾、中枢神经***和红细胞中积累。证明特异性阳离子转运蛋白(OCTN1)对人体中的ET具有高亲和力，并且所述转运蛋白的过度活性和缺乏对人细胞发挥负面作用。

在某些分枝杆菌真菌中已经检测到ET的生物合成，然而，确切的代谢途径没有完成或仅部分证实。Seebeck使用大肠杆菌在体外重构了分枝杆菌麦角硫因生物合成，以分别表达甲酰甘氨酸生成酶样蛋白(EgtB)、谷氨酰胺转酰胺酶(EgtC)、组氨酸甲基转移酶(EgtD)和替代5-磷酸吡哆醛结合蛋白(EgtE)的来自Erwinia tasmaniensis的无关的β-裂合酶（因为可溶性EgtE蛋白的重组产生失败）(参见，J. Am. Chem. Soc. 2010, 132:6632-6633)。

迄今为止，仅编码EgtB、EgtC和EgtD的3种基因已被鉴定用于体外生产麦角硫因。EgtE的推定基因仍未在体外或体内表征。到目前为止，尽管有各种生物转化的尝试，但尚未报道使用上述基因以在大肠杆菌中工程改造分枝杆菌麦角硫因代谢途径的微生物生产。此外，尽管各种真菌和分枝杆菌来源可用于麦角硫因提取，但产量太低，以致于不能商业用于麦角硫因的工业生产。因此，存在生产麦角硫因的需求。

公开概述

本公开总体涉及用于生产麦角硫因的工程改造的宿主细胞和方法。更具体地，本公开涉及工程改造的宿主细胞和用于使用所述工程改造的宿主细胞微生物麦角硫因生物合成的方法。

在一个方面，本公开涉及用于生产麦角硫因的转化的宿主细胞，其包含编码EgtB的核酸序列、编码EgtC的核酸序列、编码EgtD的核酸序列和编码EgtE的核酸序列。

在另一个方面，本公开涉及用于生产麦角硫因的方法。所述方法包括培养宿主细胞，其中所述宿主细胞用编码EgtB的核酸序列、编码EgtC的核酸序列、编码EgtD的核酸序列和编码EgtE的核酸序列转化；诱导所述宿主细胞以表达编码EgtB的核酸序列、编码EgtC的核酸序列、编码EgtD的核酸序列和编码EgtE的核酸序列；和收集麦角硫因。

在另一个方面，本公开涉及用于生产麦角硫因的表达载体，其包含编码选自EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的氨基酸序列的核酸序列。

附图简述

当考虑其以下详述时，将更好地理解本公开，并且除了上述那些之外的特征、方面和优点将变得显而易见。此类详述参考以下附图，其中：

图1A是含有EgtD和EgtB基因的载体图谱，如实施例1中所讨论。

图1B是含有EgtC和EgtE基因的载体图谱，如实施例1中所讨论。

图2是说明仅在含有所有四种基因的菌株中生产ET的图，如实施例2中所讨论。EI，用IPTG诱导的空载体细胞；SI，用IPTG诱导的含有四个基因的菌株；Ck+，添加20 mg/L麦角硫因的样品。

图3A和3B是显示100 mg/L麦角硫因标准品的HPLC保留时间和UV光谱的图，如实施例2中所讨论。

图4A和4B是显示用编码EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的核酸序列转化的大肠杆菌中生产的麦角硫因的HPLC保留时间和UV光谱的图，如实施例2中所讨论。

图5是显示工程改造的大肠杆菌细胞和空载体对照细胞中麦角硫因生产的时间过程的图，如实施例3中所讨论。EI，用IPTG诱导的空载体对照；SI，用IPTG诱导的含有EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的菌株。

图6是显示用各种底物和辅因子进料的转化的大肠杆菌菌株的图。无，未添加底物或辅因子；His，组氨酸；Met，甲硫氨酸；Cys，半胱氨酸；Fe，铁Fe⁺⁺。

尽管本公开易于呈现各种改变和替代形式，但其具体实施方案已经通过实例的方式在附图中显示，并且在本文下面详细描述。然而，应当理解，具体实施方案的描述并不意在将本公开限制为涵盖落入由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的所有改变、等同方案和替代方案。

详述

术语“互补”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于描述能够与彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本技术还包括与所附序列表中报道的完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互补的分离的核酸片段。

术语“核酸”和“核苷酸”根据本领域普通技术人员所理解的其各自普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，该术语涵盖含有与参考核酸具有相似结合特性且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另有指明，特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰或简并的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指明的序列。

术语“分离的”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且当在分离的核酸或分离的多肽的上下文中使用时，在没有限制的情况下用于指通过人工，远离其天然环境存在并且因此不是天然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以以纯化形式存在或可以存在于非天然环境中，诸如例如在转基因宿主细胞中。

如本文所使用的术语“孵育(incubating)”和“孵育(incubation)”是指将两种或更多种化学或生物实体(诸如化合物和酶)混合并允许它们在有利于产生甜菊糖苷组合物的条件下相互作用的过程。

术语“简并变体”是指具有通过一个或多个简并密码子取代而不同于参考核酸序列的残基序列的核酸序列。简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。核酸序列和所有其简并变体将表达相同的氨基酸或多肽。

术语“多肽”、“蛋白”和“肽”根据本领域普通技术人员所理解的其各自普通和常规含义使用；三个术语有时可互换使用，并且在没有限制的情况下用于指氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，而无论其大小或功能。尽管“蛋白”经常被用来指相对大的多肽且“肽”经常被用来指小的多肽，但本领域中的这些术语的使用重叠且变化。如本文所使用，术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白，除非另有说明。当是指多核苷酸产物时，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽包括多核苷酸产物，天然存在的蛋白，同源物，直向同源物，旁系同源物，片段，和前述的其他等同物、变体和类似物。

当关于参考多肽使用时，术语“多肽片段”和“片段”根据本领域普通技术人员的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指这样的多肽，其中与参考多肽本身相比氨基酸残基缺失，但其中剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置相同。此类缺失可以发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端，或者两者。

多肽或蛋白的术语“功能片段”是指这样的肽片段，其为全长多肽或蛋白的一部分，并且具有与全长多肽或蛋白基本上相同的生物活性，或实施与全长多肽或蛋白基本上相同的功能(例如，实施相同的酶促反应)。

