CN111088209B - 一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产1,4‑丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用，所述的重组丁醇梭菌是通过在丁醇梭菌中表达4‑羟基丁酰辅酶A脱水酶构建得到的。与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)相比于无法生产1,4‑丁二醇的野生菌，本发明构造的重组菌在生产1,4‑丁二醇的过程中，其产量达到66mg/L。(2)本发明进一步将丁醇梭菌中etfA基因失活，该重组菌产1,4‑丁二醇的产量进一步提高了，达到182mg/L。

Description

一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用。

背景技术

1,4-丁二醇是一种重要的基本有机化工原料和精细化工原料，其下游衍生物很多，用途十分广泛。其衍生物是高附加值的精细化工产品，广泛用于溶剂、医药、化妆品、增塑剂、固化剂、农药，主要用于制造四氢呋喃(THF)、聚二苯二甲酸丁二醇脂(PBT)、γ-丁内酯(GBL)、N－甲基吡咯烷酮(NMP)、N－乙烯基吡咯烷酮(NVP)等。中国是全球需求增速最快的地区，预计增速为4％～6％。国外一些生产商已在规避BDO产能过剩，德国巴斯夫公司是全球最大的BDO生产商，年产能为46.7万吨。然而现在工业化生产1,4-丁二醇还是以化石燃料为主极大的耗费了资源且会对环境产负担，因而需要开发一种生物制备的方法来生产1,4-丁二醇。

现有的1,4-丁二醇的方法有两种，第一种在于利用TCA循环后的琥珀酸作为底物经过一些基因改造生产1,4-丁二醇；另有一种以木糖非磷酸化途径进行生产。第一种方法能量产出为0，还原力为1，第二种方法能量产出为1，还原力为0，其能量产出和还原力均比较低。因此，需要开发一种高能量产出，高还原力的制备1,4-丁二醇的方法路径。此外，丁醇梭菌主要用于丙酮-丁醇乙醇(ABE)发酵，现在也有应用于生产2,3-丁二醇，乙偶姻等产品中，且产量较高，应用广泛，而对相似的1,4-丁二醇上的应用极少，利用丁醇梭菌是为了构建新的能够高效产1,4-丁二醇的生物途径，从而发展成为一种的梭菌模型。

乙偶姻是合成2,3-丁二醇的前提，丙酮丁醇梭菌自身具有合成乙偶姻的基因，且流向乙偶姻的代谢步骤相对需要用巴豆酰辅酶A进行进一步合成的1,4-丁二醇来说较少，代谢支路少更易控制其代谢方向。而生产1,4丁二醇的过程中代谢支路和多余代谢产物也较多，相对更难控制代谢途径的转变，也因而更难生产。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组丁醇梭菌的构建方法。

本发明最后还要解决的技术问题是提供上述重组丁醇梭菌的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌，所述的重组丁醇梭菌是通过在丁醇梭菌中表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶构建得到的。其代谢图可见图1。图1的代谢过程可看出在丁醇梭菌中表达4羟基丁酰辅酶A脱水酶并利用巴豆酰辅酶A，是由巴豆酰辅酶A通过4HBD转化生产的1,4-丁二醇。

其中，所述的丁醇梭菌为CGMCC NO.5234或ATCC824。

其中，所述的表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶是通过4HBD，即cbei_2100(4HBD-1)，ckl_3020(4HBD-2)，abfD(4HBD-3)，lf65-02412(4HBD-4)和ctk-c07640(4HBD-5)中的任意一种的基因片段表达；其中，cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

其中，所述的重组丁醇梭菌优选导入cbei_2100(4HBD-1)，ckl_3020(4HBD-2)，abfD(4HBD-3)，lf65-02412(4HBD-4)和ctk-c07640(4HBD-5)中的任意一种的基因片段的丙酮丁醇梭菌。

更优选导入了cbei_2100(4HBD-1)基因片段的丁醇梭菌。

上述产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌的构建方法包括如下步骤：

(1)将cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640中的任意一种的基因片段***到载体质粒的Nde I酶切位点后，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒进行甲基化，得到甲基化的重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的甲基化的重组质粒转至丁醇梭菌中，筛选即得。

步骤(1)中，所述的载体质粒为PSY8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选地，所述的重组丁醇梭菌中etfA基因失活以进一步提高1,4-丁二醇的产量，所得重组丁醇梭菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

上述的产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌的构建方法，其中，etfA基因失活的重组丁醇梭菌的构建方法为利用二型内含子基因敲除技术将SEQ ID NO.8所示的内含子序列***etfA基因的第639bp和第640bp之间。

其中，所述的二型内含子基因敲除技术包括如下步骤：

(1)分析SEQ ID NO.6所示的序列，得到内含子的核苷酸序列和基因的***位；

(2)将SEQ ID NO.8所示的内含子序列构建到基因敲除质粒中，得到重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化丁醇梭菌，筛选得到etfA基因失活的菌株。

步骤(2)中，所述的基因敲除质粒为PMTL007C-E2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

上述重组丁醇梭菌在制备1,4-丁二醇中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的应用包括如下步骤：将上述重组丁醇梭菌置于种子培养基中培养，得到种子液，按10％的体积比将种子液转入到发酵培养基中，进行厌氧发酵，发酵约84h。

其中，所述的种子培养基为酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，无水葡萄糖10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠2g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，其余为水。

其中，所述的发酵培养基为溶液I：无水葡萄糖60g/L，溶剂为水；溶液Ⅱ：乙酸铵2.2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，溶剂为水；溶液Ⅲ：氯化钠0.01g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，溶剂为水；溶液Ⅳ：VB11mg/L，对氨基苯甲酚1mg/L，生物素0.01mg/L，溶剂为水。

以80％溶液I，10％溶液Ⅱ加扩大1000倍配置的溶液Ⅲ和溶液Ⅳ，各千分之一，(以50mL体系为例，发酵液是40mL溶液1，5mL溶液2；溶液3、4各50μL，将溶液1、2、3、4混合后加5mL种子液)最终得到发酵培养基。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)本发明以更为价廉和普遍的葡萄糖为底物进行生产。

(2)本发明制备1,4丁二醇的工艺路线为厌氧发酵，代谢过程能够最大限度的保留能量和还原力用于产物合成和菌体生长，其能量产出为2，还原力为1，更有利于产物合成和菌体生长，合成路径有最大的理论得率。

