CN109321564A - 一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒 - Google Patents

一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒，属于分子生物学领域。本发明利用双向热循环消减指数级富集的配体进化***SELEX，以基因工程中融合蛋白为筛选靶标，环氧基（或羧基、NHS磁珠和链霉素）琼脂磁珠作为载体，将融合标签蛋白抗体（或生物素化的核酸适配体）偶联到磁珠上，形成捕捉磁珠，捕获基因工程中表达的融合标签蛋白，利用大容量的随机寡核苷酸文库与磁珠‑标签蛋白抗体‑标签蛋白‑靶蛋白结合形成复合物，从中筛选出与靶蛋白特异结合的核酸适配体。本发明具有灵敏度高、特异性强、快速、高效等优点，对细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达基因工程融合蛋白的检测及药物研究具有重要意义。

Description

一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，尤其涉及一种将纳米磁珠材料、SELEX筛选技术和高通量核酸测序有机结合，建立的基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，本发明同时还涉及基于该筛选方法的试剂盒，属于基因工程技术领域。
背景技术
SELEX即指数级富集的配体进化***（SystematicEvolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX），该技术利用大容量的随机寡核苷酸库文与靶蛋白相互作用，从中筛选出与靶标特异结合的核酸适配体。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速、高效等优点。自Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过二十多年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具,被应用于生物化学、基因调控、疾病诊断及新药研发等领域。筛选的靶标越来越广泛，从最开始的有机染料和酶逐渐扩展到更小的离子、氨基酸、毒素以及更复杂的癌细胞、干细胞、临床组织切片、血清等，对于不同的靶物质，采用适当的方法，才可以更快更方便地找到亲和力高、特异性强的适配体。
近年来研究者在原有筛选方法的基础上将石墨烯，碳纳米管，毛细管，流式细胞仪，原子力显微镜等不同的材料和仪器引入了分离步骤以提高分离效率，使经典的SELEX技术得到发展和完善，衍生出了众多改良的SELEX技术如：反向筛选（counter SELEX）、消减筛选（subtractive SELEX）、毛细管电泳筛选（CE SELEX）、基因组SELEX（genomic SELEX）、加尾筛选（tailored SELEX）、切换筛选（toggle SELEX）和基于修饰核苷酸的SELEX等。这些方法的建立，提高了筛选效率，丰富了核酸适配体的应用形式，为核酸适配体的研究和应用奠定了基础。但是，这些筛选方法都存在一定的局限性，如筛选成本高、周期长、操作复杂，针对的靶标单一等。因此建立一种成本较低、操作简单、快速、高效的核酸适配体筛选技术具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种具有灵敏度高、特异性强、快速、高效等特点的融合蛋白核酸适配体筛选方法；可用于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达基因工程中融合蛋白的筛选。
本发明的另一目的是提供一种基于上述筛选方法的融合蛋白核酸适配体的试剂盒。
一、融合蛋白核酸适配体的筛选方法
本发明基因工程中融合蛋白核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
（1）靶磁珠制备：将捕捉磁珠分别与基因工程中融合表达标签蛋白-未知蛋白发酵液混合和基因工程中表达标签蛋白的混合液混合，37±0.3℃孵育30min，洗涤缓冲液洗3次，分别形成磁珠-目标靶、磁珠-消减靶；再分别加入蛋白封闭液封闭37±0.3℃1h后，去上清，用洗涤缓冲液洗至无泡沫，将分离磁珠中加入pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液，含0.1%的叠氮钠；
融合蛋白发酵混合物：包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞分泌或胞内表达基因工程中表达蛋白发酵液中的一种。
