CN102115739B

CN102115739B - 分离核酸的方法、试剂及套组

Info

Publication number: CN102115739B
Application number: CN200910217168.7A
Authority: CN
Inventors: 江佩馨; 巫昆展; 苏钰婷; 林嘉芸; 苏秀卿; 林玉娟
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2029-12-31
Also published as: CN102115739A

Abstract

本发明提供一种简易快速分离核酸的方法。本发明的方法包括提供一核酸分离试剂，将其与含有一或多个核酸的生物样本混和，于一适当反应条件下，可使核酸自生物样本中以单步骤分离出来，不需样本前处理。所述试剂含有1～40wt％的聚乙二醇(PEG)和/或大于30wt％的低分子量醇类、盐类及表面活性剂，通过改变核酸溶解度，使核酸结合至固相载体上而进行分离。此外，本发明另提供一种分离核酸的试剂及套组。

Description

分离核酸的方法、试剂及套组

技术领域

本发明是有关于一种分离核酸的方法，且特别有关于一种单一步骤的核酸分离方法与核酸分离试剂。

背景技术

近年来，分子诊断、药物基因体学、转译医学及刑事鉴定等兴起，各种核酸分析的需求也急速增加，然而，不论要进行何种的核酸分析，首先必须要求高纯度的核酸，以及方便、快速的核酸分离方法。

在进行分析时，由于待测物质在液态样本中存在的时间非常短暂，且样本中的杂质会影响在检测的准确度，因此发展出一种核酸的分离技术，即利用一固相载体结合核酸，或是以管柱内壁作为固相载体，再加入微珠至管柱中，利用微珠结合核酸后再将微珠分离出来。此外，目前也发展出利用磁珠分离核酸的方法，主要是利用磁珠结合核酸，再利用磁性将结合核酸的磁珠分离出来。

随着核酸分离的需求愈来愈频繁，所需操作的样本来源也愈来愈广泛，由于磁性分离技术不需离心或抽真空等步骤，因此可节省处理时间及成本。此外，磁性分离的纯化过程快速、操作方便、因此目前磁性分离已逐渐发展成为主要的核酸分离方法。

目前市面上常见的核酸分离技术主要是先处理复杂样本将核酸释出，再利用固相结合分离核酸，固相分离部分应用Boom Patent(美国第5234809号专利)的Chaotropic Salt(离液盐)将样品中的核酸吸附至硅材料(Silica)上，经过清洗步骤之后，再使用冲提(elution，洗脱)缓冲液将硅材料上的核酸冲洗下来，达到分离核酸的效果。此外，美国第6274386号专利则是应用含硅表面材料的磁性固相载体吸附核酸。

然而，不论如何，所有的核酸分离方法皆需经过溶解(1ysis)、萃取、沉淀、清洗、冲提等5个步骤，其所花费的时间较长、且容易污染。因此，本发明提供一快速且方便的核酸分离方法及试剂(组合物)，可省去传统繁复及耗时的多步骤核酸分离方法。

发明内容

本发明是提供一种分离核酸的方法，该方法包括将一分离试剂与一含有核酸的生物样本混合后，所述分离试剂会使核酸自生物样本中分离出来并结合至一固相载体上，不需样本前处理即可以单步骤分离核酸，其特征在于：使用的分离试剂包括1～40wt％的聚乙二醇(PEG)和/或大于30wt％的低分子量醇类、盐类及表面活性剂，通过改变核酸溶解度结合至固相载体。

本发明另提供一种分离核酸的试剂，该试剂包括1～40wt％的聚乙二醇(PEG)和/或大于30wt％的低分子量醇类、一盐类、一表面活性剂、以及一固相载体。

本发明还提供一种分离核酸的套组，该套组包括一分离试剂，其含有1～40wt％的聚乙二醇(PEG)和/或大于30wt％的低分子量醇类、盐类、表面活性剂、固相载体和/或蛋白质水解酶，以及一容器。

