CN107267499A - 制备环状dna或rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种高浓度环状DNA或RNA的制备方法。包括以下步骤：将成环反应所需的辅助模板DNA(下统称splint)、连接酶、连接酶的缓冲液混合配制成初始体系；将单链DNA或者RNA(下统称成环链)和连接酶的缓冲液配制成添加液；每间隔一定时间，向初始体系中添加一定量的含成环链的添加液，每次添加新的成环链后，体系中成环链的浓度增加0.1‑5μM，如此反复数次；最后一次加入含成环链的添加液后，再反应2‑15h；体系中splint与成环链的浓度摩尔比为(1‑10):1。方法简单易操作，不需苛刻的条件，且可以实现超高成环链浓度(≥10μM)下，环状DNA或RNA环的高产率制备。
Description
技术领域
本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种环状DNA或RNA的制备方法。
背景技术
纳米技术是一种利用分子或原子来建构出可操控的纳米尺度结构或机械的新型技术。核酸因其序列可编程性、易操作性和自组装等特性而成为纳米技术中的常用材料。随着核酸自组装纳米技术的快速发展，环状DNA或RNA的互锁逐渐成为核酸纳米技术中除二维和三维 DNA折纸外的另一重要分支。这使得环状DNA或RNA的特性及其拓扑结构特点逐渐成为人们关注的热点。此外，对环状DNA或RNA的性质和拓扑结构的研究还与DNAzyme和RNAzyme的催化特性、滚环扩增等研究密切相关。
然而，这些研究面临的一个共同问题就是如何得到大量的单一的环状DNA或RNA。通常的成环方法是DNA模板链辅助的酶法连接成环，即通过一条与DNA或RNA成环链两端都互补的短链DNA模板将成环链的首尾相接，通过连接酶将成环链的两端相连形成环状 DNA或RNA(图1)。但在成环体系中，单链DNA或RNA在进行分子内连接形成单分子环的同时也会存在分子间连接，形成由多条DNA或RNA单链首尾相接而成的较大的多分子线性或环状DNA或RNA(下统称大分子副产物)，从而大大降低单分子环的产率。并且，随着DNA或RNA单链浓度的升高，副产物的比例会急剧增加，大大降低单环DNA或RNA 的产率。据报道，在以环状DNA为研究对象的实验中，大部分都是通过在低浓度底物的条件下(≤0.5μM)制备环状DNA，以减少副产物的产生(J.Am.Chem.Soc.,2008,130, 10882-10883；Nat.Commun.,2016,7.)。但是，这样就需要后期繁琐的浓缩和纯化步骤来得到单一的环状DNA，且产率较低。因此，控制DNA或RNA链的环化过程并提高单分子环的产率变得尤为重要。
显然，如果能提高高浓度底物下的环状DNA或RNA的产率甚至得到几乎无副产物的环状DNA或RNA将使其研究和应用大大简化，不但可以对其拓扑结构进行详细的研究，也可为环状DNA或RNA互锁和滚环扩增等研究提供大量的研究材料。
发明内容
针对DNA或RNA成环过程中存在的大分子副产物随着底物浓度的增加而急剧增加，单一环状DNA或RNA产率低、后期处理步骤繁琐的问题，本发明提供了一种环状DNA或RNA 的制备方法，在DNA模板链辅助的酶法连接成环过程中，能够减少或杜绝较高浓度单链DNA 或RNA成环过程中大分子副产物的产生，提高DNA环或RNA环的产率。
本发明采用的技术方案如下：
1.一种制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将成环反应所需的辅助模板DNA(下统称splint)、连接酶和连接酶反应的缓冲液混合配制成初始体系；将3’或5’端磷酸化修饰的单链DNA或者RNA(下统称成环链)中的一种和上述缓冲液配制成添加液；
步骤二，向初始体系中添加一定量的添加液，加入的成环链借助splint形成环状分子，间隔一段时间，待体系中已有的大部分成环链成环后，再次加入添加液，每次添加新的成环链后，体系中成环链的浓度增加0.1-5μM，如此反复数次；
步骤三，最后一次加入含成环链的添加液后，再反应2-15h；
初始体系中splint的摩尔浓度与成环链的摩尔浓度之比为(1-10):1。
进一步地，步骤二中两次加入添加液之间的间隔时间为10-60min。
进一步地，反应结束后最终体系中的环状分子、成环链及副产物的总浓度为1μM-30μM。
进一步地，所述成环链的长度25-200nt。
进一步地，所述的添加液中成环链的浓度为1-100μM。
进一步地，步骤一中所述的连接酶为可以连接双链DNA、双链RNA或DNA-RNA杂交链中的切刻部分的连接酶。
进一步地，步骤一中所述的连接酶为T4DNA Ligase、T4RNA Ligase、Taq DNALigase、 T3DNA Ligase、T7DNA Ligase、E.coli DNA Ligase中的任意一种。
进一步地，所述连接酶反应的缓冲液浓度为标准浓度的0.1～1倍。