可互换使用的术语“变体多肽”、“修饰的氨基酸序列”或“修饰的多肽”是指与参考多肽有一个或多个氨基酸不同(例如，通过一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列。在一个方面，变体是保留参考多肽的一些或所有能力的“功能变体”。

术语“功能变体”还包括保守取代的变体。术语“保守取代的变体”是指具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列通过一个或多个保守氨基酸取代而不同于参考肽，并且维持参考肽的一些或所有活性。“保守的氨基酸取代”是用功能相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包括一个非极性(疏水性)残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个非极性(疏水性)残基；一个带电荷或极性(亲水性)残基取代另一个带电荷或极性(亲水性)残基，诸如在精氨酸和赖氨酸之间，在谷氨酰胺和天冬酰胺之间，在苏氨酸和丝氨酸之间；一个碱性残基诸如赖氨酸或精氨酸取代另一个碱性残基；或一个酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个酸性残基；或一个芳族残基(诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代另一个芳族残基。预期此类取代对蛋白或多肽的表观分子量或等电点影响很少或没有影响。短语“保守取代的变体”还包括其中残基被化学衍生的残基取代的肽，条件是所得肽维持如本文所述的参考肽的一些或所有活性。

与本技术的多肽相关的术语“变体”还包括具有这样的氨基酸序列的功能活性多肽，所述氨基酸序列与参考多肽的氨基酸序列至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%且甚至100%相同。

以所有其语法形式和拼写变化的术语“同源的”是指具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包括来自超家族的多核苷酸或多肽和来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白(Reeck等人, Cell 50:667, 1987)。此类多核苷酸或多肽具有序列同源性，如由它们的序列相似性所反映，无论是百分比同一性还是在保守位置存在特定氨基酸或基序的方面。例如，两个同源多肽可以具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%且甚至100%相同的氨基酸序列。

关于本技术的变体多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”是指候选序列中与参考多肽(诸如，例如SEQ ID NO:6)的氨基酸残基在比对序列并引入空位(如果必要)以实现最大百分比序列同一性（并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分）之后相同的氨基酸残基的百分比。

用于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术内的各种方式，例如，使用公开可得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或Megalign(DNASTAR)软件来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括实现所比较序列全长内的最大比对所需的任何算法。例如，％氨基酸序列同一性可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2来确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可以从ncbi.nlm.nih.gov下载。NCBIBLAST2使用几个搜索参数，其中所有那些搜索参数被设置为默认值，包括例如不屏蔽：是(unmask yes)；链 = 所有；预期发生数：10；最小低复杂度长度=15/5；多通道e-值=0.01；多通道的常数=25；最终空位比对的下降(dropoff)=25；和评分矩阵=BLOSUM62。在NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对于、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以替代地表述为对于、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：分数X/Y乘以100，其中X是在A和B的该程序比对中通过序列比对程序NCBI-BLAST2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B对于A的％氨基酸序列同一性。

在该意义上，用于确定氨基酸序列“相似性”的技术是本领域众所周知的。通常，“相似性”是指在适当位置处的两个或更多个多肽的确切的氨基酸与氨基酸比较，其中氨基酸是相同的或具有相似的化学和/或物理性质，诸如电荷或疏水性。然后可以在比较的多肽序列之间确定所谓的“百分比相似性”。用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术也是本领域众所周知的，并且包括确定该基因的mRNA的核苷酸序列(通常经由cDNA中间体)，并确定其中编码的氨基酸序列，并将其与第二氨基酸序列比较。通常，“同一性”分别是指两个多核苷酸或多肽序列的确切的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应性。可以通过确定它们的“百分比同一性”来比较两个或更多个多核苷酸序列，如同两个或更多个氨基酸序列一样。Wisconsin Sequence Analysis Package, 版本8 (可得自Genetics Computer Group,Madison, Wis.)中可得的程序，例如GAP程序，能够分别计算两个多核苷酸之间的同一性和两个多肽序列之间的同一性和相似性。用于计算序列之间的同一性或相似性的其他程序是本领域技术人员已知的。

“对应于”参考位置的氨基酸位置是指与参考序列比对的位置，如通过比对氨基酸序列所鉴定。此类比对可以通过手动或通过使用众所周知的序列比对程序诸如ClustalW2、Blast 2等来进行。

除非另有指明，两个多肽或多核苷酸序列的百分比同一性是指在两个序列中的较短者的整个长度的相同氨基酸残基或核苷酸的百分比。

“编码序列”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“合适的调节序列”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可以整体源自天然基因，或由源自自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因在不同细胞类型中或在不同的发育阶段或响应于不同的环境条件的表达。引起基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下，调节序列的确切边界尚未完全确定，所以不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。

术语“可操作连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个核酸序列的功能受另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与该编码序列可操作连接。编码序列可以与调节序列以有义或反义取向可操作连接。

如本文所使用的术语“表达”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指源自本技术的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”是指在转基因或重组生物体中产生基因产物，其超过正常或非转化生物体中的产生水平。

“转化”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指多核苷酸转移至靶细胞中。转移的多核苷酸可以并入靶细胞的基因组或染色体DNA中，导致基因上稳定的遗传(genetically stable inheritance)，或者其可以独立于宿主染色体复制。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体。

当在本文中与宿主细胞结合使用时，术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指其中已经引入异源核酸分子的宿主生物体的细胞，诸如植物或微生物细胞。核酸分子可以稳定地整合入宿主细胞的基因组中，或者核酸分子可以作为染色体外分子存在。此类染色体外分子可以自主复制。转化的细胞、组织或主体应理解为不仅涵盖转化过程的最终产物，而且涵盖其转基因子代。

当在本文中与多核苷酸结合使用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指源自对于特定宿主细胞而言外源的来源、或者如果源自相同来源则从其原始形式修饰的多核苷酸(例如，DNA序列或基因)。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于特定宿主细胞是内源的、但已经通过例如使用定点诱变或其他重组技术进行修饰的基因。所述术语还包括非天然存在的多个拷贝的天然存在的DNA序列。因此，所述术语是指这样的DNA区段，其对于细胞是外来或异源的，或者与细胞同源、但在宿主细胞内通常不存在所述元件的位置处或者以宿主细胞内通常不存在所述元件的形式。