较佳的，本发明中：

所述低分子量醇类的分子量为30～100g/mol。

所述低分子量醇类为乙醇。

所述低分子量醇类的重量浓度为40～60％。

所述聚乙二醇的重量浓度为5～20％。

所述固相载体包括金属、金属氧化物、硅化物或聚合物。

所述固相载体包括磁性物质。

所述盐类包括碱金族、碱土族和/或铵盐卤化物。

所述表面活性剂包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35或CHAPS。

所述试剂还包括一蛋白质水解酶。

所述试剂还包括一糖类。其中所述试剂包括一多糖类或多糖类衍生物。其中所述多糖类包括肝糖、淀粉、低聚糖、葡聚糖、纤维素、琼脂糖、几丁聚糖、黏多糖、肽聚糖。

所述试剂与生物样本的混合反应温度为约50℃～80℃。

所述生物样本与试剂的混合酸碱值为pH 6～9。

所述生物样本包含有一或多个核酸。

所述生物样本包含有细胞物质。

所述生物样本包括原核生物、真菌、病毒、细胞、血液、羊水、脑脊液，或来自皮肤、肌肉、结膜、胎盘或肠胃道的组织及其组织液。

本发明的方法还可包括在所述生物样本与试剂混合后，进行一清洗程序。该方法还包括在所述清洗程序后，进行一冲提程序。

本发明的套组还可包括一清洗缓冲液和/或一冲提缓冲液。其中所述清洗缓冲液可去除盐类及蛋白质。其中所述冲提缓冲液可将核酸由固相载体上冲洗下来。

本发明的套组中，所述容器用于盛装分离试剂。

为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特列举较佳实施例，并配合附图，作详细说明。

附图说明

图1为DNA琼胶电泳分析。

具体实施方式

本发明是提供一种分离及/或纯化核酸的方法。在本发明的方法中，将一分离试剂与一生物样本混合及反应后可分离出生物样本中的核酸。

在一实施例中，本发明的分离试剂包括1～40wt％的聚乙二醇(PEG)，较佳为5～20wt％的聚乙二醇。

在另一实施例中，本发明的分离试剂包括大于30wt％的低分子量醇类，较佳为40～60wt％的低分子量醇类，其中低分子量醇类的分子量为约30～100g/mol。在一实施例中，低分子量醇类为乙醇。

在另一实施例中，本发明的分离试剂可同时包括聚乙二醇及低分子量醇类。

本发明的分离试剂更包括一盐类、一表面活性剂、一蛋白质水解酶、以及一固相载体。

本发明所述的盐类可为任何适用于分子生物实验的盐类，包括一碱金族或碱土族及/或胺盐，例如，Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺、Cs⁺、Fr⁺、Gu⁺(guanidine)、Be²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Ra²⁺和/或NH₄ ⁺。在一实施例中，本发明的盐类可包括一卤族元素，特别为Cl^-。一般来说，常用的盐类为Gu-HCl(guanidinehydrochloride)、LiCl、NaCl、Tris-HCl、Gu-SCN(guanidine thiocyanate)或其类似物。

本发明所述的表面活性剂可为离子型表面活性剂、两性表面活性剂或非离子型表面活性剂，其中较佳为非离子型表面活性剂与两性表面活性剂，非离子型表面活性剂的种类并无特别限制，较佳为聚氧化乙烯类(polyoxyethylene)的非离子型表面活性剂，如Tween-20(吐温20)、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、NP40(壬基酚聚氧乙烯醚)或Brij35(聚氧乙烯月桂醚)等。非离子表面活性剂的使用量或浓度不限制，例如，可为0.01％至40％，较佳为5％至20％，两性表面活性剂的种类并无特别限制，较佳为CHAPS(3-{(3-cholamidopropyl)dimethylammonio}-propanesulfonate，3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，两性表面活性剂的使用量或浓度不限制，例如可为0.01％至20％，较佳为1％至10％。

本发明所述的蛋白质水解酶，可为任何具有水解蛋白质功效的物质，例如嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶(bromelain)、碱性水解蛋白酶(Alcalase)、蛋白酶K(Protease K)、风味蛋白酶(Flavorzyme)或碱性益瑞蛋白酶(Esperase)等，较佳为蛋白酶K(Protease K)。

本发明所述的分离试剂可添加多糖类(polysaccharides)，包括肝糖(glycogen)、淀粉(starch)、低聚糖(oligosaccharides)、葡聚糖(dextran)、纤维素(cellulose)、琼脂糖(agarose)、几丁聚糖(chitosan)、黏多糖(mucopolysaccharides)、或肽聚糖(peptidoglycan)，可增加小分子核酸与固相载体的结合能力，提高核酸产率及纯度。

