JP4193986B2 - ガンマグルタミルシステインの生産方法 - Google Patents
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Description
Grill,E.,Loeffler,S.,Winnacker,E.L.,and Zenk,M.H.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86,6838−6842.
これらのいわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は、対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっており、かつデータベースに登録されている場合、かかるデータベースを用いて配列検索することにより得ることができるであろう。
実際、本発明者がNCBI−BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)を用いて配列検索したところ、シアノバクテリアNostoc punctiforme,Trichodesmium erythraeum IMS101,及びProchlorococcus marinus MIT9313においても本発明の遺伝子に類似する遺伝子が存在することが見出された(図6参照)。図6に示す通り、alr 0975タンパク質とこれらの三つの遺伝子によりコードされる推定されるタンパク質は真核生物のPC合成酵素のN末端領域と相同性が高く、かつ五つの保存的システインのうち一つしか有していないという共通の性質(後ほど詳細に説明する)を有する。従ってこれらの三つの遺伝子もグルタチオンからγECを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である可能性が極めて高く、本発明の遺伝子に包含されうるものである。
対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっていない場合、いわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は以下の手順により得ることができるであろう。
(1)γECG→γEC+G
(2)(γEC)nG+γEC→(γEC)n+1G
一段階目の反応は基質であるグルタチオンからグリシンを切り離してγECを生成する反応である。このγECを二段階目の反応においてアクセプターであるPCnと結合させることによってPCn+1が合成される。この二つの反応を繰り返すことにより、重合度の高いPCが生合成される。
使用株
Nostoc sp.PCC 7120(The Pasteur Culture Collectionより分与)
E.coli BL21(DE3)細胞(NOVAGENより購入)
培養方法
Nostoc sp.PCC 7120は以下に示す条件で培養を行った。
培地:BG11 培地
光照射条件:白色蛍光灯連続照射(10W/m2)
通気条件:1% CO2連続通気(30ml/分)
培養温度:30℃
最近、かずさDNA研究所のゲノムプロジェクトによりシアノバクテリアNostoc sp.PCC 7120の全ゲノム配列が決定され、公表された。本発明者はこのNostoc sp.PCC 7120の配列データベースを検索することにより、真核生物において見出されるPC合成酵素の遺伝子と類似する予想される遺伝子alr 0975(配列表の配列番号1;DDBJ/EMBL/GenBank accession No.AP 003584)の存在を見出した。この遺伝子はシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のAtPCS1遺伝子(accession No.AF 085230)に対してアミノ酸レベルで36%の相同性を有する仮想的なタンパク質をコードする。alr 0975タンパク質は242個のアミノ酸残基からなる(配列表の配列番号2)。
alr 0975遺伝子をゲノム中に有するNostoc細胞が重金属によりPCを誘導生産するかどうか調べるため、Nostoc細胞を様々な濃度のCdCl2及びZnCl2で処理して細胞中のPCの検出を試みた。
サンプルの調製:藻細胞を遠心分離(1,500×g,10分,4℃)により回収し、30mM Tris−HClバッファー(pH8.0)で再懸濁した。細胞懸濁液を凍結乾燥機(Freezone 1L,Labconco)を用いて24時間凍結乾燥後、1.0mLの0.5mg/mL NaBH4を含んだ0.5N NaOH溶液に懸濁し、超音波破砕した(output:4.5,duty cycle:50%,4分)。遠心分離(10,000×g,10分,4℃)により得た上清を0.8mL回収し、塩酸によりタンパク質除去を行った。タンパク質除去は回収したサンプル0.8mLに0.16mLの3.6N HClを加え、ボルテックスにより撹拌し、氷上で15分間放置した後、遠心(10,000×g,10分,4℃)により上清を回収することにより行った。
測定方法:上記の操作によって得たサンプルを0.02%のトリフルオロ酢酸(TFA)及び5mMのオクタン硫酸で平衡化した逆相カラム(Hibar HPLC−cartridge 250−4 LiChrospher 100RP−18(5μM))を用いて、グラジエントプログラムによりアセトニトリルの濃度を上昇させて流速1.5mL/minで溶出した後、3mのサンプルループ中で流速1.5mL/分でEllman試薬と混合し、50℃で反応させ、412nmでの吸光度を測定した。
Nostoc細胞におけるalr 0975遺伝子の発現を測定するため、alr 0975DNAフラグメントをプローブとして以下の手順でノーザン解析を行った。
