CN112251392B - 一种生产麦角硫因的基因工程菌株及其应用 - Google Patents

一种生产麦角硫因的基因工程菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株高产麦角硫因的基因工程菌及其应用，该菌株是以大肠杆菌为宿主，在宿主的基因组上整合了谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体的编码基因hisG*；还在其基因组上增加了组氨酸操纵子基因hisDBCHAFI的拷贝数；还在其基因组上整合了耻垢分枝杆菌麦角硫因操纵子基因egtBCDE；还在其基因组上整合了大肠杆菌谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因gshA，促进麦角硫因的合成；还在其基因组上整合了粗糙脉胞菌C‑S裂解酶编码基因egtEncr，进一步促进麦角硫因合成；还在其基因组上整合了亚砜合酶突变体的基因egtB*msm，进一步促进麦角硫因合成。

Description

一种生产麦角硫因的基因工程菌株及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种生产麦角硫因的基因工程菌及其应用。
背景技术
麦角硫因(Ergothioneine，EGT)，巯基组氨酸三甲基内盐，是1909年在麦角中发现的一种天然氨基酸衍生物。麦角硫因具有抗氧化、清除自由基、调节氧化还原反应以及参与细胞内能量调节等多种功能。由于其优良细胞生理保护功能，麦角硫因可以应用到包括医药、食品、饲料和化妆品行业等诸多领域。2017年，麦角硫因被欧洲食品***认可作为一种用于婴幼儿、孕妇和哺乳期妇女膳食的安全新资源食品。2019年，麦角硫因获得美国食品和药物管理局GRAS认证。
目前麦角硫因主要生产方式为真菌菌丝体深层发酵，但由于真菌菌丝体发酵周期长，麦角硫因产率很低，不具备工业化生产的潜力。微生物发酵法生产麦角硫因，原料成本低廉，环境友好，操作简单，周期短，适合工业化生产，成为当前麦角硫因生产研究的热点。微生物发酵法生产麦角硫因的瓶颈在于缺乏高效生产麦角硫因的菌株。虽然麦角硫因的生物合成途径已经解析，但采用微生物细胞工厂异源合成麦角硫因仍然是一个艰巨的挑战。首先，微生物细胞工厂构建，需要引入异源的麦角硫因合成代谢模块，还涉及中心代谢模块以及多个前体物合成代谢模块改造，高效组合并优化这些代谢模块是很艰巨的工作；其次，组氨酸、腺苷蛋氨酸和半胱氨酸的供应直接影响麦角硫因合成，它们在细胞中的合成代谢通量都较低，协同提高这几个前体物的合成通量难度大；最后，三个主要前体物涉及不同的代谢模块，需要协调中心代谢和不同支路代谢相关基因的表达水平，严格控制中间代谢产物及合成前体的胞内含量，否则极易引起细胞代谢失衡。研究者们尝试利用各种宿主微生物(如甲基杆菌、酿酒酵母、大肠杆菌、米曲霉等)合成麦角硫因，但是其产量很仍低，发酵时间仍很长，成本仍很高。
目前利用大肠杆菌发酵生产麦角硫因的最高产量为文献(Naoyuki tanaka,Yusuke Kawano,Yasuharu satoh,tohru Dairi&Iwao ohtsu(2019)."Gram-scalefermentative production of ergothioneine driven by overproduction of cysteinein Escherichia coli＂Scientific reports 9(1):1895-1895.)报道，在大肠杆菌中异源表达分枝杆菌来源的麦角硫因的合成途径，研究获得工程菌，进行发酵罐培养，持续性补加组氨酸等前体物质，发酵216h最终可获得1.3g/L麦角硫因。在补充多种前体物的条件下，大肠杆菌实现了麦角硫因的合成，但产量和生产强度仍然很低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的是提供一种提高麦角硫因发酵产量的方法，并且提供一株新的麦角硫因发酵生产菌株。
本发明技术方案概述如下：
本发明提供一株高产麦角硫因的基因工程菌E.coli EGT12，该菌株是以大肠杆菌为宿主，在宿主的基因组上整合了序列如SEQ ID NO:1所示的谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体的编码基因hisG*，以解除HisG所受的反馈调节作用；还在其基因组上增加了组氨酸操纵子基因hisDBCHAFI的拷贝数，从而增强组氨酸的终端合成途径；还在其基因组上整合了耻垢分枝杆菌麦角硫因操纵子基因egtBCDE；还在其基因组上整合了大肠杆菌谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因gshA，为麦角硫因合成提供更多的硫化底物谷氨酰半胱氨酸，促进麦角硫因的合成；还在其基因组上整合了序列如SEQ ID NO:2所示的粗糙脉胞菌C-S裂解酶编码基因egtEncr，进一步促进麦角硫因合成；还在其基因组上整合了编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的亚砜合酶突变体的基因egtB*msm，进一步促进麦角硫因合成。
进一步地，所述大肠杆菌为E.coli MG1655。
进一步地，所述组氨酸操纵子基因hisDBCHAFI，包含hisD、hisB、hisC、hisH、hisA、hisF和hisI七个基因，在大肠杆菌基因组上增加所述组氨酸操纵子基因为双拷贝。
进一步地，上述整合在大肠杆菌基因组上的基因由一种强启动子启动该基因转录表达。
在本发明一种实施方式中，所述强启动子为启动子Ptrc。
本发明所述亚砜合酶突变体是以原始Mycolicibacterium smegmatis亚砜合酶的氨基酸序列(NCBI-ProteinID:WP_011731158.1)第374位的氨基酸R(精氨酸)替换为Q(谷氨酰胺)得到，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明一种具体实施方式中，所述亚砜合酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在本发明一种具体实施方式中，所述大肠杆菌谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因gshA替换为耻垢分枝杆菌谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因egtA。
在本发明一种具体实施方式中，所述粗糙脉胞菌来源的C-S裂解酶编码基因egtEncr替换为耻垢分枝杆菌C-S裂解酶编码基因egtEmsm。
在本发明一种具体实施方式中，所述亚砜合酶突变体的编码基因egtB*msm替换为耻垢分枝杆菌来源的亚砜合酶编码基因egtEmsm。
作为本发明一种较佳实施方式，所述基因工程菌E.coli EGT12是采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对宿主E.coli MG1655进行定向改造所得，具体包括如下步骤：
(1)构建启动子Ptrc与核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的谷氨酸棒杆菌的ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*的连接片段Ptrc-hisG*，并将其整合在宿主基因组上tdcD基因位点；
(2)将组氨酸操纵子基因hisDBCHAF整合在宿主基因组上yghX基因位点，并由启动子Ptrc启动；
(3)将麦角硫因操纵子基因egtBCDE整合在宿主基因组上ilvG基因位点，并由启动子Ptrc启动；
(4)构建启动子Ptrc与大肠杆菌谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因gshA的连接片段Ptrc-gshA，并将其整合在宿主基因组上mbhA基因位点；
(5)构建启动子Ptrc与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的粗糙脉胞菌C-S裂解酶编码基因egtEncr的连接片段Ptrc-egtEncr，并将其整合在宿主基因组上tehB基因位点；
