CN106636383A - 微量样品中核酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微量样品中核酸的检测方法，包括：获得复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外的外壳，所述外壳与抗体偶联，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；将所述样品置于一容器中以及将所述样品与所述复合捕获体接触，使捕获复合体与细胞或病毒结合；向所述容器施加磁场，使所述捕获复合体吸附到所述容器内壁上，去除废液；加入漂洗液对所述捕获复合体进行洗涤，得到捕获复合体‑细胞结合物或捕获复合体‑病毒结合物，去除废液；扩增和检测所述捕获复合体‑细胞结合物或捕获复合体‑病毒结合物。本发明解决现有技术中生物成分分离和检测过程操作复杂，特异性不高的问题，更易实现分离和检测过程自动化和高通量处理。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体涉及微量样品中核酸的检测方法。
背景技术
自PCR技术在上世纪八十年代问世以来，其在分子生物学相关领域的应用越来越广泛。尤其是近年来，随着人们对临床诊断精度灵敏度要求的提高，以及个体化医疗概念的提出和推广，PCR技术凭借其在临床诊断中快速、敏感、特异等优点，已经迅速广泛的应用到了临床诊疗，通过检测患者样本中的基因，从而帮助医生确定用药和治疗方案。
而样本核酸提取是PCR技术运用的前提，人类外周血在人体内免疫反应及代谢中发挥着重要作用，可用于血液***及其他众多***疾病的分子监测，由于其在临床上取样简单易得，在临床诊断或研究中应用最为广泛。
目前全血核酸提取方法主要有苯酚-氯仿法、离心柱法、磁珠法。其中苯酚-氯仿法操作复杂且含有大毒性的有机溶剂已少有使用；离心柱法仍然是目前使用最广泛的全血核酸提取方法，但其需要特殊的硅胶膜层析柱，且需要反复的离心清洗后才能洗脱获得核酸；磁珠法采用磁珠吸附、清洗洗脱获得核酸；这些方法操作过程中需要多次离心、换管、磁棒分离过程，操作复杂，提取时间较长，对操作要求较高，不利于临床诊疗或研究应用。
专利CN201410010668.4公开了一种进行全血基因组快速扩增的方法，所述全血基因组快速扩增的方法是通过核酸释放剂及与之相匹配的PCR反应液来实现的，主要步骤为，取5μl核酸释放剂加入到PCR反应管中，然后取5μl血液与之混合，室温静止5-10分钟，然后取40μl配置好的PCR反应液直接加入上述混合液中，最后上机扩增。该发明在核酸释放剂的作用下，核酸能够直接，快速的从血液中白细胞或细小细胞等有核细胞中释放出来，同时，核酸释放试剂又能够导致血红素和其他杂质蛋白变性，减少这些干扰物质对于后续PCR扩增的干扰,从而实现血液基因组快速PCR扩增检测。
但该方法直接将全血中的核酸从细胞核中释放出来，会引入血液中的病毒、细菌的核酸，并且不能完全清除血红素和其他蛋白质，这些物质的存在会对后续PCR扩增产生干扰，影响PCR扩增的特异性。
发明内容
本发明的一个目的是，解决现有技术中生物成分分离和检测过程操作复杂，特异性不高的问题。
本发明的另一个目的是，实现分离和检测过程自动化，高通量处理。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
根据本发明涉及的一方面，分离和检测样品中细胞或病毒内可能存在的生物成分的方法，包括：a.获得复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外的外壳，所述外壳与抗体偶联，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.将所述样品置于一容器中以及将所述样品与所述复合捕获体接触；c.向所述容器施加磁场，使所述捕获复合体吸附到所述容器内壁上，去除废液；d.加入漂洗液对所述捕获复合体进行洗涤，若所述生物成分存在，得到捕获复合体-细胞结合物或捕获复合体-病毒结合物，去除废液；e.执行核酸扩增过程，对所述捕获复合体-细胞结合物或捕获复合体-病毒结合物中的核酸进行扩增或检测，所述捕获复合体对所述核酸扩增或检测过程不产生抑制作用；.进行检测结果判定。
