CN112625946A

CN112625946A - 枯草芽孢杆菌、微生态制剂、饲料及其在提高种母鸡生产性能和蛋壳质量中的应用

Info

Publication number: CN112625946A
Application number: CN202011476999.9A
Authority: CN
Inventors: 刘慧�; 张红星; 谢远红; 金君华
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112625946B

Abstract

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌、微生态制剂、饲料及其在提高种母鸡生产性能和蛋壳质量中的应用，涉及生物技术领域。本发明提供的枯草芽孢杆菌Liu‑c1，来源于传统干酪，发明人将枯草芽孢杆菌Liu‑c1作为微生态制剂添加入种母鸡日粮中研究发现，种母鸡产蛋率提高5.63％、种蛋合格率提高9.15％，料蛋比降低4.09％；改善蛋壳超微结构，蛋壳厚度增加3.67％，蛋壳强度增加17.21％，蛋壳钙含量增加2.34％；并且种母鸡血清、胫骨和子宫部的钙含量分别增加11.62％、5.06％和19.63％，提高子宫部有关蛋壳形成过程中参与钙转运、钙化的基因相对表达量。

Description

枯草芽孢杆菌、微生态制剂、饲料及其在提高种母鸡生产性能和蛋壳质量中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种枯草芽孢杆菌、微生态制剂、饲料及其在提高种母鸡生产性能和蛋壳质量中的应用。

背景技术

我国是目前世界最大的鸡蛋生产国和消费国，2019年我国蛋鸡总存栏量约14.54亿只，鸡蛋产量在3000万t以上，占全球产量的46％。蛋鸡的产蛋周期一般为17～72周龄，46周龄时开始进入产蛋后期，此阶段的蛋鸡由于长期进行产蛋活动，不仅生产性能下降，且生殖腔逐渐变大，种蛋内容物逐渐增加，蛋壳逐渐变薄，蛋壳质量也受到严重影响。据统计，在商业化的蛋鸡养殖生产中，产蛋后期阶段中产生蛋壳质量(破壳蛋、软壳蛋、畸形蛋)问题的鸡蛋数目较产蛋高峰期增加了20％，每年因此造成的经济损失高达5亿元人民币。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种枯草芽孢杆菌Liu-c1，于2020年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20840。

本发明的第二目的在于提供一种枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵方法，该发酵方法简单，效率高。

本发明的第三目的在于提供一种微生态制剂，包括枯草芽孢杆菌Liu-c1。

本发明的第四目的在于提供一种微生态制剂的使用方法。

本发明的第五目的在于提供一种饲料，包括枯草芽孢杆菌Liu-c1或者上述微生态制剂。

本发明的第六目的在于提供一种枯草芽孢杆菌Liu-c1及其菌剂或者饲料在提高产蛋后期种母鸡生产性能和蛋壳质量中的应用。

第一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌Liu-c1，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20840。

第二方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌Liu-c1接种于培养基中进行培养。

作为进一步技术方案，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵条件至少满足如下一种：发酵温度37-45℃、发酵时间12-16h、pH 6.5-7.5。

优选地，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵条件至少满足如下一种：发酵温度45℃、发酵时间16h、pH 6.5。

作为进一步技术方案，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1的培养基组分包括：胰蛋白胨5.0-20.0g/L、酵母浸粉2.5-20g/L、葡萄糖1-10g/L和氯化钠0-5.0g/L。

优选地，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1的培养基组分包括：胰蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉10g/L、葡萄糖10g/L和氯化钠2.5g/L。

第三方面，本发明提供了一种微生态制剂，包括枯草芽孢杆菌Liu-c1。

作为进一步技术方案，还包括副干酪乳杆菌KL1；

所述副干酪乳杆菌KL1于2015年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11533；

优选地，所述微生态制剂中枯草芽孢杆菌Liu-c1和副干酪乳杆菌KL1的菌量比例为(1-2):(1-2)，优选为，1:1。

作为进一步技术方案，所述微生态制剂的使用剂量为10⁷～10⁸CFU/只·天，优选为6.0×10⁷～8.0×10⁷CFU/只·天。

第四方面，本发明提供了一种微生态制剂的使用方法，包括如下步骤：将微生态制剂用麦芽糊精稀释并混匀后溶于水，然后喷洒至饲料表面即食。

第五方面，本发明提供了一种饲料，包括枯草芽孢杆菌Liu-c1和/或微生态制剂。

第六方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌Liu-c1、微生态制剂或者饲料在提高产蛋后期种母鸡生产性能中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的枯草芽孢杆菌Liu-c1，来源于传统干酪，发明人将枯草芽孢杆菌Liu-c1作为微生态制剂添加入母鸡日粮中研究发现，在对种母鸡的平均体重、平均蛋重、蛋形指数、蛋黄颜色和哈氏单位等性能指标皆无影响的前提下，母鸡产蛋率提高5.63％、种蛋合格率提高9.15％，料蛋比降低4.09％；改善蛋壳超微结构，蛋壳厚度增加3.67％，蛋壳强度增加17.21％，蛋壳钙含量增加2.34％；并且种母鸡血清、胫骨和子宫部的钙含量分别增加11.62％、5.06％和19.63％，提高子宫部有关蛋壳形成过程中参与钙转运、钙化的基因相对表达量。因此，本发明提供的枯草芽孢杆菌Liu-c1能够用于提高产蛋后期种母鸡生产性能和蛋壳质量中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为蛋壳外表面超微结构扫描电镜图(800×)，A为空白组，B为KL1组，C为Liu-c1组，D为复合组；

图2为蛋壳内表面超微结构扫描电镜图(2000×)，A为空白组，B为KL1组，C为Liu-c1组，D为复合组；

图3为蛋壳横断面超微结构扫描电镜图(500×)，A为空白组，B为KL1组，C为Liu-c1组，D为复合组。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌Liu-c1，该菌株的分类命名为：枯草芽孢杆菌Liu-c1，拉丁文学名：Bacillus subtilis Liu-c1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年9月29日，保藏编号：CGMCC No.20840。

本发明的枯草芽孢杆菌Liu-c1分离筛选自传统干酪中。本发明的枯草芽孢杆菌Liu-c1为革兰氏阳性菌，菌体两端钝圆、芽孢位于菌体中央和近中央、周生鞭毛、无荚膜；菌落特征为表面干燥粗糙、边缘不规则、有波纹、无光泽、不透明、灰白色。

第二方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌Liu-c1接种于培养基中进行培养；

在一些优选的实施方式中，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵条件至少满足如下一种：发酵温度37-45℃、发酵时间12-16h、pH 6.5-7.5。