(6)构建启动子Ptrc与核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的亚砜合酶裂解酶突变体编码基因egtB*msm的连接片段Ptrc-egtB*msm，并将其整合在基因组上yeeP基因位点。
本发明还提供了一种制备麦角硫因的方法，所述方法是在适宜条件下培养所述基因工程菌E.coli EGT12，并从其培养物中收集麦角硫因。
有益效果：
目前麦角硫因合成菌株构建基本都是直接引入外源途径，而且产量都很低，无法达到工业生产的要求。本发明通过在大肠杆菌中，依次对不同来源的谷氨酰半胱氨酸连接酶、C-S裂解酶和亚砜合酶进行表达比较，组合出高效的麦角硫因合成途径。在大肠杆菌中双拷贝自身谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因gshA，引入突变的耻垢分枝杆菌来源的亚砜合成酶编码基因egtB*msm，密码子优化的粗糙脉胞菌来源的C-S裂解酶编码基因egtEncr，在大肠杆菌中重构了一条高效的非天然麦角硫因合成途径。本发明所述一株稳定高效生产麦角硫因的基因工程菌E.coli EGT12，经30h摇瓶发酵后，麦角硫因的产量可达到105.7mg/L；在5L发酵罐中培养52h，可产麦角硫因2.9g/L，同时可产组氨酸14.77g/L。与2019年TohruDairi等报道菌株(3L发酵罐发酵216h，L-麦角硫因的积累量为1.31g/L)相比，该菌株不经过诱变处理、无质粒载体、发酵周期短，具有遗传背景清晰、代谢稳定、生产强度高的优势，具有很好的工业应用前景。现有的麦角硫因生产菌株都需要外源添加合成前体组氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸。而该菌株具有良好的组氨酸合成能力，麦角硫因合成过程中无需外源添加组氨酸，在发酵过程中组氨酸的最高产量可达20g/L左右。
附图说明
图1(a)：pREDCas9质粒图谱。
图1(b)：pGRB质粒图谱。
图2：hisG*整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；3：hisG*基因片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。
图3：hisD整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；3：hisD基因片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。
图4：hisC-hisB整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNAmarker；1：hisC上游序列-hisC-hisB片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌的鉴定片段。
图5：hisH-hisA-hisF-hisI整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNAmarker；1：hisH上游序列-hisH-hisA-hisF-hisI片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌的鉴定片段。
图6：egtBCDE-1整合片段的构建及验证电泳图。M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：egtBCDE-1基因片段；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。
图7：egtBCDE-2整合片段的构建及验证电泳图。M：1kb DNA marker；1：egtBCDE-2基因片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌的鉴定片段。
图8：egtA整合片段的构建及验证电泳图。M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：egtA基因片段；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。
图9：gshA整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：gshA基因片段4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。
图10：egtEmsm整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂2：下游同源臂；3：egtEmsm基因片段4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。
图11：egtEncr整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂2：下游同源臂；3：egtEncr基因片段4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。
图12：egtBmsm整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：egtBmsm基因片段；4：重叠片段；5：原菌对照
图13：egtB*msm整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂2：下游同源臂；3：egtB*msm基因片段4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段
图14：E.coli EGT5和E.coli EGT6摇瓶发酵结果。
图15：E.coli EGT9和E.coli EGT10摇瓶发酵结果。
图16：E.coli EGT11和E.coli EGT12摇瓶发酵结果。
图17：E.coli EGT12在5L发酵罐上的发酵过程曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指体积百分比；溶液的百分比“％(m/v)”指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1：
构建生产麦角硫因的基因工程菌。
1基因编辑的方法
本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9 meditated genomeediting.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒图谱见附图1。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除***，λ噬菌体的Red重组***及Cas9蛋白表达***，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。
该方法的具体步骤如下：
1.1pGRB质粒构建
构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。
1.1.1靶序列设计
使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)
1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备
设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下：
退火体系
Figure BDA0002742354100000061
1.1.3线性载体的制备
载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。
1.1.4重组反应
重组体系如下表。所用重组酶均为
Figure BDA0002742354100000062
II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。
重组体系
Figure BDA0002742354100000063
Figure BDA0002742354100000071
1.1.5质粒的转化
取10μL反应液，加入到100μL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。