(3)相比于无法生产1,4-丁二醇的野生菌，本发明构造的重组菌在生产1,4-丁二醇的过程中，其产量达到66mg/L。

(4)本发明进一步将丁醇梭菌中etfA基因失活，该重组菌产1,4-丁二醇的产量进一步提高了，达到182mg/L。

附图说明

图1为生产2,3-丁二醇与1,4-丁二醇代谢途径的对比。

图2为二型内含子基因敲除质粒PMTL007C-E2的质粒图谱。

图3为验证是否敲除eftA的丙酮丁醇梭菌的菌落PCR凝胶电泳图。

图4为4HBD 1-3菌落PCR结果图。

图5为4HBD 4-5菌落PCR结果图。

图6为1,4-丁二醇标品的气相色谱图。

图7为野生菌发酵后的气相图谱。

图8为仅表达4HBD基因的重组菌发酵后的气相色谱图。

图9为敲除了etfA基因后表达4HBD的重组菌发酵后的气相色谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：丙酮丁醇梭菌以etfA基因失活突变株的构建方法

1、设计内含子

根据NCBI数据库收录的丙酮丁醇梭菌的etfA基因序列(如SEQ ID NO.6所示)，借助软件设计合适的***基因位点(http://www.Clostron.Com)，选择***在第639-640个碱基之间，并生成内含子序列，合成内含子序列S-639，其序列如SEQ ID NO.8所示。

2、etfA***失活载体的构建：

用Xhol和BSrGI双酶切载体PMTL007C-E2，其序列如SEQ ID NO.9所示。酶切产物经纯化试剂盒(Takara)化后，与内含子序列S-639通过一步克隆(ClonExpreSS)连接，将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌E.Coli DH5a(本实验室)，涂布到含有25ug/mL氯霉素抗性LB平板，37℃培养12h，挑取转化子，接到液体含有25ug/耐氯霉素LB培养基中，37℃200rpm培养12h，提取重组质粒，测序验证，获得etfA***失活载体PMTL007C-E2-etfA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，***后的质粒图如图2所示。

3、载体PMTL007C-E2-etfA的甲基化：

由于已经证明丙酮丁醇梭菌(ClostridiumaCetobutliCum)ATCC824中含有限制性内切酶Cac824I，可以切割未甲基化的外源DNA，因此在对丙酮丁醇梭菌进行转化前对重组失活载体PMTL007C-E2-etfA进行甲基化修饰。具体操作步骤为制备E.Coli TOP10/pANZ(本实验室)的化学感受态，将测序成功的失活载体转化到大肠杆菌E.COli TOP10，由于pANZ质粒具有四环素抗性，故涂布到含有25ug/mL氯霉素和10ug/mL四环素双抗性LB平板，37℃培养12h，挑取转化子，接到液体含有25ug/mL氯霉素和10ug/mL四环素LB培养基中，37℃200rpm培养12h，提取甲基化缺失载体(pANZ质粒含有一个枯草芽抱杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)。

4、电转化甲基化的敲除质粒至丙酮丁醇梭菌：

厌氧条件下，取2xYTG培养基培养的生长至对数中期的C.acetobutylicum B3培养液60mL，40℃4000rpm离心10min弃去上清，加入足量预冷的电转缓冲液EPB(27omM蔗糖，sfnMNaHZpO4，pH7.4)，洗涤两次，并用2.3mL EPB重悬；然后取570uL加入0.4cm电转杯放置在冰浴中冷却，并加入20uL甲基化质粒，冰浴放置2min。2.O kV电压，25uF电容进行电转化；随后将电转液加入到l mL37℃的2xYTG培养基中复苏培养4h，离心收集细胞100uL并将细胞涂布于含有20ug/mL甲飒霉素的P2平板中，厌氧培养24h。

5、筛选etfA***失活突变株

挑取转化子，使用引物etfA-F(其序列如SEQ ID NO.10所示)和etfA-R(其序列如SEQ ID NO.11所示)，对转化子进行菌落PCR验证，筛选出内含子***基因组的突变株(***后，PCR扩增出基因条带电泳图上比野生型大约1Kbp)。将正确***的突变株传代三次，同时涂布在含有红霉素抗性和红霉素加甲飒霉素抗性的P2固体培养基上，筛选出敲除质粒丢失的突变株(在同时含红霉素和甲飒霉素抗性平板上不能生长的突变株)，用凝胶核酸电泳验证结果的菌落PCR结果如图3所示。

实施例2：

1.设计重组质粒：查找NCBI工数据库收录的丙酮丁醇梭菌的cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412，ctk-c07640的基因序列，将其分别***到载体质粒为PSY8中Nde I酶切位点后，送与金唯志进行合成。将合成的穿刺菌接到液体含有25ug/氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm培养12h，提取重组质粒并用甘油对菌株进行保存，储藏在-80℃冰箱。

2.重组PSY8质粒的甲基化：

由于已经证明丙酮丁醇梭菌(ClostridiumaCetobutliCum)ATCC824中含有限制性内切酶Cac824，可以切割未甲基化的外源DNA，因此在对丙酮丁醇梭菌进行转化前对重组载体PSY8进行甲基化修饰。

具体操作步骤为制备E.Coli Top 10/pANZ(本实验室)的化学感受态，将提取的重组质粒载体转化到大肠杆菌E.COli Top10，由于pANZ质粒具有四环素抗性，故涂布到含有25ug/mL氨苄抗性和10ug/mL四环素双抗性LB平板，37℃培养12h，挑取转化子，接到液体含有25ug/mL氨苄和10ug/mL四环素LB培养基中，37℃200rpm培养12h，提取甲基化缺失载体(pANZ质粒含有一个枯草芽抱杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)。

3.电转化甲基化的重组质粒至丙酮丁醇梭菌和实例1敲除etfA的丙酮丁醇梭菌：

厌氧条件下，取2xYTG培养基培养的生长至对数中期的C.acetobutyliCum B3培养液60mL，4℃4000rpm离心10min弃去上清，加入足量预冷的电转缓冲液EPB(270mM蔗糖，5mMNaHZpO₄，pH7.4)，洗涤两次，并用2.3mL EPB重悬，然后取570uL加入0.4cm电转杯放置在冰浴中冷却，并加入20uL甲基化质粒，冰浴放置30min；2.0kV电压，25uF电容进行电转化。

随后将电转液加入到10mL37℃的2xYTG培养基中复苏培养4h，离心收集细胞100uL并将细胞涂布于含有20ug/mL甲飒霉素的P2平板中厌氧培养24-36h，验证4HBD基因是否成功电转入丙酮丁醇梭菌中：平板培养后挑出30个单菌落到甲砜霉素抗性的P2平板，长成后进行菌落PCR。PCR条件：95℃，10min；38cycles×(95℃，10s；52℃，15s；72℃，2min)。