在本发明中，枯草芽孢杆菌Liu-c1发酵的温度典型但非限制性地为37℃、39℃、41℃、43℃或45℃；发酵时间典型但非限制性地为12h、13h、14h、15h或16h；pH典型但非限制性地为6.5、6.7、6.9、7.1、7.3或7.5。枯草芽孢杆菌Liu-c1在上述条件下能够较好的进行发酵。

通过对枯草芽孢杆菌Liu-c1发酵条件的进一步优化和调整，得到其最佳发酵条件为发酵温度45℃、发酵时间16h和pH 6.5。

在一些优选的实施方式中，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1的培养基组分包括：胰蛋白胨5.0-20.0g/L、酵母浸粉2.5-20g/L、葡萄糖1-10g/L和氯化钠0-5.0g/L。

在本发明中，培养基中胰蛋白胨的浓度典型但非限制性地为5.0g/L、10.0g/L、15.0g/L或20.0g/L；酵母浸粉的浓度典型但非限制性地为2.5g/L、5g/L、10g/L、15g/L或20g/L；葡萄糖的浓度典型但非限制性地为1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L或10g/L；氯化钠的浓度典型但非限制性地为0g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L或5.0g/L。

通过对枯草芽孢杆菌Liu-c1培养基组分的进一步优化和调整，得到培养基的最佳组分配比。

第三方面，本发明提供了一种微生态制剂，包括但不限于枯草芽孢杆菌Liu-c1。

本发明提供的微生态制剂，包括本发明的枯草芽孢杆菌Liu-c1，或者枯草芽孢杆菌Liu-c1与辅料或者其他菌的混合，例如，可以是本发明的枯草芽孢杆菌Liu-c1与其他的菌混合制备的菌剂，也可以是本发明的枯草芽孢杆菌Liu-c1与辅料制备得到的菌剂。

发明人将枯草芽孢杆菌Liu-c1作为微生态制剂添加入种母鸡日粮中研究发现，在对种母鸡的平均体重、平均蛋重、蛋形指数、蛋黄颜色和哈氏单位等性能指标皆无影响的前提下，种母鸡产蛋率提高5.63％、种蛋合格率提高9.15％，料蛋比降低4.09％；改善蛋壳超微结构，蛋壳厚度增加3.67％，蛋壳强度增加17.21％，蛋壳钙含量增加2.34％；并且种母鸡血清、胫骨和子宫部的钙含量分别增加11.62％、5.06％和19.63％，提高子宫部有关蛋壳形成过程中参与钙转运、钙化的基因相对表达量。

在一些优选的实施方式中，还包括副干酪乳杆菌KL1；

所述副干酪乳杆菌KL1，分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，该菌株的分类命名为：副干酪乳杆菌KL1，拉丁文学名：Lactobacillus paracaseiKL1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年10月22日，保藏编号：CGMCC No.11533。

发明人将枯草芽孢杆菌Liu-c1和副干酪乳杆菌KL1作为微生态制剂添加入种母鸡日粮中研究发现，在对种母鸡的平均体重、平均蛋重、蛋形指数、蛋黄颜色和哈氏单位等性能指标皆无影响的前提下，种母鸡产蛋率提高8.84％、种蛋合格率提高14.43％，料蛋比降低5.45％；改善蛋壳超微结构，蛋壳厚度增加8.33％，蛋壳强度增加31.82％，蛋壳钙含量增加2.91％；并且种母鸡血清、胫骨和子宫部的钙含量分别增加26.10％、9.64％和60.37％，提高子宫部有关蛋壳形成过程中参与钙转运、钙化的基因相对表达量。因此，本发明提供的枯草芽孢杆菌Liu-c1能够用于提高产蛋后期种母鸡生产性能和蛋壳质量中。

优选地，所述微生态制剂中枯草芽孢杆菌Liu-c1和副干酪乳杆菌KL1的菌量比例为(1-2):(1-2)，例如可以为但不限于1:1、1:2或2:1，优选为，1:1。

在一些优选的实施方式中，所述微生态制剂的使用剂量为10⁷～10⁸CFU/只·天，例如可以为但不限于1.0×10⁷CFU/只·天、2.0×10⁷CFU/只·天、4.0×10⁷CFU/只·天、6.0×10⁷CFU/只·天、8.0×10⁷CFU/只·天或1.0×10⁸CFU/只·天，优选为6.0×10⁷～8.0×10⁷CFU/只·天。

在本发明中，通过对微生态制剂的使用量以及复合微生态制剂中两种菌的配比进行进一步优化和调整，能够更好的提高产蛋后期种母鸡生产性能和蛋壳质量。

本发明的使用方法操作简单易行，能保证所有种母鸡同时快速摄入微生态制剂，可避免微生态制剂在使用过程中活菌数量的损失，确保微生态制剂的有效摄入。

例如一种可行的实施方法为：将本发明的微生态制剂使用麦芽糊精稀释并混匀，得到活菌数为8.0×10⁸CFU/g的微生态制剂预混料，然后按照1万只鸡饲用1kg微生态制剂的剂量准确称取微生态制剂预混料，再将1kg微生态制剂溶于35kg家禽饮用水得到微生态制剂预混料稀释液，最后将各组微生态制剂预混料稀释液均匀喷洒于种母鸡料槽内的饲料表面，此时表面的湿润含菌饲料一般在10min内即可被种母鸡食用完毕。

本发明提供的饲料，包括本发明的枯草芽孢杆菌Liu-c1或微生态制剂与营养物质的混合，例如，可以是本发明的枯草芽孢杆菌Liu-c1与营养物质混合得到的饲料，也可以是本发明的微生态制剂与营养物质混合得到的饲料。该饲料具有本发明枯草芽孢杆菌Liu-c1或微生态制剂的所有有益效果。

需要说明的是，“和/或”的含义为，饲料中可以包括枯草芽孢杆菌Liu-c1，可以包括微生态制剂，也可以包括枯草芽孢杆菌Liu-c1和微生态制剂。

第六方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌Liu-c1、微生态制剂或者饲料在提高产蛋后期种母鸡生产性能和蛋壳质量中的应用。

发明人试验发现，本发明的枯草芽孢杆菌Liu-c1、微生态制剂或者饲料，在对种母鸡的平均体重、平均蛋重、蛋形指数、蛋黄颜色和哈氏单位等性能指标皆无影响的前提下，具有提高其产蛋率、种蛋合格率，降低料蛋比，改善蛋壳超微结构，增加血清、胫骨和子宫部的钙含量，提高子宫部有关蛋壳形成过程中参与钙转运、钙化的基因相对表达量，促进蛋壳钙沉积，增加蛋壳厚度，增强蛋壳强度等作用，因此，能够用于提高产蛋后期种母鸡生产性能与蛋壳质量中。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