1.1.6克隆鉴定
将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，酶切鉴定。
1.2重组DNA片段的制备
用于敲除的重组片段由需敲除基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)；用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。利用引物设计软件primer 5，以待敲除基因或待整合位点的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500bp)；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR的体系和方法如下表：
PCR扩增体系
Figure BDA0002742354100000072
重叠PCR的体系如下表：
重叠PCR扩增体系
Figure BDA0002742354100000081
注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。
PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
1.3质粒和重组DNA片段的转化
1.3.1pREDCas9的转化
利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至MG1655的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。
1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备
32℃培养至OD600＝0.1～0.15添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD600＝0.2～0.3时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。
1.3.3pGRB和重组DNA片段的转化
将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。
1.4质粒的消除
1.4.1pGRB的消除
将阳性重组子置于含有0.2％***糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
1.4.2pREDCas9质粒的消除
将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
2.菌株构建过程中所涉及的所有引物见下表：
Figure BDA0002742354100000091
Figure BDA0002742354100000101
Figure BDA0002742354100000111
3菌株构建的具体过程
3.1将Ptrc-hisG*整合在tdcD基因位点
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其tdcD基因的上下游序列设计上游同源臂引物(tdcD-UP-S、tdcD-UP-A)和下游同源臂引物(tdcD-DN-S、tdcD-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；并根据hisG*基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)设计引物(hisG*-S、hisG*-A)，然后再扩增hisG*基因片段。启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和hisG*基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得hisG*基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-hisG*-下游同源臂)，构建pGRB-tdcD使用的含靶序列的DNA片段通过引物tdcD-gRNA-S和tdcD-gRNA-A的退火制得。制备E.coli MG1655的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT1。Ptrc-hisG*整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中，上游同源臂的长度应为484bp，所扩增的hisG*基因片段长度应为627bp，下游同源臂的长度应为642bp，整合片段的总长应为1864bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1864bp，原菌PCR扩增片段长度应为2269bp。
3.2将E.coli MG1655自身的组氨酸操纵子基因在yghX基因位点进行双拷贝
本发明中将E.coli MG1655中的组氨酸操纵基因(hisDBCHAFI，包含hisD、hisB、hisC、hisH、hisA、hisF和hisI七个基因)按顺序依次整合在E.coli EGT1基因组上的假基因yghX位点处，并由启动子Ptrc启动该操纵子的转录表达，构建了菌株E.coli EGT2-3。
组氨酸操纵子基因的整合共分三段完成。
3.2.1Ptrc-hisD的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物(yghX-UP-S、yghX-UP-A)和下游同源臂引物(yghX-DN-S1、yghX-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；根据hisD基因序列设计引物(hisD-S、hisD-A)，并PCR扩增hisD片段；启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和hisD基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得Ptrc-hisD基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-hisD-下游同源臂)，构建pGRB-yghX使用的含靶序列的DNA片段通过引物yghX-gRNA-S和yghX-gRNA-A的退火制得。制备E.coli.EGT1的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT2-1。Ptrc-hisD片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3。其中上游同源臂长度为602bp，hisD基因片段长度为1305bp，下游同源臂长度为561bp，重叠片段的长度为2542bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子所扩增的片段长度应为1208bp，原菌无条带。
3.2.2hisB-hisC的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据hisB-hisC及其上游序列设计上游同源臂引物(hisCB-UP-S、hisCB-UP-A)，并PCR扩增其上游同源臂片段；以E.coli MG1655基因组为模板，根据其yghX基因的下游序列设计下游同源臂引物(yghX-DN-S2、yghX-DN-A)，并PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得hisB-hisC的整合片段(hisB的上游片段-hisB-hisC-下游同源臂)。构建pGRB-his1使用的含靶序列的DNA片段通过引物his1-gRNA-S和his1-gRNA-S的退火制得。制备E.coli EGT2-1的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT2-2。hisB-hisC片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图4。其中hisB的上游片段-hisB-hisC的总长度为2696bp，下游同源臂长度为561bp，重叠片段的长度为3317bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子扩增片段的长度为1118bp，原菌无条带。