进一步地，所述连接酶反应的缓冲液组成为20-40mM Tris-HCl(pH7-8@25℃),10mM MgCl2,DTT,0.5-1mM ATP。
进一步地，所述连接酶反应的缓冲液组成为30mM Tris-HCl(pH 8.0@25℃),4mMMgCl2, 1mM DTT,26μM NAD+。
本发明中的DNA成环链既包括单链DNA，还包括分子链上嵌有RNA序列的单链DNA。
在初始体系中，splint与成环链的摩尔比为1:1-10:1，splint少于单链DNA或RNA时，多条DNA或RNA链共用一条splint，会促进大分子副产物的产生，splint过多时，一条成环链两端带有两条splint会影响连接的效率。所述的缓冲液的种类和浓度需适合相应的连接酶的反应，并含有连接酶所需的离子以及ATP等辅酶。
向初始体系中添加一定量的含成环链的添加液，使其在低浓度下成环，当体系中已有的大部分成环链成环后再加入新的成环链，这样使得体系中成环链的浓度始终保持在较低的水平，并达到形成高浓度环状DNA或RNA的目的，此方法称为逐次加入法。
加入添加液的间隔时间为10-60min，时间太短则不足以使体系中已有的大部分成环链成环，时间过长会增加实验的持续时间；每次添加新的成环链后，体系中成环链的浓度增加0.1-5 μM，增加浓度太高会使得大分子副产物较多，增加浓度太低则导致最终得到的DNA或RNA 环的浓度过低。添加液的加入次数根据实际情况选择，通常加入次数为2-30次。
成环链的长度≥25nt，优选30-100nt。若成环链过短则会由于DNA或RNA的刚性过强而不易成环，而对于较长的DNA或RNA链，本身大分子副产物较少，不需要使用本方法。
当对环状DNA或RNA的纯度要求很高时，需要纯化。所述纯化方法包括：用PAGE切胶回收，HPLC纯化，或用外切酶去除未环化的DNA或RNA，酚-氯仿抽提除蛋白，再用乙醇沉淀浓缩或直接用切胶回收，以富集纯化环状DNA或RNA。
相对于现有的一次法成环，本发明制备环状DNA或RNA的方法简单易操作，不需苛刻的条件，且可以实现超高成环链浓度(≥10μM)下，环状DNA或RNA环的高产率制备。因此可以为纳米结构或滚环扩增等以环状DNA或RNA为研究对象的研究提供充足的实验材料。此外，对于某些较易成环的单链DNA或RNA，本方法还可几乎杜绝大分子副产物的产生，直接得到浓度较高的单一的环状DNA或RNA，因此后续只需简单的醇沉等纯化步骤就可直接使用，大大简化了环状DNA或RNA的制备过程。
附图说明
图1 DNA模板链辅助的酶法连接成环示意图以及大分子副产物示意图；
图2逐次加入法的操作示意图；
图3实施例1一次成环法对不同浓度成环链的成环结果图；
图4实施例1一次成环法与逐次加入法的结果比较图；
图5实施例1生成的DNA环的酶切结果图；
图6实施例2一次成环法与逐次加入法的结果比较图；
图7实施例3一次成环法与逐次加入法的结果比较图；
图8实施例4一次成环法与逐次加入法的结果比较图；
图9实施例5一次成环法与逐次加入法的结果比较图；
图10实施例6一次成环法与逐次加入法的结果比较图；
图11实施例7一次成环法与逐次加入法的结果比较图；
图12实施例8一次成环法与逐次加入法的结果比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
下述实施例采用的成环链和辅助模板DNA均购自苏州金唯智生物科技有限公司，为人工合成；T4DNA ligase和10×T4ligase buffer购自美国赛默飞世尔公司(ThermoScientific)；其他化合用品购自美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
实施例1
1)原料
成环链(5’→3’)：TCAGTGTTTTTTTCGTCGATTGCAGTAACTCCCCACAACCTCTTTTTCGATGCTTTTTTTGTGCGA(5’-磷酸化，长度为66nt，SEQ ID NO：1)
成环链上含有Taq I的酶切位点T↓CGA，因此后续可通过酶切实验确定DNA环的形成。
splint(5’→3’)：CACTGATCGCAC(长度为12nt,，SEQ ID NO：2)
来源：人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)
2)连接成环
一次法成环：将成环链一次性加入到反应体系中，初始状态时，体系中成环链的浓度为 10μM或者30μM，成环链与splint的摩尔比为1:2，2.5U T4DNA Ligase/μM成环链，1×T4 DNA连接酶缓冲液(Ligase Buffer)，总体积20μL；20℃条件下连接8h。
1×T4DNA Ligase Buffer组成：40mM Tris-HCl(pH7.8@25℃),10mM MgCl2,10mMDTT, 0.5mM ATP。
逐次加入法成环：