如无特殊说明，本发明所用的种母鸡均为饲养条件一致、体重无显著性差异的54周龄“京红1号”父母代种母鸡，选自北京市华都峪口禽业有限责任公司。

基础日粮由北京市华都峪口禽业有限责任公司提供，其组成及营养水平如表1所示。

表1基础日粮的组成及营养水平(风干基础)

1)预混料可为每千克日粮提供：铁65mg、铜10mg、锌101mg、锰90mg、维生素A9975IU、维生素VD3 4970IU、维生素E 80IU、核黄素10mg、烟酸50.1mg、泛酸钙18mg、维生素B₁₂ 0.03mg、生物素0.4mg、氯化胆碱450mg。

2)代谢能为计算值，其余为实测值。

主要试剂包括：(1)PCA培养基：胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1g，pH 7.0±0.2，蒸馏水1 000mL。以上配方为液体培养基，在此基础上加17g琼脂粉即为固体培养基。

(2)蛋白质琼脂培养基(用于检验蛋白质分解菌)：

A液：脱脂乳粉50g，蒸馏水500mL。

B液：可溶性淀粉10g，酵母浸粉5.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄ 0.2g。

琼脂粉17g，蒸馏水500mL，pH7.0～7.6。

A液、B液分别配制，0.07MPa灭菌20min，使用时1:1混合即可。

(3)淀粉琼脂培养基(用于检验淀粉水解菌)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂17g，pH7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa灭菌15～20min。

(4)改良MRS培养基(用于培养副干酪乳杆菌KL1菌株)：胰蛋白胨5.00g，酸水解酪蛋白5.00g，牛肉膏10.00g，酵母浸粉5.00g，磷酸二氢钾2.00g，柠檬酸三钠2.00g，乙酸钠2.00g，葡萄糖20.00g，七水合硫酸镁0.58g，四水合硫酸锰0.25g，吐温-80 1.00mL，pH 6.5±0.2，加蒸馏水至1000mL，以上配方为液体培养基，在此基础上加17g琼脂即为固体培养基。

(5)改良PCA培养基(用于培养枯草芽孢杆菌Liu-c1菌株)：胰蛋白胨10.00g，酵母浸粉10.00g，葡萄糖10.00g，氯化钠2.50g，pH 6.5±0.2，加蒸馏水至1000mL，以上配方为液体培养基，在此基础上加17g琼脂即为固体培养基。

(6)微生态制剂保护剂：5.5％(质量体积百分数)脱脂乳粉，14.5％(质量体积百分数)麦芽糊精，0.07Mpa灭菌20min后立即从灭菌锅中取出，以防止保护剂发生褐变而影响保护效果。

实施例1枯草芽孢杆菌Liu-c1微生态制剂制备

(1)枯草芽孢杆菌的筛选

无菌称取1.0g传统干酪样品，放入装有99mL含0.1％吐温生理盐水的无菌均质袋中，混匀并排气密封。用拍击式匀浆器(SCIENTZ-11，宁波新芝生物科技股份有限公司)以6T/S拍打20min，使样品充分溶解，得到样品稀释液。取样品稀释液1mL以10倍梯度递增稀释，得到多个浓度样品稀释菌液。选取3～4个不同浓度样品稀释液各100μL，采用涂布法接种于PCA培养基平板上，于37℃培养24h后，挑取平板上菌落特征为表面干燥粗糙、边缘不规则、有波纹、无光泽、不透明、灰白色的单菌落，再连续三次涂布接种于PCA平板上，进一步分离培养目标菌株。从PCA平板上挑取1环目标菌株单菌落划线接种于PCA斜面试管培养基中，37℃培养24h后，革兰氏染色镜检菌株纯度，将纯粹的目标菌株于4℃冰箱保种备用。

(2)产蛋白酶和淀粉酶枯草芽孢杆菌的筛选

将上述筛选得到的目标菌株斜面培养物接种于100mL PCA液体培养基中，于37℃培养18h后，以6000rpm离心5min，取其上清液，以无菌200μL移液枪取10μL上清液分别点接种于蛋白质琼脂培养基平板和淀粉琼脂培养基平板表面，蛋白质琼脂培养基平板于45℃培养2d后，分别测量菌落周围透明圈和菌落的直径，计算各菌株透明圈直径与菌落圈直径的差值，比较各菌株差值大小；淀粉琼脂培养基平板于45℃培养12h后，将平皿盖打开，滴入少量鲁格尔碘液于培养基表面，轻轻旋转平皿，使碘液均匀分布整个平板，分别测量菌落周围透明圈和菌落的直径，计算各菌株透明圈直径与菌落圈直径的差值，比较各菌株差值大小。结果如表2所示。

表2枯草芽孢杆菌蛋白酶和淀粉酶检验结果

由表2枯草芽孢杆菌蛋白酶和淀粉酶检验结果可见，与Liu-c2和Liu-c6菌株相比，Liu-c1菌株不仅蛋白酶分解透明圈与菌落圈直径的差值最大，而且淀粉酶水解透明圈与菌落圈直径的差值亦最大。表明Liu-c1菌株分泌的蛋白酶和淀粉酶的产量较高，可成为制备微生态制剂的优良菌株。

(3)Liu-c1菌株的菌落特征、形态学鉴定与分子生物学鉴定

将上述筛选出的Liu-c1优良菌株划线接种至PCA培养基平板上，37℃培养24h，观察其菌落特征并挑取单菌落进行革兰氏染色后，于光学显微镜下观察其细胞形态。菌落特征为表面干燥粗糙、边缘不规则、有波纹、无光泽、不透明、灰白色。形态学观察Liu-c1菌株为革兰氏阳性菌，菌体两端钝圆、芽孢位于菌体中央和近中央、周生鞭毛、无荚膜。

挑取上述Liu-c1菌株平板上的单菌落接种至10mL PCA液体培养基中，转速为180rpm，37℃培养18h，于4℃以8000rpm离心2min，弃上清液，取菌泥，采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒[生工生物(上海)工程股份有限公司]提取枯草芽孢杆菌的DNA，以细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3′(SEQ ID No.1)；

下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID No.2)。

对所得PCR产物外送测序[生工生物(上海)工程股份有限公司]，核苷酸序列信息如SEQ ID No.3所示：

GGGTGTGGCGGCTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCCTGTCCTGAAAGTTGGGTTAGTCCCCAACGAGCGAACCCTTGATTTTATTGCCGCATTCAGTTGGGCACCTAAGGTACTGCCGGTGAAACTTCTGTAACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCTAACACAGAGCTTTACGATCGAAAACCTTCATCCTCAGCGGCGTTGCTCGT。

将测序结果在NCBI数据库进行BLAST同源性序列比对分析，最终确定Liu-c1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，鉴定结果见表3。