3.2.3hisH-hisA-hisF-hisI的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据hisH-hisA-hisF-hisI及其上游序列设计上游同源臂引物(hisHAFI-UP-S、hisHAFI-UP-A)，并PCR扩增其上游同源臂片段；以E.coliMG1655基因组为模板，根据其yghX基因的下游序列设计下游同源臂引物(yghX-DN-S3、yghX-DN-A)，并PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得hisH-hisA-hisF-hisI的整合片段(hisH的上游片段-hisH-hisA-hisF-hisI-下游同源臂)。构建pGRB-his2使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-his2-S和gRNA-his2-A的退火制得。制备E.coli EGT2-2的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coliEGT2-3。hisH-hisA-hisF-hisI的整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图5。其中hisH的上游片段-hisH-hisA-hisF-hisI的总长度为3265bp，下游同源臂长度为561bp，重叠片段总长度为3317bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子扩增片段的长度为1136bp，原菌无条带。
3.3将Mycolicibacterium smegmatis MC2155中的麦角硫因操纵子基因在ilvG基因位点整合
本发明将Mycolicibacterium smegmatis MC2155中的麦角硫因操纵子基因(egtBCDE，包含egtB、egtC、egtD和egtE四个基因)按顺序依次整合在E.coli EGT2-3基因组上的假基因ilvG位点处，并由启动子Ptrc启动该操纵子的转录表达，构建了菌株E.coliEGT4-2。
麦角硫因操纵子基因的整合共分两段完成。
3.3.1Ptrc-egtBCDE-1的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其ilvG基因的上下游序列设计上游同源臂引物(ilvG-UP-S、ilvG-UP-A)和下游同源臂引物(FZ-ilvG-DN-S、ilvG-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；根据Mycolicibacterium smegmatis MC2155中egtBCDE基因序列设计引物(msm-S、FZ-msm-A)，然后再扩增egtBCDE-1基因片段。启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtBCDE-1基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得egtBCDE-1基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtBCDE-1-下游同源臂)，构建pGRB-ilvG使用的含靶序列的DNA片段通过引物ilvG-gRNA-S和ilvG-gRNA-A的退火制得。制备E.coli EGT2-3的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT4-1。Ptrc-egtBCDE-1整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图6。其中，上游同源臂的长度应为412bp，所扩增的egtBCDE-1基因片段长度应为2122bp，下游同源臂的长度应为461bp，整合片段的总长应为2930bp，PCR验证时，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子扩增片段的长度为749bp，原菌无条带。
3.3.2Ptrc-egtBCDE-2的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其ilvG基因的下游序列设计下游同源臂引物(ilvG-DN-S、ilvG-DN-A)，并PCR扩增其下游同源臂片段；根据Mycolicibacteriumsmegmatis MC2155中egtBCDE基因序列设计引物(FZ-msm-S、msm-A)，然后再扩增egtBCDE-2基因片段。上述片段通过重叠PCR的方法获得egtBCDE-2基因的整合片段(egtBCDE-2-下游同源臂)，构建pGRB-egt2使用的含靶序列的DNA片段通过引物egt2-gRNA-S和egt2-gRNA-A的退火制得。制备E.coli EGT4-1的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT4-2。egtBCDE-2的整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图7。所扩增的egtBCDE-2基因片段长度应为2696bp，下游同源臂长度为524bp，重叠片段总长度为3181bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子扩增片段的长度为1403bp，原菌无条带。
3.4Ptrc-egtA的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其mbhA基因的上下游序列设计上游同源臂引物(mbhA-UP-S、mbhA-UP-A)和下游同源臂引物(mbhA-DN-S、mbhA-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以Mycolicibacterium smegmatis MC2155基因组为模板，根据其egtA基因序列(NCBI-GeneID：4532453)设计引物(egtA-S、egtA-A)并PCR扩增egtA片段，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得Ptrc-egtA的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtA下游同源臂)，构建pGRB-mbhA使用的含靶序列的DNA片段通过引物mbhA-gRNA-S和mbhA-gRNA-A的退火制得。制备E.coliEGT4-2的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT5。Ptrc-egtA片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图8。其中上游同源臂长度为690bp，egtA基因片段长度为1272bp，下游同源臂长度为749bp，重叠片段的长度为2632bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子所扩增的片段长度应为1330bp，原菌无条带。
3.5Ptrc-gshA的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其mbhA基因的上下游序列设计上游同源臂引物(mbhA-UP-S、mbhA-UP-A)和下游同源臂引物(mbhA-DN-S、mbhA-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以E.coli MG1655基因组为模板，根据其gshA基因序列(NCBI-GeneID:BAA16555)设计引物(gshA-S、gshA-A)并PCR扩增gshA片段，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和gshA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得Ptrc-gshA的整合片段(上游同源臂-Ptrc-gshA下游同源臂)，构建pGRB-mbhA使用的含靶序列的DNA片段通过引物mbhA-gRNA-S和mbhA-gRNA-A的退火制得。制备E.coli EGT4-2的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT6。Ptrc-gshA片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图9。其中上游同源臂长度为690bp，gshA基因片段长度为1680bp，下游同源臂长度为749bp，重叠片段的长度为3040bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子所扩增的片段长度应为3040bp，原菌PCR扩增片段长度应为1831bp。
