CN103898071B - P450sca‑2酶突变体、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离的多肽,其是SEQ ID NO:1所示的P450sca‑2酶的变体或所述变体的生物学活性片段,其中所述多肽在对应于SEQ IDNO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代,而且相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca‑2酶,所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。本发明还涉及编码上述分离的多肽的多核苷酸,包含所述多核苷酸的重组载体,包含所述多核苷酸或所述重组载体的宿主细胞,以及通过所述宿主细胞转化美伐他汀以制备普伐他汀的方法。本发明的方法可以提高从美伐他汀转化制备普伐他汀的产率。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域。更具体地,本发明涉及P450sca-2酶突变体、其制备方法、以及其在从美伐他汀制备普伐他汀中的应用。
背景技术
高脂血症正在不断的威胁着人们的健康,因此降血脂药的开发成为制药行业的一个重要目标。普伐他汀(pravastatin)是一种非常重要的降血脂药(Tsujita Y等,1986,Biochim.Biophys.Acta 877,50-60;Koga T等,1990,Biochim.Biophys.Acta 1045,115-120)。普伐他汀钠的工业生产是两步发酵过程,包括从橘青霉(Penicillium citrinum)发酵生产美伐他汀(mevastatin),经过浓碱处理制成美伐他汀钠,最后利用微生物转化的方法将美伐他汀钠羟基化制成普伐他汀钠(Serizawa N.,1996 Biotechnol.Annu.Rev.2,373-389)。
嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)具有较强将美伐他汀钠羟基化制备普伐他汀钠的能力,广泛用于普伐他汀的工业生产(Serizawa N.,1996Biotechnol.Annu.Rev.2,373-389)。通过对此羟基化过程的机理进行研究,发现其中起主要催化作用的酶属于细胞色素P450酶系,根据其来源命名为P450sca(Matsuoka T等,1989,Eur.J.Biochem.184,707-713)。从嗜碳链霉菌中共纯化出两种P450sca酶,分别命名为P450sca-1酶和P450sca-2酶。这两种P450sca酶具有类似的分子量(46±1 kDa)和氨基酸组成(疏水氨基酸含量46-47%)。P450sca-2在催化美伐他汀转化为普伐他汀中的比活性高于P450sca-1的比活性,并且其易于被纯化,因此P450sca-2被普遍应用于生物发酵法制备普伐他汀中。
然而,目前通过生物发酵法制得的普伐他汀的产率较低,因此需要更高效的P450sca-2酶来提高普伐他汀的产率。
发明内容
一方面,本发明涉及一种分离的多肽,其是SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶的变体或所述变体的生物学活性片段,其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代,而且相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
在一个实施方式中,所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V,且所述多肽包括SEQ ID NO:2所示的序列。
在另一个实施方式中,所述多肽的氨基酸序列进一步包括在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的选自T119、N363、T85、V194和它们任意组合的位置上的氨基酸取代。
在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和N363位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363、T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363、T85和V194位置上。
在一个实施方式中,所述N363位置的氨基酸取代为N363Y或N363H。在一个实施方式中,所述T119位置的氨基酸取代为T119S、T119C或T119N。在一个实施方式中,其中所述V194位置的氨基酸取代为V194C、V194N或V194T。
在一个实施方式中,其中所述T85位置的氨基酸取代为非极性疏水氨基酸,所述非极性疏水氨基酸选自以下组成:甲硫氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。在一个实施方式中,其中所述T85位置的氨基酸取代为T85M、T85L、T85F或T85I。在一个实施方式中,所述氨基酸取代为T119S、N363Y、T85F和T194N。
另一方面,本发明涉及一种分离的多肽,其包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成:
i)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;
ii)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性的氨基酸序列;或
iii)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列相比经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列;而且
所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
另一方面,本发明涉及一种分离的多肽,其是SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶的变体或所述变体的生物学活性片段,其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的T119、N363、T85和V194中的一个或多个位置上包括氨基酸取代,而且相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和N363位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363、T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363、T85和V194位置上。
在一个实施方式中,所述N363位置的氨基酸取代为N363Y或N363H。在一个实施方式中,所述T119位置的氨基酸取代为T119S、T119C或T119N。在一个实施方式中,其中所述V194位置的氨基酸取代为V194C、V194N或V194T。
在一个实施方式中,其中所述T85位置的氨基酸取代为非极性疏水氨基酸,所述非极性疏水氨基酸选自以下组成:甲硫氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。在一个实施方式中,其中所述T85位置的氨基酸取代为T85M、T85L、T85F或T85I。
在一个实施方式中,所述多肽的氨基酸序列进一步在SEQ ID NO:1所示多肽或对应于SEQ ID NO:1所示多肽中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上具有氨基酸取代。在一个实施方式中,所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V。
另一方面,本发明涉及一种分离的多肽,其包含以下的氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成:
i)SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27;
ii)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性的氨基酸序列;或
iii)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列相比经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列;而且
所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
在一个实施方式中,所述含十氢萘环的化合物为他汀类药物。在一个优选实施方式中,所述他汀类药物为美伐他汀。
在一个实施方式中,所述宿主细胞是原核微生物或真核微生物。在一个实施方式中,所述原核微生物选自以下组中:大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、自养假诺卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica)、嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)和小四孢菌(Microtetraspora)。在一个实施方式中,所述真核微生物选自以下组中:裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母菌(Hansenula)、毕赤酵母菌(Pichia)、假丝酵母菌(Candida)、球拟酵母菌(Torulopsis)和红酵母菌(Rhodotorula)。
另一方面,本发明涉及一种分离的多核苷酸,其包含编码前述任一方面或任一项实施方式所述的分离的多肽的核苷酸序列。
另一方面,本发明涉及一种分离的多核苷酸,其包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成:
i)SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列;
ii)与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性的核苷酸序列;或
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ IDNO:56所示的核苷酸序列杂交,且
其编码的多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
在一个实施方式中,所述的分离的多核苷酸进一步包含编码Pdr和编码Pdx的核苷酸序列。
另一方面,本发明涉及一种重组载体,其包含前述任一项实施方式所述的分离的多核苷酸。