表3枯草芽孢杆菌Liu-c1筛选优良菌株鉴定结果

(4)Liu-c1菌株活化和扩大培养

将枯草芽孢杆菌Liu-c1的－80℃甘油保藏管以体积百分比2％接种量移入10mL改良PCA培养基中，转速为180rpm，37℃培养18h，如此传代两次得到活化菌株；将活化菌株以体积百分比2％接种量移入100mL改良PCA培养基中，培养条件同上，得到Liu-c1菌株扩大培养液。

(5)枯草芽孢杆菌Liu-c1菌株发酵条件的优化

在盛有200mLPCA培养基的500mL三角瓶中，以体积百分比2％接种量移入Liu-c1菌株扩大培养液，设置转速为180rpm，设计发酵温度、发酵时间和培养基起始pH三因素三水平[L₉(3³)]正交试验(见表4)，每组3次重复，以PCA发酵液中活菌数为试验指标，通过对结果的极差分析(R)和K值分析确定Liu-c1菌株较优的发酵条件。

表4枯草芽孢杆菌Liu-c1菌株正交试验优化发酵条件及结果

Liu-c1菌株优化发酵条件正交试验结果如表4所示。由表4可见，根据正交试验极差分析R_A＞R_C＞R_B可知，不同发酵条件对菌株Liu-c1活菌数的影响顺序为：发酵温度＞发酵培养基起始pH＞发酵时间；根据正交试验K值分析K_A3＞K_A1＞K_A2、K_B3＞K_B1＞K_B2、K_C1＞K_C2＞K_C3可知，菌株Liu-c1的最佳发酵条件为：温度为45℃、时间为16h、培养基起始pH为6.5。

(6)枯草芽孢杆菌Liu-c1菌株PCA培养基的改良试验

在5L智能发酵罐中，将上述Liu-c1菌株扩大培养液按2％接种量移入2.0L改良PCA培养基中，采用上述Liu-c1菌株优化发酵条件结果分别按表5进行高密度发酵，测定不同PCA发酵液中的活菌数。

表5枯草芽孢杆菌Liu-c1菌株在不同PCA培养中的活菌数

由表5可见，与PCA培养基相比，采用改良PCA-2培养基的发酵液中的活菌数最高，为1.11×10 ⁹CFU/mL，故确定枯草芽孢杆菌Liu-c1菌株改良PCA培养配方为胰蛋白胨10g/L、酵母浸膏10g/L、葡萄糖10.0g/L、氯化钠2.5g/L。

(7)枯草芽孢杆菌Liu-c1菌株高密度发酵

将上述Liu-c1菌株扩大培养液按2％接种量移入盛有2.0L改良PCA培养基的5L智能发酵罐[5L/DM9000A，德镁生物科技(上海)有限公司]中，控制发酵温度为45℃，发酵液pH为6.5(以发酵罐自动流加2mol/L的NaOH调节发酵液pH)，设置发酵罐搅拌转速600～700rpm或关联溶解氧60％～70％，发酵时间为16h，得到Liu-c1菌株高密度发酵液。

(8)菌体收集

发酵结束后，无菌操作条件下将高密度发酵液转移至离心瓶中，采用高速立式冷冻离心机(TGL-21M，上海卢湘仪离心机有限公司)于4℃条件下，8000rpm离心20min，弃上清，收集得到菌泥。并将所得菌泥用1/10发酵液体积的灭菌微生态制剂保护剂复溶，得到浓缩发酵剂。

(9)预冻和冻干

将浓缩发酵剂于－45℃冰箱中预冻10h后得到预冻发酵剂，利用真空冷冻干燥机(6LLABCONCO，美国LABCONCO公司)将预冻发酵剂于在－55℃、真空度0.16mBar的条件下冻干48h，得到枯草芽孢杆菌Liu-c1微生态制剂，于－20℃冰箱中贮藏备用。经过检测，枯草芽孢杆菌Liu-c1微生态制剂的活菌数为2.2×10¹⁰CFU/g。

(10)副干酪乳杆菌KL1微生态制剂制备

将副干酪乳杆菌KL1菌株的甘油保藏管以体积百分比3％接种量移入10mL改良MRS培养基中，37℃静置培养14h，如此传代两次得到活化菌株；将活化菌株以体积百分比3％接种量移入100mL改良MRS培养基中，37℃静置培养14h，得到KL1菌株扩大培养液。将上述KL1菌株扩大培养液按体积百分比3％接种量移入盛有2.5L改良MRS培养基的5L智能发酵罐中，控制发酵温度为37℃、发酵液pH为6.5(以发酵罐自动流加2mol/L的NaOH调节发酵液pH)，设置发酵罐搅拌转速为90rpm，发酵时间为14h，得到KL1菌株高密度发酵液。在经过(8)和(9)步骤制备得到副干酪乳杆菌KL1微生态制剂。经过检测，副干酪乳杆菌KL1微生态制剂的活菌数为2.5×10¹¹CFU/g。

实施例2微生态制剂使用方法及种母鸡生产性能和种蛋品质的测定

(1)动物试验分组设计

选取同一饲养条件下健康、体重接近的54周龄“京红1号”父母代种母鸡384只，随机分成4组，每组96只(每组6个重复，每个重复16只)进行为期8周(54～61周龄)的动物试验，分组及微生态制剂添加量如表6所示。饲养条件严格依据北京华都峪口禽业有限公司饲养管理规定操作：三层A字型阶梯式笼养，每笼4羽，光照强度10～15lx，时长恒定15.5h，温度18℃～25℃，相对湿度40％～70％。每日投料三次，鸡只自由采食、饮水，鸡舍内采用湿帘降温，风机通风，定期清理粪便，环境、用具皆消毒。

表6京红1号父母代种母鸡试验分组

(2)微生态制剂使用方法

将制备的活菌数为2.5×10¹¹CFU/g的KL1微生态制剂和2.2×10¹⁰CFU/g的Liu-c1微生态制剂分别用麦芽糊精稀释并混匀，得到活菌数为8.0×10⁸CFU/g的微生态制剂预混料，于－20℃冰箱中贮藏备用。临用时每天14:00(此时种母鸡采食量为一天中高峰期)按1万只鸡饲用1kg微生态制剂的剂量准确称取各组的微生态制剂预混料，而后按照1kg微生态制剂溶于35kg家禽饮用水的比例，将各组的微生态制剂预混料分别溶于家禽饮用水中，得到微生态制剂预混料稀释液；将各组微生态制剂预混料稀释液分别均匀喷洒于该组种母鸡料槽内的饲料表面(空白组料槽内喷洒无添加微生态制剂的家禽饮用水)，此时表面的湿润含菌饲料一般在10min内即可被种母鸡食用完毕。