将成环反应所需的辅助模板DNA(下统称splint)、连接酶和连接酶反应的缓冲液混合配制成初始体系，该初始体系含40μM splint，1×T4DNA Ligase Buffer，50U T4DNALigase，总体积为20μL。配制含20μM成环链，1×T4DNA Ligase Buffer的添加液，总体积为20μL。 20℃温浴条件下，向初始体系中添加2μL添加液，加入的成环链借助splint形成环状分子，间隔15min，体系中已有的大部分成环链成环，再次加入添加液，如此反复添加10次后，20℃条件下连接8h。
参照上述方法配制初始体系和添加液。该初始体系含120μM splint，1×T4DNALigase Buffer，100U T4DNA Ligase，总体积为20μL。添加液含60μM成环链，1×T4DNALigase Buffer，总体积为20μL。20℃温浴条件下，向初始体系中添加2μL添加液，间隔15min，体系中已有的大部分成环链成环，再次加入添加液，如此反复添加10次后，20℃条件下连接8 h。
3)电泳检测
对不同单链DNA浓度下的成环结果进行11％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并使用Image Lab软件通过条带亮度对DNA环的产率进行定量。图3为不同浓度单链DNA的成环结果。结果显示，相比于单链DNA，DNA环的电泳速度明显变慢，说明连接反应完成。此外，单链DNA的浓度越高，DNA环的产率越低，大分子副产物越多。
图4为使用逐次加入法进行成环与一次法成环的比较。结果显示，逐次加入法可以大大降低副产物的产生。当单链DNA的浓度为10μM时，采用一次法成环DNA环的产率为56％，采用逐次加入法，DNA环的产率提高到89％；当单链DNA的浓度为30μM时，采用一次法 DNA环的产率为27％，采用逐次加入法，DNA环的产率提高到64％。
4)纯化与酶切确认
通过切胶回收对DNA环进行纯化，并得到了纯化后的单一的DNA环条带(图5)。为确认得到的条带为DNA环，使用内切酶FastdigestTM Taq I对DNA环进行酶切。酶切体系： 1μM纯化后DNA环，1μM环的互补链，1×FastdigestTM Buffer，1FDU FastdigestTM Taq I，总体积20μL；65℃酶切30min。图5结果显示，酶切后的电泳条带单一且位置与单链DNA 一致，说明纯化得到的DNA确实为DNA环。
实施例2
1)原料
成环链A(5’→3’)：TAAGACACGTTGAGTTACATGAGCATCGTTCACAGCTCTATAGT GGCCTATT(5’-磷酸化，长度为52nt，SEQ ID NO：3)
splint A(5’→3’)：GTCTTAAATAGGCC(长度为14nt，SEQ ID NO：4)
成环链B(5’→3’)：GAATTAACGACTTAGAGCTGTGCTTCTCCAGTAATTTTTTTTTT TTAGTCTC(5’-磷酸化，长度为52nt，SEQ ID NO：5)
splint B(5’→3’)：TAATTCGAGACT(长度为12nt，SEQ ID NO：6)
来源：人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)
2)连接成环
一次法成环：将成环链一次性加入到体系中进行反应，该体系初始状态时含5μM成环链DNA，5μM splint，10U T4DNA Ligase，2×T4DNA Ligase Buffer，总体积20μL；16℃连接4h。
1×T4DNA Ligase Buffer组成：40mM Tris-HCl(pH7.8@25℃),10mM MgCl2,10mMDTT, 0.5mM ATP。
逐次加入法成环：参考实施例1逐次加入法，配制初始体系和添加液。初始体系含10μM splint，2×T4DNA Ligase Buffer，20U T4DNA Ligase，总体积为20μL。添加液含10μM成环链，2×T4DNA Ligase Buffer，总体积为20μL。16℃温浴条件下，每隔20min向初始体系中添加4μL添加液，添加5次后，16℃连接4h。
3)电泳检测
图6为使用逐次加入法进行成环与一次法成环的比较(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，相同长度但序列不同的两条成环链的成环产率大大不同。一次法成环时，成环链A的产率为17％，远远小于成环链B的成环产率(62％)。但通过逐次加入法都可以大大降低两条成环链的副产物的产生，使成环链A和B的成环的产率分别提高至90％和92％。
实施例3
1)原料
成环链(5’→3’)：AACCGTGCGTGCGTGCGGATCAACTAATACGACTCATCATAA(5’- 磷酸化，长度为42nt，SEQ ID NO：7)