进一步的，所述核酸扩增的方法选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR、巢式PCR、多重PCR、半定量PCR、实时荧光定量PCR、原位PCR、连接酶链反应、随机扩增多态性DNA、等温扩增技术、重组PCR、锚定PCR、不对称PCR、反向PCR或免疫PCR中的一种或多种。
进一步的，所述核酸等温扩增技术选自链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶核酸扩增、依赖核酸序列扩增、环介导等温扩增、单引物等温扩增技术、快速等温检测放大技术和Qβ复制技术中的一种或多种。。
根据本发明涉及的另一方面，将所述样品置于所述容器中前将所述样品与所述复合捕获体接触或将所述样品置于所述容器中后将所述样品与所述复合捕获体接触。
根据本发明涉及的另一方面，还包括在将所述样品与所述复合捕获体接触前向所述样品中加入缓冲液的步骤。
根据本发明涉及的另一方面，所述样品选自淋巴液、泪液、汗液、尿液、唾液、全血、脑脊液、肺腔液、腹膜液、关节的液体、羊水、组织间隙液、组织培养液或细胞培养液中的一种或多种。
根据本发明涉及的另一方面，所述细胞选自人体细胞、动物细胞、植物细胞、细菌、真菌细胞或重组细胞中的一种或多种。
优选的，所述人体细胞选自肠道脱落细胞、上皮脱落细胞、吞噬细胞、白细胞、干细胞、神经细胞中的一种或多种。
根据本发明涉及的另一方面，所述抗体选自CD45特异性抗体、E.coli抗体、mAbRE-4D8、anti-M13抗体、甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体中的一种或多种。
根据本发明涉及的另一方面，核酸检测方法包括：a.利用所述分离和检测样品中细胞或病毒内可能存在的生物成分的方法获得结合在所述捕获复合体上的细胞或病毒，所述细胞或病毒内含有核酸；b.执行PCR扩增及等温扩增等其他扩增或者检测方式，获得所述细胞或病毒核酸扩增产物或检测结果，所述捕获复合体对PCR扩增、等温扩增或者其他检测方式不产生抑制作用；c.检测或分析所述核酸扩增产物、等温扩增产物等。
根据本发明涉及的另一方面，所述检测结果判定的方法选自凝胶电泳、核酸测序、核酸分子杂交中的一种或多种，所述捕获复合体对扩增和检测无抑制作用。
根据本发明涉及的另一方面，分离样品中细胞或病毒的装置，包括：a.复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外与抗体偶联的外壳，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.使所述样品与所述复合捕获体接触的装置；c.磁场产生装置。
根据本发明涉及的另一方面，分离和检测样品中细胞或病毒内核酸的装置，包括：a.复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外与抗体偶联的外壳，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.使所述样品与所述复合捕获体接触的装置；c.磁场产生装置；d.扩增所述样品中细胞或病毒内的核酸的装置；e.检测所述样品中细胞或病毒内的核酸的装置及试剂。
根据本发明涉及的另一方面，所述分离和检测样品中细胞或病毒内核酸的装置在核酸检测中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
所述复合捕获体可以特异性结合靶细胞或病毒，而去除了样品中的其他各种成分，最终所获得的生物成分是唯一来源于靶细胞或病毒的所述生物成分；此外，在核酸检测过程中，可以有效避免样品中其他杂质对PCR扩增及核酸检测的干扰。
进一步的，可以在不同规模的样品中使用本发明涉及的方法和装置，特别是少量和微量样品，并且本发明涉及的方法和装置易于自动化和微型化，可实现高通量基因检测。
