CN101509041A

CN101509041A - 一种利用rna恒温扩增的沙眼衣原体核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN101509041A
Application number: CNA200910047902XA
Authority: CN
Inventors: 张常娥; 方亮; 于明辉; 王敏; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2009-08-19

Abstract

本发明涉及一种利用磁珠－RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对沙眼衣原体(CT)进行检测的试剂盒，包含尿样保存液、核酸提取液、洗涤液、CT反应液、CT检测液、SAT酶液、CT阳性对照、CT阴性对照。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。

Description

一种利用RNA恒温扩增的沙眼衣原体核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对沙眼衣原体(CT)进行检测的试剂盒。

背景技术

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)是一种在人体内长期生存并又广泛传播的病原体，大小约250～450nm。由其引起的疾病范围广泛，可累及眼、生殖道和其他脏器，可引起男性尿道炎、***，女性***、***等，尤其是与***等其他病原体合并感染时更加重疾病的发展及引起其它并发症，也可导致母婴传播。因而，沙眼衣原体感染的防治具有十分重要的公共卫生意义。在临床上，70％～80％的女性和多达50％的男性常表现为无临床症状的感染，所以实验室诊断具有重要作用。沙眼衣原体的检测目前有三类方法：细胞生物学检测方法；免疫学检测方法和分子生物学方法。

细胞生物学检测方法包括显微镜检查和细胞分离培养。显微镜检查可发现沙眼衣原体包涵体，因敏感性过低在临床上不推荐使用，仅限于CT鉴定。培养法的特异性为100％，但敏感性低，且各个实验室操作步骤有所不同，没有标准化。目前组织细胞培养法是诊断CT感染的“金标准”，但是由于分离培养操作复杂，技术及设备要求高，所需时间长，且敏感性受标本采集、运送、保存等的影响较大，加上国内很多医院不具备细胞培养条件，因而不适于临床应用，多用于科研和疑难病例的终鉴定。

免疫学检测方法包括直接免疫荧光法、胶体金法和酶联免疫吸附试验等。直接荧光抗体测定(DFA)将针对CT的单克隆抗体用荧光标记，与标本中的CT结合后，荧光显微镜检查就能见到发荧光的原体(Ebs)，其敏感性受人群感染率的影响，且有判定结果带有主观性，荧光易淬灭，不适于检测大量标本。由于此法操作简便、费用低廉、特异性较高，在不具备分子生物学试验条件的医院，可用以检测临床标本，但需经验丰富者操作。酶联免疫吸附试验(EIA)用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT的脂多糖(LPS)或外膜蛋白(MOMP)，酶反应生成有色产物，用酶标仪进行测定，其敏感性从64％到98％，特异性从93％到98％。通常认为，其敏感性在高危人群中可得到满意结果，而在新近感染及治疗监测中敏感性明显下降。胶体金法将酶与单克隆抗体用交联剂结合起来，形成酶标抗体，检测标本中有无CT抗原，如有CT抗原，则与酶标抗体发生特异性反应，加入酶的底物，底物被酶催化生成可溶性或不溶性产物，即为阳性。可用肉眼或分光光度计定性或定量，10分钟可出报告。其最大缺点在于，与其他常见微生物产生交叉反应，如金黄色葡萄球菌、A群及B群链球菌、淋病奈瑟菌等，从而使特异性不高。

分子生物学方法包括直接检测核酸的技术(即基因探针技术)、PCR法、连接链式反应(LCR)、链置换扩增技术(SDA法)、依赖核酸序列的扩增技术(NASBA法)、转录介导的扩增(TMA法)，此类方法对于诊断泌尿生殖道沙眼衣原体感染敏感性和特异性均达90％～100％。

最新发展的扩增是Gen-Probe公司的扩增CT的转录介导扩增法(TMA)，扩增并检测CT的rRNA。核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7RNA多聚酶来同时实现，采用化学发光法进行终点检测。有学者报道TMA检测女性尿标本的敏感性和特异性分别为93.8％和100％，男性尿标本为95.6％和98.7％，提示TMA将成为另外一种能利用尿标本检测CT的扩增方法，但该方法使用的终点化学发光检测，在污染控制上稍显不足。

本公司已申请了专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)(申请号：200810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)；在此两项技术的基础上，本发明沙眼衣原体核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测拭子和尿样中的CT rRNA，具有特异性高、灵敏度高和污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)的特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术特异性、灵敏性不高，实验污染不易控制的缺点，提供一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对沙眼衣原体(CT)进行检测的试剂盒。