splint(5’→3’)：ACGGTTTTATGA(长度为12nt，SEQ ID NO：8)
来源：人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)
2)连接成环
一次法成环：将成环链一次性加入到反应体系中，该体系初始状态时含4μM成环链DNA，20μM splint，10U T4DNA Ligase，0.5×T4DNA Ligase Buffer，总体积20μL；22℃条件下连接8h。
1×T4DNA Ligase Buffer组成：40mM Tris-HCl(pH7.8@25℃),10mM MgCl2,10mMDTT, 0.5mM ATP。
逐次加入法成环：参考实施例1逐次加入法的制备步骤，配制初始体系和添加液。该初始体系含40μM splint，0.5×T4DNA Ligase Buffer，40U T4DNA Ligase，总体积为20μL。该添加液含8μM成环链，0.5×T4DNA Ligase Buffer，总体积为20μL。22℃温浴条件下，每隔15min向初始体系中添加2μL添加液，添加10次后，22℃连接8h。
3)电泳检测
图7为42nt成环链使用逐次加入法进行成环与一次法成环的比较(15％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，逐次加入法可以大大降低副产物的产生，使DNA环的产率从 27％提高至70％。
实施例4
1)原料
成环链(5’→3’)：ACAACGAAAGTAGCAGAAAUACAGGTATCTAGGCTAGCT(5’- 磷酸化，长度为39nt，SEQ ID NO：9)
下划线部分为RNA序列
splint(5’→3’)：CGTTGTAGCTAGC(长度为13nt，SEQ ID NO：10)
来源：人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)
2)连接成环
一次法成环：将成环链一次性加入到反应体系中，该体系初始状态时含10μM成环链 DNA，20μM splint，20U T4DNA Ligase，0.1×T4DNA Ligase Buffer，总体积20μL；25℃条件下连接12h。
1×T4DNA Ligase Buffer组成：40mM Tris-HCl(pH7.8@25℃),10mM MgCl2,10mMDTT, 0.5mM ATP。
逐次加入法成环：参考实施例1逐次加入法的制备步骤，配制初始体系和添加液。该初始体系含40μM splint，0.1×T4DNA Ligase Buffer，80U T4DNA Ligase，总体积为20μL。添加液含20μM成环链，0.1×T4DNA Ligase Buffer，总体积为20μL。25℃温浴条件下，每隔30min向初始体系中添加2μL添加液，添加10次后，25℃连接12h。
3)电泳检测
图8为39nt成环链使用逐次加入法进行成环与一次法成环的比较(10％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，DNA链中含有部分RNA序列并不影响成环反应，并且逐次加入法可以大大降低副产物的产生，使DNA环的产率从1％提高至47％。
实施例5
1)原料
成环链(5’→3’)：UCUGGACCGGUCGAUGUAUGUCUUGCACACGUGUACUCUUAAGCAACAGUUACUGCGACGUGAAA(5’-磷酸化，长度为65nt，SEQ ID NO：11)
此成环链为RNA序列
splint(5’→3’)：GGTCCAGATTTCACGT(长度为16nt，SEQ ID NO：12)
来源：人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)
2)连接成环
一次法成环：将成环链一次性加入到反应体系中，该体系初始状态时含1μM成环链DNA，2μM splint，10U T4RNA Ligase，1×T4RNA Ligase Buffer，总体积20μL；37℃连接2h。
1×T4RNA Ligase Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),10mM MgCl2,10mMDTT, 1mM ATP。
逐次加入法成环：参考实施例1逐次加入法的制备步骤，配制初始体系和添加液。初始体系含4μM splint，1×T4RNA Ligase Buffer，4U T4RNA Ligase，总体积为20μL。添加液含2μM成环链，1×T4RNA Ligase Buffer，总体积为20μL。37℃温浴条件下，每隔15min 向初始体系中添加2μL添加液，添加10次后，37℃连接2h。
3)电泳检测
