CN106591294A

CN106591294A - 一种一管反应式的dna分子克隆拼接方法

Info

Publication number: CN106591294A
Application number: CN201611255752.8A
Authority: CN
Inventors: 陆勇军; 阿迪亚
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-12-30
Also published as: CN106591294B

Abstract

本发明提供了一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，将目标DNA片段、桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺，pH值为6～10，通过一个热循环过程完成，本发明实现了在一管内一次性完成连接反应，且大大提高了连接反应效率，还具有以下优点：（1）DNA片段的磷酸化和拼接步骤在一管中一步完成连接反应，避免了使用磷酸化引物造成的高昂成本；（2）DNA片段无缝连接，不引入多余核苷酸；（3）非DNA序列依赖；（4）被拼接的DNA片段末端不引入其它核苷酸，DNA片段可重用于其他构建工作；（5）价格低廉，较常规的酶切连接方法成本低廉。

Description

一种一管反应式的DNA分子克隆拼接方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种一管反应式的DNA分子克隆拼接方法。

背景技术

DNA拼接技术是当今生物学研究当中最重要的技术方法之一，大部分的分子生物学与细胞生物学都基于这项技术。然而，自从Cohen等研究者在40年前重组了第一个DNA分子，主流的DNA操作方法仍然基于原始的酶切连接方法，传统基于酶切连接克隆方法拥有完善的操作体系，但是在最终拼接产生的DNA产物当中残留有6bp的核苷酸疤痕；同时，这种传统的方法无法满足当今复杂多样的应用要求。例如代谢工程中的多片段连接，合成生物学当中的DNA片段标准化与DNA片段重用，以及高效可靠地拼接不同大小的DNA片段。

基于上述普遍的需求，众多强大的DNA拼接技术不断产生。大体上来讲，这些技术方法可以被分为两大类，一大类是基于酶切连接，另一大类基于同源重叠。在传统的酶切连接基础上，BioBrick标准的建立使得DNA片段被定义为功能化的片段并且按照特定规则进行拼接。另一个例子是Golden Gate拼接方法，这个方法基于Type IIs限制性内切酶对识别序列之后相隔五个核苷酸的位置进行切割，这样6bp的疤痕最终就不会被包括在产物当中。这个方法也实现了多片段的一次性连接。然而这个基于限制性内切酶的方法仍然不可规避序列依赖性的问题，即只有在序列中存在限制性酶切位点的DNA分子才可以被此方法操作拼接。同时，该方法使用的Type IIs限制性内切酶的种类有限，如果在目标序列当中含有限制性酶切位点，则会大大增加构建工作的复杂程度。

由于上述限制性内切酶的有限性与序列依赖性，人们探索了使用同源重叠的方法进行构建。重叠延伸PCR或者CPEC的方法利用设计PCR末端的同源片段进行搭接，然后通过PCR反应完成扩增。近几年拼接最小人类全合成基因组的Gibson Assembly是同源重叠的另一个典型例子。Gibson Assembly利用DNA片段末端20～40bp的同源区域，首先通过5’核苷酸外切酶消化产生可互补的同源区域，退火后含有同源区域的片段搭接在一起，通过DNA聚合酶补齐被消化的同源区域，最后通过Taq连接酶补齐接口处的缺刻完成连接。保证GibsonAssembly特异性的根源在于所要拼接前后DNA分子片段末端与头端的20～40碱基对的核苷酸同源序列。此方法避免了限制性内切酶的使用因此是非序列依赖的，绝大多数的构建工作可通过此方法完成。然而，DNA片段的标准化与重用仍然未能实现，DNA尾端的序列修饰仍然存在。另外，多片段DNA连接仍然不够可靠，多于四片段组装时效率低下，转化子数量非常稀少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种一管反应式的DNA分子克隆拼接方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，将目标DNA片段、桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，将所述反应体系进行热循环反应获得完整连接产物，所述桥接引物的一段序列与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，桥接引物的剩余一段序列与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述多聚核苷酸激酶对单链或双链目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；所述热稳定性DNA连接酶是对含有缺刻处的双链DNA的缺刻处进行连接；所述反应缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺；所述缓冲液的pH值为6～10；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；所述热循环包括以下条件：80～105℃，0～2min高温变性、30～80℃，0～2min退火、30～80℃，0～10min延伸，循环数为1～60。