本发明所述的生物样本为一种含有核酸的生物样本。本发明的生物样本并无特别限制，可为任何具有核酸、染色体和/或质体的样本。在一实施例中，本发明的生物样本可为真菌、原核生物(细菌)、病毒、动物细胞或植物细胞。在另一实施例中，本发明的生物样本可为动物的血液、羊水、脑脊液、或来自皮肤、肌肉、口腔黏膜、胎盘、肠胃道或其它器官的组织液。应注意的是，本发明的生物样本不需经由任何前处理，可直接与分离试剂反应，即可分离出所需要的核酸。

本发明所述的核酸可为任何天然或人工合成的DNA或RNA分子，包括单链DNA分子、双链DNA分子、RNA、LNA、PNA、核酸-蛋白质复合体和/或核酸-糖类复合体等。

本发明的分离试剂与生物样本混合后，于一适当的条件下进行一反应步骤。反应步骤的温度可为室温、50℃～80℃，较佳为60～70℃；pH值可为6～9，较佳为7～8，反应时间可为5～30分钟，较佳为10～20分钟，最佳为15分钟。应注意的是，生物材料可直接与本发明的分离试剂反应，而不须进行任何的前处理。

加入分离试剂后，若生物样本为含有细胞型态的复杂生物样本或全血检体，分离试剂可使细胞破裂释出核酸，且样本中的核酸会因为溶解度改变而被分离出来，不需事先进行样本离心、细胞分离、细胞溶裂等前处理步骤。本领域的技术人员可选用任何适合的方法进一步纯化核酸，例如：分离的核酸可利用酒精清洗来得到更高纯度的核酸。

在另一实施例中，分离的核酸可与固相载体结合后，再冲提出来。本发明的分离试剂除了会改变核酸的溶解度外，也会改变核酸的结构，使核酸更易于贴覆在固相载体上，以达到分离的目的。

本发明的固相载体可为一种磁性物质、金属、金属氧化物、硅化物、聚合物。固相载体的表面可以化学键修饰。在一较佳实施例中，固相载体的表面具有糖类(碳氢化合物)，例如，纤维素、硝化纤维素、葡聚糖或其类似物。在另一实施例中，固相载体的表面具有一疏水基团，例如，C₁～C₃₀烷基或C₅～C₃₀芳基等。在另一实施例中，固相载体的表面可具有一亲水基团，例如，羟基、羰基、羧基、酯类、胺基、硫基等。

此外，在反应步骤后，可依序进行一清洗程序及冲提程序。

清洗程序包括加入一清洗缓冲液，以移除多余的盐类及蛋白质。本发明所述的清洗缓冲液可为任何适合的清洗缓冲液，其主要为移除核酸上的蛋白质、聚糖类、脂质或细胞碎片。一般来说，清洗缓冲液可包含醇类及盐类，醇类可为乙醇或聚乙二醇。盐类可为低于3M的氯化钠或其类似物。一般来说，清洗缓冲液的体积及清洗次数以足以移除杂质(蛋白质、聚糖类、脂质或细胞碎片)，但不影响核酸产量为佳。

在清洗程序后可进行一冲提程序。冲提程序包括加入一冲提缓冲液将核酸由固相载体上冲提出来。冲提缓冲液可为水、TE、TAE或TBE或其类似物。

本发明的分离和/或纯化核酸的方法使用单一试剂，以单一步骤完成，可快速、简便地获得高纯度及高产量的核酸。更重要的是，生物样本不需经由任何前处理，可直接与分离试剂反应，即可分离出所需要的核酸。

本发明另提供一种核酸的分离试剂，至少包括1～40wt％的聚乙二醇(PEG)及/或大于30wt％的低分子量醇类。

本发明的分离试剂可进一步包括上述的盐类、表面活性剂、固相载体和/或蛋白质水解酶。

本发明还提供一种分离核酸的套组，包括一分离试剂，其含有1～40wt％的聚乙二醇(PEG)和/或大于30wt％的低分子量醇类、盐类、表面活性剂及固相载体、一清洗缓冲液、一容器，以及一使用说明书。