此外，只需要采集微量(1-5微升)的样品即可进行核酸检测，比如采集人全血样品可以是成年人指尖血、婴儿足跟血等，同时尤其适合于稀缺样品的检测，降低了核酸检测对样本采集的要求，减少了取样的困难。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一方面，本发明涉及分离和检测样品中细胞或病毒内可能存在的生物成分的方法，包括：a.获得复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外与抗体偶联的外壳，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.将所述样品置于一容器中以及将所述样品与所述复合捕获体接触；c.向所述容器施加磁场，使所述捕获复合体吸附到所述容器内壁上，去除废液；d.加入漂洗液对所述捕获复合体进行洗涤，若所述生物成分存在，得到捕获复合体-细胞结合物或捕获复合体-病毒结合物，去除废液；e.检测可能结合在所述捕获复合体上的细胞或病毒内的生物成分。其中，在b步骤中可以将所述样品置于所述容器中前将所述样品与所述复合捕获体接触，也可以将所述样品置于所述容器中后将所述样品与所述复合捕获体接触。其中，通过摇匀等方式使所述样品与所述复合捕获体充分接触，使所述样品与所述复合捕获体更多的特异性结合。其中，在将所述样品与所述复合捕获体接触前还包括向所述样品中加入缓冲液的步骤。其中，以上步骤均在合适的温度条件下进行，例如，在分离和检测动物细胞特别是人类细胞时，保持温度在30-40摄氏度。
另一方面，本发明实施例涉及微量样品中核酸的检测方法，包括：a.获得复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外与抗体偶联的外壳，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.将所述样品置于一容器中以及将所述样品与所述复合捕获体接触；c.向所述容器施加磁场，使所述捕获复合体吸附到所述容器内壁上，去除废液；d.加入漂洗液对所述捕获复合体进行洗涤，得到捕获复合体-核酸结合物或捕获复合体-病毒结合物，去除废液；e.执行PCR扩增过程，对所述捕获复合体-细胞结合物或捕获复合体-病毒结合物中的核酸进行扩增或检测，所述捕获复合体对所述核酸扩增或检测过程不产生抑制作用；f.进行检测结果判定。
另一方面，本发明实施例涉及分离样品中细胞或病毒的装置，包括：a.复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外与抗体偶联的外壳，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.使所述样品与所述复合捕获体接触的装置，所述复合捕获体与所述细胞或病毒结合为述复合捕获体-细胞组合物或复合捕获体-病毒组合物；c.磁场产生装置，在所述样品与所述复合捕获体接触的装置中产生磁场力使所述复合捕获体与其它不需要的组分分离。
进一步的，本发明实施例涉及分离和检测样品中细胞或病毒内核酸的装置，包括：a.复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外与抗体偶联的外壳，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.使所述样品与所述复合捕获体接触的装置；c.磁场产生装置；d.扩增所述样品中细胞或病毒内的核酸的装置；e.检测所述样品中细胞或病毒内的核酸的装置。
本发明实施例涉及的方法和装置可以用于动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或重组细胞，例如动物细胞中的肌肉细胞、神经细胞、上皮细胞、免疫细胞、白细胞等。本发明实施例的方法和装置可以用于植物病毒、动物病毒、噬菌体。
本发明实施例涉及的方法和装置检测的样品可以来源于植物、动物、培养液等，特别是液体样品，例如来源于动物的样品可以为动物的体液，如人的体液，包括血清、血浆、全血、痰、脑脊液、羊水、尿液、胃肠道内容物、骨髓液、唾液及汗液等，或组织培养液、细胞培养液、植物体液、细菌培养液、病毒培养液等。
本发明实施例涉及的方法和装置可以用于检测的细胞或病毒内的生物成分包括氨基酸、肽、蛋白质、脂质、单糖、寡糖、碳水化合物、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、核酸、维生素及其复合物。
本发明实施例涉及的复合捕获体的磁性核心1包括选自顺磁物质、铁磁化物质和亚铁磁化物质的可磁化物质，如四氧化三铁；本发明实施例的方法和装置涉及的捕获复合体的外壳可以是合适的各种包被材料，抗体2结合在外壳3上，抗体2针对所要分离或检测的细胞或病毒种类进行选择，抗体2对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力，优选能特异性识别细胞或病毒表面表达丰富的特异性抗原的抗体，例如针对人类白细胞选择CD45特异性抗体。