利用核酸凝胶电泳检测菌落PCR结果，得到结果如图4，图5(其中4HBD-1，2，3，4，5分别表示***的基因为cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412，ctk-c07640)

实施例3：重组菌与野生菌分别在50mL蓝口瓶中进行发酵

1.P2平板培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，无水葡萄糖10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠2g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，琼脂15g/L，其余为水。

2.种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，无水葡萄糖10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠2g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，其余为水。

3.发酵培养基：

溶液I：无水葡萄糖60g/L，溶剂为水；

溶液Ⅱ：乙酸铵2.2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，溶剂为水；

溶液Ⅲ：氯化钠0.01g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，溶剂为水；

溶液Ⅳ：VB1 1mg/L，对氨基苯甲酚1mg/L，生物素0.01mg/L，溶剂为水。

以80％溶液I，10％溶液Ⅱ加扩大1000倍配置的溶液Ⅲ和溶液Ⅳ，各千分之一，最终得到发酵培养基。

4.平板培养：将实施例1构建的重组菌、实施例2构建的丁醇梭菌重组菌和野生菌株接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间12h。将平板培养的重组菌和野生菌接种到种子培养基(不加琼脂，其他组分同P2平板培养基)中37℃静止培养12h。

5.液体发酵：将种子培养基中培养的重组菌和野生菌分别取5mL加到已配置好的45mL发酵培养基中，放入厌氧箱37℃培养72h，每12h取样一次并储存于-80℃冰箱，72h后停止发酵。

实施例4：利用高效气相色谱仪检测1，4-丁二醇产量

1.色谱条件：毛细管柱(30m×0.32mm，0.25μL)；程序升温：初始温度70℃，保存0.5min，再以20℃/min上升到180℃，保持2min，最后以25℃/min上升到235℃，保持2min。气化室温度240℃，FID检测器温度250℃，分流比10：1，进样量1微升

2.具体操作如下

(1)气相小瓶的制备：从-80℃冰箱取出12、24、36、48、60、72h的样品，融化后从5mL发酵液中取1mL于1.5mL离心管中，记好标记，用l mL针管吸出，通过滤膜打入到气相小瓶中，制备成样品。

(2)标品的制备：丁醇10g/L，乙醇2g/L，丙酮4g/L，乙偶姻2g/L，乙酸2g/L，丁酸2g/L，1,4-丁二醇2g/L。取配置后的标准溶液通过滤膜打入到气相小瓶中，制备成标品。

(3)产物定量：1.4丁二醇产量＝(标品中1,4-丁二醇的含量/标品的出峰面积)*(样品的出峰面积)

图6为1,4-丁二醇标品的气相色谱图，表明1,4-丁二醇的出峰时间在11.069左右。图7为野生菌发酵后的气相图谱，可发现野生菌本身并不产生1,4-丁二醇。图8为仅表达4HBD基因的重组菌发酵后的气相色谱图。图9为敲除了etfA基因后表达4HBD的重组菌发酵后的气相色谱图。

表1实验中最终1,4-丁二醇的产量

检测结果见表1，从表1中可以看出，相比于仅4HBD基因过表达后1，4-丁二醇产量，在敲除eftA后的表达4HBD的突变菌的1.4丁二醇产量提升很高，其中，以Cbei-2100表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶，产物1,4-丁二醇的产量最高，达到66mg/L，且在eftA失活后，1,4-丁二醇的产量达到182mg/L。

本发明提供了一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 4-羟基丁酰辅酶A脱水酶(cbei_2100)

<400> 1

atgccattaa aaacaaagga acaatatatt gaaagcctta gaaagttaaa cctaaaagtg 60

tacatgtttg gaaaaccagt tgacaatgtt gttgataatc caatcataag accatctctt 120

aattcagttg ctatgactta tgaattagca caaatgccag agtatgaaga tttaatgaca 180

gctacttcta atttaacagg ggaaaaagta aatagatttg ctcatttaca tcaaagcaca 240

gatgatctta ttaaaaaagt aaagatgcaa agattacttg gtcaaaaaac cgcatcatgt 300

ttccaaaggt gcgttggtat ggatgctttt aatgcattat acagttcaac atacgaaata 360

gataaagcgt gtggaacaaa ttatcatgaa aactttaata agtttttaaa atatgttcaa 420

gaaaacgact taaccgttga tggtgcaatg actgatccta aaggggacag aggattatcg 480

ccaagtaaac aagctgatgg agatttatac ttaagggttg ttgaaagaag agaagatggg 540

gtagttgtta gaggagcaaa atgtcaccaa actggaatgt taaattctca tgaggtagta 600

gtaatgccaa caatagcatt aactccaaat gataaggatt gggcaatatc ttttgcagtg 660

cctacagatg ctgaaggaat aattcatata tatggaaggc aatcttgtga tacaagaaaa 720

ttggagccag gtgctgatat agatcttgga aatgctgaat ttggtggaca agaaacatta 780

acaatatttg ataatgtatt tgtaccaaat gaaagaattt tcttaaatgg agaaactgat 840

tttgctggaa tgatagttga aagatttgca ggatatcata gacaaagtta tggtggatgc 900

aaagtcggag ttggagatgt tctaattgga gctgctgcag tagctgctga ttataatgga 960

gctcacaaag catctcatgt taaagataaa ttaatagaaa tgactcactt aaatgaaact 1020

ttattctctt gtggtattgc atgttcagca atgggttcta aaacagaagc tggaaattat 1080

tatattgata atctgctagc aaatgtatgt aagcaaaatg ttacaagatt cccttatgaa 1140

atatgtagac ttgcagaaga tattgctgga ggaatcatgg tgactatgcc atcagaagca 1200

gattttaaag atgaaaagat aggtccatat atagataaat atttgagagg tgtaaactca 1260

gtttcaacag aaaatagaat gagaatatta agattaatag aaaatatttg tttagggact 1320

gcagctgtcg gatatagaac agaatcaatg catggagctg gatcaccaca agctcaaaga 1380

attatgatag ctagacaagg aaatttagca gctaaaaaga aaatagctaa gaaaatagct 1440

agaattaaag aataa 1455

<210> 2

<211> 1455

<212> DNA

<213> 4-羟基丁酰辅酶A脱水酶(ckl_3020)