本发明所述方法的基本原理如下：

1、首先通过高保真DNA聚合酶PCR，使用常规无需磷酸化的引物扩增获得所有所需要的DNA片段，过柱纯化，测量浓度。

2、用于组装的目标DNA(例如双链DNA)片段混合体系当中首先被多聚核苷酸激酶将5’端磷酸化，同时去除3’端可能存在的磷酸基团。这个过程避免了使用昂贵的5’磷酸化引物，使得价格下降。

3、被磷酸化的双链DNA片段经过变性打开双链，之后温度降低至55度左右的退火温度，此时要被组装的单链DNA片段与相应的桥接引物退火，桥接引物将两个要被组装的单链DNA片段拉在一起(n个片段按照相同原理通过n个桥接引物根据序列特异性按照顺序拉在一起)。之后温度升高至60度反应温度，此温度下热稳定性连接酶将寻找DNA缺刻并且进行连接反应。之前被桥接引物拉在一起的两个单链DNA片段此时中间只缺少一个磷酸二酯键。热稳定性连接酶将对此缺刻处催化形成磷酸二酯键。此过程中，热稳定性连接酶不会对其他平末端DNA或者未磷酸化的DNA进行非特异性连接，热稳定性连接酶只会对双链DNA缺刻(一条链完整，另一条链断裂并且断裂处含有5’端磷酸基团，3’端无磷酸基团)进行特异性连接，这确保了连接反应的特异性。

4、在下一个热循环过程当中，之前的连接产物将本身作为桥接引物引导互补链进行连接反应。由于此过程是指数型增长模型，因此在数次热循环之后，绝大多数的接口处都将被桥接引物引导而完成连接反应。

需要说明的是，本发明上述一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法中，也适用于本身含有5’端磷酸基团的目标DNA和本身含有5’端磷酸基团的桥接引物，此时去除反应体系中的多聚核苷酸激酶即可，该目标DNA片段为双链DNA片段或单链DNA片段。此DNA片段末端为平末端或粘性末端。该目标DNA片段产生方法为通过PCR扩增产生或通过对质粒、基因组等双链DNA进行酶切获得。

在不考虑成本的情况下，设计更长的桥接引物将保证更佳的连接效率，但通常桥接引物的总长度不超过100bp。

本发明上述基因拼接或者基因改造的方法中，所用的多聚核苷酸激酶是对单链或双链目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；这里可以使用NEB公司生产的T4Polynucleotide Kinase，但任何具有所述功能的多聚核苷酸激酶都可用于本发明，其多聚核苷酸激酶的种类不作具体限定。

所述热稳定性DNA连接酶是对含有缺刻的双链DNA的缺刻处进行连接；这里可以使用NEB公司生产的Taq DNA Ligase，但任何具有所述功能的热稳定性DNA连接酶都可用于本发明，其热稳定性DNA连接酶的种类不作具体限定。

所述高保真DNA聚合酶可以使用Vazyme公司生产的 MaxSuper-FidelityDNA Polymerase。但不限于此，任何具有相同功能带有3’到5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶均可用于此处。

优选地，所述缓冲液中ATP的浓度小于等于20mM、NAD⁺的浓度小于等于20mM，Mg²⁺的浓度小于等于100mM。

为了避免酶在高温时被氧化，保证酶在高温反应下的稳定性，可以在缓冲液中加入一定量的还原剂，如DTT等；为了使得酶与DNA结合更充分，可以在缓冲液中加入一定量的PEG8000，Triton X-100，DMSO，K⁺等，这些物质的加入都可以进一步提高反应效率，从而提高转化子的数量，因此优选地，所述缓冲液还含有K⁺和/或DMSO和/或DTT和/或Triton X-100和/或PEG8000。