类似地，当在本文中与多肽或氨基酸序列结合使用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”意指源自对于特定宿主细胞而言外来的来源、或者如果源自相同来源则从其原始形式修饰的多肽或氨基酸序列。因此，重组DNA区段可以在宿主细胞中表达以产生重组多肽。

术语“质粒”、“载体”和“盒”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规含义使用，并且在没有限制的情况下用于指这样的染色体外元件，所述染色体外元件经常携带不是细胞的中央代谢的一部分的基因且通常为环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是源自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性或环状的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已经接合或重组成能够将启动子片段和所选基因产物的DNA序列连同适当的3'非翻译序列引入细胞的独特构建体。“转化盒”是指含有外来基因并且除了外来基因外还具有促进特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”是指含有外来基因并且除了外来基因外还具有允许该基因在外来宿主中的增强表达的元件的特定载体。

本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且描述于例如Sambrook, J., Fritsch, E. F. 和Maniatis, T. Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 第2版; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989(以下称为"Maniatis"); 和Silhavy, T. J., Bennan, M. L.和Enquist, L. W.Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold SpringHarbor, N.Y., 1984; 和Ausubel, F. M.等人, In Current Protocols in MolecularBiology, 由Greene Publishing and Wiley-Interscience出版, 1987; 其各自整体由此在它们与之一致的程度上通过引用并入本文。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但下面描述了优选的材料和方法。

根据本公开，已经开发了用于生产麦角硫因和具有编码可用于生产麦角硫因的EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的基因的宿主细胞的方法。令人惊讶且出人意料地，已经在体外微生物生产***中重现了麦角硫因生产途径。

用于生产麦角硫因的工程改造的宿主细胞

在一个方面，本公开涉及工程改造的宿主细胞。工程改造的宿主细胞包括编码EgtB的核酸序列、编码EgtC的核酸序列、编码EgtD的核酸序列和编码EgtE的核酸序列。

EgtB(或铁(II)-依赖性氧化还原酶EgtB)经由在组氨酸三甲基内盐(N-α,N-α,N-α-三甲基-L-组氨酸)上添加氧和γ-谷氨酰-半胱氨酸而催化组氨酸三甲基内盐的氧化硫化作用。

合适的EgtB可以是，例如，分枝杆菌EgtB。特别合适的EgtB可以是，例如，编码与SEQ ID NO:2中提供的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtB可以是，例如，编码与SEQ ID NO:2中提供的氨基酸序列至少96％相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtB可以是，例如，编码与SEQID NO:2中提供的氨基酸序列至少97％相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtB可以是，例如，编码与SEQ ID NO:2中提供的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtB可以是，例如，编码与SEQ IDNO:2中提供的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtB可以是，例如，编码与SEQ ID NO:2中提供的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。

EgtC(或酰胺水解酶EgtC)催化从N-(γ-谷氨酰)-[N(α), N (α), N (α)-三甲基-L-组氨酰]-半胱氨酸亚砜水解γ-谷氨酰胺键(gamma-glutamyl amide bond)以产生组氨酸三甲基半胱氨酸(hercynylcysteine)亚砜。

合适的EgtC可以是，例如，分枝杆菌EgtC。特别合适的EgtC可以是，例如，编码与SEQ ID NO:4中提供的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtC可以是，例如，编码与SEQ ID NO:4中提供的氨基酸序列至少96％相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtC可以是，例如，编码与SEQID NO:4中提供的氨基酸序列至少97％相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtC可以是，例如，编码与SEQ ID NO:4中提供的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtC可以是，例如，编码与SEQ IDNO:4中提供的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtC可以是，例如，编码与SEQ ID NO:4中提供的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。

EgtD(或组氨酸特异性甲基转移酶EgtD)催化组氨酸的甲基化以形成N-α,N-α,N-α-三甲基-L-组氨酸(也称为组氨酸三甲基内盐(hercynine))。组氨酸和α-N,N-二甲基组氨酸是优选的底物。

合适的EgtD可以是，例如，分枝杆菌EgtD。特别合适的EgtD可以是，例如，编码与SEQ ID NO:6中提供的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtD可以是，例如，编码与SEQ ID NO:6中提供的氨基酸序列至少96％相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtD可以是，例如，编码与SEQID NO:6中提供的氨基酸序列至少97％相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtD可以是，例如，编码与SEQ ID NO:6中提供的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtD可以是，例如，编码与SEQ IDNO:6中提供的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtD可以是，例如，编码与SEQ ID NO:6中提供的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。

EgtE(或磷酸吡哆醛-依赖性蛋白EgtE)据信催化去除丙酮酸、氨和氧以产生麦角硫因。

合适的EgtE可以是，例如，分枝杆菌EgtE。特别合适的EgtE可以是，例如，编码与SEQ ID NO:8中提供的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtE可以是，例如，编码与SEQ ID NO:8中提供的氨基酸序列至少96％相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtE可以是，例如，编码与SEQID NO:8中提供的氨基酸序列至少97％相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtE可以是，例如，编码与SEQ ID NO:8中提供的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtE可以是，例如，编码与SEQ IDNO:8中提供的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一个方面，特别合适的EgtE可以是，例如，编码与SEQ ID NO:8中提供的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。

合适的宿主细胞可以是，例如，细菌细胞和酵母细胞。合适的细菌细胞可以是，例如，大肠杆菌。

合适的酵母细胞可以是，例如，酵母(Saccharomyces)和毕赤酵母(Pichia)。特别合适的酵母可以是，例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。特别合适的毕赤酵母可以是，例如，巴斯德毕赤酵母。

将编码EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的核酸序列克隆至表达载体中在本领域技术人员已知的启动子控制下。合适的启动子可以是，例如，本领域技术人员已知的组成型活性启动子和诱导型启动子。合适的诱导型启动子是本领域技术人员已知的，并且可以是，例如，化学诱导物，营养物添加，营养物耗竭和物理或生理化学因素改变，诸如例如pH改变和温度诱导。合适的化学诱导物可以是，例如，本领域技术人员已知的异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导型启动子和抗生素诱导型启动子。特别合适的化学诱导型启动子可以是，例如，本领域技术人员已知的异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导型启动子。其他合适的诱导型启动子可以是，例如，本领域技术人员已知的温度诱导型启动子，诸如例如，pL和pRλ噬菌体启动子。