(3)种母鸡生产性能测定

试验期间每两周称一次体重，每天统计并记录各组产蛋总重量、产蛋总数、合格种蛋数量(非破壳蛋、软蛋、砂壳蛋、畸形蛋、钢皮蛋，并且蛋重在53～72g之间)、日耗料量，计算平均蛋重、产蛋率、种蛋合格率和料蛋比，并观察种母鸡生长状态、粪便颜色，记录是否患病。

平均蛋重(g)＝产蛋总重量/产蛋总数；

产蛋率(％)＝产蛋总数/鸡只数×100％；

种蛋合格率(％)＝合格种蛋数量/产蛋总数×100％。

(4)种蛋品质的测定

每隔两周，从每重复组选取外形完好且接***均蛋重(62g)的4枚鸡蛋样品进行蛋品质指标的检测。蛋重、哈氏单位、蛋黄颜色指标采用鸡蛋全功能品质测试仪(EA-01，以色列ORKA公司)测定；蛋壳厚度指标采用超声波测厚仪(ETG-1061A，德国Karl deutsch公司)测定；蛋壳强度指标采用纹理分析仪(TA.XT plus，英国Stable Micro System公司)测定；蛋形指数采用蛋形指数测定仪(FHK，日本Robotmation公司)测定。

(5)数据处理

试验数据用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，Duncan氏多重比较检验。试验数据用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

种母鸡生产性能和种蛋品质的测定结果与分析如下：

1)种母鸡的体重变化

表7为试验期间各组种母鸡的体重变化。由表7可知，试验期间各组种母鸡的平均体重随日龄增加而增加，却无显著性差异(P＞0.05)，表明添加三种不同的微生态制剂对种母鸡体重并无影响。

表7试验2-8周各组种母鸡的体重变化(g)

注：同行肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

2)平均蛋重变化

表8为试验期间各组种母鸡的平均蛋重变化。由表8可知，试验期间各组平均蛋重均无显著性差异(P＞0.05)，表明添加三种不同的微生态制剂对种母鸡平均蛋重皆无影响。

表8试验1-8周各组种母鸡的平均蛋重变化(g)

3)产蛋率变化

表9为试验期间各组种母鸡的产蛋率变化。由表9可知，与空白组相比，KL1组、Liu-c1组和复合组在试验初始皆无显著性差异(P＞0.05)；KL1组在1-2周、3-4周分别显著增加3.85％、4.60％(P＜0.05)，第5-6周、7-8周分别极显著增加5.79％和5.77％(P＜0.01)；Liu-c1组产蛋率1-2、3-4周分别显著增加4.48％、4.82％(P＜0.05)，第5-6、7-8周分别极显著增加5.63％和5.37％(P＜0.01)。复合组在1-2、3-4周分别显著增加3.87％、3.96％(P＜0.05)，第5-6、7-8周分别极显著增加8.16％和8.84％(P＜0.01)；表明添加三种不同的微生态制剂后，第1-4周时显著提高了产蛋后期种母鸡的产蛋率，第5-8周时极显著提高了产蛋率，其中以复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组次之。

表9试验1-8周各组种母鸡的产蛋率变化(％)

4)种蛋合格率变化

表10为试验期间各组种母鸡的种蛋合格率变化。由表10可知，试验初始各组种蛋合格率无显著性差异(P＞0.05)；随着日龄的增加，空白组种蛋合格率由初始的89.16％降至第4周的79.65％，第4周至第8周保持在80％左右；而KL1组、Liu-c1组和复合组种蛋合格率始终保持在87％～93％之间。第8周时，与空白组相比，KL1组、Liu-c1组和复合组种蛋合格率分别极显著提高12.65％、9.15％和14.43％(P＜0.01)。表明三种不同的微生态制剂皆能不同程度增加“京红1号”父母代种母鸡的种蛋合格率，其中复合组最佳，KL1组和Liu-c1组次之。

表10试验1-8周各组种母鸡的种蛋合格率变化(％)

5)料蛋比变化

表11为试验期间各组种母鸡的料蛋比变化。由表11可知，与空白组相比，第1-4周，KL1组、Liu-c1组和复合组料蛋比皆显著降低(P＜0.05)；5-6周，KL1组、Liu-c1组分别显著降低2.25％和2.70％(P＜0.05)，复合组极显著降低4.50％(P＜0.01)；7-8周，KL1组显著降低2.27％(P＜0.05)，Liu-c1组和复合组极显著降低4.09％和5.45％(P＜0.01)。表明三种不同的微生态制剂皆能不同程度降低“京红1号”父母代种母鸡的料蛋比，其中复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组次之。

表11试验1-8周各组种母鸡的料蛋比变化

6)蛋壳厚度变化

试验期间各组种蛋的蛋壳厚度变化如表12所示，与空白组相比，第2周时KL1组、Liu-c1组和复合组无显著差异(P＞0.05)；第4周时，KL1组和Liu-c1组分别增加2.30％和1.97％(P＞0.05)，复合组显著增加3.61％(P＜0.05)；第6周时，KL1组和Liu-c1组分别增加2.97％和2.31％(P＞0.05)，复合组显著增加4.95％(P＜0.05)；第8周时，Liu-c1组增加3.67％(P＞0.05)，KL1组和复合组分别显著增加7.00％和8.33％(P＜0.05)。表明添加三种不同的微生态制剂后种蛋的蛋壳厚度皆有所增加，其中复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组次之。

表12试验2-8周各组种蛋的蛋壳厚度变化(mm)

7)蛋壳强度变化

试验期间各组种蛋的蛋壳强度变化如表13所示，与空白组相比，第2周时KL1组、Liu-c1组和复合组的蛋壳强度并无显著差异(P＞0.05)；第4周时，KL1组和Liu-c1组分别增加13.65％和9.84％(P＞0.05)，复合组显著增加21.59％(P＜0.05)；第6周时，KL1组和Liu-c1组分别增加6.97％和7.27％(P＞0.05)，复合组显著增加14.24％(P＜0.05)；第8周时，Liu-c1组显著增加17.21％(P＜0.05)，KL1组和复合组分别极显著增加20.45％和31.82％(P＜0.01)。表明添加三种不同的微生态制剂后种蛋的蛋壳强度皆有所增加，其中复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组次之。

表13试验2-8周各组种蛋的蛋壳强度变化(kg/cm²)

8)蛋形指数变化

试验期间各组种蛋的蛋形指数变化如表14所示。由表14数据可知，试验各组之间蛋形指数均无显著性差异(P＞0.05)，表明添加三种不同的微生态制剂对种蛋的蛋形指数无影响。

表14试验2-8周各组种蛋的蛋形指数变化

9)哈氏单位变化

试验期间各组种蛋的哈氏单位变化如表15所示。由表15数据可知，试验各组之间哈氏单位均无显著性差异(P＞0.05)，表明添加三种不同的微生态制剂对种蛋的哈氏单位无影响。