本发明所提供的沙眼衣原体检测的试剂盒，包括下列组成：

(1)尿样保存液：为裂解和保存尿液或生殖道拭子洗涤液标本中沙眼衣原体(CT)RNA的表面活性剂和HEPES缓冲液；

(2)核酸提取液：为oligodT包被的磁珠和特异性结合靶标核酸(CT RNA)的一段RNA序列；

(3)洗涤液：为含SDS、NaCl和乙醇的溶液；

(4)CT反应液：为dNTPs和NTPs等扩增所需组份；

(5)CT检测液：为恒温扩增时必需的引物和荧光探针，序列选自CT 23s rRNA基因的保守区；

(6)SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含的T7RNA聚合酶、M-MLV反转录酶及稳定剂；

(7)CT阳性对照；为含CT 23s rRNA基因的体外转录RNA稀释物；

(8)CT阴性对照：为不含任何核酸的尿样保存液及生理盐水。

尿样保存液主要有效成分是硫酸铵和去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。另外，尿样保存液中高浓度盐离子及去垢剂的存在，通过蛋白质变性使菌体细胞破裂，靶标RNA得到了释放，样本放在该保存液中，延长了样本的保存时间，RNA从细胞中释放出来。

核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸(RNA)。病原体rRNA的提取通过特异性吸附原理来实现。

核酸提取液中含有的标本提取捕获探针，包含有以下一种或几种序列：序列见序列表SEQ.ID.NO1-5。

SAT酶液中所含的T7RNA聚合酶、M-MLV反转录酶，其稳定性直接决定了扩增反应的扩增效率和试剂盒的使用有效期。该SAT酶液中加有稳定剂，经长期稳定性试验，稳定性可达10个月，保证了试剂盒有效期达6个月。

CT检测液中CT荧光探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。CT检测液中CT引物，依照SAT扩增的原理设计了5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物，下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物与靶标完全一致，保证了本试剂盒可准确进行CT检测的SAT反应。

CT检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：

CTT7：序列见序列表SEQ.ID.NO6-10；

CTnT7：序列见序列表SEQ.ID.NO11-15。

CT检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：

CT probe：序列见序列表SEQ.ID.NO16-20。

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中的CT阳性对照和CT阴性对照，均含有本试剂盒已述及的尿样保存液及生理盐水，其中CT阳性对照还含有CT RNA，是沙眼衣原体23srRNA体外转录产物的稀释物，定值约为10⁷copies/ml。使用本试剂盒时，每次应同时做平行对照的质量控制，且结果应同时满足阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。(dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数，与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似。)

CT阳性对照中的体外转录的CT RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成CT23s rRNA基因的靶标片段，长度约500bp；

(2)将片段克隆到pGEMb-T载体中，构建CT阳性对照质粒；

(3)CT阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM^b-T-CT1菌株，贮存于-70℃；

(4)纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

CT阳性对照含有长约500bp的CT23s rRNA基因序列，序列见序列表SEQ.ID.NO21。

本发明的检测试剂盒检测CT RNA的分析灵敏度为10³copies/反应(沙眼衣原体1个菌内约含3.2×10³个rRNA)，该灵敏度远远高于目前国内上市的同类产品，故本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。本发明试剂盒可用于尿液标本的检测，这种非侵入性采样方式受到病人的欢迎。

附图说明

图1.实施例4本发明试剂盒检测病人拭子标本的扩增图；

图2.实施例5本发明试剂盒检测病人尿液标本的扩增图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 CT核酸RNA的提取

核酸提取具体步骤为：

在样品处理管(1.5ml离心管)中加入100μl核酸提取液，加入400μl尿样或者拭子洗液，每加一个样本换一个吸头，涡旋混匀；60℃保温5分钟；室温放置10分钟；

将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5分钟(如果在磁珠吸附过程中有个别磁珠难以吸附至管壁则应适当延长吸附时间)；

待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠；

用洗涤液(洗涤液如果有白色絮状沉淀物，用之前应先42℃加热，直至澄清)洗涤两次，每次加入1ml洗涤液后取下样品处理管震荡30秒后置磁珠分离装置上，静置5分钟；保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠；

将样品处理管移离磁珠分离装置，管中的磁珠-核酸复合物备用(此步应清晰可见磁珠)；

向每个样品处理管中加入40μl扩增检测液(40μl CT反应液+2.5μl CT检测液)洗涤磁珠。

实施例2 SAT核酸扩增检测

从震荡混匀后的上述扩增检测液中取30μl扩增检测液(包含磁珠)至洁净微量反应管，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；同时将SAT酶液也预热到42℃；