特别合适的表达载体示于图1A和1B中。其他合适的表达载体是本领域技术人员已知的，并且可以是，例如，pET载体、pCDF载体、pRSF载体和Duet载体。

用于生产麦角硫因的方法

所述方法还可以包括向培养物添加底物。底物的合适量可以是，例如，约1 mM至约20 mM。特别合适的底物可以是，例如，组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸及其组合。

在另一个实施方案中，所述方法可以包括向培养物添加辅因子。辅因子的合适量可以是，例如，约0.05 mM至约0.4 mM。特别合适的辅因子可以是，例如，铁(II) (Fe⁺⁺)。

在一个实施方案中，所述宿主细胞可以生产约10毫克至约30毫克的麦角硫因/升。

考虑以下非限制性实施例后将更充分理解本公开。

实施例

实施例1

在本实施例中，将EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的核酸序列克隆至大肠杆菌中。

具体地，从GenBank(登录号NC 008596)获得以下序列：Egt B: MSMEG_6249 (SEQID NO:1)；Egt C: MSMEG_6248 (SEQ ID NO:3)；Egt D: MSMEG_6247 (SEQ ID NO:5)；和Egt E: MSMEG_6246 (SEQ ID NO:7)。将基因引入在IPTG诱导型启动子控制下的载体中。

为了在大肠杆菌中构建ET途径，使用表1中概述的引物对从耻垢分枝杆菌的基因组序列中PCR扩增EgtB、C、D、E核酸序列。用于克隆的所有5'-引物包括EcoRI和BglI限制性位点和核糖体结合位点(RBS)，并且所有3'-引物都包括BamHI-XhoI位点。将EgtD和EgtB序列克隆至pConB7A载体(图1A)中，并将EgtC和EgtE序列克隆至pConA5K载体(图1B)中。在克隆的序列中没有鉴定到序列错误。以相同的方式制备空载体。然后将构建体共转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。

表1.用于基因克隆的引物。

实施例2

在本实施例中，在工程改造的微生物***中生产麦角硫因。

具体地，用如实施例1中所述的编码EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的pConB7A载体和pConA5K载体转化大肠杆菌。为了在大肠杆菌***中共表达四种基因(EgtB、C、D、E)，使转化体在含有100 mg/L氨苄青霉素和50 mg/L卡那霉素的LB培养基中在37℃下生长，直至达到OD₆₀₀ ~ 0.6。通过添加0.2-0.5 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)而诱导表达，并将培养物在30℃或37℃下进一步生长16-24小时。通过离心收获细胞，并分别收集上清液和细胞沉淀。将上清液以16,000 x g离心5分钟用于HPLC分析。将沉淀重悬于1ml 50％甲醇中并超声处理1分钟(3 x 20秒)。以16,000×g离心5分钟之后，通过HPLC分析5μl样品，如下所述。将用空载体转化的大肠杆菌以相同的方式处理并通过HPLC分析。将获得自IPTG诱导的含有EgtB、EgtC、EgtD、EgtE基因的大肠杆菌的样品掺入20 mg/L麦角硫因并通过HPLC分析。

使用Dionex UPLC Ultimate 3000 (Sunnyvale, CA)分析样品。在AtlantisHILIC硅胶柱(粒径3.0μm，直径×长度= 2.1×100 mm；Waters)上分离化合物，并在264 nm检测。流动相由0.1％甲酸/水(A)和0.1％甲酸/乙腈(B)组成。梯度程序为在1分钟的95％B，在8分钟的40％ B，在8.1分钟的95％B，在11分钟时终止。流速为0.6 ml/分钟，且注射体积为5μl。

如图2中所示，ET令人惊讶地仅在IPTG诱导的含有EgtB、EgtC、EgtD、EgtE序列的大肠杆菌菌株(“SI”)中积累，成功地表明在工程改造的大肠杆菌中ET的生物合成。相反，IPTG诱导的含有空载体的大肠杆菌不生产任何ET(“EI”)。在ET-掺入样品中，来自IPTG诱导的含有EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的大肠杆菌菌株的ET峰与添加的麦角硫因重叠，并且表明增加的水平以解释添加的ET(“Ck+”)。

图3A和3B说明100 mg/L麦角硫因标准品的HPLC分析。如图4A中所示，来自含有EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的大肠杆菌菌株的ET的保留时间与麦角硫因标准品的保留时间重叠(参见图3A)。除了保留时间以外，ET峰的UV光谱(参见图4B)也与麦角硫因标准品(参见图3B)匹配。这些结果表明，来自表达EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的工程改造的大肠杆菌菌株的峰对应于ET。

实施例3

在本实施例中，进行工程改造的微生物***中麦角硫因生产的时间过程。

具体地，用如实施例1中所述的含有EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的基因的载体转化大肠杆菌。对照大肠杆菌细胞包括具有空载体(无Egt基因)的细胞和含有Egt载体、但未被诱导的未诱导菌株。使细胞在30℃或37℃下生长，如实施例2所述。在0小时至20小时的不同时间点取样。超声处理1分钟(3 x 20秒)之后，将样品以16,000 x g离心5分钟，并通过HPLC分析5μl样品，如实施例2中所讨论。

如图5中所示，HPLC分析揭示，到IPTG诱导后约1小时，细胞开始生产ET。从IPTG诱导后约3小时直至约10小时观察到ET生产的最快增加。ET生产在10小时后减慢，但继续生产至少直到20小时。同时，在整个时间过程中在空载体对照中完全没有检测到ET。这些结果进一步表明，ET专门在工程改造用于表达EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的大肠杆菌菌株中生产。

实施例4

在本实施例中，进行进料实验以确定对工程改造的微生物***中的麦角硫因生产的影响。

不受理论束缚，据信ET由氨基酸诸如组氨酸(His)、甲硫氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)合成。ET的咪唑环由His提供，然后将其甲基化以产生组氨酸甜菜碱。Met是充当甲基供体的S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)的构件(building block)。硫原子从Cys引入。