优选地，所述目标DNA片段的加入摩尔浓度均相同。

另外，目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比例影响最终反应效果，若目标DNA片段与桥接引物的浓度比例比较小，桥接引物在并非类似PCR反应过程中不断被消耗，在桥接法当中桥接引物浓度始终保持不变，起到类似催化剂的作用。过多的桥接引物在反应最后的循环过程当中由于过高的浓度而与DNA片段互补链相竞争退火，导致连接好的双链DNA解链后不能与自身互补链高效率退火，最终导致产生的完整双链DNA浓度下降，呈现为效率低下；DNA片段与桥接引物的浓度比例较大，过低浓度的桥接引物无法在反应起始时与DNA片段本身竞争结合在单链DNA上。由于DNA片段本身长度远长于桥接引物，在退火过程中单链DNA片段先与自身互补链退火，只有适当提高桥接引物浓度才能使桥接引物在退火过程中与DNA片段自身互补链竞争，通过高浓度桥接引物先一步与单链DNA片段退火，使反应开始。这里优选地，所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.5～50。

实验发现对于桥接引物，针对具有相同Tm值设计进行实验的效果较好，因此优选地，所述与桥接引物的一段序列和桥接引物的剩余一段序列具有相同的Tm值，所述Tm值的取值范围为50～80℃。

实际类似PCR的热循环反应中，可以采用分子生物学领域常用的反应温度和时间，优选地，本发明所述热循环包括预反应；预加热；高温变性；高温变性、退火、反应的循环；末尾反应；停止反应或低温保存的完整过程，其中预反应温度为35～45度，时间为0～60分钟；预加热温度为60～70度，时间为0～60分钟；高温变性温度为80～105度，时间为0～10分钟；循环中，80～105度，0～2分钟高温变性、30～80度，0～2分钟退火、30～80度，反应时间为0～10分钟；循环数为1～60；末尾反应温度为30～80度，时间为0～30分钟；低温保存为-20～5度。

这里循环中的退火温度是根据桥接引物设计与扩增引物设计进行判断的，退火温度的计算可以直接使用Primer Premier 5等软件，输入相应的DNA序列即可得到相应序列的退火温度；或者也可以通过在线引物设计网站例如NCBI、NEB或thermoFisher等网站进行设计，判断相应序列的退火温度。

更优选地，上述循环反应条件：预反应温度为37度，时间为30分钟；预加热温度为65度，时间为20分钟；高温变性温度为95度，时间为3分钟；循环中，高温变性的温度为95度，时间为30秒，退火的温度为55度，时间为30秒；反应温度为60度，时间为2min，循环数为20；末尾反应温度为60度，时间为5分钟；低温保存的温度为4度。

由于DNA扩增过程中可能会有一定程度的甲基化，为了进一步提高上述基因拼接或基因改造方法的效率，优选地，所述反应体系中还加入了甲基化DNA内切酶；所述甲基化DNA内切酶对甲基化的DNA进行切割；对于PCR过程中可能残留的模版质粒甲基化DNA进行切割，确保背景DNA残留的完全清除，只留有PCR产生的DNA片段进行连接反应。这个过程降低或消除了最终连接产物转化中的假阳性克隆。

所述甲基化DNA内切酶是对甲基化的DNA进行切割，可以使用NEB公司生产的DpnI，但任何具有所述功能的甲基化DNA内切酶都可用于本发明，其甲基化DNA内切酶的种类不作具体限定。

本发明还提供一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造试剂盒，一管中包括桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性连接酶和反应缓冲液和一份说明书，其中，说明书记载了桥接引物的设计原则，所述桥接引物前半桥接引物和后半桥接引物组成，所述桥接引物的一端与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，另一端与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述扩增引物为连接产物的首尾扩增引物；或者连接产物其中某一接口处5’末端相邻的引物；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；所述多聚核苷酸激酶对单链或双链目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；所述热稳定性DNA连接酶是对含有缺刻处的双链DNA的缺刻处进行连接；所述缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺，所述ATP的浓度小于等于20mM、NAD⁺的浓度小于等于20mM，Mg²⁺的浓度小于等于100mM；所述缓冲液的pH值为6～10。