所述漂洗液为现有技术中适宜的漂洗液，例如等渗的生理盐水、PBS缓冲液等。
可以在不同规模的样品中使用本发明实施例涉及的方法和装置，特别是少量和微量样品，并且本发明实施例涉及的方法和装置易于自动化和微型化。
本发明实施例涉及的核酸检测方法中，将PCR所需试剂(包含缓冲液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕获复合体-核酸结合物或捕获复合体-病毒结合物中，无需分离捕获复合体和细胞或病毒，直接进入PCR程序，在低渗溶液及高温作用下，细胞或病毒将裂解并释放出核酸作为PCR的模板，捕获复合体对PCR扩增不产生抑制作用。
本发明实施例涉及的核酸扩增和检测步骤中，可以在PCR扩增后使用合适的方法直接对核酸进行检测和分析，如凝胶电泳、核酸测序、核酸分子杂交等，也可以利用荧光定量PCR方法对所述细胞或病毒核酸进行扩增和检测，所述捕获复合体对所述扩增和检测均无抑制作用。
实施例1.从人全血中分离白细胞以及检测核酸
(1)将CD45特异性抗体偶联到捕获复合体外壳上；
(2)取3微升人指尖血样置于容器中，37摄氏度下，加入100微升HEPES缓冲液(pH7.4)，加入捕获复合体，摇晃，捕获复合体特异性结合白细胞形成捕获复合体-白细胞结合物，使用磁铁在容器外壁吸附捕获复合体到容器内壁上，去除废液，加入漂洗液对捕获复合体-白细胞结合物进行洗涤，去除废液；
(3)将PCR所需试剂(包含缓冲液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕获复合体-白细胞结合物中，直接进入荧光定量PCR程序，在低渗溶液及高温作用下，白细胞将裂解并释放出核酸作为PCR的模板，利用荧光定量PCR、ARMS-PCR,LAMP等方法对白细胞核酸进行扩增和检测；
实施例2.从胸腺组织培养液中分离小鼠胸腺上皮细胞以及检测核酸
(1)将mAb RE-4D8抗体偶联到捕获复合体外壳上；
(2)取3微升胸腺组织培养液样品与捕获复合体混合，置于容器中，加入100微升Tris-EDTA缓冲液(pH7.6)，将混合物用涡旋混合器轻轻搅拌15秒，在37摄氏度下静置3分钟，捕获复合体特异性结合小鼠胸腺上皮细胞形成捕获复合体-上皮细胞结合物，使用磁铁在容器外壁吸附捕获复合体到容器内壁上，去除废液，加入PBS缓冲液(pH7.4)对捕获复合体-上皮细胞结合物进行洗涤，去除废液；
(3)将PCR所需试剂(包含缓冲液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕获复合体-上皮细胞结合物中，直接进入PCR程序，在低渗溶液及高温作用下，小鼠胸腺上皮细胞将裂解并释放出核酸作为PCR的模板，得到小鼠胸腺上皮细胞核酸扩增产物；
(4)PCR结束之后，使用凝胶电泳对核酸扩增产物进行检测和分析。
实施例3.从细菌培养液中分离M13噬菌体以及检测核酸
(1)将anti-M13抗体偶联到捕获复合体外壳上；
(2)取100微升细菌培养液样品置于容器中，用Hanks液将抗原稀释至10μg/ml，加入捕获复合体混合，将混合物用涡旋混合器轻轻搅拌15秒，在37摄氏度条件下孵育3分钟，捕获复合体特异性结合M13噬菌体形成捕获复合体-噬菌体结合物，使用磁铁在容器外壁吸附捕获复合体到容器内壁上，去除废液，加入PBS缓冲液(pH7.4)对捕获复合体-噬菌体结合物进行洗涤，去除废液；
(3)将PCR所需试剂(包含缓冲液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕获复合体-噬菌体结合物中，直接进入PCR程序，在低渗溶液及高温作用下，M13噬菌体将裂解并释放出核酸作为PCR的模板，得到M13噬菌体核酸扩增产物；
(4)PCR结束之后，使用凝胶电泳对核酸扩增产物进行检测和分析。
实施例4.检测血浆中是否存在H5N1甲型流感病毒
(1)将纯化后的甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体偶联到捕获复合体外壳上；