另一方面,本发明涉及一种宿主细胞,其包含前述任一项实施方式所述的分离的多核苷酸,或者转化有前述任一项实施方式所述的重组载体。
在一个实施方式中,所述宿主细胞是原核微生物或真核微生物。在一个实施方式中,所述原核微生物选自以下组中:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、自养假诺卡氏菌、嗜碳链霉菌和小四孢菌。在一个实施方式中,所述真核微生物选自以下组中:裂殖酵母菌、汉逊酵母菌、毕赤酵母菌、假丝酵母菌、球拟酵母菌和红酵母菌。
另一方面,本发明涉及制备如前述任一项实施方式所述的分离的多肽的方法,包括培养如前述任一项实施方式所述的宿主细胞,和分离和纯化如前述任一项实施方式所述的多肽。
另一方面,本发明涉及制备普伐他汀的方法,包括以下步骤:
i)构建本发明的重组载体;
ii)用本发明的重组载体转化适合的宿主细胞;
iii)在存在底物美伐他汀或其盐的情况下培养转化后的宿主细胞,由此将美伐他汀转化为普伐他汀;和
iv)分离或纯化普伐他汀或其盐。
在一个优选的实施方式中,美伐他汀的盐是美伐他汀钠。
在一个优选的实施方式中,普伐他汀的盐是普伐他汀钠。
在一个优选实施方式中,所述宿主细胞是大肠杆菌。
附图说明
图1:所示为P450sca-2催化美伐他汀钠转化为普伐他汀钠的示意图。
图2:所示为表达质粒pET-P450sca-2-Pdr-Pdx的质粒图谱。
图3:所示为美伐他汀钠经不同细胞转化后的产物的HPLC分析结果,其中,A为普伐他汀钠标准品;B为美伐他汀钠标准品;C为只表达Pdr/Pdx的细胞(阴性对照);D为只表达P450sca-2的细胞(阴性对照);和E为表达P450sca-2/Pdr/Pdx的细胞。
图4:所示为P450sca-2酶变体的三级结构模型,其中:
A显示出通过同源建模获得的突变株1-R8-5C的P450sca-2的三级结构模型,其中突变株1-R8-5C的P450sca-2相对于野生型P450sca-2的氨基酸突变用球棍模型表示并标记;
B显示出突变株1-R8-5C的P450sca-2与美伐他汀钠的分子对接结果,其中美伐他汀钠分子用黄色表示,底物口袋中的氨基酸用浅绿色球棍模型表示,R77和T85位点用紫色球棍模型表示;且
C显示出底物进入突变株1-R8-5C的P450sca-2的通道,其中在所示F/G loop、Fhelix和G helix区域中,红色表示亲水,蓝色表示疏水,F helix的C末端上的V185用球状模型表示,G helix的N末端上的V194用紫色球棍模型表示。
图5:所示为P450cam与Pdx之间的两条电子传递路径。
图6:所示为突变株1-R8-5C的P450sca-2与Pdx结合界面上的αC和αC*,其中紫色球棍模型标记的119位的苏氨酸位于两个α螺旋的连接处。
图7:显示从野生型P450sca-2开始,进行随机突变和随后定点饱和突变的策略,以及所得不同P450sca-2酶的突变体的全细胞活性。
图8:显示从突变株1-R8-5C的P450sca-2开始,对4个重要位点T85、T119、V194和N363进行迭代饱和突变组合的策略,以及所得不同P450sca-2酶的突变体的全细胞活性。
发明详述
本申请的发明人首次通过对野生型P450sca-2酶进行定向进化以提高P450sca-2酶催化美伐他汀转化为普伐他汀的活性。具体地,本发明采用易错PCR对包含野生型P450sca-2酶核苷酸序列的多核苷酸载体进行扩增,转化宿主细胞以构建随机突变文库,并随后通过筛选得到一个全细胞活性显著提高的突变株1-R8-5C。通过测序发现,突变株1-R8-5C中P450sca-2酶的氨基酸序列在SEQ ID NO:1所示多肽中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置具有氨基酸取代。
因此,一方面,本发明涉及一种分离的多肽,其是SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶的变体或所述变体的生物学活性片段,其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代,而且相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。在一个实施方式中,所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V,且所述多肽包括SEQ ID NO:2所示的序列。
在本文中,术语“P450sca-2酶”是指来自于嗜碳链霉菌且属于细胞色素P450酶家族的一种酶。野生型P450sca-2酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,长度为410个氨基酸,分子量为45KDa。当P450sca-2酶和电子传递蛋白Pdr和Pdx在宿主细胞例如大肠杆菌中共表达时,使得此宿主细胞具有在美伐他汀的十氢萘环6β位引入羟基的能力。
图1说明了P450sca-2酶催化底物美伐他汀钠转化普伐他汀钠的示意图。如图1所示,首先P450sca-2酶与底物结合形成复合物,随后Pdr与NADH进行反应以获得电子,并将电子传递给Pdx,Pdx随后将电子传递给P450sca-2酶。获得电子的P450sca-2酶被还原,并向底物美伐他汀钠的十氢萘环的6β位引入羟基,随后释放出产物普伐他汀钠。
在本文中,术语“P450sca-2酶的变体”是指包含一个或多个氨基酸突变,且与野生型P450sca-2酶相比使得宿主细胞在美伐他汀的十氢萘环6β位引入羟基的能力提高的酶。P450sca-2酶的变体可由本领域已知的任何方法制备。例如,P450sca-2酶的变体可通过从其它嗜碳链霉菌株系中分离获得,或者通过人工诱变或突变的方式获得。在本文中,术语“P450sca-2酶的变体”与“P450sca-2酶的突变体”或“修饰的P450sca-2酶”可互换使用。
在本文中,术语“氨基酸”为含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物。在本发明中,氨基酸包括20种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即其中的α碳具有侧链的氨基酸)。天然存在的氨基酸包括选自以下组中的氨基酸:酪氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸。天然氨基酸残基的缩写示于下表1中:
表1
非天然氨基酸和氨基酸类似物的实例为本领域技术人员已知,并且包括但不限于2-氨基己二酸(Aad)、3-氨基己二酸(Baad)、β-丙氨酸/β-氨基-丙酸(Bala)、2-氨基丁酸(Abu)、6-氨基己酸(Acp)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(Baib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2,4-二氨基丁酸(Dbu)、锁链素(Des)、2,2'-二氨基庚二酸(Dpm)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、羟赖氨酸(Hyl)、别-羟赖氨酸(Ahyl)、3-羟脯氨酸(3Hyp)、4-羟脯氨酸(4Hyp)、异锁链素(Ide)、别-异亮氨酸(Aile)、N-甲基甘氨酸、肌氨酸(MeGly)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、6-N-甲基赖氨酸(MeLys)、N-甲基缬氨酸(MeVal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)和鸟氨酸(Orn)。
在本文中,术语“多肽”表示由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。在本文中,术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用,
在本文中,术语“对应于”是指本领域技术人员利用已知的序列比对方法以最大化匹配来比对两个或更多个相关多肽或核酸序列(包括分子的序列、分子的区域和/或理论序列)从而获得最高等级匹配时,互相对齐的部分、位置或区域。换句话说,在两个或更多个多肽或核酸序列最适比对时,两个类似位置(或部分或区域)对齐。当比对两个或更多个序列时,基于沿线性核酸或氨基酸序列的位置鉴定类似部分/位置/区域。
已知的比对方法例如BLASTP或BLASTN比对程序。通过比对多肽或核酸的序列,本领域技术人员可以利用保守和相同的氨基酸残基作为指导鉴定类似的部分或位置。而且,本领域技术人员还可以采用保守氨基酸或核苷酸残基作为指导以找到不同物种相同基因序列之间的对应的氨基酸或核苷酸残基。对应位置还可以基于结构比对,例如通过利用计算机模拟的蛋白结构比对。在其他情况下,可以鉴定相应区域。
在本文中,术语“在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力”是指相对于含有野生型P450sca-2酶的宿主细胞,包含本发明的P450sca-2酶变体或其生物学活性片段的宿主细胞在相同的培养条件下能够更有效地在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基。此功效可以通过检测包含P450sca-2酶变体或其生物学活性片段的宿主细胞的全细胞活性来评价。
在本文,术语“全细胞活性”是指宿主细胞在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的活性。全细胞活性与P450sca-2酶变体或其生物学活性片段的表达量和比活性相关。
因此,本文中所称的“全细胞活性增加”包括P450sca-2酶变体或其生物学活性片段的表达量提高、P450sca-2酶变体或其生物学活性片段的比活性提高、或者P450sca-2酶变体或其生物学活性片段的表达量和比活性均提高。在某些情况下,“全细胞活性增加”也包括P450sca-2酶变体或其生物学活性片段的表达量降低但比活性提高,或者表达量提高但比活性降低,但是整体上导致宿主细胞在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力的提高。需要说明,只有成功的折叠并将辅因子血红素heme按正确朝向组装在活性中心的P450sca-2的酶才具有活性。因此,在本文中,P450sca-2酶的表达量应理解为是P450sca-2的活性表达量。本领域技术人员已知P450sca-2酶变体或其生物学活性片段的表达量和比活性的测定方法,具体参见本发明的实施例部分。
近些年,陆续报道了几个与P450sca-2具有高度同源性的P450的晶体结构。本发明人利用这些已知的与P450sca-2具有高度同源性的P450的晶体结构,构建P450sca-2的三级结构模型。通过对P450sca-2酶的关键催化位点的分析,本发明人在突变株1-R8-5C的P450sca-2酶变体的基础上进一步对T119、N363、T85和V194这四个点进行单点全饱和突变,结果发现其中所有单点饱和突变株的全细胞活性均有所提高。进一步,本发明人根据位点重要性排序,依次对每个位点进行全饱和突变,以获得所有位点的最好组合。经过测定,发明人发现在突变株1-R8-5C的P450sca-2酶变体的基础上组合了T119S、N363Y、T85F和T194N得到的突变株的全细胞活性最高。