捕捉磁珠是指以环氧基、羧基、NHS磁珠或链霉素琼脂磁珠作为载体，将融合标签蛋白抗体或生物素化的核酸适配体偶联到磁珠上，形成捕捉磁珠。捕捉琼脂磁珠与基因工程中融合蛋白发酵液混合、基因工程中融合蛋白未发酵混合液的体积比分别为1:1。
捕捉琼脂磁珠：琼脂磁珠是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，其结构是核心为超顺磁性粒子，核心外层包裹琼脂聚合物。捕捉琼脂磁珠通过化学偶联生物配体和抗体，形成可捕捉配基和抗原的捕捉磁珠。琼脂磁珠对蛋白和核酸分子类几乎没有吸附作用，并且具有较好的亲水性，可以使生物分子易于靠近并与配体作用，且不会使生物分子丧失活性。琼脂磁珠微粒的制备如下：
以油酸作为分散剂制备Fe3O4磁流体：在氮气保护下，将19.48g FeCl2·4H2O和52.98gFeCl3·6H2O置于烧瓶后溶于600 mL三蒸水，80℃下磁力搅拌并缓慢加入含25% Tween-20的氨水30 mL，80℃磁力搅拌30 min。反应结束后，向悬浮液中缓慢加入30mL油酸，80℃磁力搅拌30 min，用盐酸调节pH至中性，用磁铁分离溶液中的Fe3O4，用三蒸水反复洗去过量的油酸后自然干燥。取3g油酸改性Fe3O4微粒于广口瓶中，加入10 mL三蒸水和120µL Tween-20超声10 min，制备成磁流体，保存于4℃冰箱中备用。
反相聚合包埋法制备琼脂糖磁性微球（AMM）：有机相：在250 mL三口烧瓶中加入2gSpan-80，50mL液体石蜡，预热至80℃。水相：在4mL蒸馏水中加入0.125g琼脂糖，加热溶解后加入1mL自制的磁流体，充分混合。在850 r/min机械搅拌下，迅速将水相滴入有机相，80℃反应10min后冷却至室温，250 r/min搅拌5 min使微球成形。微球用10mL石油醚和1mL异丙醇洗涤、抽滤，之后用石油醚和三蒸水分别清洗2次除去有机相后置于20%乙醇中，制得琼脂糖磁性微球，4℃保存冰箱备用。
所述洗涤缓冲液用于洗去未结合的非特异性分子。洗涤缓冲液采用pH值为7.4的0.01M PBS（含1% Tween-20）。
所述蛋白封闭液是用于是寡核苷酸文库与靶分子充分结合。蛋白封闭液采用pH值为7.4的0.01M PBS，其中含2%蔗糖、1％BSA、1%酪蛋白，4℃保存。
（2）双向消减结合：将ssDNA文库用100µL结合缓冲液溶解，然后在95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却10min；
正向结合：第一轮将ssDNA文库先和磁珠-消减靶37±0.3℃结合1h，磁分离，吸出上清再和磁珠-目标靶37±0.3℃结合1h；从第二轮开始次级文库先与磁珠-目标靶结合后，磁分离，弃上清，重复加入结合缓冲液3次，然后在95℃加热5min，磁分离3次，吸出上清与磁珠-消减靶37±0.3℃结合1h，磁分离，留上清；
反向结合：将磁珠-消减靶视为目标靶，磁珠-目标靶为消减靶，结合过程同正向结合；
结合缓冲液采用pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液（含5nmolMgCl2）。
所述的随机寡核苷酸文库（ssDNA文库）序列为80~150个碱基，其中两端是固定引物，中间是随机序列，如：5’-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-N40-CAAAAGTGCACGCTACT T-TGCTAA-3’，其中：两端分别为上、下游引物，中间40个碱基为随机序列。
（3）洗涤：将结合有靶分子的磁珠用洗涤缓冲液充分摇动洗涤3次以洗去未结合的非特异性分子。洗涤缓冲液采同上。
（4）洗脱：用洗脱缓冲液洗涤结合有靶分子的磁珠3次，磁分离，在磁珠中加入结合缓冲液300µL，然后在95℃加热5min，磁分离，吸取上清，重复加热 3次，收集上清混匀；将上清加入磁珠-消减复合物中37±0.3℃结合1h，磁分离取上清为次级文库。
洗脱缓冲液为3×SSC，用于分离结合在琼脂磁珠上的寡核苷酸分子。1L 3×SSC的配制：25.04g NaCl，12.6g 柠檬酸三钠，加水定容至1L，室温保存。
（5）次级文库的制备：以步骤（4）所得上清为模板DNA，PCR扩增16~20个循环后，得到第一轮筛选产物；再以筛选产物为模板，不对称PCR扩增20~30个循环，取PCR产物进行变性PAGE凝胶电泳，切取单链条带，粉碎，加入洗脱缓冲液，然后在95℃加热5min，3000r/min离心收集上清，重复3次；将上清加入3000Dr 超滤管中，超滤20min，得到ssDNA次级文库（或用链霉亲和素结合负链5’端带有生物素的双链，变性洗脱，磁分离制单链，或酶解双链制备单链方法）。