为了测定对工程改造的大肠杆菌中的麦角硫因生产的影响，通过培养基将几种底物和辅因子诸如Fe⁺⁺进料给转基因大肠杆菌细胞。诱导3小时后，将2 mM His、4 mM Met、4mM Cys和0.2 mM Fe⁺⁺添加至培养基，并将细胞进一步培养16小时、24小时和42小时。用相同的底物或辅因子进料对照大肠杆菌培养物(携带空载体)。通过HPLC分析样品，如实施例2所述。

如图6中所示，进料实验揭示，Cys的添加在三个时间点内使ET产量增加17.3-44.4％。该结果表明Cys及其衍生物γ-谷氨酰半胱氨酸在ET的生物合成中发挥重要作用。对照培养物不产生任何ET。

实施例5

在本实施例中，将在工程改造的酿酒酵母***中生产麦角硫因。

为了在酿酒酵母中生产ET，将EgtB、C、D、E基因克隆至可商购的pESC载体中，诸如pESC-His和pESC-Leu (Agilent Technologies)。这些载体含有相反取向的GAL1和GAL10酵母启动子，其允许将两个基因引入酵母菌株中分别在两个阻抑型启动子的控制下。然后将所得两种构建体共转化至酿酒酵母中。为了在酵母中共表达四种基因(EgtB、C、D、E)，将转化体在不含两种氨基酸组氨酸和亮氨酸的培养基中生长，直到达到OD₆₀₀ ~ 0.4。通过添加2％半乳糖诱导表达，并且使培养物在28℃或30℃下进一步生长24-48小时。通过离心收获细胞，并分别收集上清液和细胞沉淀。将上清液以12,000 x g离心5分钟，并通过HPLC分析。将沉淀重悬于1ml 50％甲醇中并超声处理1分钟(3 x 20秒)。以12,000 x g离心5分钟之后，将5μl样品注入HPLC中。携带空载体的酵母以相同的方式进行转化和分析。可以将上述构建体最终整合入酵母基因组中并在组成型启动子诸如GPD启动子或GAP启动子的控制下表达。

实施例6

在本实施例中，在工程改造的巴斯德毕赤酵母***中生产麦角硫因。

为了在巴斯德毕赤酵母中生产ET，将EgtB、C、D、E基因克隆至可商购的pPICZ或pGAPZ载体(Invitrogen, Life Technologies)中。pPICZ载体含有甲醇调节的AOX1启动子，而pGAPZ载体具有组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子。pPICZ载体中的四种基因(EgtB、C、D、E)的共表达将由0.5-5％甲醇诱导。ET的生产将使用上述相同方法通过HPLC分析来分析。

鉴于上述内容，将看到，实现了本公开的几个优点并且获得了其他有利的结果。因为在不背离本公开范围的情况下可以在上述方法和***中进行各种改变，所以意欲上文描述中含有和附图中显示的所有内容均应被解释为说明性而非限制性意义。

当介绍本公开的要素或其各种版本、实施方案或方面时，冠词“一个/种(a)”，“一个/种(an)”，“该(the)”和“所述(said)”意指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”意欲为包括性的，并且意味着可以存在除了所列要素之外的额外要素。

序列表

<110> Conagen Inc.

Han, Jixiang

Chen, Hui

Yu, Oliver

<120> 微生物麦角硫因生物合成

<130> C1497.70015

<140> 尚未指定

<141> 随此同时地

<150> PCT/US2015/027977

<151> 2015-04-28

<160> 16

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 1287

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

atgatcgcac gcgagacact ggccgacgag ctggccctgg cccgcgaacg cacgttgcgg 60

ctcgtggagt tcgacgacgc ggaactgcat cgccagtaca acccgctgat gagcccgctc 120

gtgtgggacc tcgcgcacat cgggcagcag gaagaactgt ggctgctgcg cgacggcaac 180

cccgaccgcc ccggcatgct cgcacccgag gtggaccggc tttacgacgc gttcgagcac 240

tcacgcgcca gccgggtcaa cctcccgttg ctgccgcctt cggatgcgcg cgcctactgc 300

gcgacggtgc gggccaaggc gctcgacacc ctcgacacgc tgcccgagga cgatccgggc 360

ttccggttcg cgctggtgat cagccacgag aaccagcacg acgagaccat gctgcaggca 420

ctcaacctgc gcgagggccc acccctgctc gacaccggaa ttcccctgcc cgcgggcagg 480

ccaggcgtgg caggcacgtc ggtgctggtg ccgggcggcc cgttcgtgct cggggtcgac 540

gcgctgaccg aaccgcactc actggacaac gaacggcccg cccacgtcgt ggacatcccg 600

tcgttccgga tcggccgcgt gccggtcacc aacgccgaat ggcgcgagtt catcgacgac 660

ggtggctacg accaaccgcg ctggtggtcg ccacgcggct gggcgcaccg ccaggaggcg 720

ggcctggtgg ccccgcagtt ctggaacccc gacggcaccc gcacccggtt cgggcacatc 780

gaggagatcc cgggtgacga acccgtgcag cacgtgacgt tcttcgaagc cgaggcctac 840

gcggcgtggg ccggtgctcg gttgcccacc gagatcgaat gggagaaggc ctgcgcgtgg 900

gatccggtcg ccggtgctcg gcgccggttc ccctggggct cagcacaacc cagcgcggcg 960

ctggccaacc tcggcggtga cgcacgccgc ccggcgccgg tcggggccta cccggcgggg 1020

gcgtcggcct atggcgccga gcagatgctg ggcgacgtgt gggagtggac ctcctcgccg 1080

ctgcggccgt ggcccggttt cacgccgatg atctacgagc gctacagcac gccgttcttc 1140

gagggcacca catccggtga ctaccgcgtg ctgcgcggcg ggtcatgggc cgttgcaccg 1200

ggaatcctgc ggcccagctt ccgcaactgg gaccacccga tccggcggca gatattctcg 1260

ggtgtccgcc tggcctggga cgtctga 1287

<210> 2

<211> 428

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Met Ile Ala Arg Glu Thr Leu Ala Asp Glu Leu Ala Leu Ala Arg Glu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Arg Leu Val Glu Phe Asp Asp Ala Glu Leu His Arg Gln