在多肽中引入氨基酸突变的方法为本领域技术人员所熟知。例如参见Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994);T.Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarborlaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。例如,可使用市售试剂盒,例如QuikChangeTM定点诱变试剂盒Stratagene,或者直接通过化学法合成具有突变的多肽。
因此,在一个实施方式中,本发明的多肽进一步包括在对应于SEQ IDNO:1所示多肽中的T119、N363、T85和/或V194位置上的氨基酸取代。
在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T85位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在V194位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和N363位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和T85位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和V194位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363和T85位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363和V194位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T85和V194位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和T85位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和V194位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、T85和V194位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363、T85和V194位置上。在另一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363、T85和V194位置上。
进一步,在一个优选实施方式中,所述N363位置的氨基酸取代为N363Y或N363H。在另一个优选实施方式中,所述T119位置的氨基酸取代为T119S、T119C或T119N。在另一个优选实施方式中,其中所述V194位置的氨基酸取代为V194C、V194N或V194T。
在一个优选实施方式中,其中所述T85位置的氨基酸取代为非极性疏水氨基酸,所述非极性疏水氨基酸选自以下组成:甲硫氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。在一个优选实施方式中,其中所述T85位置的氨基酸取代为T85M、T85L、T85F或T85I。
在一个最优选实施方式中,所述氨基酸取代为T119S、N363Y、T85F和T194N。在一个最优选实施方式中,本发明的多肽包括SEQ ID NO:16所示的序列。
本领域技术人员明白,可以对本发明的上述多肽进行进一步的修饰,例如通过引入额外的一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失,而仍保持所需的生物学活性,即当所述修饰的多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。例如,可以对上述多肽进行进一步的保守性氨基酸取代。
在本文中,术语“保守性氨基酸取代”是一种氨基酸残基被另一种具有类似化学性质,例如电荷或疏水性的侧链R基团的氨基酸残基所取代。一般而言,保守性氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。
具有类似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括:1)脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸;2)脂肪族羟基侧链:丝氨酸及苏氨酸;3)含有酰胺的侧链:天冬酰胺及谷氨酰胺;4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸;5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸及组氨酸;6)酸性侧链:天冬氨酸及谷氨酸;和7)含硫侧链:半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代包括:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本领域技术人员可以根据现有技术的教导来确定是否一种氨基酸取代属于保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代可以按照下表2进行:
表2
原有残基 | 保守取代 |
Ala(A) | Gly;Ser |
Arg(R) | Lys |
Asn(N) | Gln;His |
Cys(C) | Ser |
Gln(Q) | Asn |
Glu(E) | Asp |
Gly(G) | Ala;Pro |
His(H) | Asn;Gln |
Ile(I) | Leu;Val |
Leu(L) | Ile;Val |
Lys(K) | Arg;Gln;Glu |
Met(M) | Leu;Tyr;Ile |
Phe(F) | Met;Leu;Tyr |
Ser(S) | Thr |
Thr(T) | Ser |
Trp(W) | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe |
Val(V) | Ile;Leu |
因此,本发明还包括这样的多肽,所述多肽包含本发明的任一上述多肽的氨基酸取代并与SEQ ID NO:1所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性,且所述多肽仍保持所需的生物学活性,即当所述修饰的多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
另一方面,本发明涉及一种分离的多肽,其包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成:
i)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;
ii)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性的氨基酸序列;或者
iii)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列相比经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列;而且
所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
在本文中,当用于定义多肽或多核苷酸序列时,术语“包含”、“包括”或“具有”是开放式的,其表示在所定义的多肽或多核苷酸序列的一个或两个末端可选地包含其它氨基酸或核苷酸残基。在本文中,当用于定义多肽或多核苷酸序列时,术语“由...组成”是封闭式的,其表示在所定义的多肽或多核苷酸序列的两个末端不再包含其它氨基酸或核苷酸残基。
在本文中,术语“序列相同性”是指氨基酸或核苷酸序列不变的程度。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如,氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如,可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定,可以参见例如:Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics andGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;ComputerAnalyis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994;Sequence Analyis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991。
进一步地,本发明人还发现在野生型P450sca-2酶的T85、V194、T119和N363位点上分别引入单点突变也能提高野生型P450sca-2的全细胞活性。
因此,本发明还涉及一种分离的多肽,其是SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶的变体或所述变体的生物学活性片段,其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的T119、N363、T85和V194中的一个或多个位置上包括氨基酸取代,而且相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和N363位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和T85位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在N363、T85和V194位置上。在一个实施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363、T85和V194位置上。
在一个优选实施方式中,所述N363位置的氨基酸取代为N363Y或N363H。在一个优选实施方式中,所述T119位置的氨基酸取代为T119S、T119C或T119N。在一个优选实施方式中,其中所述V194位置的氨基酸取代为V194C、V194N或V194T。
在一个优选实施方式中,其中所述T85位置的氨基酸取代为非极性疏水氨基酸,所述非极性疏水氨基酸选自以下组成:甲硫氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。在一个优选实施方式中,其中所述T85位置的氨基酸取代为T85M、T85L、T85F或T85I。