【实施例】

1.全血的核酸分离

在此实施例中使用的分离试剂含有不同浓度的PEG(0％、5％、10％、15％、20％、30％)、盐类为3M胍盐酸盐(Gu-HCl)、表面活性剂为5％Tween-20及0.5μg的磁性固相载体，并含有蛋白质水解酶及6M尿素。

取720μl的本发明分离试剂直接与200μl的人类全血混合，于56℃下，反应10分钟后，可将核酸分离结合至磁性固相载体上，去除水溶液后，以清洗缓冲液加以洗涤，最后加入200μl无菌去离子水冲堤10分钟后将磁性固相载体上冲提出来的核酸做分析。此实施例使用的清洗缓冲液为70％EtOH。

由表一可知，本发明的分离方法不需前处理全血样本中的红血球，可有效地直接将DNA由全血中分离出来，可自200μl的人类全血中分离出约1～3μg DNA，纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)约为1.3～1.6。

表一、DNA分离的效果

PEG浓度(％)	DNA分离量(μg)	DNA纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)
			0	0.73	1.31
5	1.68	1.55
			10	3.21	1.62
15	2.85	1.46
			20	2.12	1.35
30	1.03	1.26

另外，在分离试剂中使用不同浓度的乙醇(40％、50％及60％)、盐类为3M胍盐酸盐(Gu-HCl)、表面活性剂为5％Tween-20及0.5μg的磁珠作为固相载体，并含有蛋白质水解酶及6M尿素，清洗缓冲液为70％的EtOH。可自200μl的人类全血分离出约2μg DNA，纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)约为1.3～1.6。

2.全血及血浆的核酸分离

在此实施例中使用的分离试剂含有10％的PEG、盐类为6M胍盐酸盐、表面活性剂为10％Tween-20，以及0.5μg的磁性固相载体、蛋白质水解酶及6M的尿素。

取720μl的本发明分离试剂直接与200μl的人类全血或离心分离后的血浆混合，于56℃下，反应10～15分钟后，可将核酸分离结合至磁性固相载体上，去除水溶液后，以清洗缓冲液加以洗涤，最后加入200μl无菌去离子水冲堤10分钟后将磁性固相载体上冲提出来的核酸做分析。此实施例使用的清洗缓冲液为70％的EtOH。

实施例的对照组中，以市售的Promega公司的MegaZorb试剂套组作为正对照组，代表传统的分离方法，即包括溶解(lysis)、萃取、沉淀、清洗、冲提等5个步骤。将所分离的DNA进行分析，其结果如表二所示。结果显示本发明的分离试剂在全血样本或经过离心前处理的血浆样本，皆可由200μl样本纯化出DNA约5μg，纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)约为1.89，本发明的分离试剂可直接用于复杂样本纯化核酸，不需离心的样本前处理。

表二、DNA分离的效果

在另一实施例中，使用相同的分离试剂，并以市售的Promega公司的MegaZorb试剂套组作为正对照组。每次实验重复3次。

由表三结果可知，本发明的分离试剂及方法可有效地直接将DNA由全血中分离出来，且其分离效果与市售产品相当，200μl全血样本可分离出DNA量约5μg，此以本发明分离试剂所分离的DNA具有较高的纯度，且重复误差较小，纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)约为1.9±0.051，纯化的核酸样本可应用于聚合酶反应分析(Polymerase Chain Reaction，PCR)。

表三、DNA分离的效果

在另一个实施例中，本发明的分离试剂可在室温下反应，可有效地直接将DNA由全血中分离出来，且200μl全血样本可分离出DNA量约4μg，纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)约为1.7。

3.细胞的核酸分离

在此实施例中使用的分离试剂含有10％的PEG、盐类为6M胍盐酸盐(Gu-HCl)、表面活性剂为10％Tween-20及0.5μg的磁性固相载体，并含有蛋白质水解酶及6M尿素。

取720μl的本发明分离试剂直接与200μl的CT26小鼠大肠癌细胞株混合，细胞总数约为8×10⁵cells/ml，于56℃下，反应10分钟后，可将核酸分离结合至磁性固相载体上，去除水溶液后，以清洗缓冲液加以洗涤，最后加入200μl的无菌去离子水冲堤10分钟后，分析由磁性固相载体上所冲提出来的核酸。此实施例使用的清洗缓冲液为70％的EtOH。其结果如表四所示。在此实施例中，以市售的Promega公司的MegaZorb试剂套组作为正对照组。