图9为65nt RNA成环链使用逐次加入法进行成环与一次法成环的比较(15％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，逐次加入法可以大大降低单链RNA在成环过程中副产物的产生，使RNA环的产率从68％提高至接近100％。然而逐次加入法成环仍有一些底物剩余，后期可通过使用外切酶切除单链RNA从而得到较纯的RNA环。
实施例6
1)原料
成环链A(5’→3’)：CACCTCGCTTTCAACTTACAATGCGTGCGTGCGGTCTAATACGACTCACTATAAATCGAACATCAGCAAACGGA(5’-磷酸化，长度为74nt，SEQ ID NO：13)
splint A(5’→3’)：GAGGTGTCCGTT(长度为12nt，SEQ ID NO：14)
成环链B(5’→3’)：TCCGTTTGCTGATGTTCGATTTATAGTGAGTCGTATTAGACCGCACGCACGCATTGTA AGTTGAAAGCGAGGTG(5’-磷酸化，长度为74nt，SEQ ID NO：15)
splint B(5’→3’)：AACGGACACCTC(长度为12nt，SEQ ID NO：16)
来源：人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)
2)连接成环
一次法成环：将成环链一次性加入到反应体系中，该体系初始状态时含2μM成环链DNA，2μM splint，5U T4DNA Ligase，0.2×T4DNA Ligase Buffer，总体积20μL；30℃连接2h。
1×T4DNA Ligase Buffer组成：40mM Tris-HCl(pH7.8@25℃),10mM MgCl2,10mMDTT, 0.5mM ATP。
逐次加入法成环条件：参考实施例1逐次加入法的制备步骤，配制初始体系和添加液。初始体系含4μM splint，0.2×T4DNA Ligase Buffer，20U T4DNA Ligase，总体积为20μL。添加液含4μM成环链，0.2×T4DNA Ligase Buffer，总体积为20μL。30℃温浴条件下，每隔15min向初始体系中添加1μL添加液，添加20次后，30℃连接2h。
3)电泳检测
图10为使用逐次加入法进行成环与一次法成环的比较(10％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，成环链A和成环链B都可以通过逐次加入法抑制副产物的产生，分别将成环产率从82％和38％提高至接近100％，从而得到单一的DNA环条带，因此产物不需经过纯化或经过简单的醇沉就可直接使用。
实施例7
1)原料
成环链(5’→3’)：TCAGTGTTTTTTCAGTAACTCCCCACAACCTCTTTTTCGATGCAAAAAAAATATGTGCGA(5’-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：17)
splint(5’→3’)：CACTGATCGCAC(长度为12nt，SEQ ID NO：18)
来源：人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)
2)连接成环
一次法成环：将成环链一次性加入到反应体系中，该体系初始状态时含1μM成环链DNA，10μM splint，5U E.coli DNA Ligase，1×E.coli DNA Ligase Buffer，总体积20μL；16℃连接2h。
1×E.coli DNA Ligase Buffer组成：30mM Tris-HCl(pH 8.0@25℃),4mM MgCl2,1mM DTT,26μM NAD+。
逐次加入法成环：参考实施例1逐次加入法的制备步骤，配制初始体系和添加液。初始体系含20μM splint，1×E.coli DNA Ligase Buffer，10U E.coli DNA Ligase，总体积为40μL。添加液含2μM成环链，1×E.coli DNA Ligase Buffer，总体积为40μL。16℃温浴条件下，每隔20min向初始体系中添加2μL添加液，添加20次后，16℃连接2h。
3)电泳检测
图11为使用逐次加入法进行成环与一次法成环的比较(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，一次法成环的产率为69％，而逐次加入法可几乎完全抑制副产物的产生，从而得到单一的DNA环条带(产率接近100％)，因此产物不需经过纯化或经过简单的醇沉就可直接使用。
实施例8
1)原料
成环链(5’→3’)：TCCGTTTGCTGATGTTCGATTTATAGTGAGTCGTATTAGACCGCACGCACGCATTGTA AGTTGAAAGCGAGGTG(5’-磷酸化，长度为74nt，SEQ ID NO：19)
splint(5’→3’)：GCAAACGGACACCTCGCT(长度为18nt，SEQ ID NO：20)