制备次级文库时，实时荧光定量-PCR对次级文库进行富集检测，实时定量PCR扩增体系为：10×PCR Buffer l0µL，引物P7（25mmol/L）0.4µL，引物P1l（25mmol/L）0.4µL，4种dNTP混合物（每种2.5mmol/L）0.8µL，荧光染料（Super Green I）lµL,Taq DNA聚合酶0.5µL，模板20µL，加超纯水至120µL。实时定量PCR扩增条件：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环。
反向结合：将磁珠-消减靶视为目标靶，磁珠-目标靶为消减靶，结合过程同正向结合；
（6）循环筛选：重复步骤（1）~（5），筛选7~15轮，每轮用实时荧光定量-PCR检测次级库对目标靶和消减靶的结合量，确定富集程度，制备适配体富集文库。
（7）对适配体富集文库进行高通量测序，保证了筛选数据的完整性。
二、基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选试剂盒
包括以下试剂：
试剂1：5~10mL，pH值为7.4的0.01~0.1M PBS，内溶50%粒径5~50nm的琼脂磁珠微粒；
试剂2：结合缓冲液5-10mL，pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液，其中含5nmolMgCl2；
试剂3：洗涤缓冲液5-10mL，pH值为7.4的0.01M PBS，其中含1% Tween-20；
试剂4：蛋白封闭液5 mL，pH值为7.4的0.01M PBS，其中包括2%蔗糖、1% BSA、1%酪蛋白；
试剂5：洗脱缓冲液为3×SSC，1L3×SSC的配制：25.04g NaCl，12.6g 柠檬酸三钠，加水定容至1L，室温保存。
本发明相对现有技术具有以下优点：
1、本发明将纳米磁珠材料、SELEX筛选技术和高通量核酸测序有机结合，无需对表达的粗蛋白进行多次长时间的高速离心及滤膜过滤、无需控制流速、更不需要昂贵的层析设备；ssDNA文库与磁珠-目标靶的特异性结合、洗涤及靶标蛋白的检测变得简单、快速、易操作，同时也提高了核酸适配体筛选基因工程中融合蛋白的高效性、特异性、亲和性；
2、琼脂免疫磁珠具有磁性，可方便简单地进行分离和磁性导向，具有很好的生物相容性、化学稳定性、分散性，非特异性吸附作用小，能保持结合分子的空间结构等特性，外加活性基团，如羧基、环氧基和氨基等活性基团，可以使生物分子易于靠近并与配体作用，且不会使生物分子丧失活性。可机械化完成孵育、结合、分离等步骤，减少了人为操作的误差。
3、细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达基因工程融合蛋白是多种分子混合物，针对这些复合靶标进行消减热循环双向SELEX筛选，可以“盲筛”获得已知或未知靶分子的特异性核酸适配体，从而钓取基因工程中相关融合蛋白，为基因工程中融合蛋白的检测及药物研究提供技术支持。
4、双向消减筛选可有效去除表达融合蛋白和未表达蛋白之间的差异分子，同时获得目标靶和消减靶两个靶标的核酸适配体，极大的提高了筛选效率，有助于特异性融合蛋白的比对分析。从而可以用于检测基因工程中融合蛋白表达情况以及药物研究。
5、常规SELEX方案的经典方法是通过细菌克隆与Sanger测序结合对筛选、富集的ssDNA文库进行分析。然而克隆后测序操作繁琐、周期长、易造成核酸适配体的丢失和不完整。结合高通量核酸测序技术分析和鉴定核酸适配体，具有通量大、精确度高和信息量丰富等优点，可以在短时间内精确定位序列，检测未知序列，并提供更加深入和灵活的研究分析方法，这是传统的研究分析方法无法比拟的。依靠高通量测序技术，可以省时高效的获得信息量丰富的核酸适配体序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明融合蛋白核酸适配体的试剂盒及筛选方法做进一步描述。
一、融合蛋白核酸适配体的试剂盒，包括以下试剂：
试剂1：5~10mL，pH值为7.4的0.01~0.1M PBS，内溶50%粒径5~50nm的琼脂磁珠微粒；
试剂2：结合缓冲液5~10mL，pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液（含5nmol MgCl2）；1L 1×Binding buffer的配制：138mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8.1mmol/L Na2HPO4，1.1mmol/L KH2PO4，5nmol/L MgCl2，用HCl调节溶液的PH值至7.4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20min，室温保存。