3.6Ptrc-egtEmsm的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其tehB基因的上下游序列设计上游同源臂引物(tehB-UP-S、tehB-UP-A)和下游同源臂引物(tehB-DN-S、tehB-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以Mycolicibacterium smegmatis MC2155基因组为模板，根据egrEmsm(NCBI-GeneID：4531386)基因序列设计引物(egtEmsm-S、egtEmsm-A)并PCR扩增egtEmsm，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtEncr基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得Ptrc-egtEmsm的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtEmsm-下游同源臂)，构建pGRB-tehB使用的含靶序列的DNA片段通过引物tehB-gRNA-S和tehB-gRNA-A的退火制得。制备E.coli EGT6的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT9。Ptrc-egtEmsm片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图10。其中上游同源臂长度为538bp，egtEmsm基因片段长度为1116bp，下游同源臂长度为493bp，重叠片段的长度为2066bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子所扩增的片段长度应为2066bp，原菌PCR扩增片段长度应为1437bp。
3.7Ptrc-egtEncr的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其tehB基因的上下游序列设计上游同源臂引物(tehB-UP-S、tehB-UP-A)和下游同源臂引物(tehB-DN-S、tehB-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以Neurospora crassa基因组为基础，对其egtEncr基因经过密码子优化后通过化学合成的方法获得，并根据密码子优化后egtEncr基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：2)设计引物(egtEncr-S，egtEncr-A)，并PCR扩增egtEncr片段，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtEncr基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得Ptrc-egtEncr的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtEncr-下游同源臂)，构建pGRB-tehB使用的含靶序列的DNA片段通过引物tehB-gRNA-S和tehB-gRNA-A的退火制得。制备E.coli EGT6的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli EGT10。Ptrc-egtEncr片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图11。其中上游同源臂长度为538bp，egtEncr基因片段长度为1545bp，下游同源臂长度为493bp，重叠片段的长度为2495bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子所扩增的片段长度应为2495bp，原菌PCR扩增片段长度应为1437bp。
3.8Ptrc-egtBmsm的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其yeeP基因的上下游序列设计上游同源臂引物(yeep-UP-S、yeep-UP-A)和下游同源臂引物(yeeP-DN-S、yeeP-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以Mycolicibacterium smegmatis MC2155基因组为模板，根据egtBmsm(NCBI-GeneID：4533015)基因序列设计引物(egtBmsm-S、egtBmsm-A)并PCR扩增egtBmsm，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtBmsm基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得Ptrc-egtBmsm的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtBmsm下游同源臂)，构建pGRB-yeeP使用的含靶序列的DNA片段通过引物yeeP-gRNA-S和yeeP-gRNA-A的退火制得。制备E.coli EGT10的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coliEGT11。Ptrc-egtBmsm片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图12。其中上游同源臂长度为572bp，egtBmsm基因片段长度为1287bp，下游同源臂长度为580bp，重叠片段的长度为2473bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子所扩增的片段长度应为1121bp，原菌无条带。
3.9Ptrc-egtB*msm的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其yeep基因的上下游序列设计上游同源臂引物(yeeP-UP-S、yeeP-UP-A)和下游同源臂引物(yeeP-DN-S、yeeP-DN-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；基于10种分枝杆菌亚砜合酶的同源性，对活性位点、活性位点附近，以及保守区域，进行***发育突变，获得亚砜合酶突变体。以Mycolicibacterium smegmatisMC2155基因组为基础，突变egtB*msm基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)设计引物(egtBmsm-S，egtB*msm-A，egtB*msm-S，egtBmsm-A)，并PCR扩增egtB*msm-1和egtB*msm-2片段，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtB*msm-1片段的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得Ptrc-egtB*msm的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtB*msm下游同源臂)，构建pGRB-yeeP使用的含靶序列的DNA片段通过引物yeeP-gRNA-S和yeeP-gRNA-A的退火制得。制备E.coli EGT10的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coliEGT12。Ptrc-egtB*msm片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图13。其中上游同源臂长度为572bp，egtB*msm基因片段长度为1396bp，下游同源臂长度为580bp，重叠片段的长度为2473bp，设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性重组子所扩增的片段长度应为1121bp，原菌无条带。