优选地，所述目标DNA片段的加入摩尔浓度均相同。

优选地，所述反应缓冲液还含有K⁺和/或DMSO和/或DTT和/或Triton X-100和/或PEG8000。

优选地，所述试剂盒还包括甲基化DNA内切酶；所述甲基化DNA内切酶对甲基化的DNA进行切割。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，将目标DNA片段、桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，将所述反应体系进行热循环反应获得完整连接产物，所述桥接引物的一段序列与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，桥接引物的剩余一段序列与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述多聚核苷酸激酶对单链或双链目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；所述热稳定性DNA连接酶是对含有缺刻处的双链DNA的缺刻处进行连接；所述反应缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺；所述缓冲液的pH值为6～10；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；所述热循环包括以下条件：80～105℃，0～2min高温变性、30～80℃，0～2min退火、30～80℃，0～10min延伸，循环数为1～60；本发明通过优化反应体系中缓冲液的组分，不仅实现了在一管内依次性完成连接反应，且大大提高了连接反应效率，该方法还具有以下优点：(1)DNA片段的磷酸化和拼接步骤在一管中反应，一步完成连接反应，避免了使用磷酸化引物造成的高昂成本；(2)DNA片段无缝连接，不引入多余核苷酸；(3)非DNA序列依赖；(4)高效的多片段拼接能力；(5)被拼接的DNA片段末端不引入其它核苷酸，DNA片段可重用于其他构建工作；(6)价格低廉，较常规的酶切连接方法成本低廉。

附图说明

图1为利用不同热循环程序进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图。

图2为利用不同设计原则获得的桥接引物进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图；L1是基于相同Tm值的桥接引物；L2是基于相同长度设计的桥接引物。

图3为不同浓度的桥接引物进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图。

图4为不同浓度的DNA片段进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图。

图5为不同缓冲液组分的反应得到的转化子平皿图，其中，1号为两种缓冲液组分简单1：1混合所得转化子数量；2，3，4依次为Taq连接酶缓冲液，T4多聚核苷酸激酶缓冲液以及纯水所得转化子数量。

图6为不同缓冲液组分的反应得到的转化子平皿图，5号为Taq连接酶缓冲液当中加入10mM ATP后所得转化子数量，6号为T4多聚核苷酸激酶缓冲液当中加入10mM NAD⁺辅因子后所得转化子数量；9号为纯水中加入10mM ATP与10mM NAD⁺辅因子后所得转化子数量。

图7为不同缓冲液组分的反应得到的转化子平皿图。

图8为不同缓冲液组分的反应得到的转化子平皿图。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

具体实施方式中用到的DNA片段和桥接引物如表1和表2所示。

表1 DNA连接反应所用的片段

片段	名称	长度
			1(SEQ ID NO：1)	mCherry	711
2(SEQ ID NO：2)	pZS backbone	4020

表2 DNA连接反应所用的桥接引物

一、Taq连接酶(即热稳定性连接酶)缓冲液组分

20mM Tris-HCl、10mM醋酸镁、25mM醋酸钾、0.1％Triton X-100、10mM DTT、1mMNAD⁺、pH 7.6。

二、T4多聚核苷酸激酶的缓冲液组分(这里使用T4连接酶缓冲液)

50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10mM DTT、1mM ATP、pH 7.5。

实施例1热循环程序的优化

将表3所述六种不同的热循环程序用于本发明所述基因拼接的方法(除了热循环程序不同，其余实验材料和方法均相同)，结果表明：较长的反应时间，较多的反应循环数，较低的退火温度和反应温度有利于实验进行。两步的热循环调节和三步的循环条件结果上没有显著的差别(表3，图1)。因此配合PCR反应，采用三步的热循环条件，较长的反应时间，较多的反应循环次数来提高反应效率。