向微量反应管中加入10μl已预热的酶液(加样tip头不要接触微量反应管，如有接触请务必更换tip头)，加酶后盖上管盖1200rpm震荡15秒钟混匀；

将微量反应管快速转至合适的恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；

反应结束后，直接将微量反应管取出浸泡于10％84消毒液中，取微量反应管应小心操作，严禁打开反应管(防止污染反应区)！实验结束后用10％84消毒液清洁工作区及用具，最后用清水擦拭干净。

参考值：

1.阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。

2.dt≤35的样本为阳性；

3.35<dt<40的样本建议重新检测，检测结果dt<40的样本为阳性；

4.dt无数值或为40的样本为阴性。

注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。

实施例3 CT试剂盒各组份的配制和组装

试剂盒分为2～30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15～-35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)。

A盒(标本处理单元)组成为：

尿样保存液：0.1M硫酸铵；0.15M HEPES；

核酸提取液：0.15uM捕获探针和磁性颗粒250mg/L；

洗涤液：0.1％SDS。

B盒(核酸扩增检测单元)组成为：

CT反应液：4mM dNTPs和16mM NTPs；

SAT酶液：M-MLV2000U；T7RNA聚合酶500U；

CT检测液：主要含3.5uM CT特异引物、2.7uM特异荧光探针；

CT阳性对照：主要含10⁷copies/ml CT RNA；

CT阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。

实施例4 应用模式之临床样本尿液的检测

本检测模式为本发明的最佳体现：试剂的制备同实施例3，试剂的生产在GMP车间进行，沙眼衣原体尿液临床样本为上海皮肤病性病医院提供的临床实验样品，编号为CT尿液标本1～8，另设阴性对照、阳性对照各一个。标本的核酸提取同实施例1，SAT扩增检测及判定同实施例2，所使用的荧光PCR仪为Bio-Rad iQ5。结果见附图1，与金标准培养法检测结果完全相同。

实施例5 应用模式之临床样本拭子的检测

本检测模式为本发明的另一个应用：试剂的制备同实施例3，试剂的生产在GMP车间进行，沙眼衣原体拭子临床样本为上海皮肤病性病医院提供的临床实验样品，编号为CT拭子标本1～8(与尿液标本编号为一一对应)，另设阴性对照、阳性对照各一个。标本的核酸提取同实施例1，SAT扩增检测及判定同实施例2，所使用的荧光PCR仪为Bio-RadiQ5。结果见附图2，与金标准培养法检测结果完全相同，与实施例4结果也完全一致。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的沙眼衣原体(CT)核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不是构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种利用RNA恒温扩增的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于包括下列组成：

(3)洗涤液：为含SDS、NaCl和乙醇的溶液；

(4)CT反应液：为dNTPs和NTPs等扩增所需组份；

(6)SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶、M-MLV反转录酶及稳定剂；

(7)CT阳性对照；为含CT 23s rRNA基因的体外转录RNA稀释物；

(8)CT阴性对照：为不含任何核酸的尿样保存液及生理盐水。

2.根据权利要求1所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的尿样保存液含有硫酸铵和去垢剂。

3.根据权利要求1所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的核酸提取液是利用磁珠分离法进行核酸提取，含有磁性颗粒和捕获探针。

4.根据权利要求3所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的捕获探针包含有以下一种或几种序列：序列见序列表SEQ.ID.NO1-5。

5.根据权利要求1所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的CT检测液中CT荧光探针为分子信标，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎。

6.根据权利要求5所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的CT检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：CT probe：序列见序列表SEQ.ID.NO16-20。

7.根据权利要求1所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的CT检测液中CT引物为5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物，下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物序列与靶标完全一致。

8.根据权利要求7所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的CT检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：

CT T7：序列见序列表SEQ.ID.NO6-10；

CT nT7：序列见序列表SEQ.ID.NO11-15。

9.根据权利要求1所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的CT阳性对照中体外转录的CT RNA，制备方法包括下列步骤：

(1)用化学合成法合成CT 23s rRNA基因的靶标片段，长度约500bp；

(2)将片段克隆到pGEMb-T载体中，构建CT阳性对照质粒；

(4)纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

10.根据权利要求1或9所述的沙眼衣原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的CT阳性对照含有长521bp的CT 23s rRNA基因序列，序列见序列表SEQ.ID.NO21。