实施例2：
利用实施例1构建的所述基因工程菌E.coli EGT5和E.coli EGT6、E.coli EGT9、E.coli EGT10、E.coli EGT11和E.coli EGT12摇瓶发酵生产麦角硫因的方法如下：
斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；
摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养8-10h；
摇瓶发酵培养：按10-15％接种量接种种子液到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期26-30h；
斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂20-25g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母提取物5-10g/L，蛋白胨5-10g/L，KH2PO45-15g/L，MgSO4·7H2O 2-5g/L，FeSO4·7H2O 5-20mg/L，MnSO4·H2O 5-20mg/L，VB1 1-3mg/L，VH 0.1-1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
发酵培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，酵母提取物2-5g/L，蛋白胨2-4g/L，KH2PO41-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，FeSO4·7H2O 5-20mg/L，MnSO4·7H2O 5-20mg/L，蛋氨酸1-2g/L，半胱氨酸0.5-1g/L VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L，VB6 5-10mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
E.coli EGT5和E.coli EGT6摇瓶发酵结果如图14。
E.coli EGT9和E.coli EGT10摇瓶发酵结果如图15。
E.coli EGT11和E.coli EGT12摇瓶发酵结果如图16。
本发明通过在大肠杆菌中，依次对不同来源的谷氨酰半胱氨酸连接酶、C-S裂解酶和亚砜合酶进行表达比较。经26h摇瓶发酵验证，E.coli EGT5可产生4.2mg/L的麦角硫因，E.coli EGT6可产生6.2mg/L的麦角硫因，表明大肠杆菌自身谷氨酰半胱氨酸连接酶可以合成更多的谷氨酰半胱氨酸；E.coli EGT9可产23.5mg/L的麦角硫因，E.coli EGT10可产生34.4mg/L的麦角硫因，表明粗糙脉胞菌来源的C-S裂解酶具有更高的活性；E.coli EGT11可产生80mg/L的麦角硫因和E.coli EGT12可产生84.7mg/L的麦角硫因，表明突变后的亚砜合酶具有更高的麦角硫因合成能力。
经摇瓶发酵验证以大肠杆菌来源的谷氨酰半胱氨酸连接酶(编码基因为gshA)；粗糙脉胞菌来源的亚砜合酶(编码基因为egtEncr)；耻垢分枝杆菌来源的C-S裂解酶(编码基因为egtB*msm)的组合方式，在大肠杆菌中重构了一条高效的麦角硫因合成途径。26h摇瓶发酵，E.coli EGT12菌株发酵液中麦角硫因的产量为84.7mg/L；继续发酵至30h，麦角硫因可积累至105.7mg/L。
实施例3：
E.coli EGT12在5L罐上的发酵实验。
以实施例1构建的菌株E.coli EGT12作为生产菌株生产麦角硫因，具体如下：
斜面活化：取甘油保存菌种划线接种于试管斜面培养基，37℃培养12h；再将斜面保存菌种划线接种于茄形瓶斜面培养基，37℃培养14h。种子培养：取活化的新鲜茄形瓶斜面一支，用150mL无菌水洗下，在火焰保护下接种到发酵罐中，温度控制37℃，自动流加氨水控制pH在7.0，初始通气速率为2L/min，初始搅拌转速为200rpm，培养过程中维持DO值在20-30％之间，种子培养至OD600为15左右。
发酵罐培养：发酵罐种子以15％接种量接入种子液(放料至450mL，在火焰保护下倒入灭菌的发酵培养基)，温度控制35℃，自动流加氨水(或20％硫酸)控制pH在7.0，初始通气速率为2L/min，通气比为0.667vvm，初始搅拌转速为400rpm，通过调整转速和风量控制溶氧在20-30％，通过手动滴加泡敌消泡，发酵过程中流加80％的葡萄糖溶液，随糖流加5g/L的蛋氨酸和2g/L的半胱氨酸。
斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂25g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，VB1 2mg/L，VH 1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨4g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4·H2O 20mg/L，蛋氨酸5-10g/L，半胱氨酸2-5g/L，VB6 10-20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
E.coli EGT12在5L发酵罐上的发酵曲线如图17。
从发酵曲线上可以看出，菌体在发酵8h后开始进入对数生长期，44h OD600达到最大值后进入稳定期；发酵12h后开始进入麦角硫因的快速积累阶段，发酵52h麦角硫因产量最高为2.9g/L；菌体在前32h组氨酸不断积累，在32h达到最大产量约20g/L，之后组氨酸产量有所下降，发酵结束最终组氨酸产量为14.77g/L；由于随糖流加蛋氨酸前8h出现蛋氨酸浓度升高的情况，之后开始下降，在24h后发酵液无法检测到蛋氨酸。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种生产麦角硫因的基因工程菌株及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttgaaaa tcgctgtccc aaacaaaggc tcgctgtccg agcgcgccat ggaaatcctc 60
gccgaagcag gctacgcagg ccgtggagat tccaaatccc tcaacgtttt tgatgaagca 120
aacaacgttg aattcttctt ccttcgccct aaagatatcg ccatctacgt tgctggtggc 180
cagctcgatt tgggtatcac cggccgcgac cttgctcgcg attcccaggc tgatgtccac 240
gaagttcttt ccctcggctt cggttcctcc actttccgtt acgcagcacc agctgatgaa 300
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<212> DNA
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atcgactacg tgatcgaaga caagcgcggt atcgtgagca gccgctgcat tccgctcatc 480
tacccggccg aagacgacga tgttgttgcc gcgtttcgcg atgcgatcaa gaagagccgc 540
gaggaaggta aacgcccacg tctggcggtg attgatgtgg tgagcagcat gccgggcgtg 600