(2)取3微升血浆样品置于容器中，加入100微升PBS缓冲液(pH6.8)，加入捕获复合体混合，将混合物用涡旋混合器轻轻搅拌15秒，在37摄氏度条件下孵育30分钟，若血浆中存在H5N1甲型流感病毒，则捕获复合体特异性结合H5N1甲型流感病毒形成捕获复合体-病毒结合物，使用磁铁在容器外壁吸附捕获复合体到容器内壁上，去除废液，加入PBS缓冲液(pH6.8)对捕获复合体-病毒结合物进行洗涤，去除废液；
(3)将PCR所需试剂(包含缓冲液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕获复合体-病毒结合物中，直接进入PCR程序，在低渗溶液及高温作用下，若血浆中存在H5N1甲型流感病毒，则H5N1甲型流感病毒将裂解并释放出核酸作为PCR的模板，得到H5N1甲型流感病毒核酸扩增产物；
(4)PCR结束之后，使用核酸分子杂交方法对核酸扩增产物进行检测和分析。
上面对本发明的各种实施方式的描述以描述的目的提供给本领域技术人员。其不旨在是穷举的、或者不旨在将本发明限制于单个公开的实施方式。如上所述，本发明的各种替代和变化对于上述技术所属领域技术人员而言将是显而易见的。因此，虽然已经具体讨论了一些另选的实施方式，但是其它实施方式将是显而易见的，或者本领域技术人员相对容易得出。本发明旨在包括在此已经讨论过的本发明的所有替代、修改、和变化，以及落在上述申请的精神和范围内的其它实施方式。
虽然通过实施方式描绘了本发明，本领域普通技术人员知道，本发明有许多变形和变化而不脱离本发明的精神，希望所附的权利要求包括这些变形和变化而不脱离本发明的精神。
Claims (9)
1.微量样品中核酸的检测方法，包括：a.获得复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外的外壳，所述外壳与抗体偶联，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.将所述样品置于一容器中以及将所述样品与所述复合捕获体接触，使捕获复合体与细胞或病毒结合；c.向所述容器施加磁场，使所述捕获复合体吸附到所述容器内壁上，去除废液；d.加入漂洗液对所述捕获复合体进行洗涤，得到捕获复合体-细胞结合物或捕获复合体-病毒结合物，去除废液；e.执行核酸扩增过程，对所述捕获复合体-细胞结合物或捕获复合体-病毒结合物中的核酸进行扩增或检测，所述捕获复合体对所述核酸扩增或检测过程不产生抑制作用；f.进行检测结果判定。
2.如权利要求1所述方法，所述核酸扩增的方法选自聚合酶链式反应、逆转录PCR、巢式PCR、多重PCR、半定量PCR、实时荧光定量PCR、原位PCR、连接酶链反应、随机扩增多态性DNA、环介导等温扩增、核酸序列依赖性扩增、重组PCR、锚定PCR、不对称PCR、反向PCR或免疫PCR中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述方法，还包括在将所述样品与所述复合捕获体接触前向所述样品中加入缓冲液的步骤。
4.如权利要求1所述方法，所述检测结果判定的方法选自凝胶电泳、核酸测序、核酸分子杂交中的一种或多种。
5.如权利要求1或2所述方法，所述样品选自淋巴液、泪液、汗液、尿液、唾液、全血、***、脑脊液、肺腔液、腹膜液、关节的液体、羊水、组织间隙液、组织培养液或细胞培养液中的一种或多种。
6.如权利要求1或2所述方法，所述细胞选自人体细胞、动物细胞、植物细胞、细菌、真菌细胞或重组细胞中的一种或多种。
7.如权利要求6所述方法，所述人体细胞选自肠道脱落细胞、上皮脱落细胞、吞噬细胞、白细胞、干细胞、神经细胞中的一种或多种。
8.如权利要求1或2所述方法，所述抗体选自CD45特异性抗体、E.coli抗体、mAb RE-4D8、anti-M13抗体、甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体中的一种或多种。
9.检测微量样品中核酸的装置，包括：a.复合捕获体，所述复合捕获体包含磁性核心和包被于所述磁性核心外的外壳，所述外壳与抗体偶联，所述抗体对所述样品中细胞或病毒上的特定表位具有特异性亲和力；b.使所述样品与所述复合捕获体接触的装置；c.磁场产生装置；d.扩增所述样品中细胞或病毒内的核酸的装置；e.检测所述样品中细胞或病毒内的核酸的装置。
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