试剂3：洗涤缓冲液5~10mL、pH值为7.4的0.01M PBS（含1% Tween-20）。1L 0.01MPBS的配制：8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4 12H2O，0.24g KH2PO4，HCl调节溶液的PH值至7.4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20min，室温保存。
试剂4：蛋白封闭液5mL，pH值为7.4的0.01M PBS，其中含2%蔗糖、1％BSA、1%酪蛋白，4℃保存。
试剂5：洗脱缓冲液为3×SSC，1L3×SSC的配制：25.04g NaCl，12.6g 柠檬酸三钠，加水定容至1L，室温保存。
二、融合蛋白核酸适配体的筛选
实施例1、应用融合蛋白核酸适配体筛选试剂盒筛选大肠杆菌细胞内表达Strep-TagII 的方法
（1）将100µL大肠杆菌融合蛋白表达菌液和100µL未表达蛋白菌液在4℃，12000r/min，离心30min后弃去上清，分别与100µL琼脂磁珠一起37±0.3℃孵育30min，洗涤缓冲液洗1次，加入蛋白封闭液于37±0.3℃封闭1h后，去上清，用洗涤缓冲液洗1次，磁分离，分别得到正筛管（磁珠大肠杆菌融合表达蛋白菌液）和反筛管（磁珠大肠杆菌未表达蛋白菌液）。
（2）正向结合：第一轮筛选时将随机寡核苷酸文库（ssDNA库）用结合缓冲液溶解，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却10min后，加入至反筛管中37±0.3℃结合1h，磁分离，吸出上清加入到正筛管中37±0.3℃结合1h。从第二轮开始次级文库先与正筛管37±0.3℃结合1h，磁分离，弃上清，加入结合缓冲液，95℃加热5min，磁分离，吸出上清与反筛管37±0.3℃结合1h，磁分离，留上清。反向结合：是将磁珠大肠杆菌未表达蛋白菌液作为目标靶，磁珠大肠杆菌融合表达蛋白菌液作为消减靶，结合过程同正向结合。
（3）在正筛管和反筛管中分别加入0.5ml洗涤缓冲液洗磁珠3次后，磁分离，弃上清。
（4）再加入0.5mL洗脱缓冲液洗磁珠3次后，磁分离，在磁珠中加入300μL 结合缓冲液95℃加热5min，磁分离，取上清，重复加热 3次，收集上清混匀。
（5）分别以收集的正筛管和反筛管的上清为模板DNA，PCR扩增16~20个循环后，得到第一轮筛选产物；再以筛选产物为模板，不对称PCR扩增20~30个循环，取PCR产物进行变性PAGE凝胶电泳，切取单链条带，粉碎，加入300μL 洗脱缓冲液 95℃加热5min，3000r/min离心收集上清，重复3次；将收集的上清加入3000Dr 超滤管中，超滤20min，得到大肠杆菌表达融合蛋白和未表达蛋白ssDNA次级文库。并用实时荧光定量-PCR对ssDNA文库进行富集检测。
（6）重复步骤（1）-（5），每轮经过37±0.3℃孵育，95℃变性，14轮循环后，获得大肠杆菌表达融合蛋白和未表达蛋白核酸适配体富集文库。
（7）将大肠杆菌表达融合蛋白和未表达蛋白适配体富集文库进行高通量测序。比对分析测序结果，筛选到大肠杆菌细胞内表达Strep-Tag II融合蛋白核酸适配体。
实施例2、应用融合蛋白核酸适配体筛选试剂盒筛选毕赤酵母表达GST的方法
（1）将100µL毕赤酵母融合蛋白表达菌液和100µL未表达蛋白菌液在4℃，12000r/min，离心30min后弃去上清，分别与100µL琼脂磁珠一起37±0.3℃孵育30min，洗涤缓冲液洗1次，加入蛋白封闭液于37±0.3℃封闭1h后，去上清，用洗涤缓冲液洗1次，磁分离，分别得到正筛管（磁珠毕赤酵母融合表达蛋白菌液）和反筛管（磁珠毕赤酵母未表达蛋白菌液）。
（2）正向结合：第一轮筛选时将随机寡核苷酸文库（ssDNA库）用结合缓冲液溶解，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却10min后，加入至反筛管中37±0.3℃结合1h，磁分离，吸出上清加入到正筛管中37±0.3℃结合1h。从第二轮开始次级文库先与正筛管37±0.3℃结合1h，磁分离，弃上清，加入结合缓冲液，95℃加热5min，磁分离，吸出上清与反筛管37℃结合1h，磁分离，留上清。反向结合：是将磁珠毕赤酵母未表达蛋白菌液作为目标靶，磁珠毕赤酵母融合表达蛋白菌液作为消减靶，结合过程同正向结合。
（3）在正筛管和反筛管中分别加入0.5mL洗涤缓冲液洗磁珠3次后，磁分离，弃上清。
（4）再加入0.5ml洗脱缓冲液洗磁珠3次后，磁分离，在磁珠中加入300μL 结合缓冲液95℃加热5min，磁分离，取上清，重复加热 3次，收集上清混匀。