cgtttcccgt tcgaggacat cgtgaagatc tgtaaagaag aggaaatcat tagctgcgtg 660
gatggcgcgc aaggcatcgg catggtggac ctcaaaatca ccgagaccga cccggacttc 720
ctcatcagca actgccataa gtggctgttc accccgcgtg gttgcgccgt gttctacgtt 780
ccggtgcgta accagcatct gattcgtagt acgctgccga cgagccatgg tttcgtgccg 840
caagttggta atcgtttcaa cccgctggtg ccagccggca acaagagtgc cttcgtgagc 900
aacttcgagt tcgtgggtac ggtggacaac agcccgttct tctgcgtgaa agacgccatc 960
aagtggcgtg aggaagttct cggtggcgag gagcgcatta tggagtacat gacgaagctg 1020
gcccgcgaag gcggccaaaa ggttgcggaa attctgggta cccgcgttct ggagaacagt 1080
acgggtaccc tcattcgctg cgcgatggtt aacatcgcgc tgccgtttgt ggttggcgaa 1140
gatccgaaag cgccggtgaa gctgaccgag aaagaggaga aagacgtgga aggtctgtac 1200
gaaatcccac acgaggaagc gaacatggcc ttcaagtgga tgtacaacgt gctgcaagat 1260
gagttcaata cgtttgtgcc aatgaccttc catcgtcgcc gtttttgggc ccgtctgagt 1320
gcccaagttt atctggaaat gagcgacttc gagtgggccg gcaaaacgct caaagagctg 1380
tgcgagcgcg tggccaaagg cgaatacaaa gagagcgcct aa 1422
<210> 3
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgatcgcac gcgagacact ggccgacgag ctggccctgg cccgcgaacg cacgttgcgg 60
ctcgtggagt tcgacgacgc ggaactgcat cgccagtaca acccgctgat gagcccgctc 120
gtgtgggacc tcgcgcacat cgggcagcag gaagaactgt ggctgctgcg cgacggcaac 180
cccgaccgcc ccggcatgct cgcacccgag gtggaccggc tttacgacgc gttcgagcac 240
tcacgcgcca gccgggtcaa cctcccgttg ctgccgcctt cggatgcgcg cgcctactgc 300
gcgacggtgc gggccaaggc gctcgacacc ctcgacacgc tgcccgagga cgatccgggc 360
ttccggttcg cgctggtgat cagccacgag aaccagcacg acgagaccat gctgcaggca 420
ctcaacctgc gcgagggccc acccctgctc gacaccggaa ttcccctgcc cgcgggcagg 480
ccaggcgtgg caggcacgtc ggtgctggtg ccgggcggcc cgttcgtgct cggggtcgac 540
gcgctgaccg aaccgcactc actggacaac gaacggcccg cccacgtcgt ggacatcccg 600
tcgttccgga tcggccgcgt gccggtcacc aacgccgaat ggcgcgagtt catcgacgac 660
ggtggctacg accaaccgcg ctggtggtcg ccacgcggct gggcgcaccg ccaggaggcg 720
ggcctggtgg ccccgcagtt ctggaacccc gacggcaccc gcacccggtt cgggcacatc 780
gaggagatcc cgggtgacga acccgtgcag cacgtgacgt tcttcgaagc cgaggcctac 840
gcggcgtggg ccggtgctcg gttgcccacc gagatcgaat gggagaaggc ctgcgcgtgg 900
gatccggtcg ccggtgctcg gcgccggttc ccctggggct cagcacaacc cagcgcggcg 960
ctggccaacc tcggcggtga cgcacgccgc ccggcgccgg tcggggccta cccggcgggg 1020
gcgtcggcct atggcgccga gcagatgctg ggcgacgtgt gggagtggac ctcctcgccg 1080
ctgcggccgt ggcccggttt cacgccgatg atctacgagc agtacagcac gccgttcttc 1140
gagggcacca catccggtga ctaccgcgtg ctgcgcggcg ggtcatgggc cgttgcaccg 1200
ggaatcctgc ggcccagctt ccgcaactgg gaccacccga tccggcggca gatcttctcg 1260
ggtgtccgcc tggcctggga cgtctga 1287
<210> 4
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ile Ala Arg Glu Thr Leu Ala Asp Glu Leu Ala Leu Ala Arg Glu
1 5 10 15
Arg Thr Leu Arg Leu Val Glu Phe Asp Asp Ala Glu Leu His Arg Gln
20 25 30
Tyr Asn Pro Leu Met Ser Pro Leu Val Trp Asp Leu Ala His Ile Gly
35 40 45
Gln Gln Glu Glu Leu Trp Leu Leu Arg Asp Gly Asn Pro Asp Arg Pro
50 55 60
Gly Met Leu Ala Pro Glu Val Asp Arg Leu Tyr Asp Ala Phe Glu His
65 70 75 80
Ser Arg Ala Ser Arg Val Asn Leu Pro Leu Leu Pro Pro Ser Asp Ala
85 90 95
Arg Ala Tyr Cys Ala Thr Val Arg Ala Lys Ala Leu Asp Thr Leu Asp
100 105 110
Thr Leu Pro Glu Asp Asp Pro Gly Phe Arg Phe Ala Leu Val Ile Ser
115 120 125
His Glu Asn Gln His Asp Glu Thr Met Leu Gln Ala Leu Asn Leu Arg
130 135 140
Glu Gly Pro Pro Leu Leu Asp Thr Gly Ile Pro Leu Pro Ala Gly Arg
145 150 155 160
Pro Gly Val Ala Gly Thr Ser Val Leu Val Pro Gly Gly Pro Phe Val
165 170 175
Leu Gly Val Asp Ala Leu Thr Glu Pro His Ser Leu Asp Asn Glu Arg
180 185 190
Pro Ala His Val Val Asp Ile Pro Ser Phe Arg Ile Gly Arg Val Pro
195 200 205
Val Thr Asn Ala Glu Trp Arg Glu Phe Ile Asp Asp Gly Gly Tyr Asp
210 215 220