表3

组别	反应条件；循环数	转化子数量
			1	55C 15s、65C 45s；20次	36
2	55C 15s、65C 45s；30次	112
			3	55C 30s、65C 90s；20次	154
4	55C 15s、65C 45s；30次	96
			5	55C 60s；20X	168
6	65C 60s；20X	154

因此，可以确定本发明的热循环条件可以是高温变性：80～105℃，0～2min、退火：30～80℃、0～2min。

更具体地，本发明的下面具体实施例中，热循环条件选用表4的条件。

表4

37℃	30min
		65℃	20min
95℃	2min
		95℃	30sec
55℃	30sec
		60℃	2min
GOTO 2	20x
		60℃	5min
4℃	hold

注：GOTO2指跳转到55℃，15sec

实施例2桥接引物的优化

1、桥接引物的设计优化

本发明的桥接引物由两条半桥接引物(桥接引物1和桥接引物2)组成，其中桥接引物1与一条目标DNA的5’磷酸化端互补；桥接引物2与另一条目标DNA的3’去磷酸化端互补，所述桥接引物1和桥接引物2组成连续的一条桥接引物，本发明对桥接引物的设计，设置了2组，第1组为设计具有相同Tm值的桥接引物1和桥接引物2；第2组为设计具有相同长度的桥接引物1和桥接引物2，利用该两组进行本发明所述基因拼接的方法(除了桥接引物设计不同，其余实验材料和方法均相同)，结果表明：第1组实验获得转化子140个，第2组实验获得转化子90个；因此该两组设计均可以获得一定数量的完整连接产物的转化子，因此均可用于本发明的基因拼接方法，另外，利用基于相同Tm值设计的半桥接引物进行实验结果要优于基于相同长度设计的半桥接引物的实验结果(图2)。

2、桥接引物的浓度

DNA片段浓度在反应混合液中固定为10nM；桥接引物浓度梯度分别为：1uM、100nM、10nM、1nM；组别分别为1～4。结果表明：第1组获得转化子数量为556，第2组获得转化子数量为1238，第3组获得的转化子数量为655，第4组获得的转化子数量为15(图3)，研究还发现：桥接引物与DNA片段的浓度比例很重要，若桥接引物与DNA片段的浓度比例过高，会导致连接好的双链DNA解链后不能与自身互补链高效退火，最终导致产生的完整双链DNA的浓度下降，效率低下；而若桥接引物与DNA片段的浓度比例过低，退火过程中单链DNA片段先与自身互补链退火，导致效率低下，甚至不能使桥接引物与单链DNA片段退火反应进行。本发明中需控制桥接引物与DNA片段的浓度比例为1：0.1～1：100。

四、DNA片段浓度的优化

桥接引物浓度在反应混合液中固定设置为50nM；DNA片段浓度梯度分别为：15nM、1.5nM、0.15nM；组别分别为1～3。结果表明：DNA片段浓度为15nM时获得的转化子数量为11，DNA片段浓度为1.5nM时获得的转化子数量为92，DNA片段浓度为0.15nM时获得的转化子数量为1(图4)。

实施例3反应缓冲液组分的优化

实验过程中所用到的热循环条件为表4所示条件，反应体系为表5。

表5反应体系

一、由于一管反应中同时含有Taq连接酶和T4多聚核苷酸激酶这两种酶，不同的酶会使用到不同的缓冲液组分，本实验对兼顾两种不同酶组分所搭配形成的缓冲液组分(20X)加入到最终反应体系当中；其他实验组为Taq连接酶缓冲液，T4多聚核苷酸激酶缓冲液或者纯水。

经过试验发现，不同的缓冲液造成的效果非常明显。除了两种缓冲液简单混合的实验组以外，其余实验组所用的缓冲液均导致最终转化子数量为0(如图5，实验过程中，除了不同实验组所用到的缓冲液组分不同以外，其余条件均完全相同，包括所使用的DNA含量，酶含量，热循环条件等)；比较可知，单独的Taq连接酶缓冲液或者T4多聚核苷酸激酶缓冲液并不能完成DNA的连接反应。