20 25 30

Tyr Asn Pro Leu Met Ser Pro Leu Val Trp Asp Leu Ala His Ile Gly

35 40 45

Gln Gln Glu Glu Leu Trp Leu Leu Arg Asp Gly Asn Pro Asp Arg Pro

50 55 60

Gly Met Leu Ala Pro Glu Val Asp Arg Leu Tyr Asp Ala Phe Glu His

65 70 75 80

Ser Arg Ala Ser Arg Val Asn Leu Pro Leu Leu Pro Pro Ser Asp Ala

85 90 95

Arg Ala Tyr Cys Ala Thr Val Arg Ala Lys Ala Leu Asp Thr Leu Asp

100 105 110

Thr Leu Pro Glu Asp Asp Pro Gly Phe Arg Phe Ala Leu Val Ile Ser

115 120 125

His Glu Asn Gln His Asp Glu Thr Met Leu Gln Ala Leu Asn Leu Arg

130 135 140

Glu Gly Pro Pro Leu Leu Asp Thr Gly Ile Pro Leu Pro Ala Gly Arg

145 150 155 160

Pro Gly Val Ala Gly Thr Ser Val Leu Val Pro Gly Gly Pro Phe Val

165 170 175

Leu Gly Val Asp Ala Leu Thr Glu Pro His Ser Leu Asp Asn Glu Arg

180 185 190

Pro Ala His Val Val Asp Ile Pro Ser Phe Arg Ile Gly Arg Val Pro

195 200 205

Val Thr Asn Ala Glu Trp Arg Glu Phe Ile Asp Asp Gly Gly Tyr Asp

210 215 220

Gln Pro Arg Trp Trp Ser Pro Arg Gly Trp Ala His Arg Gln Glu Ala

225 230 235 240

Gly Leu Val Ala Pro Gln Phe Trp Asn Pro Asp Gly Thr Arg Thr Arg

245 250 255

Phe Gly His Ile Glu Glu Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Gln His Val

260 265 270

Thr Phe Phe Glu Ala Glu Ala Tyr Ala Ala Trp Ala Gly Ala Arg Leu

275 280 285

Pro Thr Glu Ile Glu Trp Glu Lys Ala Cys Ala Trp Asp Pro Val Ala

290 295 300

Gly Ala Arg Arg Arg Phe Pro Trp Gly Ser Ala Gln Pro Ser Ala Ala

305 310 315 320

Leu Ala Asn Leu Gly Gly Asp Ala Arg Arg Pro Ala Pro Val Gly Ala

325 330 335

Tyr Pro Ala Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ala Glu Gln Met Leu Gly Asp

340 345 350

Val Trp Glu Trp Thr Ser Ser Pro Leu Arg Pro Trp Pro Gly Phe Thr

355 360 365

Pro Met Ile Tyr Glu Arg Tyr Ser Thr Pro Phe Phe Glu Gly Thr Thr

370 375 380

Ser Gly Asp Tyr Arg Val Leu Arg Gly Gly Ser Trp Ala Val Ala Pro

385 390 395 400

Gly Ile Leu Arg Pro Ser Phe Arg Asn Trp Asp His Pro Ile Arg Arg

405 410 415

Gln Ile Phe Ser Gly Val Arg Leu Ala Trp Asp Val

420 425

<210> 3

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

atgtgccggc atgtggcgtg gctgggcgcg ccgcggtcgt tggccgacct ggtgctcgac 60

ccgccgcagg gactgctggt gcagtcctac gcaccgcgac gacagaagca cggtctgatg 120

aacgccgacg gttggggcgc agggtttttc gacgacgagg gagtggcccg ccgctggcgc 180

agcgacaaac cgctgtgggg tgatgcgtcg ttcgcgtcgg tggcacccgc actacgcagt 240

cgttgcgtgc tggccgcggt gcgctcggcc accatcggca tgcccatcga accgtcggcg 300

tcggcgccgt tcagcgacgg gcagtggctg ctgtcgcaca acggcctggt cgaccgcggg 360

gtgctcccgt tgaccggtgc cgccgagtcc acggtggaca gcgcgatcgt cgcggcgctc 420

atcttctccc gtggcctcga cgcgctcggc gccaccatcg ccgaggtcgg cgaactcgac 480

ccgaacgcgc ggttgaacat cctggccgcc aacggttccc ggctgctcgc caccacctgg 540

ggggacacgc tgtcggtcct gcaccgcccc gacggcgtcg tcctcgcgag cgaaccctac 600

gacgacgatc ccggctggtc ggacatcccg gaccggcacc tcgtcgacgt ccgcgacgcc 660

cacgtcgtcg tgacacccct gtga 684

<210> 4

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Met Cys Arg His Val Ala Trp Leu Gly Ala Pro Arg Ser Leu Ala Asp

1 5 10 15

Leu Val Leu Asp Pro Pro Gln Gly Leu Leu Val Gln Ser Tyr Ala Pro

20 25 30

Arg Arg Gln Lys His Gly Leu Met Asn Ala Asp Gly Trp Gly Ala Gly

35 40 45

Phe Phe Asp Asp Glu Gly Val Ala Arg Arg Trp Arg Ser Asp Lys Pro

50 55 60

Leu Trp Gly Asp Ala Ser Phe Ala Ser Val Ala Pro Ala Leu Arg Ser

65 70 75 80

Arg Cys Val Leu Ala Ala Val Arg Ser Ala Thr Ile Gly Met Pro Ile

85 90 95

Glu Pro Ser Ala Ser Ala Pro Phe Ser Asp Gly Gln Trp Leu Leu Ser

100 105 110

His Asn Gly Leu Val Asp Arg Gly Val Leu Pro Leu Thr Gly Ala Ala

115 120 125

Glu Ser Thr Val Asp Ser Ala Ile Val Ala Ala Leu Ile Phe Ser Arg

130 135 140

Gly Leu Asp Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ala Glu Val Gly Glu Leu Asp