<400> 2

atgtctttaa tgactgggga agaatatgta gaaagtttac gtaaattaaa attaaacgtt 60

tattatctgg gagagaaaat agataatcca gtggataacc ctgtacttcg tccatcttta 120

aattctgtta agatgactta tgacttggcc caagaagcag aatatgagga tttaatgaca 180

acaacatcaa atataacagg tgaaaaaata aatagattta caaatttaca tcaaagcagt 240

gaagatttgg taaaaaaagt taaaatgcag agattgtgcg gacaaaaaac tgcagcctgt 300

ttccaaagat gcgttggtat ggactcattt aatgcagtgt acagtactac ttttgaaata 360

gataaggaat ataatacaaa ttattttgaa aatttcaaga aatttttaac ttatgttcaa 420

aagaacgatt taacagtaga tggagctatg acagatccaa aaggagacag aggattgtca 480

ccaagcaaac aggctgatcc agatttatat ttaagagttg tagaaagaag agaagacggt 540

gtagttgtaa gaggagcaaa ggctcaccag acaggtatat gtaattctca tgaagtattg 600

gttatgccaa ctattgctat gagaccggat gataaagatt atgcaatagc tttttctgtt 660

cctacagatg cagaaggaat aactatgata attggaagac agtcctgtga tactagaaaa 720

atggaaaaag atgcggacat agatgttggt aataaagaat ttggcggagt agaagcatta 780

gtagtatttg acgatgtatt tgttccaaat gacaggatat tcttaaatgg tgaaactgaa 840

tatgcaggaa tgttagtaga gagatttgca ggatatcata gacaaagtta tggtggatgc 900

aaagtaggag tgggagatgt attgataggc gctgctgcag tggctgcaga ctataatgga 960

gctgcaaagg catctcacat aaaggataaa ttaatagaaa tgatgcattt aaatgaaact 1020

ctttacgctt gcggaattgc gtgctcagca gaaggacatg caacaaaagc tggaaattac 1080

caaatagact tgcttcttgc aaatgtatgt aagcaaaata taacaagatt cccttatgaa 1140

attgtgagat tagcagaaga tatagcagga ggattaatgg ttactatgcc ttctgaaaag 1200

gattataaga gtccagaggt tggaaaatat gtagagaagt acttggtggg agttgcatcc 1260

gtacctgttg aagacagaat gaagatatta agattattag aaaatatatg tcttggaacg 1320

gctgcagtag gatatagaac tgaatccatg catggagcag gttcacctca agcacagaga 1380

ataatgatat caagacaggg aaacctagca cataagaaga aacttgcaaa gaagatagct 1440

agaatagaag attaa 1455

<210> 3

<211> 430

<212> PRT

<213> 4-羟基丁酰辅酶A脱水酶(abfD)

<400> 3

Met Leu Met Thr Ala Glu Gln Tyr Ile Glu Ser Leu Arg Lys Leu Asn

1 5 10 15

Thr Arg Val Tyr Met Phe Gly Glu Lys Ile Glu Asn Trp Val Asp His

20 25 30

Pro Met Ile Arg Pro Ser Ile Asn Cys Val Ala Met Thr Tyr Glu Leu

35 40 45

Ala Gln Asp Pro Gln Tyr Ala Asp Leu Met Thr Thr Lys Ser Asn Leu

50 55 60

Ile Gly Lys Thr Ile Asn Arg Phe Ala Asn Leu His Gln Ser Thr Asp

65 70 75 80

Asp Leu Arg Lys Lys Val Lys Met Gln Arg Leu Leu Gly Gln Lys Thr

85 90 95

Ala Ser Cys Phe Gln Arg Cys Val Gly Met Asp Ala Phe Asn Ala Val

100 105 110

Phe Ser Thr Thr Tyr Glu Ile Asp Gln Lys Tyr Gly Thr Asn Tyr His

115 120 125

Lys Asn Phe Thr Glu Tyr Leu Lys Tyr Ile Gln Glu Asn Asp Leu Ile

130 135 140

Val Asp Gly Ala Met Thr Asp Pro Lys Gly Asp Arg Gly Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ser Ala Gln Lys Asp Pro Asp Leu Phe Leu Arg Ile Val Glu Lys Arg

165 170 175

Glu Asp Gly Ile Glu Glu Gly Ala Asp Ile Asp Leu Gly Asn Lys Gln

180 185 190

Phe Gly Gly Gln Glu Ala Leu Val Val Phe Asp Asn Val Phe Ile Pro

195 200 205

Asn Asp Arg Ile Phe Leu Cys Gln Glu Tyr Asp Phe Ala Gly Met Met

210 215 220

Val Glu Arg Phe Ala Gly Tyr His Arg Gln Ser Tyr Gly Gly Cys Lys

225 230 235 240

Val Gly Val Gly Asp Val Val Ile Gly Ala Ala Ala Leu Ala Ala Asp

245 250 255

Tyr Asn Gly Ala Gln Lys Ala Ser His Val Lys Asp Lys Leu Ile Glu

260 265 270

Met Thr His Leu Asn Glu Thr Leu Tyr Cys Cys Gly Ile Ala Cys Ser

275 280 285

Ala Glu Gly Tyr Pro Thr Ala Ala Gly Asn Tyr Gln Ile Asp Leu Leu

290 295 300

Leu Ala Asn Val Cys Lys Gln Asn Ile Thr Arg Phe Pro Tyr Glu Ile

305 310 315 320

Val Arg Leu Ala Glu Asp Ile Ala Gly Gly Leu Met Val Thr Met Pro

325 330 335

Ser Glu Ala Asp Phe Lys Ser Glu Thr Val Val Gly Arg Asp Gly Glu

340 345 350

Thr Ile Gly Asp Phe Cys Asn Lys Phe Phe Ala Ala Ala Pro Thr Cys

355 360 365

Thr Thr Glu Glu Arg Met Arg Val Leu Arg Phe Leu Glu Asn Ile Cys

370 375 380

Leu Gly Ala Ser Ala Val Gly Tyr Arg Thr Glu Ser Met His Gly Ala

385 390 395 400

Gly Ser Pro Gln Ala Gln Arg Ile Met Ile Ala Arg Gln Gly Asn Ile

405 410 415

Asn Ala Lys Lys Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Gly Ile Lys

420 425 430

<210> 4

<211> 1455

<212> DNA

<213> 4-羟基丁酰辅酶A脱水酶(lf65-02412)