二、分别在Taq连接酶缓冲液当中补充T4多聚核苷酸激酶缓冲液中所含有的ATP，在T4多聚核苷酸激酶缓冲液当中补充Taq连接酶缓冲液当中含有的NAD⁺辅因子来进行DNA连接反应，考察转化子数量。

经过实验对比发现，两种缓冲液在补充NAD⁺辅因子或者ATP之后均产生了非常明显的提升效果，从之前未能得到任何转化子的情况转变为得到大量转化子，转化子数量甚至超过将Taq连接酶缓冲液和T4多聚核苷酸激酶缓冲液简单1:1混合所得后所得的转化子数量(如图6，实验过程中，除了不同实验组所用到的缓冲液组分不同以外，其余条件均完全相同，包括所使用的DNA含量，酶含量，热循环条件等)。

三、同时测试单纯在纯水当中加入10mM ATP与10mM NAD⁺辅因子，结果发现并未得到任何转化子(图6)

五、设置六组实验，每组实验除了所用到的缓冲液组分不同以外，其余条件均完全相同，包括所使用的DNA含量，酶含量，热循环条件等；考察不同组分的缓冲液对DNA连接反应的影响，六组缓冲液组分如表6所示。

表6

组别	缓冲液组成
		1	ATP 1mM+NAD⁺1mM
2	ATP 1mM+NAD⁺1mM+Tris-HCl 50mM；PH 7.5
		3	ATP 1mM+NAD⁺1mM+Tris-HCl 50mM+MgCl₂ 10mM；PH 7.5
4	ATP 1mM+NAD⁺1mM+Tris-HCl 50mM+MgCl₂ 10mM
		5	ATP 1mM+NAD⁺1mM+Tris-HCl 50mM
6	ATP 1mM+NAD⁺1mM+MgCl₂ 10mM

实验结果如图7所示，除了组别3、4以外，其它组别均没有菌落。其中组别3、4所得到的菌落数量接近。

因此，由以上实验可知，完成一步法构建过程当中所用到的缓冲液组分当中必须含有ATP、NAD⁺、Mg²⁺，以及维持pH值稳定的缓冲对，例如Tris-HCl等的存在。其中ATP、NAD⁺、Mg²⁺为反应过程中酶不可或缺的辅因子，缓冲对保证了反应体系不随着温度时间的变化而剧烈波动导致酶的失活。

六、在步骤五实验的基础上，进一步考察了4组缓冲液对DNA连接反应的影响，实验1的缓冲液组分：ATP 1mM+NAD⁺1mM；实验2的缓冲液组分：ATP 1mM+NAD⁺1mM+Tris-HCl 50mM+MgCl₂ 10mM；PH 7.5；实验3的缓冲液组分：ATP 1mM+NAD⁺1mM+Tris-HCl 50mM+MgCl₂ 10mM+DTT 10mM；PH 7.5；实验4的缓冲液组分：T4多聚核苷酸激酶缓冲液+10mM NAD⁺。

结果如图8所示，实验一和实验二均能得到一定量的转化子，且实验二的转化子的数量明显多于实验一的转化子数量，说明DTT等还原剂的加入保证了在高温条件下酶的稳定性，不因高温而被氧化失活，因此在反应体系当中可以提高反应效率，得到更多的转化子数量。

七、经过近一步优化实验，最终得到了一个最佳的缓冲液组分(ATP，NAD⁺，Mg²⁺，pH在6～10)，来同时完美地兼容T4多聚核苷酸激酶和Taq连接酶协同在一管中完成DNA片段连接反应。两种酶在此缓冲液当中一管完成的DNA片段连接效率较高，转化子数量比起传统的两步法实现DNA连接反应得到的转化子数量高出十倍以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种一管反应式的DNA分子克隆拼接方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 711

<212> DNA

<213> mCherry

<400> 1

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cttgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

<210> 2

<211> 4020

<212> DNA

<213> pZS backbone

<400> 2

ctgcagggcg atatcggatc tactagtgcc tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga 60

ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca 120

tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 180

cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg 240

gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat 300

aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt ttggatccaa 360

atctagagtc gacacttgac gtcttcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 420

