CN110938648B - 一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用 - Google Patents

一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用，该真菌分泌表达载体是在pCT74载体的4665bp处***Six1d分泌蛋白N端23aa(MAPYSMVLLGALSILGFGAYAQE)的胞外信号肽的真菌分泌型表达载体74HSP，本发明成功构建了能够有效将植物蛋白分泌到病原菌胞外的真菌分泌型表达载体，实现了在侵染过程中使目的蛋白有效在真菌中表达并分泌到植物中，从而实现植物基因功能的快速鉴定。

Description

一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用。
背景技术
传统的植物转基因技术能够鉴定植物基因的功能，利用信号肽构建分泌型表达载体进行外源基因的表达，将目的蛋白分泌到细胞外，利于植物基因功能的有效鉴定，但现有的转基因技术对于分泌型表达载体的构建过程繁琐，存在一定的局限性，对于香蕉等转基因体系尚不成熟植物，此项工作更是难以开展。目前在构建的表达载体的过程中，往往容易出现无法有效的蛋白剪切和分泌，或使目的蛋白N端遗留较长的序列，从而导致影响目的蛋白功能，无法实现使目的蛋白成功地在真菌中表达并分泌到植物中。因此，构建一种新型分泌型表达载体，使目的蛋白在真菌中表达并分泌到植物中，实现植物基因功能的快速鉴定，对植物真菌抗病机理研究提供技术支撑具有重要意义。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用，成功构建了能够有效将植物蛋白分泌到病原菌胞外的真菌分泌型表达载体，实现在侵染过程中使目的蛋白有效在真菌中表达并分泌到植物中，从而实现植物基因功能的快速鉴定。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种真菌分泌表达载体，在pCT74载体的4665bp处***Six1d分泌蛋白N端23aa(MAPYSMVLLGALSILGFGAYAQE)的胞外信号肽的真菌分泌型表达载体74HSP。
进一步说明，Six1d分泌蛋白N端23aa的胞外信号肽的核苷酸序列为：ATGGCGCCCTATAGCATGGTACTCCTTGGCGCCCTCTCAATCCTTGGGTTTGGGGCTTATGCTCAAGAG。
进一步说明，所述真菌分泌型表达载体74HSP还含有酶切位点短序列，所述酶切位点短序列的核苷酸序列为：GATATCCATATGGCTAGCAGGCCT。
进一步说明，在酶切位点短序列中连入外源EGFP基因，形成74HSP-EGFP重组载体。
进一步说明，所述74HSP-EGFP重组载体的序列见序列表中序列3的核苷酸序列。
一种真菌分泌表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)通过信号肽分析，确定分泌信号肽序列为Six1d蛋白N端23aa的胞外信号肽，并设计了酶切位点短序列；所述酶切位点短序列包含EcoRV、NdeI、NheI、StuI四种限制性内切酶位点；
(2)使用核酸合成仪合成包含信号肽和酶切位点短序列的载体序列；
(3)将包含信号肽和酶切位点短序列的载体序列通过T4-DNA连接酶连接至pCT74载体，获得真菌分泌型表达载体74HSP。
一种真菌分泌表达外源基因***的构建方法，包括如下步骤：
(1)将外源EGFP基因通过NheI和StuI限制性内切酶在酶切位点短序列中连入真菌分泌型表达载体74HSP，获得完整的74HSP-EGFP重组载体；
(2)将74HSP-EGFP重组载体，转化尖孢镰刀菌Foc4，得到转化pCT74-S分泌型载体的FOC 4转化菌。
一种真菌分泌表达载体在表达外源蛋白中的应用。
现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过信号肽分析确定Six1d蛋白N端23aa的胞外信号肽，并在该序列后设计了包含酶切位点的短序列，从而成功构建了能够有效将植物蛋白分泌到病原菌胞外的真菌分泌型表达载体74HSP，通过对尖孢镰刀菌Foc4的遗传转化，实现在侵染过程中使目的蛋白在真菌中表达并分泌到植物中，达到了植物基因功能的快速鉴定的目的，该载体的成功构建能够为真菌抗病机理研究提供技术支撑。
附图说明
图1为本发明实施的pCT74载体的模式图；
图2为本发明实施的含Six1d分泌蛋白N端23aa的胞外信号肽的真菌分泌型表达载体74HSP-EGFP模式图；
图3为本发明实施的F4-O、F4-I和F4菌株的液体培养基的培养效果图；
图4为本发明实施的F4-O、F4-I和F4菌株的固体培养基的培养效果图；
图5为本发明实施的单独使用N端23aa的序列的信号肽分析预测图；
图6为本发明实施的单独使用N端30aa的序列的信号肽分析预测图；
图7为本发明实施的单独使用N端40aa的序列的信号肽分析预测图；
图8为本发明实施的单独使用N端50aa的序列的信号肽分析预测图；
图9为本发明实施的使用N端23aa的序列和酶切位点的短序列的信号肽分析预测图；
图10为本发明实施的使用N端23aa的序列和酶切位点的短序列的信号肽分析预测图；
图11为本发明实施的使用N端23aa的序列和酶切位点的短序列的信号肽分析预测图；
图中，F4：FOC4野生型(尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种野生型)
F4-O：转化pCT74-S分泌型载体的FOC4转化菌
F4-I：转化pCT74非分泌型载体的FOC4转化菌。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-胞外信号肽的确定及包含酶切位点的短序列的设计
1、本发明通过分泌蛋白质组学从尖孢镰刀菌古巴专化型一号小种(Foc1)中鉴定到一个丰度很高的分泌蛋白Six1d，并通过信号肽分析，预测到该蛋白序列N端存在1个21aa的胞外信号肽，21aa和22aa间可以实现蛋白的剪切和分泌，而N端的23aa、甚至30aa单独使用时都无法预测到有效剪切，虽然使用该蛋白N端40aa和50aa的序列可实现蛋白剪切和分泌，但当使用40aa或50aa的序列构建的载体时，会在目的蛋白N端遗留较长的序列，影响目的蛋白的功能。
2、具体实验如下：
(1)单独使用N端23aa的序列(MAPYSMVLLG ALSILGFGAY AQE)，不能预测到剪切和分泌，如图5所示；
(2)单独使用N端30aa的序列(MAPYSMVLLG ALSILGFGAY AQEAAVEEPQ)，不能预测到剪切和分泌，如图6所示；
(3)单独使用N端40aa的序列(MAPYSMVLLG ALSILGFGAY AQEAAVEEPQIFFNLTYTEY)，可以预测到较弱的剪切，如图7所示；