<400> 4

atgccattaa aaacaaagga acaatatatt gaaagtctta ggaagttaaa cctaaaagtg 60

tacatgtttg gaaaaccagt tgacaatgtt gttgataatc caatcataag accatctctt 120

aattcggttg ctatgactta tgaattagca caaatgccag agcatgaaga tttaatgaca 180

gctacttcta atttaacagg ggaaaaagta aatagatttg ctcatttaca tcaaagcaca 240

gatgatctta ttaaaaaagt aaagatgcaa agattacttg gtcaaaaaac cgcatcatgt 300

ttccaaaggt gcgttggtat ggatgctttt aatgcactat acagttcaac atacgaaata 360

gataaagcgt gtggaacaaa ttatcatgaa aactttaata agtttttaaa atatgttcaa 420

gaaaacgact taaccgttga tggtgcaatg actgatccta agggggacag aggattatcg 480

ccaagtaaac aagctgatgg agatttatac ttaagggttg ttgaaagaag agaagatggg 540

gtagttgtta gaggagcaaa atgtcaccaa actggaatgt taaattctca tgaggtagta 600

gtaatgccaa caatagcatt aactccaaat gataaggatt gggcaatatc ttttgcagtg 660

cctacagatg ctgaaggaat aattcatata tacggaaggc aatcttgtga tacaagaaaa 720

ctagaaccag gtgcagatat agatcttgga aacgctgaat ttggtggaca agaaacatta 780

acaatatttg ataatgtatt tgtaccaaat gaaagaattt tcttaaatgg agagactgat 840

tttgctggaa tgatcgttga aagatttgca ggatatcata gacaaagtta tggtggatgt 900

aaagttggag ttggagatgt tctaattgga gctgctgcag tagctgctga ttataacgga 960

gctcacaaag catctcatgt taaagataaa ttaatagaaa tgactcactt aaatgaaact 1020

ttattctctt gtggtattgc atgttcagca atgggttcta aaacagaagc tggaaattat 1080

tatattgata atttgctagc aaatgtatgt aagcaaaatg ttacaagatt cccttatgaa 1140

atatgtagac ttgcagaaga tattgcagga ggaatcatgg ttactatgcc atcagaagct 1200

gactttaaag atgaaaagat aggaccatat atagataaat atttgagagg tgtaaactca 1260

gtttcaacag aaaatagaat gagaatatta agattaatag aaaatatttg tttaggaact 1320

gcagctgtcg gatatagaac agaatcaatg catggagcag gatcaccaca agctcaaaga 1380

attatgatag ctagacaagg aaatttagca gctaaaaaga aaatagctaa gaaaatagct 1440

agaattgaag aataa 1455

<210> 5

<211> 1455

<212> DNA

<213> 4-羟基丁酰辅酶A脱水酶(ctk-c07640)

<400> 5

atggctttaa tgacaggaga acaatatgta gaaagtatac gtaaattaaa tttaaatatt 60

tatatgttgg gagataaggt agacagtccg gtggacaatc ctatacttcg tccatcattg 120

aattctgtaa agatgactta tgaattggct cagcaacctg agtatgagga tttaatgaca 180

acgacttcaa acttaacagg taaaaaaata aatagattta caaatttaca tcagaattca 240

gaggatctag ttaaaaaagt aaagatgcag agattactag gacaaaaaac agctgcctgt 300

tttcaaagat gtgttggaat ggatgctttt aatgcagttt atagtactac ttatgaagtg 360

gacaaggaat ataaaacaaa ttattttgaa aatttcaaga agtttttagc atacgtacag 420

gacaatgatt taactgtaga tggagctatg actgatccga aaggtgacag aggactttca 480

ccaagtaaac aggctgatcc tgatttatac ctgagagtag tagagagaag gcctgatgga 540

attgttgtaa gaggtgccaa agctcatcaa acaggcattt gtaattctca tgaggtactt 600

gtaatgccaa cagtagccat gagaccagaa gataaagact atgctgtagc attttcagta 660

cctacagata caaagggaat aactatgata attggcagac aatcctgtga cactagaaag 720

tctgaaaaaa atgcagacat agatgttgga aacaaggtat ttggtggagt agaggcttta 780

gttgtatttg atgatgtatt tgtaccaaat gacaggatat ttttaaatgg tgaaagtgaa 840

tatgcaggga tgcttgtaga aaggtttgca ggatatcata gacagagtta tggtggatgc 900

aaagttggtg taggtgatgt cttgatagga gctgctgcat tggctgcaga ttataatgga 960

gcagcaagag catctcatat aaaggataaa ctaatagaaa tgacacattt aaatgaaact 1020

ctatatgcat gtggaattgc atgttctgca gaagggcatc caactaaggc aggaaactat 1080

gaaataaatt tacttcttgc aaatgtatgt aaacaaaatg taactagatt tccatatgaa 1140

atagtaagat tggcagaaga tatagcaggt ggattaatgg ttactcttcc atctgaaaaa 1200

gactataaca atcctgaaac taaaggatat atagagaagt atttagtagg agttaattct 1260

gtatctacag aaaatagaat gagaatattg agattaatag aaaacttaag tcttggaact 1320

gcagcagtag gctacagaac cgaatcaatg cacggagcag gttcaccaca agcccagaga 1380

ataatgatat caagacaggg taatcttcct gctaagaaga aattggcaaa agctatagct 1440

agaatagaag aatag 1455

<210> 6

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 6

atgaataaag cagattacaa gggcgtatgg gtgtttgctg aacaaagaga cggagaatta 60

caaaaggtat cattggaatt attaggtaaa ggtaaggaaa tggctgagaa attaggcgtt 120

gaattaacag ctgttttact tggacataat actgaaaaaa tgtcaaagga tttattatct 180

catggagcag ataaggtttt agcagcagat aatgaacttt tagcacattt ttcaacagat 240

ggatatgcta aagttatatg tgatttagtt aatgaaagaa agccagaaat attattcata 300

ggagctactt tcataggaag agatttagga ccaagaatag cagcaagact ttctactggt 360

ttaactgctg attgtacatc acttgacata gatgtagaaa atagagattt attggctaca 420

agaccagcgt ttggtggaaa tttgatagct acaatagttt gttcagacca cagaccacaa 480

atggctacag taagacctgg tgtgtttgaa aaattacctg ttaatgatgc aaatgtttct 540

gatgataaaa tagaaaaagt tgcaattaaa ttaacagcat cagacataag aacaaaagtt 600

tcaaaagttg ttaagcttgc taaagatatt gcagatatcg gagaagctaa ggtattagtt 660

gctggtggta gaggagttgg aagcaaagaa aactttgaaa aacttgaaga gttagcaagt 720

ttacttggtg gaacaatagc cgcttcaaga gcagcaatag aaaaagaatg ggttgataag 780

gaccttcaag taggtcaaac tggtaaaact gtaagaccaa ctctttatat tgcatgtggt 840

atatcaggag ctatccagca tttagcaggt atgcaagatt cagattacat aattgctata 900

aataaagatg tagaagcccc aataatgaag gtagcagatt tggctatagt tggtgatgta 960

aataaagttg taccagaatt aatagctcaa gttaaagctg ctaataatta a 1011

<210> 7

<211> 4040

<212> DNA

<213> 载体质粒(PSY8)