在一个最优选实施方式中,所述多肽的氨基酸序列进一步在SEQ IDNO:1所示多肽或对应于SEQ ID NO:1所示多肽中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上具有氨基酸取代。在一个最优选实施方式中,所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V。
另一方面,本发明涉及一种分离的多肽,其包含以下的氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成:
i)SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27;
ii)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性的氨基酸序列;或者
iii)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列相比经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列;而且
所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
另一方面,本发明涉及一种分离的多核苷酸,其包含编码前述任一项实施方式所述的分离的多肽的核苷酸序列。
编码野生型P450sca-2酶的多核苷酸序列可通过本领域可获取的序列数据库获得。例如,编码野生型P450sca-2酶的多核苷酸序列可根据NCBI数据库中P450sca-2的氨基酸序列(登录号:D30815),并通过DNAworks程序(Version 2.1.4)获得。例如,P450sca-2酶多核苷酸序列也可通过自动化的化学合成方法产生,参见例如Edge,1981,Nature 292,756;Nambair等,1984,Science 223:1299;Jay等,1984,J.Biol.Chem.259:6311。
另一方面,本发明涉及一种分离的多核苷酸,其包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成:
i)SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列;
ii)与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性的核苷酸序列;或者
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ IDNO:56所示的核苷酸序列杂交,且
其编码的多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
在本文中,术语“在严格条件下杂交”是指多核苷酸分子与靶核酸分子通过互补的碱基配对退火。本领域技术人员熟悉影响特异性杂交的参数,例如特定分子的长度和组成。与杂交特别相关的参数还包括例如退火和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。在一个实施方式中,在严格条件下杂交是指在高度严格条件下杂交,即0.1×SSPE,0.1% SDS,65℃。在一个实施方式中,在严格条件下杂交是指在中度严格条件下杂交,即0.2×SSPE,0.1% SDS,50℃。在一个实施方式中,在严格条件下杂交是指在低度严格条件下杂交,即0.2×SSPE,0.1%SDS,40℃。等效的严格条件是本领域已知的。本领域技术人员能够调整影响杂交的参数,以在低、中或高度严格条件下实现多核苷酸分子与靶核酸分子的杂交。
在一个实施方式中,所述的分离的多核苷酸进一步包含Pdr和Pdx的核苷酸序列。
在本文中,术语“Pdx”是指含有Fe-S簇的假单孢氧还蛋白(putidaredoxin),其大小为11.5KDa。在P450酶的反应体系中,Pdx能为P450酶提供所需要的电子,在反应体系中实现底物C-H键的断裂。
在本文中,术语“Pdr”是指包含辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的假单孢氧还蛋白还原酶(putidaredoxin reductase),其大小为45.6KDa。在P450反应体系中,Pdr能与NADH反应获得电子,并将电子传递给Pdx。
本发明采用来自于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的Pdx和Pdr作为P450sca-2的天然电子传递蛋白,与P450sca-2进行共表达,在宿主细胞内构建完整的P450sca-2酶催化体系。本领域技术人员明白也可以其它来源的含有Fe-S簇的铁氧还蛋白(ferredoxin,Fdx)和包含辅因子FAD的铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase,Fdr)。
另一方面,本发明涉及一种重组载体,其包含前述任一项实施方式所述的分离的多核苷酸。可用于本发明的载体包括但不限于原核载体和真核载体。原核载体的实例包括但不限于:pET系列、pGEX系列、pQE系列、pKK系列、pBR系列、pUC系列等。真核载体的实例包括但不限于:pCDNA系列、pPICZ系列、pEGFP系列、pPIC系列等。
载体可以包括例如表达调控序列。在本文中,术语“表达调控序列”是指在给定的宿主细胞或生物体中的任何允许、有助于或调节核酸分子表达的序列,其包括复制、重复、转录、剪切、翻译、稳定性和/或将所述核酸分子或其mRNA运输进宿主细胞或生物体中的序列。示例性的调控序列包括启动子和增强子。
本领域技术人员应理解,本发明的载体除调控序列外,还可以包括额外的元件,例如,用于在宿主细胞或生物体中正确地起始、调控和/或终止转录的序列(例如,多聚A转录终止序列),mRNA转运序列(例如,核定位信号序列)、mRNA加工序列(例如,剪接信号)和mRNA稳定序列(例如,内含子和非编码的5'和3'序列)、起翻译功能的序列(例如,起始子甲硫氨酸、三联前导序列、核糖体结合位点、Shine-Dalgamo序列等)和起纯化功能的序列(例如,纯化标签)。本领域技术人员能够根据需要选择适合的载体。
在一个实施方式中,所述的重组载体进一步包含启动子、增强子、mRNA转运序列、mRNA加工序列、mRNA稳定序列、起翻译功能的序列、起纯化功能的序列或它们的组合。在一个实施方式中,所述启动子选自T7启动子、SP6启动子、trp、lac、tac或它们的组合。
另一方面,本发明涉及一种宿主细胞,其包含前述任一项实施方式所述的分离的多核苷酸,或者转化有前述任一项实施方式所述的重组载体。
在本文中,术语“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。可用于本发明的宿主细胞包括但不限于原核微生物和真核微生物。在一个实施方式中,所述原核微生物选自以下组中:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、自养假诺卡氏菌、小四孢菌、嗜碳链霉菌和小四孢菌和链霉菌。在一个实施方式中,所述真核微生物选自以下组中:酵母菌、裂殖酵母菌、汉逊酵母菌、毕赤酵母菌、假丝酵母菌、球拟酵母菌和红酵母菌。
在本文中,术语“转化的”是指宿主细胞被遗传改造以包含本发明的分离的多核苷酸或重组载体的一、二或多个拷贝。本领域技术人员已知将外源多核苷酸或载体导入宿主细胞的方法,所述方法包括但不限于:显微注射(Capechi等,1980,Cell,22:479)、CaPO4介导的转染(Chen等,1987,Mol.CellBiol.,7:2745)、DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔法(Chu等,1987,NucleicAcid Res.,15:1311)、脂质体转染/脂质体融合(Feigner等,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 84:7413)、粒子轰击(Yang等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA87:9568)和基因枪。
另一方面,本发明涉及制备如前述任一项实施方式所述的分离的多肽的方法,包括构建如前述任一项实施方式所述的重组载体,用所述重组载体转化如前述任一项实施方式所述的宿主细胞,和在宿主细胞内表达。
术语“表达”通常是指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。在本文制备多肽的方法中,术语“表达”应理解为“异源表达”,即是指在宿主细胞中表达由异源核酸编码的多肽。
另一方面,本发明涉及制备普伐他汀的方法,包括用如前述任一项实施方式所述的宿主细胞转化美伐他汀以制备普伐他汀的发酵工艺。
本发明的宿主细胞可在常规发酵生物反应器、烧瓶和培养皿平板中培养。发酵培养基可包括例如碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子、抗生素等。示例性的碳源可包括糖类及其衍生物、脂类、醇类、有机酸类、芳香化合物类和各种含碳化合物。示例性的氮源可包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆等。示例性的无机盐可包括含钾、钠、钙、镁、磷或硫的有机或无机酸盐,例如K2HPO4、KH2PO4和MgSO4。示例性的生长因子可包括氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。在一个实施方式中,可用于本发明的发酵培养基包括选自以下的一种或多种组分:酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂和卡那霉素。在一个实施方式中,可用于本发明的种子培养基包括LB固体培养基和LB液体培养基。在一个实施方式中,LB固体培养基和LB液体培养基中的示例性组分包括0.5%酵母粉、1%蛋白胨、0.5%氯化钠、1.5%琼脂粉和50μg/mL卡那霉素。本领域技术人员可根据需要对培养基的组分和含量进行选择。此外,本领域技术人员还可以进一步通过从提高溶氧、增大细胞通透性、连续流加底物等来进一步提高普伐他汀钠的产量。
对于通过发酵法从美伐他汀以制备普伐他汀的工艺可参见,例如:罗荣荣等,江西科学,2004年6月,Vol.22 No.2;周鹃等,江西医药,2003年,38卷,6期,606-408;Peng Y等,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,1998,20:373-375;YoshikazuGujii等,Biochemical andBiophysical Research Communications,404(2011)511-516;EP1500704B1.