（5）分别以收集的正筛管和反筛管的上清为模板DNA，PCR扩增16~20个循环后，得到第一轮筛选产物；再以筛选产物为模板，不对称PCR扩增20~30个循环，取PCR产物进行变性PAGE凝胶电泳，切取单链条带，粉碎，加入300μL 洗脱缓冲液 95℃加热5min，3000r/min离心收集上清，重复3次；将收集的上清加入3000Dr 超滤管中，超滤20min，得到毕赤酵母表达融合蛋白和未表达蛋白ssDNA次级文库。并用实时荧光定量-PCR对ssDNA文库进行富集检测。
（6）重复步骤（1）~（5），每轮经过37±0.3℃孵育，95℃变性，14轮循环后，获得毕赤酵母表达融合蛋白和未表达蛋白核酸适配体富集文库；
（7）将毕赤酵母表达融合蛋白和未表达蛋白适配体富集文库进行高通量测序。比对分析测序结果，筛选到毕赤酵母表达GST融合蛋白核酸适配体。
实施例3、应用融合蛋白核酸适配体筛选试剂盒筛选杆状病毒表达His-tag的方法
（1）将100µL杆状病毒融合蛋白表达菌液和100µL未表达蛋白菌液在4℃，12000r/min，离心30min后弃去上清，分别与100µL琼脂磁珠一起37±0.3℃孵育30min，洗涤缓冲液洗1次，加入蛋白封闭液于37±0.3℃封闭1h后，去上清，用洗涤缓冲液洗1次，磁分离，分别得到正筛管（磁珠杆状病毒融合表达蛋白菌液）和反筛管（磁珠杆状病毒未表达蛋白菌液）。
（2）正向结合：第一轮筛选时将随机寡核苷酸文库（ssDNA库）用结合缓冲液溶解，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却10min后，加入至反筛管中37±0.3℃结合1h，磁分离，吸出上清加入到正筛管中37±0.3℃结合1h。从第二轮开始次级文库先与正筛管37±0.3℃结合1h，磁分离，弃上清，加入结合缓冲液，95℃加热5min，磁分离，吸出上清与反筛管37±0.3℃结合1h，磁分离，留上清。反向结合：是将磁珠杆状病毒未表达蛋白菌液作为目标靶，磁珠杆状病毒融合表达蛋白菌液作为消减靶，结合过程同正向结合。
（3）在正筛管和反筛管中分别加入0.5mL洗涤缓冲液洗磁珠3次后，磁分离，弃上清。
（4）再加入0.5ml洗脱缓冲液洗磁珠3次后，磁分离，在磁珠中加入300μL 结合缓冲液95℃加热5min，磁分离，取上清，重复加热 3次，收集上清混匀。
（5）分别以收集的正筛管和反筛管的上清为模板DNA，PCR扩增16~20个循环后，得到第一轮筛选产物；再以筛选产物为模板，不对称PCR扩增20~30个循环，取PCR产物进行变性PAGE凝胶电泳，切取单链条带，粉碎，加入300μL 洗脱缓冲液 95℃加热5min，3000r/min离心收集上清，重复3次；将收集的上清加入3000Dr 超滤管中，超滤20min，得到杆状病毒表达融合蛋白和未表达蛋白ssDNA次级文库。并用实时荧光定量-PCR对ssDNA文库进行富集检测。
（6）重复步骤（1）~（5），每轮经过37±0.3℃孵育，95℃变性，14轮循环后，获得杆状病毒表达融合蛋白和未表达蛋白核酸适配体富集文库；
（7）将杆状病毒表达融合蛋白和未表达蛋白适配体富集文库进行高通量测序。比对分析测序结果，筛选到杆状病毒表达His-tag融合蛋白。

Claims (9)

1.一种基因工程中融合蛋白核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
（1）靶磁珠制备：将捕捉磁珠分别与基因工程中融合表达标签蛋白-未知蛋白发酵液混合和基因工程中表达标签蛋白的混合液混合，37±0.3℃孵育30min，洗涤缓冲液洗3次，分别形成磁珠-目标靶、磁珠-消减靶；再分别加入蛋白封闭液封闭37±0.3℃1h后，去上清，用洗涤缓冲液洗至无泡沫，将分离磁珠中加入pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液，含0.1%的叠氮钠；
（2）双向消减结合：将ssDNA文库用100µL结合缓冲液溶解，然后在95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却10min；
正向结合：第一轮将ssDNA文库先和磁珠-消减靶37±0.3℃结合1h，磁分离，吸出上清再和磁珠-目标靶37±0.3℃结合1h；从第二轮开始次级文库先与磁珠-目标靶结合后，磁分离，弃上清，重复加入结合缓冲液3次，然后在95℃加热5min，磁分离3次，吸出上清与磁珠-消减靶37±0.3℃结合1h，磁分离，留上清；
反向结合：将磁珠-消减靶视为目标靶，磁珠-目标靶为消减靶，结合过程同正向结合；
（3）洗涤：将结合有靶分子的磁珠用洗涤缓冲液充分摇动洗涤3次以洗去未结合的非特异性分子；
（4）洗脱：用洗脱缓冲液洗涤结合有靶分子的磁珠3次，磁分离，在磁珠中加入结合缓冲液300µL，然后在95℃加热5min，磁分离，吸取上清，重复加热 3次，收集上清混匀；将上清加入磁珠-消减复合物中，37±0.3℃结合1h，磁分离取上清为次级文库模板；