表15试验2-8周各组种蛋的哈氏单位变化

10)蛋黄颜色变化

试验期间各组种蛋的蛋黄颜色变化如表16所示。由表16可知，试验各组之间蛋黄颜色均无显著性差异(P＞0.05)，表明添加三种不同的微生态制剂对种蛋的蛋黄颜色无影响。

表16试验2-8周各组种蛋的蛋黄颜色变化

讨论与结论：蛋鸡在经历产蛋高峰期后生长逐渐停止，于36～38周龄基本完成体重增长，平均蛋重也达到稳定高峰值。蛋壳厚度和蛋壳强度对蛋品质、运输、保存和种蛋的孵化有重要作用。蛋形指数也是影响种蛋孵化的重要因素之一，鸡蛋不能过圆或过长，一般成椭圆形最好，适宜蛋形指数会减少畸形蛋的产生。哈氏单位是衡量鸡蛋新鲜程度的重要指标之一，反映了鸡蛋的新鲜程度和保存时间，哈氏单位越低，表明蛋白粘稠度越差，鸡蛋新鲜程度越低。蛋黄颜色则反应了脂溶性色素的沉积情况。本试验中添加的三种微生态制剂显著增加了产蛋后期种母鸡的产蛋率、种蛋合格率、蛋壳厚度和强度，并且显著降低了料蛋比，而平均体重、平均蛋重、蛋形指数、哈氏单位和蛋黄颜色等指标皆无显著变化，表明三种不同的微生态制剂在提高产蛋后期种母鸡生产性能和蛋品质的同时并不会对种母鸡和种蛋产生不良影响。

实施例3蛋壳超微结构的观察

(1)蛋壳的取样

试验第8周末，每组选取6枚新鲜种蛋(每组的6个重复中各随机抽取1枚)，分别收集各组6枚种蛋壳的相同部位，去除蛋壳膜，将蛋壳上附着的蛋清等杂质用PBS清洗干净后修剪为0.5cm²左右。浸泡于PBS配制的2.5％戊二醛溶液固定样品并置于4℃冰箱保存。

(2)蛋壳的前处理

将固定好的蛋壳样品用PBS溶液再次清洗干净，并依次用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇，不同梯度乙醇浸泡15min左右，100％乙醇浸泡3次，将蛋壳细胞组织内的水分置换出来，此过程不可过夜。脱水的蛋壳样品用叔丁醇浸泡3次，每次30min，将蛋壳细胞组织中的乙醇置换出来，前两次加0.2mL左右，第三次加叔丁醇以刚没过样品为宜，便于样品的干燥，将蛋壳样品置于-20℃冰箱10min后，于冷冻干燥仪中干燥30min。

(3)蛋壳的超微结构观察

将完成干燥的蛋壳修剪为约0.2cm²，分别将蛋壳的外表面、内表面、横断面粘于样品台上，离子溅射仪进行喷金处理后，置于扫描电子显微镜腔中进行观测并拍照。

蛋壳超微结构的观察结果与分析如下：

1)蛋壳外表面超微结构观察

蛋壳外表面超微结构扫描电镜观察结果如图1所示，空白组蛋壳外表面出现明显皲裂，裂纹的裂缝较宽；Liu-c1组蛋壳外表面皲裂面积减小，裂纹的裂缝较窄；KL1组蛋壳外表面皲裂面积明显减少，裂纹减少，无裂缝；复合组蛋壳外表面裂纹明显减少，无裂缝。表明三种不同的微生态制剂皆能改善产蛋后期种母鸡的蛋壳外表面，其中复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组其次。

2)蛋壳内表面超微结构观察

蛋壳内表面超微结构扫描电镜观察结果如图2所示，空白组蛋壳内表面纤维结构层次混乱，纤维之间的间隙较大，分布不均匀，并且纤维直径较细；KL1组和Liu-c1组蛋壳内表面层次分布较均匀，纤维之间的间隙较小；复合组蛋壳内表面纤维粗壮，结构排布致密、清晰，层次分布均匀。表明三种不同的微生态制剂皆能改善产蛋后期种母鸡的蛋壳内表面结构，其中复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组其次。

3)蛋壳横断面超微结构观察

蛋壳横断面超微结构扫描电镜观察结果如图3所示，空白组蛋壳横断面栅栏层结构疏松，气洞较多，***层***间隙不均匀且间隙较大；与空白组相比，KL1组和Liu-c1组蛋壳横断面栅栏层结构较为致密，气洞明显减少，乳突层乳突分布均匀且排位整齐；复合组蛋壳横断面栅栏层结构致密，基本无气洞，乳突层***数少且宽，乳突间隙致密。表明三种微生态制剂皆可以改善产蛋后期种母鸡的蛋壳栅栏层稀疏结构，增加乳突宽度减少乳突间隙，从而改善蛋壳质量，其中以复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组其次。

讨论与结论：蛋壳是一种复杂的生物材料，利用扫描电镜观察到，蛋壳结构包含6层：内外壳膜、***层、栅栏层、方解石晶体层和表皮层。最内2层为无钙化状态的内外壳膜，较薄的内膜包裹着内容物，构成鸡蛋最内屏障，较厚的壳外膜由蛋白纤维纵横交错成网状，呈多层排列。蛋白纤维层的表面分布着许多颗粒状的突起和结节，这些结节起到连接和固定蛋白质纤维的作用，并维持其结构稳定。钙化不规则***层、栅栏层和垂直晶体层共同构成蛋壳的钙化层。最外的表皮层是由沉积在蛋壳表面的有机层构成。研究蛋壳质量和超微结构之间的关系发现，蛋壳外表面裂隙数和蛋壳强度呈显著正相关，而外表面裂隙宽度和蛋壳强度呈显著负相关，外表面皲裂细小而密集将有助于抵抗内应力，从而防止蛋壳碎裂。本试验在蛋鸡日粮中添加微生态制剂8周后，KL1组、Liu-c1组和复合组的蛋壳外表面皲裂程度均得到明显改善，裂纹的裂缝宽度减小，内表面纤维间隙减小，纤维直径增加；此外，在纤维网状结构上可见附着有许多小结节，复合组结节分布最多，结节直径也最大，横断面栅栏层结构致密，气孔明显减少。以上结果表明单独或复合添加副干酪乳杆菌KL1、枯草芽孢杆菌Liu-c1微生态制剂皆可改善京红1号种母鸡的蛋壳超微结构，而其中以二者复合效果最佳。