除非另有定义,否则与本发明关联使用的科学及技术术语应具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。除非另有定义,否则本发明的方法及技术一般根据本领域公知的和常规的方法来进行。除非另有定义,否则当本案使用术语“一”、“一个”或“一种”时,其意为“至少一个(种)”或“一或多个(种)”。此外,除非另有定义,否则本文中的单数术语和其对应的复数形式可互换使用。除实施例或另有说明外,在本说明书和权利要求书中所使用的所有表达成分量、反应条件等的数字在所有情况下应被理解为被术语“大约”所修饰。因此,除非有相反表示,说明书和权利要求书中表述的数字参数均为近似值。本文中所引用的所有出版物均以全文引用的方式并入本文中。
实施例
下述的实施例用于举例说明使用以上描述的发明的方式,和表述设想的实施本发明各方面的最好的模式。应理解这些方法不以任何方式用于限定本发明的真正范围,而只是用于说明的目的。
实施例1-P450sca-2、Pdr和Pdx共表达载体的的构建
根据NCBI数据库中野生型P450sca-2的氨基酸序列(序列号:D30815,见附录A),将其全长的氨基酸序列(410aa)在线输入DNAworks程序(Version2.1.4)。通过设定密码子偏爱性,DNAWorks输出适合于在E.coli中表达的P450sca-2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:30),并将目的基因序列设计成48条相互重叠的寡核苷酸片段。这些寡核苷酸片段由上海生物工程技术服务有限公司合成。
将合成的寡聚核苷酸片段用10mM Tris-HCl,pH 8.0的缓冲液溶解,按照表3配制PCR反应液,然后按照表4的反应程序进行PCR反应。PCR反应条件通过调整反应程序中x和y的值来优化。在此实施例中,x=2s,y=30(A)或40(B)。
表3:PCR反应体系
表4:PCR反应程序
步骤 | 温度 | 时间 |
1 | 94°C | 2min |
2 | 94°C | 30s |
3 | 64°C | 30s,-0.5°C/循环 |
4 | 72°C | 15s,+x/循环 |
5 | 返回步骤2 | 19次 |
6 | 94°C | 30s |
7 | 54°C | 30s |
8 | 72°C | 55s+x/循环 |
9 | 返回步骤6 | y次 |
10 | 72°C | 10min |
11 | 4°C | 长时间 |
12 | 结束 |
分别以两种反应条件(A,B)下得到的PCR产物作为模板,用下述引物在Tm 67°C条件下通过touch-down PCR扩增P450sca-2基因。
正向引物:5'-GGGAATTCCATATGACCGAAATGACGGAGAAG-3'(P450sca-for)(SEQ IDNO:59);和
反向引物:5'-GAAGATCTTCACCAGGTCACCGGTAATTCG-3'(P450sca-rev)(SEQ ID NO:60)
引物下划线部分分别为限制性内切酶NdeI和BglII的识别位点。
按照下表5配制PCR反应液,然后按照下表6的反应程序扩增P450sca-2基因。
表5:进行基因扩增的PCR反应体系
表6:基因扩增PCR反应程序
步骤 | 温度 | 时间 |
1 | 94°C | 2min |
2 | 94°C | 1min |
3 | 67°C | 1min,-0.5°C/循环 |
4 | 72°C | 3min |
5 | 返回步骤2 | 20次 |
6 | 94°C | 1min |
7 | 57°C | 1min |
8 | 72°C | 3min |
9 | 返回步骤6 | 15次 |
10 | 72°C | 10min |
11 | 4°C | 长时间 |
12 | 结束 |
PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果PCR扩增出1233bp大小的条带,与预期结果相符。回收、纯化该目的片段,将其用限制性内切酶NdeI和BglII进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET30a(+)(Novagen)进行连接,得到质粒pET30a-P450sca-2。
质粒pDuet-Pdr-Pdx由韩国首尔大学的Kim教授馈赠。此质粒是以pETDuet质粒(Novagen)为骨架,在限制性酶切位点BamHI/SacI和NdeI/EcoRV之间分别***了编码Pdr的基因camA(SEQ ID NO:57)和编码Pdx的基因camB(SEQ ID NO:58)。每个基因前面都分别有一个T7启动子。以质粒pDuet-Pdr-Pdx为模板,用重叠PCR扩增camA和camB基因以及它们上游的T7启动子,并将camB上游的NdeI替换为KpnI。
所用引物如下:
5'-CGGAATTCTGATGCCGGCCACGATGCGT-3'(正向引物upT7-camA-for)(SEQ ID NO:61)
5'-TACTTTAGACATGGTACCTATATCTCCTTCTTATACTTAACT-3'(反向引物,Ovp-KpnI-rev)(SEQ ID NO:62)
5'-AGATATAGGTACCATGTCTAAAGTAGTGTATGTGTCAC-3'(正向引物,Ovp-KpnI-for)(SEQ ID NO:63)
5'-CGGAATTCTTACCATTGCCTATCGGGAAC-3'(反向引物,camB-rev)(SEQ ID NO:64)。
将得到的两个片段以等摩尔混合液为模板,重叠扩增全长基因,所用聚合酶为Pfu聚合酶。不加引物反应15个循环后,添加引物upT7-camA-for和camB-rev,继续反应30个循环。PCR产物纯化后,用EcoRI酶切后,再***同样酶切的pET30a-P450sca-2质粒,转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中,筛选阳性克隆,提取质粒,对其进行测序。测序结果表明所克隆的P450sca-2、camA和camB基因序列正确,且正确连入pET30a(+)中。此重组质粒命名为pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx,其物理图谱如图2所示。
为了方便纯化,克隆了带有N端His6-tag的P450sca-2,所用的引物如下所示:
5'-TGGACCTCATATG TCTTCTGGTATGACCGAAATGACGGAGA-3'(P450sca-for-NH)(SEQ ID NO:65);和
P450sca-rev,
其中引物下划线部分为限制性内切酶NdeI,框内是His6标签序列。
实施例2-P450sca-2、Pdr和Pdx在大肠杆菌中的共表达和美伐他汀的转化
将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx接种在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上,37°C过夜培养。挑取单菌落接种于1mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中,在37°C和250rpm过夜培养。E.coliBL21(DE3)/pET30a作为空白对照。以1%的接种量转接种于10mL新鲜的液体LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中,继续培养至OD600为0.6-0.8。加入终浓度为1mM的5-氨基酮戊酸和终浓度为0.5mM的FeCl3,在23°C和250rpm条件下继续培养20min。然后加入终浓度为0.02mM的IPTG,在23°C和250rpm条件下培养6h,诱导P450sca-2、Pdr和Pdx的表达。