由结果可知，本发明的分离试剂及方法可有效地直接将DNA由细胞中分离出来，约可由10⁵细胞纯化出约7μg的DNA，纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)高于1.8。

表四、DNA分离的效果

将上述由细胞所萃取的核酸样本直接进行DNA琼胶电泳分析，其结果如图1所示。本发明的试剂与MegaZorb皆显示高分子量的DNA亮带(泳道1：由MegaZorb萃取出的核酸；泳道2～3：由本发明的试剂萃取出的核酸；泳道4：1Kb DNA marker)。由电泳结果可知本发明的分离试剂及方法可直接分离细胞中的DNA，且其分离DNA具有高产率及高纯度。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰。

Claims

1.一种分离核酸的方法，该方法包括：

将一分离试剂与一含有核酸的生物样本混合后，所述分离试剂会使核酸自生物样本中分离出来并结合至包含于所述分离试剂中的一固相载体上，其特征在于：

所述分离试剂是由1～40wt%的聚乙二醇和/或重量浓度为40～60%的乙醇、一胍盐酸盐、一表面活性剂、蛋白质水解酶、尿素及所述固相载体所组成，其通过改变核酸的溶解度使核酸结合至所述固相载体。

2.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述聚乙二醇的重量浓度为5～20%。

3.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述固相载体包括金属、金属氧化物、硅化物或聚合物。

4.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述固相载体包括磁性物质。

5.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述表面活性剂包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35或CHAPS。

6.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述试剂与生物样本的混合反应温度为50℃～80℃。

7.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述生物样本与试剂的混合酸碱值为pH6～9。

8.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述生物样本包含有一或多个核酸。

9.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述生物样本包含有细胞物质。

10.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其中所述生物样本包括原核生物、真菌、病毒、细胞、血液、羊水、脑脊液，或来自皮肤、肌肉、结膜、胎盘或肠胃道的组织及其组织液。

11.如权利要求1所述的分离核酸的方法，该方法还包括在所述生物样本与试剂混合后，进行一清洗程序。

12.如权利要求11所述的分离核酸的方法，该方法还包括在所述清洗程序后，进行一冲提程序。

13.一种分离核酸的试剂，该试剂是由1～40wt%的聚乙二醇和/或重量浓度为40～60%的乙醇、一胍盐酸盐、一表面活性剂、蛋白质水解酶、尿素以及一固相载体所组成。

14.如权利要求13所述的分离核酸的试剂，其中所述聚乙二醇的重量浓度为5～20wt%。

15.如权利要求13所述的分离核酸的试剂，其中所述表面活性剂包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35或CHAPS。

16.如权利要求13所述的分离核酸的试剂，其中所述固相载体包括金属、金属氧化物、硅化物或聚合物。

17.如权利要求13所述的分离核酸的试剂，其中所述固相载体包括磁性物质。

18.一种分离核酸的套组，该套组包括：

一试剂，其是由1～40wt%的聚乙二醇和/或重量浓度为40～60%的乙醇、一胍盐酸盐、一表面活性剂、蛋白质水解酶、尿素以及一固相载体所组成；以及

一容器。

19.如权利要求18所述的分离核酸的套组，其中所述聚乙二醇的重量浓度为5～20wt%。

20.如权利要求18所述的分离核酸的套组，其中所述表面活性剂包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35或CHAPS。

21.如权利要求18所述的分离核酸的套组，其中所述固相载体包括金属、金属氧化物、硅化物或聚合物。

22.如权利要求18所述的分离核酸的套组，其中所述固相载体包括磁性物质。

23.如权利要求18所述的分离核酸的套组，其中该套组还包括一清洗缓冲液和/或一冲提缓冲液。

24.如权利要求23所述的分离核酸的套组，其中所述清洗缓冲液可去除盐类及蛋白质。

25.如权利要求23所述的分离核酸的套组，其中所述冲提缓冲液可将核酸由固相载体上冲洗下来。

26.如权利要求18所述的分离核酸的套组，其中所述容器用于盛装分离试剂。