145 150 155 160

Pro Asn Ala Arg Leu Asn Ile Leu Ala Ala Asn Gly Ser Arg Leu Leu

165 170 175

Ala Thr Thr Trp Gly Asp Thr Leu Ser Val Leu His Arg Pro Asp Gly

180 185 190

Val Val Leu Ala Ser Glu Pro Tyr Asp Asp Asp Pro Gly Trp Ser Asp

195 200 205

Ile Pro Asp Arg His Leu Val Asp Val Arg Asp Ala His Val Val Val

210 215 220

Thr Pro Leu

225

<210> 5

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

atgacgctct cactggccaa ctacctggca gccgactcgg ccgccgaagc actgcgccgt 60

gacgtccgcg cgggcctcac cgcggcaccg aagagtctgc cgcccaagtg gttctacgac 120

gccgtcggca gtgatctgtt cgaccagatc acccggctcc ccgagtatta ccccacccgc 180

accgaggcgc agatcctgcg gacccggtcg gcggagatca tcgcggccgc gggtgccgac 240

accctggtgg aactgggcag tggtacgtcg gagaaaaccc gcatgctgct cgacgccatg 300

cgcgacgccg agttgctgcg ccgcttcatc ccgttcgacg tcgacgcggg cgtgctgcgc 360

tcggccgggg cggcaatcgg cgcggagtac cccggtatcg agatcgacgc ggtatgtggc 420

gatttcgagg aacatctggg caagatcccg catgtcggac ggcggctcgt ggtgttcctg 480

gggtcgacca tcggcaacct gacacccgcg ccccgcgcgg agttcctcag tactctcgcg 540

gacacgctgc agccgggcga cagcctgctg ctgggcaccg atctggtgaa ggacaccggc 600

cggttggtgc gcgcgtacga cgacgcggcc ggcgtcaccg cggcgttcaa ccgcaacgtg 660

ctggccgtgg tgaaccgcga actgtccgcc gatttcgacc tcgacgcgtt cgagcatgtc 720

gcgaagtgga actccgacga ggaacgcatc gagatgtggt tgcgtgcccg caccgcacag 780

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accgaggtgt cctgcaagtt ccgtcccgag aacgtcgtcg ccgagctggc ggaagccggt 900

ctgcggcaga cgcattggtg gaccgatccg gccggggatt tcgggttgtc gctggcggtg 960

cggtga 966

<210> 6

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Met Thr Leu Ser Leu Ala Asn Tyr Leu Ala Ala Asp Ser Ala Ala Glu

1 5 10 15

Ala Leu Arg Arg Asp Val Arg Ala Gly Leu Thr Ala Ala Pro Lys Ser

20 25 30

Leu Pro Pro Lys Trp Phe Tyr Asp Ala Val Gly Ser Asp Leu Phe Asp

35 40 45

Gln Ile Thr Arg Leu Pro Glu Tyr Tyr Pro Thr Arg Thr Glu Ala Gln

50 55 60

Ile Leu Arg Thr Arg Ser Ala Glu Ile Ile Ala Ala Ala Gly Ala Asp

65 70 75 80

Thr Leu Val Glu Leu Gly Ser Gly Thr Ser Glu Lys Thr Arg Met Leu

85 90 95

Leu Asp Ala Met Arg Asp Ala Glu Leu Leu Arg Arg Phe Ile Pro Phe

100 105 110

Asp Val Asp Ala Gly Val Leu Arg Ser Ala Gly Ala Ala Ile Gly Ala

115 120 125

Glu Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Asp Ala Val Cys Gly Asp Phe Glu Glu

130 135 140

His Leu Gly Lys Ile Pro His Val Gly Arg Arg Leu Val Val Phe Leu

145 150 155 160

Gly Ser Thr Ile Gly Asn Leu Thr Pro Ala Pro Arg Ala Glu Phe Leu

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asp Thr Leu Gln Pro Gly Asp Ser Leu Leu Leu Gly

180 185 190

Thr Asp Leu Val Lys Asp Thr Gly Arg Leu Val Arg Ala Tyr Asp Asp

195 200 205

Ala Ala Gly Val Thr Ala Ala Phe Asn Arg Asn Val Leu Ala Val Val

210 215 220

Asn Arg Glu Leu Ser Ala Asp Phe Asp Leu Asp Ala Phe Glu His Val

225 230 235 240

Ala Lys Trp Asn Ser Asp Glu Glu Arg Ile Glu Met Trp Leu Arg Ala

245 250 255

Arg Thr Ala Gln His Val Arg Val Ala Ala Leu Asp Leu Glu Val Asp

260 265 270

Phe Ala Ala Gly Glu Glu Met Leu Thr Glu Val Ser Cys Lys Phe Arg

275 280 285

Pro Glu Asn Val Val Ala Glu Leu Ala Glu Ala Gly Leu Arg Gln Thr

290 295 300

His Trp Trp Thr Asp Pro Ala Gly Asp Phe Gly Leu Ser Leu Ala Val

305 310 315 320

Arg

<210> 7

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

atgctcgcgc agcagtggcg tgacgcccgt cccaaggttg ccgggttgca cctggacagc 60

ggggcatgtt cgcggcagag cttcgcggtg atcgacgcga ccaccgcaca cgcacgccac 120

gaggccgagg tgggtggtta tgtggcggcc gaggctgcga cgccggcgct cgacgccggg 180

cgggccgcgg tcgcgtcgct catcggtttt gcggcgtcgg acgtggtgta caccagcgga 240

tccaaccacg ccatcgacct gttgctgtcg agctggccgg ggaagcgcac gctggcctgc 300

ctgcccggcg agtacgggcc gaatctgtct gccatggcgg ccaacggttt ccaggtgcgt 360

gcgctaccgg tcgacgacga cgggcgggtg ctggtcgacg aggcgtcgca cgaactgtcg 420

gcccatcccg tcgcgctcgt acacctcacc gcattggcaa gccatcgcgg gatcgcgcaa 480

cccgcggcag aactcgtcga ggcctgccac aatgcgggga tccccgtggt gatcgacgcc 540

gcgcaggcgc tggggcatct ggactgcaat gtcggggccg acgcggtgta ctcatcgtcg 600

cgcaagtggc tcgccggccc gcgtggtgtc ggggtgctcg cggtgcggcc cgaactcgcc 660

gagcgtctgc aaccgcggat ccccccgtcc gactggccaa ttccgatgag cgtcttggag 720

aagctcgaac taggtgagca caacgcggcg gcgcgtgtgg gattctccgt cgcggttggt 780

gagcatctcg cagcagggcc cacggcggtg cgcgaacgac tcgccgaggt ggggcgtctc 840

tctcggcagg tgctggcaga ggtcgacggg tggcgcgtcg tcgaacccgt cgaccaaccc 900

accgcgatca ccacccttga gtccaccgat ggtgccgatc ccgcgtcggt gcgctcgtgg 960

ctgatcgcgg agcgtggcat cgtgaccacc gcgtgtgaac tcgcgcgggc accgttcgag 1020

atgcgcacgc cggtgctgcg aatctcgccg cacgtcgacg tgacggtcga cgaactggag 1080

cagttcgccg cagcgttgcg tgaggcgccc tga 1113

<210> 8

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Met Leu Ala Gln Gln Trp Arg Asp Ala Arg Pro Lys Val Ala Gly Leu