诱导表达结束后,将菌液在4°C和3,500rpm条件下离心10min。菌体沉淀用细胞裂解缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 7.5,20%v/v甘油,2mMEDTA,1.5mM DTT)重悬,并加入底物美伐他汀钠(终浓度为0.7mg/mL)。
随后在30°C下进行美伐他汀钠的羟基化反应(21h)。反应结束后,利用HPLC分析转化产物。HPLC检测条件如下:DiamonsilTM C18柱(200×4.6mm,5μm),流速1.0mL/min,柱温30°C,检测波长237nm,流动相CH3OH:H2O(75:25v/v,水中含有0.5%(v/v)的冰醋酸)。
普伐他汀钠和美伐他汀钠的保留时间tR分别为4.3min和17.5min。经诱导表达的E.coli BL21(DE3)/pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx菌株的色谱图(图3E)显示,在保留时间tR4.3min处出现一色谱峰,与普伐他汀钠标准品色谱峰(图3A)的保留时间一致。经普伐他汀钠的标准曲线计算,共表达P450sca-2/Pdr/Pdx体系的全细胞催化活性为12.88±2.22mg/L(图3E),只表达P450sca-2蛋白的全细胞催化活性为1.91±0.55mg/L(图3D),而只表达Pdr/Pdx的阴性对照则没有检测到普伐他汀钠的峰(图3C)。上述结果说明所表达的这三个蛋白是有功能的,并且P450sca-2能利用Pdr和Pdx进行催化。
实施例3-随机突变库的构建
以质粒pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx为模板,开展一轮定向进化。使用易错PCR引入随机突变,按照表7配置反应混和液进行反应,其中Mn2+浓度为0.15mM,所用的引物为P450sca-for和P450sca-rev。将易错PCR产物用NdeI和BglII双切,纯化后,与用同样内切酶双切的质粒pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx连接。连接产物转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中,得到野生型P450sca-2的随机突变文库(>30,000突变株)。
表7:易错PCR反应体系和反应条件
实施例4-突变株的筛选
随后,将随机突变文库中的单菌落接种在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上,同时接种于96孔板的200μL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中,在37°C和250rpm过夜培养。使用建立突变库所用的模板菌株做为阳性对照。以1%的接种量转接于1mL新鲜的液体LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中,继续在37°C培养2小时。加入终浓度为1mM的5-氨基酮戊酸和终浓度为0.5mM的FeCl3,在23°C和250rpm条件下继续培养20min。然后加入终浓度为0.02mM的IPTG,在23°C和250rpm条件下培养6h,以诱导P450sca-2、Pdr和Pdx的表达。诱导表达结束后,将菌液于4°C和3,500rpm条件下离心10min,菌体沉淀用细胞裂解缓冲液重悬(100mMTris-HCl,pH 7.5,20%v/v甘油,2mM EDTA,1.5mM DTT)。
按照实施例2的方法,加入底物美伐他汀钠,随后在30°C下进行美伐他汀钠的羟基化反应(21h),以测定全细胞活性。
以上述筛选方法对该随机突变文库进行筛选,共筛选出约2000突变株,其中得到了一个活性显著提高的突变株1-R8-5C。相比于野生型,突变株1-R8-5C有6个氨基酸突变,其全细胞活性提高3.12倍(表8)。
表8:随机突变和定点饱和突变得到的P450sca-2突变株的氨基酸突变和全细胞活性
a活性P450表达量是将纯化后的P450sca-2蛋白由Fe2+-CO/Fe2+计算得到;
b体外测定P450sca-2活性的体系为,P450sca-2:Pdx:PdR比例为1:20:2,其中P450sca-2的终浓度为1.5μM。
实施例5–活性表达量和比活性的测定
5.1活性P450sca-2的表达量通过以下方法测定:
将质粒pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中,其中质粒pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx中只有P450sca-2带有N端的His6-tag,而共表达Pdr和Pdx是为了利于P450sca-2的折叠。将重组菌E.coliBL21(DE3)/pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx接种含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上,37°C过夜培养。挑取生长良好的的单菌落接种于1mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中,37°C,250rpm过夜培养。
将1%的培养液接种于10mL新鲜的液体LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中,继续培养至OD600为0.6-0.8。加入终浓度为1mM的5-氨基酮戊酸和终浓度为0.5mM的FeCl3,在23°C,250rpm条件下继续培养20min。然后加入终浓度为0.02mM的IPTG,在23°C,250rpm条件下培养20h,诱导P450sca-2、Pdr和Pdx的表达。
表达后将菌体进行离心,然后用缓冲液A (20mM磷酸钠缓冲液,pH7.4,包含500mM氯化钠、30mM咪唑、1mM DTT和10%甘油v/v)重悬菌体沉淀,并超声99次破碎并再次离心,得到目标蛋白的粗提液。取上清液,用0.22μm低蛋白质结合的滤膜过滤后,上样至已结合Ni2+的HiTrapTM柱(1mL),再用30-330mM咪唑梯度洗脱蛋白。纯化得到的蛋白保存于20%的甘油中,在-70°C保存。
由于P450sca-2酶比较容易失活,故实验所有操作都要在4°C进行,并预冷所有相关缓冲液。此外,P450sca-2酶在420nm都有特定吸收峰,故在纯化过程中,用420nm检测蛋白峰可以有效防止杂蛋白的干扰。
得到纯化的P450sca-2蛋白后,用Fe2+-CO/Fe2+差谱法测定其活性表达量。方法如下:用50mM磷酸钠缓冲液(包含20%v/v甘油,pH 7.25)稀释纯化的P450sca-2酶液,平均分为两份。向其中一份(220μL)通入CO气泡(约100个)。随后迅速向两份中分别加入一定体积(40μL)的SDT水溶液(0.25g/3mL),快速摇匀。每份各取200μL,检测400-500nm处的吸收谱图。
将通入CO的样品的吸收值逐一减去对应的不含CO的样品的吸收值即得P450sca-2的CO差谱。每份样品中活性P450sca-2酶的量由下式计算得到。
其中,ΔA450nm-490nm:P450sca-2蛋白在450nm的光吸收差值与其在490nm的光吸收差值的吸收差值;
b:光程,0.41cm;
ε:消光系数,91mM-1cm-1。
再将测得的样品浓度乘以稀释倍数,除以菌体重悬时的浓缩倍数,便可以计算得到培养基中表达的活性P450sca-2含量,单位表示为nmol/L培养基。
5.2P450sca-2的比活性的测定