(4)单独使用N端50aa的序列(MAPYSMVLLG ALSILGFGAY AQEAAVEEPQ IFFNLTYTEYLDKVAASHGS)，可以预测到剪切和分泌，但将把50aa的序列应用到的载体中时，剪切却只发生在21aa-22aa的位置，会在目的蛋白N端保留较长的序列，影响到目的蛋白的功能，如图8所示；
(5)根据上述结果，本发明最终确定使用Six1d蛋白N端23aa(MAPYSMVLLGALSILGFGAYAQE)的胞外信号肽序列，并在该序列后设计一段包含酶切位点的短序列，构建该真菌分泌表达载体74HSP。该酶切位点的短序列，不仅有效防止了酶切反应过程中破坏载体的完整性，而且实现分泌信号肽表达后的有效剪切，保证目的蛋白的成功分泌，成本低等优点。该包含酶切位点的短序列为：
Figure BDA0002308084180000041
Figure BDA0002308084180000051
通过这种设计，进而发现不论从StuI***目的基因：(如图9所示)
Figure BDA0002308084180000052
还是从NheI***目的基因：(如图10所示)
Figure BDA0002308084180000053
Figure BDA0002308084180000061
还是从NdeI***目的基因(如图11所示)
Figure BDA0002308084180000062
均可以有效预测到目的蛋白的高效稳定的剪切和分泌。
实施例2-一种真菌分泌表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)通过信号肽分析，确定分泌信号肽序列为Six1d蛋白N端23aa(MAPYSMVLLGALSILGFGAYAQE)的胞外信号肽，核苷酸序列为：ATGGCGCCCTATAGCATGGTACTCCTTGGCGCCCTCTCAATCCTTGGGTTTGGGGCTT ATGCTCAAGAG；并设计酶切位点短序列，核苷酸序列为：GATATCCATATGGCTAGCAGGCCT；所述酶切位点短序列包含EcoRV、NdeI、NheI、StuI四种限制性内切酶位点；
(2)使用核酸合成仪合成包含信号肽和酶切位点短序列的载体序列；
(3)将包含信号肽和酶切位点短序列的载体序列通过T4-DNA连接酶连接至pCT74载体，获得真菌分泌型表达载体74HSP。
实施例3-一种真菌分泌表达外源基因***的构建方法，包括如下步骤：
(1)将外源EGFP基因通过NheI和StuI限制性内切酶在酶切位点短序列中连入真菌分泌型表达载体74HSP，获得完整的74HSP-EGFP重组载体；
(2)将74HSP-EGFP重组载体，转化尖孢镰刀菌Foc4，得到转化pCT74-S分泌型载体的FOC 4转化菌。
实施例4-真菌分泌表达外源基因***的构建和荧光信号分析：
1、载体的构建：通过信号肽分析，确定分泌信号肽序列为Six1d蛋白N端23aa(MAPYSMVLLGALSILGFGAYAQE)的胞外信号肽，核苷酸序列为：ATGGCGCCCTATAGCATGGTACTCCTTGGCGCCCTCTCAATCCTTGGGTTTGGGGCTTATGCTCAAGAG；同时，在该序列后设计一段酶切位点短序列，核苷酸序列为：GATATCCATATGGCTAGCAGGCCT；所述酶切位点短序列包含EcoRV、NdeI、NheI、StuI四种限制性内切酶位点；
2、使用核酸合成仪合成包含信号肽和酶切位点短序列的载体序列；
3、将包含信号肽和酶切位点短序列的载体序列通过T4-DNA连接酶在4665bp处***至pCT74载体中，对pCT74载体进行改造，获得真菌分泌型表达载体74HSP；
4、将外源EGFP基因通过NheI和StuI限制性内切酶在酶切位点短序列中连入所构建的真菌分泌型表达载体74HSP中，获得完整的74HSP-EGFP重组载体，如图2所示；
5、将74HSP-EGFP重组载体(分泌型)和pCT74载体(非分泌型)，分别转化Foc4菌株，获得F4-O(分泌型)和F4-I(非分泌型)表达菌株；
6、将F4-O(分泌型)和F4-I(非分泌型)表达菌株进行后续的GFP荧光信号分析，包括如下步骤：
(1)配制液体培养基进行F4-O、F4-I和F4菌株培养
a.液体培养基：马铃薯200g/L，切碎煮沸15min，4层纱布过滤后取滤液使用；葡萄糖20g/L；定容至1L，121℃灭菌20min。
b.F4-O和F4-I液体培养：取30mL液体培养基，加入潮霉素终浓度90μL(终浓度3mL/L)，接入直径0.5cm大小的菌种，28℃，200rpm，培养72h。
c.F4液体培养：取30mL液体培养基，接入直径0.5cm大小的菌种，28℃，200rpm，培养72h。
d.取5mL摇好的菌液，13000rpm室温离心15min后，分别于白光、荧光条件下进行拍照。试验结果为：在白光条件下，所有的菌体和菌液均无绿色荧光信号；在荧光条件下，F4菌体和菌液均无绿色荧光信号；F4-O菌株的绿色荧光信号出现在上清中(分泌型)；F4-I菌株的绿色荧光信号则出现在菌体中(非分泌型)，如图3所示。
(2)配制固体培养基进行F4-O、F4-I和F4菌株培养
a.固体培养基：马铃薯200g/L，切碎煮沸15min，4层纱布过滤后取滤液使用；葡萄糖20g/L；加入琼脂20g/L，121℃灭菌20min。
b.F4-O和F4-I固体培养：取灭菌后未凝固的固体培养基，加入潮霉素终浓度3mL/L；使用直径6cm培养皿，每个培养皿倒入15mL培养基，凝固后，每个培养皿中心加入图2中培养72小时的F4-O和F4-I菌液10μL，待菌液风干后，28℃倒置培养72h。
c.F4固体培养：取灭菌后未凝固的固体培养基，使用直径6cm培养皿，每个培养皿倒入15mL培养基，凝固后，每个培养皿中心加入图2中培养72小时的F4菌液10微升，待菌液风干后，28℃倒置培养72h。
d.将培养72h后的培养皿分别在白光和荧光下对培养皿上的菌落进行拍照。试验结果为：在白光条件下，所有的菌株均无绿色荧光信号；在荧光条件下，F4菌株的菌丝和培养基中均无绿色荧光信号；F4-O菌株的绿色荧光信号出现培养基中(分泌型)；F4-I菌株的绿色荧光信号则出现在菌丝中(非分泌型)，如图4所示。
通过上述试验可知，本发明构建的真菌分泌型表达载体74HSP-EGFP，用于转化尖孢镰刀菌Foc4，其绿色荧光蛋白EGFP的只在培养液中存在，并不在菌体中存在，说明74HSP-EGFP可以有效的将外源蛋白分泌到胞外，进一步利用携带74HSP-EGFP的Foc4侵染香蕉，发现绿色荧光蛋白能在香蕉中检测到。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgccct atagcatggt actccttggc gccctctcaa tccttgggtt tggggcttat 60
gctcaagag 69
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatatccata tggctagcag gcct 24