1 5 10 15

His Leu Asp Ser Gly Ala Cys Ser Arg Gln Ser Phe Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ala Thr Thr Ala His Ala Arg His Glu Ala Glu Val Gly Gly Tyr Val

35 40 45

Ala Ala Glu Ala Ala Thr Pro Ala Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Val

50 55 60

Ala Ser Leu Ile Gly Phe Ala Ala Ser Asp Val Val Tyr Thr Ser Gly

65 70 75 80

Ser Asn His Ala Ile Asp Leu Leu Leu Ser Ser Trp Pro Gly Lys Arg

85 90 95

Thr Leu Ala Cys Leu Pro Gly Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Ser Ala Met

100 105 110

Ala Ala Asn Gly Phe Gln Val Arg Ala Leu Pro Val Asp Asp Asp Gly

115 120 125

Arg Val Leu Val Asp Glu Ala Ser His Glu Leu Ser Ala His Pro Val

130 135 140

Ala Leu Val His Leu Thr Ala Leu Ala Ser His Arg Gly Ile Ala Gln

145 150 155 160

Pro Ala Ala Glu Leu Val Glu Ala Cys His Asn Ala Gly Ile Pro Val

165 170 175

Val Ile Asp Ala Ala Gln Ala Leu Gly His Leu Asp Cys Asn Val Gly

180 185 190

Ala Asp Ala Val Tyr Ser Ser Ser Arg Lys Trp Leu Ala Gly Pro Arg

195 200 205

Gly Val Gly Val Leu Ala Val Arg Pro Glu Leu Ala Glu Arg Leu Gln

210 215 220

Pro Arg Ile Pro Pro Ser Asp Trp Pro Ile Pro Met Ser Val Leu Glu

225 230 235 240

Lys Leu Glu Leu Gly Glu His Asn Ala Ala Ala Arg Val Gly Phe Ser

245 250 255

Val Ala Val Gly Glu His Leu Ala Ala Gly Pro Thr Ala Val Arg Glu

260 265 270

Arg Leu Ala Glu Val Gly Arg Leu Ser Arg Gln Val Leu Ala Glu Val

275 280 285

Asp Gly Trp Arg Val Val Glu Pro Val Asp Gln Pro Thr Ala Ile Thr

290 295 300

Thr Leu Glu Ser Thr Asp Gly Ala Asp Pro Ala Ser Val Arg Ser Trp

305 310 315 320

Leu Ile Ala Glu Arg Gly Ile Val Thr Thr Ala Cys Glu Leu Ala Arg

325 330 335

Ala Pro Phe Glu Met Arg Thr Pro Val Leu Arg Ile Ser Pro His Val

340 345 350

Asp Val Thr Val Asp Glu Leu Glu Gln Phe Ala Ala Ala Leu Arg Glu

355 360 365

Ala Pro

370

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

agaattcaaa agatctaaag gaggccatcc atgatcgcac gcgagacac 49

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

actcgagttt ggatcctcag acgtcccagg ccaggcggac acccgagaat atc 53

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

agaattcaaa agatctaaag gaggccatcc atgtgccggc atgtggcgtg 50

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

actcgagttt ggatcctcac aggggtgtca cgac 34

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

agaattcaaa agatctaaag gaggccatcc atgacgctct cactggccaa c 51

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

actcgagttt ggatcctcac cgcaccgcca gcgac 35

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

agaattcaaa agatctaaag gaggccatcc atgctcgcgc agcagtg 47

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

actcgagttt ggatcctcag ggcgcctcac gcaac 35

Claims

1.用于生产麦角硫因的工程改造的宿主细胞，其包含编码EgtB的核酸序列、编码EgtC的核酸序列、编码EgtD的核酸序列和编码EgtE的核酸序列。

2.权利要求1的工程改造的宿主细胞，其中所述编码EgtB的核酸序列编码与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

3.权利要求1的工程改造的宿主细胞，其中所述编码EgtC的核酸序列编码与SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

4.权利要求1的工程改造的宿主细胞，其中所述编码EgtD的核酸序列编码与SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

5.权利要求1的工程改造的宿主细胞，其中所述编码EgtE的核酸序列编码与SEQ IDNO:8的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

6.权利要求1的工程改造的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞和酵母细胞。

7.权利要求6的工程改造的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

8.权利要求6的工程改造的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自酵母(Saccharomyces)细胞和毕赤酵母(Pichia)细胞。

9.权利要求8的工程改造的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

10.生产麦角硫因的方法，所述方法包括：

培养宿主细胞，其中所述宿主细胞用编码EgtB的核酸序列、编码EgtC的核酸序列、编码EgtD的核酸序列和编码EgtE的核酸序列转化；

诱导所述宿主细胞以表达编码EgtB的核酸序列、编码EgtC的核酸序列、编码EgtD的核酸序列和编码EgtE的核酸序列；和

收集麦角硫因。

11.权利要求10的方法，其中向培养物中添加选自组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸及其组合的底物。

12.权利要求10的方法，其中向培养物中添加铁(II)。

13.权利要求10的方法，其中所述宿主细胞选自细菌细胞和酵母细胞。

14.权利要求10的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。

15.权利要求13的方法，其中所述宿主细胞选自酵母细胞和毕赤酵母细胞。

16.权利要求15的方法，其中所述宿主细胞选自酿酒酵母细胞和巴斯德毕赤酵母细胞。

17.用于生产麦角硫因的表达载体，其包含编码选自EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的氨基酸序列的核酸序列。

18.权利要求17的表达载体，其中所述核酸序列编码选自以下的氨基酸序列：与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。