首先按以上方法表达得到纯化的P450sca-2,Pdr和Pdx蛋白。使用过量的NADH(终浓度640μM)提供电子。每200μL反应液含有0.1M的磷酸钾缓冲液(包含20%v/v甘油和1.5mMDTT,pH值7.4)、2.5mM MgCl2、1.5μM P450sca-2、30μM Pdx和3μM Pdr。
为了拟合得到米氏方程,加入不同浓度的底物美伐他汀钠浓度测定反应速率。美伐他汀钠浓度分别为10μM、25μM、50μM、75μM、125μM和200μM,并在每个浓度下进行三个平行实验。上述反应液在30°C预热5min后,加入NADH至终浓度640μM以启动反应。在30°C反应10min后,加入10μL 6M NaOH溶液以终止反应。离心10min后,用水1:1稀释,再用HPLC在237nm检测普伐他汀的生成。
HPLC检测条件如下:迪马DiamonsilTM C18柱(200×4.6mm,5μm),流速1.0mL/min,柱温30°C,检测波长237nm,流动相CH3OH:H2O(75:25v/v)(水中包含0.5%(v/v)的冰醋酸)。
P450sca-2的催化常数(kcat)和底物结合常数(KM)由Oringin 8软件进行拟合得到。催化常数(kcat)是指在底物完全过量的情况下,酶对底物转化速率,即每nmol P450sca-2(指由CO差谱计算出的活性P450sca-2的量)每分钟催化生成的普伐他汀钠的量(nmol)。底物结合常数(KM)则代表酶对底物的亲和性,其中KM越小,则酶对底物的亲和力最高。
本发明突变株1-R8-5C、2-T119-2-11B、2-T119-1-5E、2-N363-1-12B、2-N363-2-9B、2-T85-2-3E、2-T85-2-8C和2-V194-2-7B中P450sca-2变体的活性表达量和比活性均按照以上方法测定,结果显示在上表8中。
实施例6-基于建模的半理性设计
首先通过NCBI BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)寻找相似度高且有晶体结构的蛋白作为同源建模的模板,得到4个高同源性的模板,分别是:P450SU-1(PDBID 2ZBX,长度412aa,79%相似性,源自浅灰链霉菌Streptomyces griseolus);CYP105D6(PDB ID 3ABB,长度408aa,50%相似性,源自阿佛曼链霉菌Streptomycesavermitilis);P450MoxA (PDB ID 2Z36,长度413aa,49%相似性,源自放线菌Nonomuraea recticatena);和CYP105P1(PDB ID 3ABA,长度403aa,40%相似性,源自阿佛曼链霉菌Streptomyces avermitilis)。
以上述4个高同源性的模板为依据,使用Discovery studio 2.1(AccelrysSoftware Inc.)的MODELER程序对随机突变中获得的突变株1-R8-5C进行建模,获得了突变株1-R8-5C的三级结构模型(图4A)。基于获得的突变株1-R8-5C的三级结构模型,共选择了5个位点作为下一轮定点饱和突变的位点,其中2个位点位于底物结合口袋里,1个位点位于底物进入通道上,2个位点位于P450sca-2与Pdx进行结合和相互作用的界面上。选择过程如下:
通过Discovery studio 2.1中的LibDock模块对突变株1-R8-5C和底物美伐他汀钠进行分子对接,得到组成底物结合口袋的氨基酸位点(图4B)。发现与底物结合的序列大多是疏水氨基酸,这些氨基酸可提供疏水相互作用,驱动底物的进入。
T85位点是亲水性较强的苏氨酸,且不与底物美伐他汀钠分子有直接的分子作用,因此选择T85位点进行饱和突变,以希望获得一个最适的疏水氨基酸。预期此氨基酸可以增加底物结合口袋的疏水性,有利于底物的结合和稳定。
R77位点也在底物结合口袋内。虽然R77是亲水性强的精氨酸,但其可与heme分子形成盐桥,这有利于heme的稳定。但是R77的亲水性不利于底物美伐他汀钠的稳定,因为也选择R77位点进行饱和突变,以希望获得一个更适合的氨基酸。
FG loop位于位于底物进入的通道上,其大小对底物通道的形状有重要影响。V185和V194在两侧α螺旋末端与FG loop连接处,它们的突变有可能扩大FG loop的范围,进而影响底物的进入。而且V194的侧链正对底物通道面。序列比对显示V185是相对保守的。因此只选择V194进行饱和突变,以寻找有利于底物进入的氨基酸。
因为Pdr/Pdx这两个电子传递蛋白是P450cam-2的天然电子传递蛋白,它们之间具有很好的结合和电子传递效率。
图5显示出P450cam与Pdx预测的两个电子的主要传递路径。如图5所示,P450sca-2与P450cam电子路径中的氨基酸大部分一致,只有H361不一样。H361在P450sca-2突变株1-R8-5C上的对应位点是N363,因此选择N363进行饱和突变。最后,P450sca-2突变株1-R8-5C的T119也在Pdx结合的界面上,且它位于αC和αC*的连接处。与传统的α螺旋间的柔性loop连接不同,此氨基酸的连接性和柔性都很差,因此此氨基酸的突变会造成αC和αC*的形状和朝向的改变。通过对T119进行饱和突变,得到αC和αC*不同的构象,并通过筛选得到最适合与Pdx结合的αC和αC*构象(参见图6)。
实施例7-基于突变株1-R8-5C的单点饱和突变库的构建
单点饱和突变库分别在T85、R77、V194、T119和N363这五个位点上构建。以随机突变获得的突变株1-R8-5C为模板,并通过重叠PCR分别在每个位点上引入NNK简并密码子,以获得每个关键位点上包含所有20个氨基酸的饱和突变库。随后通过筛选获得在上述5个位点上的有益突变。
首先以1-R8-5C为模板,P450sca-for和N-rev(N为所突变的关键位点),以及N-for和P450sca-rev为引物,扩增出突变位点上下游的两个片段。引入饱和突变的引物如表9所示。将得到的两个片段以等摩尔混合液为模板,重叠扩增全长基因。不加引物反应15个循环后,添加引物P450sca-for和P450sca-rev,继续反应20个循环。具体的反应体系和程序如表10所示。
表9:构建定点饱和突变库所使用的引物,其中引入突变的位点以下划线表示
afor:定点饱和突变所使用的上游引物;
brev:定点饱和突变所使用的下游引物;
cNNK:上游引物中引入饱和突变所使用的简并密码子,其中N代表A+C+G+T四种碱基的混合物,K代表T+G两种碱基的混合物;和
dMNN:下游引物中引入饱和突变所使用的简并密码子,其中M代表A+C两种碱基的混合物。
表10:重叠PCR反应体系和程序
PCR产物纯化后,用NdeI和BglII双酶切,并与用同样内切酶双酶切的质粒pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx连接。随后将连接产物转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中。
定点饱和突变库的构建策略和筛选结果如图7所示,氨基酸突变类型和全细胞活性如表8所示。
通过结果的分析发现,只有R77没有筛选出更好的突变,说明R77为当前最有利的氨基酸。在N363和T119两个位点上均筛到了活性提高的氨基酸突变,其中突变株2-N363-2-9B和2-T119-1-5E在所有单点饱和突变株中活性最高,分别比用作模板的突变株1-R8-5C提高了146%和74%。在T85和V194两个位点上也筛到了活性提高的氨基酸突变,活性比用作模板的突变株1-R8-5C提高了39-68%。
实施例8-基于突变株1-R8-5C的迭代饱和突变库的构建
按照T85、V194、T119和N363这四个位点的重要性,使用Reetz等人发明的迭代饱和突变(Iterative saturation mutagenesis,ISM),依次对每个位点进行饱和突变,以获得所有位点的最好组合。结果发现,对T119和N363进行定点饱和突变获得的突变株活性最高。三维结构分析显示,T119和N363的距离在以内,推测它们之间可能会产生协同作用。因此,将T119和N363突变的组合引入到1-R8-5C的突变株上。