（5）次级文库的制备：以步骤（4）所得上清为模板DNA，PCR扩增16~20个循环后，得到第一轮筛选产物；再以筛选产物为模板，不对称PCR扩增20~30个循环，取PCR产物进行变性PAGE凝胶电泳，切取单链条带，粉碎，加入洗脱缓冲液，然后在95℃加热5min，3000r/min离心收集上清，重复3次；将上清加入3000Dr 超滤管中，超滤20min，得到ssDNA次级文库；
（6）循环筛选：重复步骤（1）~（5），筛选7~15轮，每轮用实时荧光定量-PCR检测次级库对目标靶和消减靶的结合量，确定富集程度，制备适配体富集文库；
（7）对适配体富集文库进行高通量测序，保证了筛选数据的完整性。
2.如权利要求1所述基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，融合蛋白发酵混合物，指包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞分泌或胞内表达的蛋白或融合表达标签蛋白等的发酵液中的一种。
3.如权利要求1所述基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，捕捉磁珠是指以环氧基、羧基、NHS磁珠或链霉素琼脂磁珠作为载体，将融合标签蛋白抗体或生物素化的核酸适配体偶联到磁珠上，形成捕捉磁珠。
4.如权利要求1所述基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，蛋白封闭液采用pH值为7.4的0.01M PBS，其中含2%蔗糖、1％BSA、1%酪蛋白，0.5%叠氮钠，4℃保存。
5.如权利要求1所述基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于：步骤（2）中，所述随机寡核苷酸文库序列为80~150个碱基，其中两端是固定引物，中间是随机序列，如：5’-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-N40-CAAAAGTGCACGCTACT T-TGCTAA-3’，其中：两端分别为上、下游引物，中间40个碱基为随机序列。
6.如权利要求1所述基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于：步骤（2）中，结合缓冲液采用pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液。
7.如权利要求1所述基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于：步骤（4）中，洗脱缓冲液为3×SSC，内含NaCl，柠檬酸三钠。
8.如权利要求1所述基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于：各步骤中，洗涤缓冲液采用pH值为7.4的0.01M PBS，含1% Tween-20。
9.基于如权利要求1所述基因工程中融合蛋白核酸适配体筛选方法的试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：
试剂1：5~10mL，pH值为7.4的0.01~0.1M PBS，内溶50%粒径5~50nm的琼脂磁珠微粒；
试剂2：结合缓冲液5-10mL，pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液，其中含5nmolMgCl2；
试剂3：洗涤缓冲液5-10mL，pH值为7.4的0.01M PBS，其中含1% Tween-20；
试剂4：蛋白封闭液5 mL，pH值为7.4的0.01M PBS，其中包括2%蔗糖、1% BSA、1%酪蛋白；
试剂5：洗脱缓冲液为3×SSC，1L3×SSC的配制：25.04g NaCl，12.6g 柠檬酸三钠，加水定容至1L，室温保存。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110885826A (zh) * 2019-10-29 2020-03-17 湖北大学 一种原核表达的cd20核酸适配体、筛选方法及其应用
WO2020087988A1 (zh) * 2018-10-30 2020-05-07 廖世奇 一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒
WO2020087989A1 (zh) * 2018-10-30 2020-05-07 廖世奇 双向消减核酸适配体筛选方法及试剂盒