<400> 7

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 60

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 120

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtttatgtt 180

acagtaatat tgacttttaa aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc 240

tcctaaattc actttagata aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg 300

atttagacaa ttggaagaga aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt 360

ttagtataac cacagaaatt gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat 420

ataaatttta ccctgcattt attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt 480

ttagaactgg ttacaatagc gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt 540

atacaatttt tgatggtgta tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg 600

acttcaaaga gttttatgat ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga 660

aattgtttcc caaaacacct atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga 720

cttcatttac tgggtttaac ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta 780

ttacagcagg aaaattcatt aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg 840

tacatcattc tgtttgtgat ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat 900

tgtcagatag gcctaatgac tggcttttat aaatcgatta tgtcttttgc gcattcactt 960

cttttctata taaatatgag cgaagcgaat aagcgtcgga aaagcagcaa aaagtttcct 1020

ttttgctgtt ggagcatggg ggttcagggg gtgcagtatc tgacgtcaat gccgagcgaa 1080

agcgagccga agggtagcat ttacgttaga taaccccctg atatgctccg acgctttata 1140

tagaaaagaa gattcaacta ggtaaaatct taatataggt tgagatgata aggtttataa 1200

ggaatttgtt tgttctaatt tttcactcat tttgttctaa tttcttttaa caaatgttct 1260

ttttttttta gaacagttat gatatagtta gaatagttta aaataaggag tgagaaaaag 1320

atgaaagaaa gatatggaac agtctataaa ggctctcaga ggctcataga cgaagaaagt 1380

ggagaagtca tagaggtaga caagttatac cgtaaacaaa cgtctggtaa cttcgtaaag 1440

gcatatatag tgcaattaat aagtatgtta gatatgattg gcggaaaaaa acttaaaatc 1500

gttaactata tcctagataa tgtccactta agtaacaata caatgatagc tacaacaaga 1560

gaaatagcaa aagctacagg aacaagtcta caaacagtaa taacaacact taaaatctta 1620

gaagaaggaa atattataaa aagaaaaact ggagtattaa tgttaaaccc tgaactacta 1680

atgagaggcg acgaccaaaa acaaaaatac ctcttactcg aatttgggaa ctttgagcaa 1740

gaggcaaatg aaatagattg acctcccaat aacaccacgt agttattggg aggtcaatct 1800

atgaaatgcg attaagcttg gctgcaggtc gacggatccc cgggaattct ataaaatata 1860

aataattttc taaaaaactt aacttcatgt gaaaagtttg ttaaaatata aatgagcacg 1920

ttaatcattt aacatagata attaaatagt aaaagggagt gtcgacatat ggtgcactct 1980

cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 2040

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 2100

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 2160

gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 2220

gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2280

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 2340

aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 2400

attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 2460

tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 2520

gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 2580

cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 2640

tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 2700

agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 2760

tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 2820

tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 2880

tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 2940

acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 3000

accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 3060

tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 3120

cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 3180

tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 3240

actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 3300

tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3360

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3420

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3480

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt 3540

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3600

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3660

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3720

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3780

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3840

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3900

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3960

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 4020

ttttgctcac atgttctttc 4040

<210> 8

<211> 309

<212> DNA

<213> 内含子(DNA)

<400> 8

ttatccttaa ttgccgatat cgtgcgccca gatagggtgt taagtcaagt agtttaaggt 60

actactctgt aagataacac agaaaacagc caacctaacc gaaaagcgaa agctgatacg 120

ggaacagagc acggttggaa agcgatgagt tacctaaaga caatcgggta cgactgagtc 180

gcaatgttaa tcagatataa ggtataagtt gtgtttactg aacgcaagtt tctaatttcg 240

gttgcaatcc gatagaggaa agtgtctgaa acctctagta caaagaaagg taagttaccg 300

atatcgact 309

<210> 9

<211> 8925

<212> DNA

<213> 敲除质粒(PMTL007C-E2)

<400> 9

cctgcagggt gtagtagcct gtgaaataag taaggaaaaa aaagaagtaa gtgttatata 60

tgatgattat tttgtagatg tagataggat aatagaatcc atagaaaata taggttatac 120

agttatataa aaattacttt aaaaattaat aaaaacatgg taaaatataa atcgtataaa 180

gttgtgtaat ttttaagctt gagctcataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 240

gattacggat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 300

ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 360

ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gctaataaag 420

atcttgtaca atctgtagga gaacctatgg gaacgaaacg aaagcgatgc cgagaatctg 480

aatttaccaa gacttaacac taactgggga taccctaaac aagaatgcct aatagaaagg 540

aggaaaaagg ctatagcact agagcttgaa aatcttgcaa gggtacggag tactcgtagt 600

agtctgagaa gggtaacgcc ctttacatgg caaaggggta cagttattgt gtactaaaat 660

taaaaattga ttagggagga aaacctcaaa atgaaaccaa caatggcaat tttagaaaga 720

atcagtaaaa attcacaaga aaatatagac gaagttttta caagacttta tcgttatctt 780

ttacgtccag atatttatta cgtggcgacg cgtgaagttc ctatactttc tagagaatag 840

gaacttcgcg actcatagaa ttatttcctc ccgttaaata atagataact attaaaaata 900

gacaatactt gctcataagt aacggtactt aaattgttta ctttggcgtg tttcattgct 960

tgatgaaact gatttttagt aaacagttga cgatattctc gattgaccca ttttgaaaca 1020

aagtacgtat atagcttcca atatttatct ggaacatctg tggtatggcg ggtaagtttt 1080

attaagacac tgtttacttt tggtttagga tgaaagcatt ccgctggcag cttaagcaat 1140

tgctgaatcg agacttgagt gtgcaagagc aaccctagtg ttcggtgaat atccaaggta 1200

cgcttgtaga atccttcttc aacaatcaga tagatgtcag acgcatggct ttcaaaaacc 1260

acttttttaa taatttgtgt gcttaaatgg taaggaatac tcccaacaat tttatacctc 1320

tgtttgttag ggaattgaaa ctgtagaata tcttggtgaa ttaaagtgac acgagtattc 1380

agttttaatt tttctgacga taagttgaat agatgactgt ctaattcaat agacgttacc 1440

tgtttactta ttttagccag tttcgtcgtt aaatgccctt tacctgttcc aatttcgtaa 1500

acggtatcgg tttcttttaa attcaattgt tttattattt ggttgagtac tttttcactc 1560

gttaaaaagt tttgagaata ttttatattt ttgttcatac cagcaccaga agcaccagca 1620

tctcttgggt taattgaggc ctgagtataa ggtgacttat acttgtaatc tatctaaacg 1680

gggaacctct ctagtagaca atcccgtgct aaattgtagg actgcccttt aataaatact 1740

tctatattta aagaggtatt tatgaaaagc ggaatttatc agattaaaaa tactttctct 1800

agagaaaatt tcgtctggat tagttactta tcgtgtaaaa tctgataaat ggaattggtt 1860

ctacataaat gcctaacgac tatccctttg gggagtaggg tcaagtgact cgaaacgata 1920

gacaacttgc tttaacaagt tggagatata gtctgctctg catggtgaca tgcagctgga 1980

tataattccg gggtaagatt aacgacctta tctgaacata atgccatatg aatccctcct 2040

aatttatacg ttttctctaa caacttaatt atacccacta ttattatttt tatcaatata 2100

gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcacgcgt tgggaaatgg caatgatagc 2160