5μM CdCl2もしくは10μM ZnCl2に12時間さらしたNostoc細胞を遠心分離し、全RNAをTRIzol(登録商標)LS reagent(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA USA)とガラスビーズによるボルテックスを用いた撹拌によって抽出した。また、ネガティブコントロールとして重金属で処理していないNostoc細胞から同様に全RNAを抽出した。得られた全RNA(各20μg)をAmershamのstruction manualsに従い、電気泳動による分離、ナイロン膜(Hybond N+,Amersham,Piscataway,NJ USA)への転写、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションプローブとしては、Nostoc sp.PCC 7120より抽出したゲノムDNA をテンプレートとし、以下のプライマーを用いて行ったPCRによる増幅産物を用いた。
NsF2(5’−GTGATAGTTATGAAACTCTTTATC−3’:配列番号3)
NsR2(5’−CTAATCTTGTGTTTTACTTACGAA−3’:配列番号4)
(1)alr 0975遺伝子のクローニング及び組換えalr 0975タンパク質の精製
PC合成酵素としてのalr 0975タンパク質の機能を調べるため、以下の手順でalr 0975遺伝子をクローニングし、組換えalr 0975タンパク質を精製した。
クローニングおよび発現ベクターの構築:Nostoc sp.PCC 7120から抽出したゲノムDNAをテンプレートとして、以下に示すプライマーを用いてalr 0975遺伝子をPCRにより増幅した。
NsF1 (5’−CTTCATATGATAGTTATGAAACTCTTTATC−3’:配列番号5)
NsR1 (5’−ATCGGATCCTAATCTTGTGTTTTACTTACG−3’:配列番号6)
得られたDNA断片を制限酵素NdeIとBamHIを用いて処理し、これをpET25b(+)ベクター(Novagenより購入)に挿入し(pET25b−alr 0975)、シークエンス解析を行い、alr 0975配列であることを確認した。得られたプラスミドを用いて、E.coli BL21(DE3)細胞を形質転換した。
得られた形質転換体を50μg/mLカルベニシリンを含むLB培地にて液体培養し、対数増殖期に0.1mMになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することによって、タンパク質合成を誘導した。IPTG処理後、6時間培養した細胞を遠心分離により回収し、バッファー(1mM EDTA 及び 1mM β−メルカプトエタノールを含む100mM Tris−HCl バッファー(pH8.0))に懸濁した。細胞懸濁液を超音波破砕にかけ、可溶性画分を抽出し、これを1mM EDTAと1mM β−メルカプトエタノールを含む20mM Tris−HCl バッファー(pH8.0)を用いて、一晩かけて透析を行った。その後、サンプルをDEAE−Toyopearl column (5cmx15cm;Tosho,Tokyo,Japan)に供し、素通り画分を回収した。これを1mM EDTAを含む20mM リン酸バッファー(pH6.0)を用いて、一晩かけて透析を行った。得られたタンパク質画分をAEKTAタンパク質精製システムを備え付けたHiTrap SP column(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)に供し、精製を行った。20mM リン酸バッファー(pH6.0)中において0から10mM NaCl のグラジエントプログラムによって精製タンパク質を得た。
組換えalr 0975タンパク質のin vitroでのPC合成酵素活性は以下の手順で調査した。
(1)の操作によって得られた組換えタンパク質の濃度をBradford法により測定した。次に、200mM Tris−HCl バッファー(pH8.0)、10mM β−メルカプトエタノール、10mM グルタチオン、0.5mM CdCl2、2μg 組換えalr 0975タンパク質を含む酵素反応溶液(125μl)を調製し、35℃で60分間反応させ、125μLの3.6N HClを添加することにより反応を停止させた。得られたサンプルについて実施例2で述べたHPLC法により、生成物を分離した。
組換えalr 0975タンパク質を用いたin vivoでのγEC生産を確認するため、実施例4の(1)で作成した組換え大腸菌(alr 0975遺伝子で形質転換された大腸菌)を100μM CdCl2の存在下及び不在下で8.5時間培養し、実施例2と同様の手順でチオール化合物を測定した。コントロールとしてシロイヌナズナのPC合成酵素遺伝子AtPCS1で形質転換した大腸菌を100μM CdCl2の存在下及び不在下で8.5時間培養し、同様にチオール化合物を測定した。また、ブランクとしてalr 0975遺伝子を挿入していない空のpET25b(+)ベクターを導入した大腸菌を100μM CdCl2の存在下及び不在下で8.5時間培養し、同様にチオール化合物を測定した。
Claims (1)
- (i)配列番号2のアミノ酸配列、又は配列番号2において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン(γEC)を生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子、又は(ii)配列番号1の塩基配列からなるDNA、又は配列番号1の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質が、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン(γEC)を生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子、が導入されている組換え生物を、前記遺伝子が発現する条件下で培養し、これにより前記組換え生物の体内にガンマグルタミルシステイン(γEC)を蓄積させ、そして前記組換え生物からガンマグルタミルシステイン(γEC)を回収することを特徴とするガンマグルタミルシステイン(γEC)の生産方法。
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