<210> 3
<211> 5836
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagctccaat tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg ttttacaacg 60
tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 120
cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 180
cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 240
tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 300
cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 360
tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 420
tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 480
cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 540
ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 600
gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc 660
acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 720
atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 780
agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 840
cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 900
gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 960
cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 1020
tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 1080
ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 1140
ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 1200
atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 1260
cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 1320
atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 1380
gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 1440
cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 1500
tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 1560
tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 1620
gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 1680
gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 1740
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 1800
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 1860
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 1920
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 1980
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 2040
ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 2100
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 2160
ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 2220
acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 2280
gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 2340
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 2400
aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 2460
atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 2520
gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 2580
gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc 2640
tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt 2700
tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt 2760
ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag 2820
ctcgaaatta accctcacta aagggaacaa aagctggtac cgggcccccc ctcgaggtcg 2880
acgttaactg gttcccggtc ggcatctact ctattccttt gccctcggac gagtgctggg 2940
gcgtcggttt ccactatcgg cgagtacttc tacacagcca tcggtccaga cggccgcgct 3000
tctgcgggcg atttgtgtac gcccgacagt cccggctccg gatcggacga ttgcgtcgca 3060
tcgaccctgc gcccaagctg catcatcgaa attgccgtca accaagctct gatagagttg 3120
gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg gaggcgcggc gatcctgcaa gctccggatg 3180
cctccgctcg aagtagcgcg tctgctgctc catacaagcc aaccacggcc tccagaagag 3240
gatgttggcg acctcgtatt gggaatcccc gaacatcgcc tcgctccagt caatgaccgc 3300
tgttatgcgg ccattgtccg tcaggacatt gttggagccg aaatccgcat gcacgaggtg 3360
ccggacttcg gggcagtcct cggcccaaag catcagctca tcgagagcct gcgcgacgga 3420
cgcactgacg gtgtcgtcca tcacagtttg ccagtgatac acatggggat cagcaatcgc 3480
gcatatgaaa tcacgccatg tagtgtattg accgattcct tgcggtccga atgggccgaa 3540
cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc gatcgcatcc atggcctccg cgaccggctg 3600
gagaacagcg ggcagttcgg tttcaggcag gtcttgcaac gtgacaccct gtgcacggcg 3660
ggagatgcaa taggtcaggc tctcgctgaa ctccccaatg tcaagcactt ccggaatcgg 3720
gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac ataacgatct ttgtagaaac catcggcgca 3780
gctatttacc cgcaggacat atccacgccc tcctacatcg aagctgaaag cacgagattc 3840
ttcgccctcc gagagctgca tcaggtcgga gacgctgtcg aacttttcga tcagaaactt 3900
ctcgacagac gtcgcggtga gttcaggctt tttcatttgg atgcttgggt agaataggta 3960
agtcagattg aatctgaaat aaagggagga agggcgaact taagaaggta tgaccgggtc 4020
gtccacttac cttgcttgac aaacgcacca agttatcgtg caccaagcag cagatgataa 4080
taatgtcctc gttcctgtct gctaataaga gtcacacttc gagcgccgcc gctactgcta 4140
caagtggggc tgatctgacc agttgcctaa atgaaccatc ttgtcaaacg acacaaattt 4200
tgtgctcacc gcctggacga ctaaaccaaa ataggcattc attgttgacc tccactagct 4260
ccagccaagc ccaaaaaatg ctccttcaat atcagttaac gtcgacggta tcgattggaa 4320
tgcatggagg agttctgtac gcgcaattcc gctctccgta aggatgcttc ggaggtgcac 4380
atggtctcat acatgtaggc ccgacgagga tcgagtcggt tccgaagtag gatcgtctcg 4440
attgttgggc atcattgcat ggacattcag agggcctact gatacctgga atccgcaccg 4500
tccggctacc tagcaataag attctgtgta tataaagggc taaggtgtcc gtccttgata 4560
aaaccaccac cctcaacaac ttacctcgac tatcagcatc ccgtcctatc taacaatcgt 4620
ccatcggtat ccaactccaa ctctattcgc agggtcctag aatcgatggc gccctatagc 4680
atggtactcc ttggcgccct ctcaatcctt gggtttgggg cttatgctca agaggatatc 4740
catatggcta gcaggatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 4800
ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 4860
ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 4920
gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 4980
cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 5040
gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 5100
gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 5160
aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 5220
gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 5280
agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 5340
ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 5400
cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 5460