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 480

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 540

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 600

aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 660

tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 720

ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 780

catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 840

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 900

ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 960

gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 1020

aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 1080

gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 1140

gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 1200

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 1260

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaagagctc 1320

gcttggactc ctgttgatag atccagtaat gacctcagaa ctccatctgg atttgttcag 1380

aacgctcggt tgccgccggg cgttttttat tggtgagaat ccaagcacta gggacagtaa 1440

gacgggtaag cctgttgatg ataccgctgc cttactgggt gcattagcca gtctgaatga 1500

cctgtcacgg gataatccga agtggtcaga ctggaaaatc agagggcagg aactgctgaa 1560

cagcaaaaag tcagatagca ccacatagca gacccgccat aaaacgccct gagaagcccg 1620

tgacgggctt ttcttgtatt atgggtagtt tccttgcatg aatccataaa aggcgcctgt 1680

agtgccattt acccccattc actgccagag ccgtgagcgc agcgaactga atgtcacgaa 1740

aaagacagcg actcaggtgc ctgatggtcg gagacaaaag gaatattcag cgatttgccc 1800

gagcttgcga gggtgctact taagccttta gggttttaag gtctgttttg tagaggagca 1860

aacagcgttt gcgacatcct tttgtaatac tgcggaactg actaaagtag tgagttatac 1920

acagggctgg gatctattct ttttatcttt ttttattctt tctttattct ataaattata 1980

accacttgaa tataaacaaa aaaaacacac aaaggtctag cggaatttac agagggtcta 2040

gcagaattta caagttttcc agcaaaggtc tagcagaatt tacagatacc cacaactcaa 2100

aggaaaagga ctagtaatta tcattgacta gcccatctca attggtatag tgattaaaat 2160

cacctagacc aattgagatg tatgtctgaa ttagttgttt tcaaagcaaa tgaactagcg 2220

attagtcgct atgacttaac ggagcatgaa accaagctaa ttttatgctg tgtggcacta 2280

ctcaacccca cgattgaaaa ccctacaagg aaagaacgga cggtatcgtt cacttataac 2340

caatacgctc agatgatgaa catcagtagg gaaaatgctt atggtgtatt agctaaagca 2400

accagagagc tgatgacgag aactgtggaa atcaggaatc ctttggttaa aggctttgag 2460

attttccagt ggacaaacta tgccaagttc tcaagcgaaa aattagaatt agtttttagt 2520

gaagagatat tgccttatct tttccagtta aaaaaattca taaaatataa tctggaacat 2580

gttaagtctt ttgaaaacaa atactctatg aggatttatg agtggttatt aaaagaacta 2640

acacaaaaga aaactcacaa ggcaaatata gagattagcc ttgatgaatt taagttcatg 2700

ttaatgcttg aaaataacta ccatgagttt aaaaggctta accaatgggt tttgaaacca 2760

ataagtaaag atttaaacac ttacagcaat atgaaattgg tggttgataa gcgaggccgc 2820

ccgactgata cgttgatttt ccaagttgaa ctagatagac aaatggatct cgtaaccgaa 2880

cttgagaaca accagataaa aatgaatggt gacaaaatac caacaaccat tacatcagat 2940

tcctacctac gtaacggact aagaaaaaca ctacacgatg ctttaactgc aaaaattcag 3000

ctcaccagtt ttgaggcaaa atttttgagt gacatgcaaa gtaagcatga tctcaatggt 3060

tcgttctcat ggctcacgca aaaacaacga accacactag agaacatact ggctaaatac 3120

ggaaggatct gaggttctta tggctcttgt atctatcagt gaagcatcaa gactaacaaa 3180

caaaagtaga acaactgttc accgttagat atcaaaggga aaactgtcca tatgcacaga 3240

tgaaaacggt gtaaaaaaga tagatacatc agagctttta cgagtttttg gtgcatttaa 3300