gaaacaacgt aaaactcttg ttgtatgctt tcattgtcat cgtcacgtga ttcataaaca 2220

caagtgaatg tcgacagtga atttttacga acgaacaata acagagccgt atactccgag 2280

aggggtacgt acggttcccg aagagggtgg tgcaaaccag tcacagtaat gtgaacaagg 2340

cggtacctcc ctacttcacc atatcatttt ctgcagcccc ctagaaataa ttttgtttaa 2400

ctttaagaag gagatataca tatatggcta gatcgtccat tccgacagca tcgccagtca 2460

ctatggcgtg ctgctagcgc tatatgcgtt gatgcaattt ctatgcactc gtagtagtct 2520

gagaagggta acgcccttta catggcaaag gggtacagtt attgtgtact aaaattaaaa 2580

attgattagg gaggaaaacc tcaaaatgaa accaacaatg gcaattttag aaagaatcag 2640

taaaaattca caagaaaata tagacgaagt ttttacaaga ctttatcgtt atcttttacg 2700

tccagatatt tattacgtgg cgtatcaaaa tttatattcc aataaaggag cttccacaaa 2760

aggaatatta gatgatacag cggatggctt tagtgaagaa aaaataaaaa agattattca 2820

atctttaaaa gacggaactt actatcctca acctgtacga agaatgtata ttgcaaaaaa 2880

gaattctaaa aagatgagac ctttaggaat tccaactttc acagataaat tgatccaaga 2940

agctgtgaga ataattcttg aatctatcta tgaaccggta ttcgaagatg tgtctcacgg 3000

ttttagacct caacgaagct gtcacacagc tttgaaaaca atcaaaagag agtttggcgg 3060

cgcaagatgg tttgtggagg gagatataaa aggctgcttc gataatatag accacgttac 3120

actcattgga ctcatcaatc ttaaaatcaa agatatgaaa atgagccaat tgatttataa 3180

atttctaaaa gcaggttatc tggaaaactg gcagtatcac aaaacttaca gcggaacacc 3240

tcaaggtgga attctatctc ctcttttggc caacatctat cttcatgaat tggataagtt 3300

tgttttacaa ctcaaaatga agtttgaccg agaaagtcca gaaagaataa cacctgaata 3360

tcgggagctc cacaatgaga taaaaagaat ttctcaccgt ctcaagaagt tggagggtga 3420

agaaaaagct aaagttcttt tagaatatca agaaaaacgt aaaagattac ccacactccc 3480

ctgtacctca cagacaaata aagtattgaa atacgtccgg tatgcggacg acttcattat 3540

ctctgttaaa ggaagcaaag aggactgtca atggataaaa gaacaattaa aactttttat 3600

tcataacaag ctaaaaatgg aattgagtga agaaaaaaca ctcatcacac atagcagtca 3660

acccgctcgt tttctgggat atgatatacg agtaaggaga tctggaacga taaaacgatc 3720

tggtaaagtc aaaaagagaa cactcaatgg gagtgtagaa ctccttattc ctcttcaaga 3780

caaaattcgt caatttattt ttgacaagaa aatagctatc caaaagaaag atagctcatg 3840

gtttccagtt cacaggaaat atcttattcg ttcaacagac ttagaaatca tcacaattta 3900

taattctgaa ctccgcggga tttgtaatta ctacggtcta gcaagtaatt ttaaccagct 3960

caattatttt gcttatctta tggaatacag ctgtctaaaa acgatagcct ccaaacataa 4020

gggaacactt tcaaaaacca tttccatgtt taaagatgga agtggttcgt gggggatccc 4080

gtatgagata aagcaaggta agcagcgccg ttattttgca aattttagtg aatgtaaatc 4140

cccttatcaa tttacggatg agataagtca agctcctgta ttgtatggct atgcccggaa 4200

tactcttgaa aacaggttaa aagctaaatg ttgtgaatta tgtgggacgt ctgatgaaaa 4260

tacttcctat gaaattcacc atgtcaataa ggtcaaaaat cttaaaggca aagaaaaatg 4320

ggaaatggca atgatagcga aacaacgtaa aactcttgtt gtatgctttc attgtcatcg 4380

tcacgtgatt cataaacaca agtgaatgtc gagcacccgt tctcggagca ctgtccgacc 4440

gctttggccg ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga 4500

tcatggcgac cacacccgtc ctgtggatcg ccaagccgcc gatggtagtg tggggtctcc 4560

ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact 4620

gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc 4680

cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc 4740

cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt 4800

ttctacaaac tcttcctgtc gtcatatcta caagccatcc ccccacagat acgggcgcgc 4860

cgccattatt tttttgaaca attgacaatt catttcttat tttttattaa gtgatagtca 4920

aaaggcataa cagtgctgaa tagaaagaaa tttacagaaa agaaaattat agaatttagt 4980

atgattaatt atactcattt atgaatgttt aattgaatac aaaaaaaaat acttgttatg 5040

tattcaatta cgggttaaaa tatagacaag ttgaaaaatt taataaaaaa ataagtcctc 5100

agctcttata tattaagcta ccaacttagt atataagcca aaacttaaat gtgctaccaa 5160

cacatcaagc cgttagagaa ctctatctat agcaatattt caaatgtacc gacatacaag 5220

agaaacatta actatatata ttcaatttat gagattatct taacagatat aaatgtaaat 5280

tgcaataagt aagatttaga agtttatagc ctttgtgtat tggaagcagt acgcaaaggc 5340

ttttttattt gataaaaatt agaagtatat ttattttttc ataattaatt tatgaaaatg 5400

aaagggggtg agcaaagtga cagaggaaag cagtatctta tcaaataaca aggtattagc 5460

aatatcatta ttgactttag cagtaaacat tatgactttt atagtgcttg tagctaagta 5520

gtacgaaagg gggagcttta aaaagctcct tggaatacat agaattcata aattaattta 5580

tgaaaagaag ggcgtatatg aaaacttgta aaaattgcaa agagtttatt aaagatactg 5640

aaatatgcaa aatacattcg ttgatgattc atgataaaac agtagcaacc tattgcagta 5700

aatacaatga gtcaagatgt ttacataaag ggaaagtcca atgtattaat tgttcaaaga 5760

tgaaccgata tggatggtgt gccataaaaa tgagatgttt tacagaggaa gaacagaaaa 5820

aagaacgtac atgcattaaa tattatgcaa ggagctttaa aaaagctcat gtaaagaaga 5880

gtaaaaagaa aaaataattt atttattaat ttaatattga gagtgccgac acagtatgca 5940

ctaaaaaata tatctgtggt gtagtgagcc gatacaaaag gatagtcact cgcattttca 6000

taatacatct tatgttatga ttatgtgtcg gtgggacttc acgacgaaaa cccacaataa 6060

aaaaagagtt cggggtaggg ttaagcatag ttgaggcaac taaacaatca agctaggata 6120

tgcagtagca gaccgtaagg tcgttgttta ggtgtgttgt aatacatacg ctattaagat 6180