CN112067802A (zh) * 2019-05-25 2020-12-11 首都师范大学 一种h1n1流感病毒检测方法及其试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102229932A (zh) * 2011-06-03 2011-11-02 湖南大学 可识别hcv e1e2蛋白的核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用
CN103114147A (zh) * 2013-02-28 2013-05-22 上海交通大学 无固定点靶物质的适配体筛选方法
CN106872680A (zh) * 2017-01-06 2017-06-20 秦皇岛拜恩发生物技术有限公司 血清复合靶核酸适配体筛选方法
WO2017218881A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Proximity Biosciences, Llc Method for aptamer pair selection
CN108004246A (zh) * 2017-12-25 2018-05-08 中国人民解放军第四军医大学 利用金属亲和法快速进行液相靶标selex筛选的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109280667A (zh) * 2018-10-30 2019-01-29 廖世奇 双向热循环消减selex快速筛选核酸适配体的方法及试剂盒
CN109321564A (zh) * 2018-10-30 2019-02-12 廖世奇 一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102229932A (zh) * 2011-06-03 2011-11-02 湖南大学 可识别hcv e1e2蛋白的核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用
CN103114147A (zh) * 2013-02-28 2013-05-22 上海交通大学 无固定点靶物质的适配体筛选方法
WO2017218881A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Proximity Biosciences, Llc Method for aptamer pair selection
CN106872680A (zh) * 2017-01-06 2017-06-20 秦皇岛拜恩发生物技术有限公司 血清复合靶核酸适配体筛选方法
CN108004246A (zh) * 2017-12-25 2018-05-08 中国人民解放军第四军医大学 利用金属亲和法快速进行液相靶标selex筛选的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIN XIANG等: "Suppression of FOXM1 Transcriptional Activities via a Single-Stranded DNA Aptamer Generated by SELEX", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
葸玉琴等: "琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIVP24抗原适配体", 《西北师范大学学报（自然科学版）》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020087988A1 (zh) * 2018-10-30 2020-05-07 廖世奇 一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒
WO2020087989A1 (zh) * 2018-10-30 2020-05-07 廖世奇 双向消减核酸适配体筛选方法及试剂盒
CN112067802A (zh) * 2019-05-25 2020-12-11 首都师范大学 一种h1n1流感病毒检测方法及其试剂盒
CN112067802B (zh) * 2019-05-25 2022-09-30 首都师范大学 一种h1n1流感病毒检测试剂盒
CN110885826A (zh) * 2019-10-29 2020-03-17 湖北大学 一种原核表达的cd20核酸适配体、筛选方法及其应用

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