实施例4种母鸡血清钙、胫骨钙、蛋壳钙和子宫钙含量的检测

(1)血清钙

试验结束时，每组选取6只种母鸡(每组的6个重复中各随机抽取1只)进行翅下静脉采血，采用无菌注射器从已空腹12h的种母鸡翅下静脉采血5mL左右，于室温下凝血2h得到血液样品；将血液样品在4℃、10000rpm条件下离心10min，分别取上清液于离心管中，4℃冰箱保存备检。使用全自动生化分析仪测定血清中钙含量。

(2)胫骨钙

将各组选取的6只种母鸡进行解剖，取其胫骨，剥去残留的肌肉和软组织后用无水乙醇浸泡48h脱水，取出用石油醚采用索氏抽提法脱脂后，105℃烘箱内烘干6h，于干燥器中冷却后测定胫骨重。将烘干的胫骨粉碎，放入坩埚，置于马弗炉中550℃碳化后灼烧24h，用干燥器冷却之后，称量胫骨灰分重，灰分中钙检测方法依据国标GB5009.90—2016食品中钙的测定方法进行测定。

(3)蛋壳钙

试验第8周末，每组选取6枚新鲜种蛋(每组的6个重复中各随机抽取1枚)，分别收集各组6枚种蛋的蛋壳，流水将蛋壳上的黏液和脏污冲洗干净，70℃烘干24h后碾碎，委托农业农村部饲料效价与安全监督检验测试中心(北京)，依据国标GB5009.90—2016食品中钙的测定方法进行检测。

(4)子宫钙

解剖后剪取子宫内膜，准确称取2g，剪碎并研磨后与18mL、4℃的生理盐水混合均匀，于无菌均质袋中拍打15-20min得到子宫匀浆液，将匀浆液于4℃、10000rpm条件下离心10min，取上清液于离心管中，4℃保存，委托北京中同蓝博临床检验所有限公司严格按照试剂盒操作进行测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

(5)数据处理

试验数据用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，Duncan氏多重比较检验。试验数据用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

血清钙、胫骨钙、蛋壳钙和子宫钙含量的检测结果与分析如下：

血清钙、胫骨钙、蛋壳钙和子宫钙含量结果如表17所示。由表17可知，与空白组相比，KL1组、Liu-c1组和复合组血清钙含量分别极显著增加12.57％、11.62％和26.10％(P＜0.01)；胫骨钙含量分别极显著增加6.99％、5.06％和9.64％(P＜0.01)；蛋壳钙含量分别极显著增加2.57％、2.34％和2.91％(P＜0.01)；子宫钙含量分别显著增加43.33％(P＜0.01)、19.63％(P＞0.05)和60.37％(P＜0.01)。表明三种微生态制剂皆能不同程度增加产蛋后期蛋种鸡的蛋壳钙、血清钙、胫骨钙和子宫钙含量，其中复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组其次。

表17微生态制剂对产蛋后期种母鸡血清、胫骨、蛋壳和子宫钙含量的影响

讨论与结论：蛋种鸡体内形成蛋壳的时间主要是在其停止采食的夜间，这期间子宫部的蛋壳钙化过程进入了线性沉积阶段，蛋种鸡髓骨中大约50％的钙被运输至子宫部中参与蛋壳的形成。研究表明微生态制剂能够在蛋鸡体内代谢大量的有机酸(乳酸、乙酸、丙酸)，将钙元素解离为离子状态，促进蛋壳钙的沉积。蛋壳的主要成分是CaCO₃，因此蛋壳钙的沉积量直接决定蛋壳的超微结构和致密程度，钙含量的增加，蛋壳强度也随之增加。本试验结果显示KL1组、Liu-c1组和复合组的子宫钙和蛋壳含量皆显著增加，且复合微生态制剂效果优于单一微生态制剂，这也是添加微生态制剂后种蛋的蛋壳强度得到提高、蛋壳超微结构得到改善的原因之一。

实施例5子宫部与蛋壳形成相关基因的表达量的检测

(1)样品采集

试验结束时，每组选取6只种母鸡(每组的6个重复中各随机抽取1只)进行解剖，小心剪取子宫内膜于离心管中，液氮速冻后于-80℃保存，检测与蛋壳钙转运相关的基因——钙转运结合蛋白(Calcium-binding protein-d28k，Cabp-d28k)、质膜钙离子ATP酶1(Plasma membrane calcium ATPase1，PMCA1)和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA)，以及检测与蛋壳钙化相关的基因——蛋壳特异性基质蛋白-17(Ovocleidin17，OC17)、卵铁传递蛋白(Ovotransferrin，OVO)和卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)的相对表达量。

(2)引物设计

Cabp-d28k、PMCA1目的基因引物和内参基因引物序列如表18所示，内参基因为鸡的β-actin基因。

表18目的基因引物和内参基因引物序列

(3)提取样本总RNA

用Total RNA Extraction Kit(DNaseⅠ)(Cat#GPQ1801，中国GenePool公司)试剂盒提取组织样本中总RNA。实验操作严格按照产品说明书步骤进行。

(4)RNA电泳

取3μL上述提取的总RNA用1％琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。

(5)反转录

采用mRNA cDNA Synthesis Kit试剂盒(Cat#GPQ1803，中国GenePool公司)进行反转录，实验操作严格按照产品说明书进行，步骤如下：将试剂盒中各组分溶解并置于冰上备用；按表19反转录体系向反应管中加入各组分，总体积为20μL，混匀。42℃孵育50min，85℃孵育5min。反应结束后短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；反转录得到的cDNA放置-20℃保存。

表19反转录体系

(6)Real Time PCR

采用BIOER Line Gene 9600Plus型荧光定量PCR仪进行Real Time PCR扩增，操作过程如下：

1)反应体系：采用mRNA qPCR Kit试剂盒(Cat#GPQ1808，中国GenePool公司)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×45个循环，同时在60-95℃进行融解曲线分析。

Real Time PCR反应体系为：

加入灭菌蒸馏水至20μL。

2)引物筛选

将各样本cDNA复合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，用目的基因引物进行扩增(见表20)，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

表20引物筛选标准曲线Real Time PCR设计

3)样品Real Time PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见表21)。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

表21样品Real Time PCR检测设计

模板	样品cDNA	样品cDNA
			重复检测孔道数	3	3
引物	目的基因引物	内参基因引物

(7)数据处理

利用2^-△△CT相对定量的方法计算样品的相对表达量，计算各组的2^-△△CT值，以空白组其中1个样品设为1，其余23个样品与之相比，进行相对定量计算。公式为：2^-△△CT＝2^{-[(目的样品CT－内参CT)－(对照样品CT－内参CT)]}。试验数据用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan氏多重比较检验。试验数据用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