gagctgtaca agaaggccta atcagatctg cggccgcccg gctgcagatc gttcaaacat 5520
ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata 5580
atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat 5640
gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa 5700
aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcc 5760
gatgataagc tgtcaaacat gagaattcct gcagcccggg ggatccacta gttctagagc 5820
ggccgccacc gcggtg 5836
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Pro Tyr Ser Met Val Leu Leu Gly Ala Leu Ser Ile Leu Gly
1 5 10 15
Phe Gly Ala Tyr Ala Gln Glu
20
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Pro Tyr Ser Met Val Leu Leu Gly Ala Leu Ser Ile Leu Gly
1 5 10 15
Phe Gly Ala Tyr Ala Gln Glu Ala Ala Val Glu Glu Pro Gln
20 25 30
<210> 6
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ala Pro Tyr Ser Met Val Leu Leu Gly Ala Leu Ser Ile Leu Gly
1 5 10 15
Phe Gly Ala Tyr Ala Gln Glu Ala Ala Val Glu Glu Pro Gln Ile Phe
20 25 30
Phe Asn Leu Thr Tyr Thr Glu Tyr
35 40
<210> 7
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Pro Tyr Ser Met Val Leu Leu Gly Ala Leu Ser Ile Leu Gly
1 5 10 15
Phe Gly Ala Tyr Ala Gln Glu Ala Ala Val Glu Glu Pro Gln Ile Phe
20 25 30
Phe Asn Leu Thr Tyr Thr Glu Tyr Leu Asp Lys Val Ala Ala Ser His
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 8
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile His Met Ala Ser Arg Pro
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Ile His Met Ala Ser Arg
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile His Met Ala
1 5
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ile His
1

Claims (7)

1.一种真菌分泌表达载体，其特征在于：在pCT74载体的4665 bp处***Six1d分泌蛋白N端23aa序列为：MAPYSMVLLGALSILGFGAYAQE的胞外信号肽的核苷酸序列，在该序列后连接一段酶切位点短序列，所述酶切位点短序列的核苷酸序列为：GATATCCATATGGCTAGCAGGCCT，构建得到的真菌分泌型表达载体74HSP。
2.根据权利要求1所述的一种真菌分泌表达载体，其特征在于：Six1d分泌蛋白N端23aa的胞外信号肽的核苷酸序列为：ATGGCGCCCTATAGCATGGTACTCCTTGGCGCCCTCTCAATCCTTGGGTTTGGGGCTTATGCTCAAGAG。
3.根据权利要求1所述的一种真菌分泌表达载体，其特征在于：在酶切位点短序列中连入外源EGFP基因，形成74HSP-EGFP重组载体。
4.根据权利要求3所述的一种真菌分泌表达载体，其特征在于：所述74HSP-EGFP重组载体的序列见序列表中如SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
5.一种如权利要求1~4中任意一项所述的真菌分泌表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）通过信号肽分析，确定分泌信号肽序列为Six1d蛋白N端23aa序列为：MAPYSMVLLGALSILGFGAYAQE的胞外信号肽，并设计了酶切位点短序列，其核苷酸序列为：GATATCCATATGGCTAGCAGGCCT，所述酶切位点短序列包含EcoRV、NdeI、NheI、StuI四种限制性内切酶位点；
（2）使用核酸合成仪合成包含信号肽和酶切位点短序列的载体序列；
（3）将包含信号肽和酶切位点短序列的载体序列通过T4-DNA连接酶连接至pCT74载体，该连接酶切位点短序列连接于胞外信号肽的核苷酸序列后，获得真菌分泌型表达载体74HSP。
6.一种如权利要求5所述的真菌分泌表达外源基因***的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将外源EGFP基因通过NheI和StuI限制性内切酶在酶切位点短序列中连入真菌分泌型表达载体74HSP，获得完整的74HSP-EGFP重组载体；
（2）将74HSP-EGFP重组载体，转化尖孢镰刀菌Foc4，得到转化pCT74-S分泌型载体的FOC4转化菌。
7.一种如权利要1~4中任意一项所述的真菌分泌表达载体在表达外源蛋白中的应用。
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Expression of effector gene SIX1 of Fusarium oxysporum requires living plant cells;H. Charlotte van der Does 等;《Fungal Genetics and Biology》;20080618;第45卷;第1257–1264页 *

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