来源：人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)
2)连接成环
一次法成环：将成环链一次性加入到反应体系中，该体系初始状态时含1μM成环链DNA，2μM splint，5U Taq DNA Ligase，1×Taq DNA Ligase Buffer，总体积20μL；55℃连接2h。
1×Taq DNA Ligase Buffer组成：20mM Tris-HCl(pH 7.6@25℃),25mM KAc,10mMMg(Ac)2，10mM DTT,1mM NAD和0.1％Triton X-100。
逐次加入法成环：参考实施例1逐次加入法的制备步骤，配制初始体系和添加液。初始体系含4μM splint，1×Taq DNA Ligase Buffer，10U Taq DNA Ligase，总体积为40μL。添加液含2μM成环链，1×Taq DNA Ligase Buffer，总体积为40μL。55℃温浴条件下，每隔20min向初始体系中添加2μL添加液，添加20次后，16℃连接2h。
3)电泳检测
图12为使用逐次加入法进行成环与一次法成环的比较(8％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，逐次加入法可以显著抑制成环副产物的产生，将DNA环的产率从64％提高到88％。产物中的未反应底物，可通过核酸外切酶酶切去除。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国海洋大学
<120> 制备环状DNA或RNA的方法
<130> 2017
<160> 20
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 1
TCAGTGTTTT TTTCGTCGAT TGCAGTAACT CCCCACAACC TCTTTTT CGA TGCTTTTTTT 60
GTGCGA 66
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 2
CACTGATCGC AC 12
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 3
TAAGACACGT TGAGTTACAT GAGCATCGTT CACAGCTCTA TAGTGGCCTA TT 52
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 4
GTCTTAAATA GGCC 14
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 5
GAATTAACGA CTTAGAGCTG TGCTTCTCCA GTAATTTTTT TTTTTTAGTC TC 52
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 6
TAATTCGAGA CT 12
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 7
AACCGTGCGT GCGTGCGGAT CAACTAATAC GACTCATCAT AA 42
<210> 8
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 8
ACGGTTTTAT GA 12
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 9
ACAACGAAAG TAGCAGAAAU ACAGGTATCT AGGCTAGCT 39
<210> 10
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 10
CGTTGTAGCT AGC 13
<210> 11
<211> 65
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 11
UCUGGACCGG UCGAUGUAUG UCUUGCACAC GUGUACUCUU AAGCAACAGU UACUGCGACG 60
UGAAA 65
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 12
GGTCCAGATT TCACGT 16
<210> 13
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 13
CACCTCGCTT TCAACTTACA ATGCGTGCGT GCGGTCTAAT ACGACTCACT ATAAATCGAA 60
CATCAGCAAA CGGA 74
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 14