agctgttcac catgaacaga tcgacaatgt aacagatgaa cagcatgtaa cacctaatag 3360

aacaggtgaa accagtaaaa caaagcaact agaacatgaa attgaacacc tgagacaact 3420

tgttacagct caacagtcac acatagacag cctgaaacag gcgatgctgc ttatcgaatc 3480

aaagctgccg acaacacggg agccagtgac gcctcccgtg gggaaaaaat catggcaatt 3540

ctggaagaaa tagcgctttc agccggcaaa cctgaagccg gatctgcgat tctgataaca 3600

aactagcaac accagaacag cccgtttgcg ggcagcaaaa cccgtacacg cgttttccta 3660

ggtttgaatt caaaagatct cttacatgaa aaaggttctt gacattttaa atccatgtgg 3720

tatatgtcat ttttctagga tctcttacat gaaaaaggtt cttgacattt taaatccatg 3780

tggtatatgt catttttcta ggatctctta catgaaaaag gttcttgaca ttttaaatcc 3840

atgtggtata tgtcattttt ctaggatctc ttacatgaaa aaggttcttg acattttaaa 3900

tccatgtggt atatgtcatt tttctaggat ctcttacatg aaaaaggttc ttgacatttt 3960

aaatccatgt ggtatatgtc atttttctag ctagctttcg gaattaagga ggtaataaat 4020

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 桥接引物1

<400> 3

gctagctttc ggaattaagg aggtaataaa tatggtgagc aagggcgag 49

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 桥接引物2

<400> 4

gcatggacga gctgtacaag taactgcagg gcgatatcgg 40

Claims

1.一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，其特征在于，将目标DNA片段、桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，将所述反应体系进行热循环反应获得完整连接产物，所述桥接引物的一段序列与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，桥接引物的剩余一段序列与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述多聚核苷酸激酶对单链或双链目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；所述热稳定性DNA连接酶是对含有缺刻处的双链DNA的缺刻处进行连接；所述反应缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺；所述缓冲液的pH值为6～10；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；所述热循环包括以下条件：80～105℃，0～2min高温变性、30～80℃，0～2min退火、30～80℃，0～10min延伸，循环数为1～60。

2.根据权利要求1所述的一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，其特征在于，所述ATP的浓度小于等于20 mM、NAD⁺的浓度小于等于20 mM，Mg²⁺的浓度小于等于100mM。

3.根据权利要求1所述的一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，其特征在于，所述缓冲液还含有K⁺和/或DMSO和/或DTT和/或Triton X-100和/或PEG8000。

4.根据权利要求1所述的一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，其特征在于，所述目标DNA片段的加入摩尔浓度均相同。

5.根据权利要求1所述的一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，其特征在于，所述反应体系中还加入了甲基化DNA内切酶；所述甲基化DNA内切酶对甲基化的DNA进行切割。

6.根据权利要求1所述的一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，其特征在于，所述与桥接引物的一段序列和桥接引物的剩余一段序列具有相同的Tm值，所述Tm值的取值范围为50～80℃。

7.一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造试剂盒，其特征在于，一管中包括桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性连接酶和反应缓冲液和一份说明书，其中，说明书记载了桥接引物的设计原则，所述桥接引物前半桥接引物和后半桥接引物组成，所述桥接引物的一端与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，另一端与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述扩增引物为连接产物的首尾扩增引物；或者连接产物其中某一接口处5’末端相邻的引物；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；所述多聚核苷酸激酶对单链或双链目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；所述热稳定性DNA连接酶是对含有缺刻处的双链DNA的缺刻处进行连接；所述缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺，所述ATP的浓度小于等于20 mM、NAD⁺的浓度小于等于20 mM，Mg²⁺的浓度小于等于100mM；所述缓冲液的pH值为6～10。

8.根据权利要求7所述的一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造试剂盒，其特征在于，所述目标DNA片段的加入浓度均相同。

9.根据权利要求7所述的一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液还含有K⁺和/或DMSO和/或DTT和/或Triton X-100和/或PEG8000。

10.根据权利要求7所述的一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括甲基化DNA内切酶；所述甲基化DNA内切酶对甲基化的DNA进行切割。