首先以突变株1-R8-5C为模板,以P450sca-for和T119-rev,T119-for和N363-rev,以及N363-for和P450sca-rev为引物,扩增出突变位点T119和N363上下游的三个片段。将得到的三个片段以等摩尔混合液为模板,重叠扩增全长基因。不加引物反应15个循环后,添加引物P450sca-for和P450sca-rev,继续反应20个循环。反应条件和体系与表10类似。
PCR产物纯化后,用NdeI和BglII双酶切,并与用同样内切酶双酶切的质粒pET30a-P450sca-2-Pdr-Pdx连接。随后将连接产物转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中。对含有T119和N363两个位点的饱和突变库进行筛选,得到三个最好的突变株组合如图8所示。然后以T119和N363组合得到的两个最好突变株(2'-C2-7F和2'-C1-12B)为模板,对T85位点进行饱和突变。操作方法与实施例7一致。最后以包含T85突变的好突变株(3'-I1-9C和3"-I2-12B)为模板,对V194位点进行饱和突变,操作方法与实施例7一致。
迭代饱和突变库的构建策略和筛选结果如图8所示,氨基酸突变类型和全细胞活性如表11所示。
结果发现,经过不同的组合后,所得突变株的活性进一步提高。在1-R8-5C的基础上组合了T85、V194、T119和N363这四个位点的突变株4'-I2-3G和4"-I1-5H有着最高的全细胞活性,其中又以突变株4'-I2-3G的全细胞活性最高,为341.18±15.20mg/L,比野生型P450sca-2提高了25.49倍。表11:迭代饱和突变得到的P450sca-2突变株的氨基酸突变和全细胞活性
实施例9-基于P450sca-2野生型的单点突变株的构建
以野生型P450sca-2为模板,并通过重叠PCR分别引入突变T119N、T119S、T119C;N363Y、N363H;T85L、T85F、T85M;V194C、V194N。引入单点突变的引物如表12所示。
表12:构建定点饱和突变库所使用的引物
其中引入突变的位点以下划线表示。
PCR的反应体系和程序与表10相同。所得的各个突变株的全细胞活性如表13所示。
表13:定点P450突变株的全细胞活性
结果发现,除了V194N外,其余9种突变都对野生型P450sca-2的全细胞活性有所提高。提高最多的是T85L突变株,比野生型提高了2.9倍。N363H突变株比野生型提高了1.7倍。
本领域技术人员应明白,本文中描述的发明除了那些明确描述的之外的变化和修改是容许的。应理解,本发明包括所有的这些变化和修改。本发明还包括所有在说明书中单独地或共同地提及或表明的步骤、特征、组合物和化合物,以及任意的和所有的组合,或者任何两或多个所述步骤或特征。
Claims (21)
1.一种分离的多肽,其是SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶的变体,
其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代,其中所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V,而且
相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
2.权利要求1的分离的多肽,其中所述多肽的氨基酸序列进一步包括在对应于SEQ IDNO:1所示序列中的选自T119、N363、T85、V194和它们任意组合的位置上的氨基酸取代,其中所述N363位置的氨基酸取代为N363Y或N363H;所述T119位置的氨基酸取代为T119S、T119C或T119N;所述V194位置的氨基酸取代为V194C、V194N或V194T;且所述T85位置的氨基酸取代为T85M、T85L、T85F或T85I。
3.权利要求2的分离的多肽,其中所述多肽的氨基酸序列进一步包括氨基酸取代T119N、N363Y、T85I和V194T。
4.权利要求2的分离的多肽,其中所述多肽的氨基酸序列进一步包括氨基酸取代T119S、N363Y、T85F和V194N。
5.一种分离的多肽,其由选自以下的氨基酸序列组成:
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;而且
所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
6.权利要求1-5任一项所述的分离的多肽,所述含十氢萘环的化合物为他汀类药物。
7.权利要求6所述的分离的多肽,所述他汀类药物为美伐他汀。
8.权利要求1-5任一项所述的分离的多肽,所述宿主细胞是原核微生物。
9.权利要求8所述的分离的多肽,所述原核微生物选自以下组中:大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、自养假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)、小四孢菌(Microtetraspora)和嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)。
10.一种分离的多核苷酸,其包含编码权利要求1-5之一所述的分离的多肽的核苷酸序列。
11.一种分离的多核苷酸,其由以下核苷酸序列组成:
SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列;
且其编码的多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。
12.权利要求10或11的分离的多核苷酸,进一步包含编码假单胞氧还蛋白还原酶Pdr和编码假单胞氧还蛋白Pdx的核苷酸序列。
13.一种重组载体,其包含权利要求10-12之一所述的分离的多核苷酸。
14.一种宿主细胞,其包含权利要求10-12之一所述的分离的多核苷酸,或者转化有权利要求13所述的重组载体。
15.权利要求14的宿主细胞,其是原核微生物。
16.权利要求15所述的宿主细胞,所述原核微生物选自以下组中:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、自养假诺卡氏菌、小四孢菌和嗜碳链霉菌。
17.一种制备权利要求1-5之一所述的分离的多肽的方法,包括以下步骤:
i)培养权利要求14-16之一所述的宿主细胞;
ii)分离和纯化权利要求1-5之一所述的分离的多肽。
18.一种制备普伐他汀或其盐的方法,包括以下步骤:
i)在存在底物美伐他汀或其盐的情况下培养权利要求14-16之一所述的宿主细胞,由此将美伐他汀转化为普伐他汀;和
ii)分离或纯化普伐他汀或其盐。
19.一种制备普伐他汀或其盐的方法,包括以下步骤:
i)用权利要求13所述重组载体转化适合的宿主细胞;
ii)在存在底物美伐他汀或其盐的情况下培养转化后的宿主细胞,由此将美伐他汀转化为普伐他汀;和
iii)分离或纯化普伐他汀或其盐。
20.权利要求19所述的方法,其中所述合适的宿主细胞是原核微生物。
21.权利要求20所述的方法,其中所述原核微生物选自以下组中:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、自养假诺卡氏菌、小四孢菌和嗜碳链霉菌。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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