gtaaaaatac ggataccaat gaagggaaaa gtataatttt tggatgtagt ttgtttgttc 6240

atctatgggc aaactacgtc caaagccgtt tccaaatctg ctaaaaagta tatcctttct 6300

aaaatcaaag tcaagtatga aatcataaat aaagtttaat tttgaagtta ttatgatatt 6360

atgtttttct attaaaataa attaagtata tagaatagtt taataatagt atatacttaa 6420

tgtgataagt gtctgacagt gtcacagaaa ggatgattgt tatggattat aagcggccgg 6480

ccagtgggca agttgaaaaa ttcacaaaaa tgtggtataa tatctttgtt cattagagcg 6540

ataaacttga atttgagagg gaacttagat ggtatttgaa aaaattgata aaaatagttg 6600

gaacagaaaa gagtattttg accactactt tgcaagtgta ccttgtacct acagcatgac 6660

cgttaaagtg gatatcacac aaataaagga aaagggaatg aaactatatc ctgcaatgct 6720

ttattatatt gcaatgattg taaaccgcca ttcagagttt aggacggcaa tcaatcaaga 6780

tggtgaattg gggatatatg atgagatgat accaagctat acaatatttc acaatgatac 6840

tgaaacattt tccagccttt ggactgagtg taagtctgac tttaaatcat ttttagcaga 6900

ttatgaaagt gatacgcaac ggtatggaaa caatcataga atggaaggaa agccaaatgc 6960

tccggaaaac atttttaatg tatctatgat accgtggtca accttcgatg gctttaatct 7020

gaatttgcag aaaggatatg attatttgat tcctattttt actatgggga aatattataa 7080

agaagataac aaaattatac ttcctttggc aattcaagtt catcacgcag tatgtgacgg 7140

atttcacatt tgccgttttg taaacgaatt gcaggaattg ataaatagtt aacttcaggt 7200

ttgtctgtaa ctaaaaacaa gtatttaagc aaaaacatcg tagaaatacg gtgttttttg 7260

ttaccctaag tttaaactcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 7320

ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 7380

ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 7440

tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 7500

gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 7560

agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 7620

taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 7680

gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 7740

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 7800

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 7860

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 7920

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 7980

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 8040

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 8100

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcagggcccc 8160

ctgcttcggg gtcattatag cgattttttc ggtatatcca tcctttttcg cacgatatac 8220

aggattttgc caaagggttc gtgtagactt tccttggtgt atccaacggc gtcagccggg 8280

caggataggt gaagtaggcc cacccgcgag cgggtgttcc ttcttcactg tcccttattc 8340

gcacctggcg gtgctcaacg ggaatcctgc tctgcgaggc tggccggcta ccgccggcgt 8400

aacagatgag ggcaagcgga tggctgatga aaccaagcca accaggaagg gcagcccacc 8460

tatcaaggtg tactgccttc cagacgaacg aagagcgatt gaggaaaagg cggcggcggc 8520

cggcatgagc ctgtcggcct acctgctggc cgtcggccag ggctacaaaa tcacgggcgt 8580

cgtggactat gagcacgtcc gcgagctggc ccgcatcaat ggcgacctgg gccgcctggg 8640

cggcctgctg aaactctggc tcaccgacga cccgcgcacg gcgcggttcg gtgatgccac 8700

gatcctcgcc ctgctggcga agatcgaaga gaagcaggac gagcttggca aggtcatgat 8760

gggcgtggtc cgcccgaggg cagagccatg acttttttag ccgctaaaac ggccgggggg 8820

tgcgcgtgat tgccaagcac gtccccatgc gctccatcaa gaagagcgac ttcgcggagc 8880

tggtgaagta catcaccgac gagcaaggca agaccgatcg ggccc 8925

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 上游引物(etfA-F)

<400> 10

acagaccaca aatggctac 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物(etfA-R)

<400> 11

tgaatcttgc atacctgcta 20

Claims (8)

1.一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌，其特征在于，所述的重组丁醇梭菌是通过在丁醇梭菌中表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶构建得到的；

其中，所述的丁醇梭菌为ATCC824；

其中，所述的表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶是通过cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640中的任意一种的基因片段表达；其中，所述cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640基因片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

2.权利要求1所述的产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640中的任意一种的基因片段***到载体质粒的酶切位点后，得到重组质粒；

（2）将步骤（1）得到的重组质粒进行甲基化，得到甲基化的重组质粒；

（3）将步骤（2）得到的甲基化的重组质粒转至丙酮丁醇梭菌中，筛选即得。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的载体质粒为PSY8，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求1所述的产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌，其特征在于，所述的重组丁醇梭菌中etfA基因失活，所得重组丁醇梭菌中etfA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.权利要求4所述的产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌的构建方法，其特征在于，etfA基因失活的重组丁醇梭菌的构建方法为利用二型内含子基因敲除技术将SEQ ID NO.8所示的内含子序列***etfA基因的第639 bp和第640 bp之间。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的二型内含子基因敲除技术包括如下步骤：

（1）将SEQ ID NO.8所示的内含子序列构建到基因敲除质粒中，得到重组质粒；

（2）将步骤（1）得到的重组质粒转化丙酮丁醇梭菌，筛选得到etfA基因失活的菌株。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的基因敲除质粒为PMTL007C-E2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

8.权利要求1所述重组丁醇梭菌在制备1,4-丁二醇中的应用。

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