Gln Pro Arg Trp Trp Ser Pro Arg Gly Trp Ala His Arg Gln Glu Ala
225 230 235 240
Gly Leu Val Ala Pro Gln Phe Trp Asn Pro Asp Gly Thr Arg Thr Arg
245 250 255
Phe Gly His Ile Glu Glu Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Gln His Val
260 265 270
Thr Phe Phe Glu Ala Glu Ala Tyr Ala Ala Trp Ala Gly Ala Arg Leu
275 280 285
Pro Thr Glu Ile Glu Trp Glu Lys Ala Cys Ala Trp Asp Pro Val Ala
290 295 300
Gly Ala Arg Arg Arg Phe Pro Trp Gly Ser Ala Gln Pro Ser Ala Ala
305 310 315 320
Leu Ala Asn Leu Gly Gly Asp Ala Arg Arg Pro Ala Pro Val Gly Ala
325 330 335
Tyr Pro Ala Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ala Glu Gln Met Leu Gly Asp
340 345 350
Val Trp Glu Trp Thr Ser Ser Pro Leu Arg Pro Trp Pro Gly Phe Thr
355 360 365
Pro Met Ile Tyr Glu Gln Tyr Ser Thr Pro Phe Phe Glu Gly Thr Thr
370 375 380
Ser Gly Asp Tyr Arg Val Leu Arg Gly Gly Ser Trp Ala Val Ala Pro
385 390 395 400
Gly Ile Leu Arg Pro Ser Phe Arg Asn Trp Asp His Pro Ile Arg Arg
405 410 415
Gln Ile Phe Ser Gly Val Arg Leu Ala Trp Asp Val
420 425

Claims (9)

1.一株生产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，在宿主基因组上tdcD基因位点整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体的编码基因hisG*；还在宿主基因组上yghX基因位点整合了E.coli MG1655组氨酸操纵子基因hisDBCHAFI；还在宿主基因组上ilvG基因位点整合了Mycolicibacterium smegmatis MC2155的麦角硫因操纵子基因egtBCDE；还在宿主基因组上mbhA基因位点整合了E.coli MG1655谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因gshA；还在宿主基因组上tehB基因位点整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的粗糙脉胞菌C-S裂解酶编码基因egtEncr；还在宿主基因组上yeeP基因位点整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的亚砜合酶突变体的基因egtB*msm。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为E.coli MG1655。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述组氨酸操纵子基因hisDBCHAFI，包含hisD、hisB、hisC、hisH、hisA、hisF和hisI七个基因。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，整合到所述宿主基因组上的基因由一种强启动子启动该基因转录表达。
5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述强启动子为启动子Ptrc。
6.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述E.coli MG1655谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因gshA替换为Mycolicibacterium smegmatis MC2155谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因egtA，和/或所述粗糙脉胞菌来源的C-S裂解酶编码基因egtEncr替换为Mycolicibacterium smegmatis MC2155C-S裂解酶编码基因egtEmsm，和/或所述亚砜合酶突变体的编码基因egtB*msm替换为Mycolicibacterium smegmatis MC2155亚砜合酶编码基因egtBmsm。
7.一种产麦角硫因的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述基因工程菌是采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对宿主E.coli MG1655进行定向改造所得，具体包括如下步骤：
(1)构建启动子Ptrc与核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的谷氨酸棒杆菌的ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*的连接片段Ptrc-hisG*，并将其整合在宿主基因组上tdcD基因位点；
(2)将E.coli MG1655组氨酸操纵子基因hisDBCHAF整合在宿主基因组上yghX基因位点，并由启动子Ptrc启动；
(3)将Mycolicibacterium smegmatis MC2155麦角硫因操纵子基因egtBCDE整合在宿主基因组上ilvG基因位点，并由启动子Ptrc启动；
(4)构建启动子Ptrc与E.coli MG1655谷氨酰半胱氨酸连接酶编码基因gshA的连接片段Ptrc-gshA，并将其整合在宿主基因组上mbhA基因位点；
(5)构建启动子Ptrc与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的粗糙脉胞菌C-S裂解酶编码基因egtEncr的连接片段Ptrc-egtEncr，并将其整合在宿主基因组上tehB基因位点；
(6)构建启动子Ptrc与核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的亚砜合酶裂解酶突变体编码基因egtB*msm的连接片段Ptrc-egtB*msm，并将其整合在基因组上yeeP基因位点。
8.一种制备麦角硫因的方法，其特征在于，所述方法是在适宜条件下培养权利要求1-5任一所述的基因工程菌，并从其培养物中收集麦角硫因。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌活化后制备种子液，以15％体积比的接种量接种至发酵培养基，温度控制在35℃，自动流加氨水或20％硫酸，控制pH在7.0，通气比为0.667vvm，初始搅拌转速为400rpm，控制溶氧在20-30％，发酵过程中流加80％质量体积比的葡萄糖溶液，随糖流加5g/L的蛋氨酸和2g/L的半胱氨酸；所述发酵培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨4g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4·H2O 20mg/L，蛋氨酸5-10g/L，半胱氨酸2-5g/L，VB610-20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
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