GAGGTGTCCG TT 12
<210> 15
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 15
TCCGTTTGCT GATGTTCGAT TTATAGTGAG TCGTATTAGA CCGCACGCAC GCATTGTAAG 60
TTGAAAGCGA GGTG 74
<210> 16
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 16
AACGGACACC TC 12
<210> 17
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 17
TCAGTGTTTT TTCAGTAACT CCCCACAACC TCTTTTTCGA TGCAAAAAAA ATATGTGCGA 59
<210> 18
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 18
CACTGATCGCAC
<210> 19
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-磷酸化
<400> 19
TCCGTTTGCT GATGTTCGAT TTATAGTGAG TCGTATTAGA CCGCACGCAC GCATTGTAAG 60
TTGAAAGCGA GGTG 74
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板链
<400> 20
GCAAACGGAC ACCTCGCT 18
Claims (10)
1.一种制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将成环反应所需的辅助模板DNA(下统称splint)、连接酶和连接酶反应的缓冲液混合配制成初始体系；将3’或5’端磷酸化修饰的单链DNA或者RNA(下统称成环链)中的一种和上述缓冲液配制成添加液；
步骤二，向初始体系中添加一定量的添加液，加入的成环链借助splint形成环状分子，间隔一段时间，待体系中已有的大部分成环链成环后，再次加入添加液，每次添加新的成环链后，体系中成环链的浓度增加0.1-5μM，如此反复数次；
步骤三，最后一次加入含成环链的添加液后，再反应2-15h；
初始体系中splint的摩尔浓度与成环链的摩尔浓度之比为(1-10):1。
2.根据权利要求1所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，步骤二中两次加入添加液之间的间隔时间为10-60min。
3.根据权利要求1所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，反应结束后最终体系中的环状分子、成环链及副产物的总浓度为1μM-30μM。
4.根据权利要求1所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，所述成环链的长度25-200nt。
5.根据权利要求1所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，所述的添加液中成环链的浓度为1-100μM。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，步骤一中所述的连接酶为可以连接双链DNA、双链RNA或DNA-RNA杂交链中的切刻部分的连接酶。
7.根据权利要求6所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，步骤一中所述的连接酶为T4DNA Ligase、T4RNA Ligase、Taq DNA Ligase、T3DNA Ligase、T7DNA Ligase、E.coliDNA Ligase中的任意一种。
8.根据权利要求1-5任一项所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，所述连接酶反应的缓冲液浓度为标准浓度的0.1-1倍。
9.根据权利要求8所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，所述连接酶反应的缓冲液组成为20-40mM Tris-HCl(pH7-8@25℃),10mM MgCl2,DTT,0.5-1mM ATP。
10.根据权利要求8所述的制备环状DNA或RNA的方法，其特征在于，所述连接酶反应的缓冲液组成为30mM Tris-HCl(pH 8.0@25℃),4mM MgCl2,1mM DTT,26μM NAD+。
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