子宫部与蛋壳形成相关基因的相对表达量检测结果与分析如下：

各组子宫部与钙转运、钙化相关的基因表达量变化结果如表22所示。与空白组相比，KL1组和复合组钙转运结合蛋白(Cabp-d28k)表达量分别极显著增加58.42％和130.97％(P＜0.01)，Liu-c1组Cabp-d28k表达量显著增加41.20％(P＜0.05)；KL1组、Liu-c1组和复合组质膜钙离子ATP酶1(PMCA1)表达量分别增加23.81％、22.62％和50.00％(P＞0.05)，碳酸酐酶(CA)表达量分别极显著增加250.91％、123.03％和270.30％(P＜0.05)；KL1组和Liu-c1组的蛋壳特异性基质蛋白-17(OC17)表达量分别增加23.71％和20.62％(P＞0.05)，卵铁传递蛋白(OVO)表达量分别增加20.59％、17.65％(P＞0.05)，复合组蛋壳特异性基质蛋白-17(OC17)和OVO表达量分别极显著增加了89.69％和64.71％(P＜0.01)；各组的卵清蛋白(OVA)表达量无显著性差异。表明三种微生态制剂皆能不同程度增加产蛋后期种母鸡的钙转运和钙化基因的表达量，其中复合组效果最佳，KL1组和Liu-c1组其次。

表22微生态制剂对子宫部与蛋壳形成相关的基因表达量影响

讨论与结论：蛋壳是由输卵管子宫部分泌的各类无机质和有机基质蛋白组合而成，其本质是碳酸钙在各种基质蛋白调控作用下在蛋壳膜上有序沉积的过程，钙转运通路中的相关基因和蛋壳钙化初期子宫中各类有机基质蛋白的变化规律对钙化的起始有至关重要的作用，并且会影响蛋壳的最终形成和蛋壳质量的优劣。该过程为钙转运结合蛋白(Cabp-d28k)和质膜钙离子ATP酶1(PMCA1)将Ca²⁺从细胞外运输至蛋鸡子宫液，碳酸酐酶(CA)催化CO₂经水合作用产生HCO₃ ^-：H₂O+CO₂→H+HCO₃ ^-，然后HCO₃ ^-转变为CO₃ ^2-：HCO₃ ^-→CO₃ ^2-+H，然后在没有酶催化的情况下Ca²⁺和CO₃ ^2-反应生成蛋壳中的CaCO₃。

在蛋壳钙化初期的过程中，参与蛋壳钙化起始的基质蛋白主要有蛋壳特异性基质蛋白-17(OC17)、卵铁传递蛋白(OVO)和卵清蛋白(OVA)。OC17是蛋壳中的特异性基质蛋白，以糖(基)化的形式存在于蛋壳的乳突层、栅栏层和角质层，在蛋壳形成过程中起基础性作用，并影响蛋壳的结构属性和物质属性。OVO是一种蛋壳基质蛋白，在蛋壳钙化的初期阶段参与蛋壳的钙化，蛋壳形成时可改变方解石晶体的大小，从而对蛋壳结构的致密性产生影响。OVA为在蛋壳中发现的第一个主要蛋白质，只存在于蛋壳乳突层，且在蛋壳钙化的初始阶段含量特别丰富，这个现象的发现表明卵清蛋白参与蛋壳***层椎体核的形成。

本试验结果表明，两种微生态制剂单独和复合使用时皆能不同程度增加京红1号父母代种母鸡的钙转运和蛋壳钙化基因表达量，复合使用效果更佳。结合蛋壳超微结构来看，钙转运和钙化基因的表达得到提高，相应的壳膜表面纤维更加粗壮，结构排布致密、清晰，层次分布均匀，外表面皲裂面积减小；蛋壳纤维内膜层和乳突层结构更致密，排列更有序，从而提高蛋壳厚度和蛋壳强度。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京农学院

<120> 枯草芽孢杆菌、微生态制剂、饲料及其在提高种母鸡生产性能和蛋壳

质量中的应用

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 2222

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 3

gggtgtggcg gctgctatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca taaaaggtgg 180

cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420

agaacaagta ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540

gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600

gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660

gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720

aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840

gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900

gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960

ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcctgtc ctgaaagttg ggttagtccc caacgagcga 1080

acccttgatt ttattgccgc attcagttgg gcacctaagg tactgccggt gaaacttctg 1140

taaccttcgg cggctggctc ctaaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct 1200

cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc 1260

cgcgattact agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag 1320

aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc ggtttcgctg ccctttgttc tgtccattgt 1380

agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct 1440

ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa 1500

gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat 1560

gcaccacctg tcactctgcc cccgaagggg acgtcctatc tctaggattg tcagaggatg 1620

tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 1680

gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc aggcggagtg 1740

cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc ggaaaccccc taacacttag cactcatcgt 1800

ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag 1860

cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat ctctacgcat 1920

ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa 1980

tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg cctgcgagcc 2040

ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca 2100

cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt accgccctat tcgaacggta 2160

cttgttcttc ctaacacaga gctttacgat cgaaaacctt catcctcagc ggcgttgctc 2220

gt 2222

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agacattaac aaccttgcga catac 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcacagagaa tgagagccag tt 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagccgtatt gaacaagaac agaa 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctaccatcct tccagagcct tc 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccatcgccat cagcaccaa 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caccaacctg tagactccat cc 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcgcttcgt ggcaccgaa 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgaaggcatt gcgctctgt 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcatgtcagc agcgttcac 19

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tctttgtcgt catctttgga gttc 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcgttcagcc ttgccagtag 20

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cctcctctat acagttcctt caca 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gagaaattgt gcgtgacatc a 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cctgaacctc tcattgcca 19

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌Liu-c1，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20840。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌Liu-c1接种于培养基中进行培养。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵条件至少满足如下一种：发酵温度37-45℃、发酵时间12-16h、pH 6.5-7.5；

4.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌Liu-c1的发酵方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌Liu-c1的培养基组分包括：胰蛋白胨5.0-20.0g/L、酵母浸粉2.5-20g/L、葡萄糖1-10g/L和氯化钠0-5.0g/L；

5.一种微生态制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Liu-c1。

6.根据权利要求5所述的微生态制剂，其特征在于，还包括副干酪乳杆菌KL1；

所述副干酪乳杆菌KL1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11533；

7.根据权利要求5或6所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂的使用剂量为10⁷～10⁸CFU/只·天，优选为6.0×10⁷～8.0×10⁷CFU/只·天。

8.权利要求5-7任一项所述的微生态制剂的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：将微生态制剂用麦芽糊精稀释并混匀后溶于水，然后喷洒至饲料表面即食。

9.一种饲料，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Liu-c1和/或权利要求5或者7所述的微生态制剂。

10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Liu-c1、权利要求5或7所述的微生态制剂或者权利要求9所述的饲料在提高产蛋后期种母鸡生产性能和蛋壳质量中的应用。