CN112175939A - 一种基于同源序列的核酸拼接方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于同源序列的核酸拼接方法及其应用。本发明涉及一种将两段或更多双链DNA分子在生物体外有序拼接起来的方法，被拼接的DNA分子相邻末端之间存在一段相同或相近的序列。在一个恒温的反应体系中，核酸外切酶III将DNA分子末端从3’‑5‘水解，在DNA分子的末端产生一段单链区，在碱基配对原则下，相邻DNA分子的单链区由于序列互补而发生杂交，用一种持续合成能力高的DNA聚合酶将杂交产生的空隙补齐，补齐产生的缺刻可以被DNA连接酶修复。这种方法操作简单，只需一步恒温操作即可完成多段DNA分子的高效拼接。本发明还涉及用于该方法的试剂盒，该试剂盒可用于大部分需要双链DNA拼接的场合。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸拼接方法，特别是一种等温的基于同源序列的有序拼接双链DNA分子的方法。
背景技术
不同长度的双链DNA分子在生物细胞内能实现不同的功能。一条基因的长度一般在几十个碱基到几万个碱基之间，一个代谢通路由多个长度不等的基因及其调控元件组成。而一个细胞的基因组长度在0.5兆碱基到几十个G碱基之间。为了人工获得不同长度的DNA分子，需要在不同水平上对DNA分子进行拼接操作。
一般一千个碱基以下的DNA分子可以直接通过拼接寡核苷酸获得，这方面的技术主要有PCA法(Stemmer；et al.(1995)."Single step assembly of a gene and entireplasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides".Gene.164(1):49–53.)和等温双向拼接法(专利公开号-CN104212791A)。
T4DNA连接酶可以将具有合适末端的DNA分子连接起来，不过其有序性和连接效率随着DNA分子种类的增加和序列长度的增加而降低。
专利US8968999B2介绍了一种基于同源序列的拼接方法，称为Gibson assembly，可以实现从几百碱基到几十万个碱基的DNA分子之间的拼接，在一个等温反应体系中，拼接过程由多种酶协同作用进行，其底物是两段或多段在末端具有同源序列的双链DNA分子，在T5外切酶的作用下，双链DNA分子的两端按照5’-3‘的方向水解，产生3’突出的单链区。由于相邻的两个DNA分子的末端存在同源，所在在碱基配对原则下，相邻的单链区发生杂交，从而将两个相邻的DNA分子组装起来，体系中存在的聚合酶可以将组装后产生的空隙部分补齐，并在随后的连接酶的作用下，将补齐产生的缺刻修复。这样两个相邻DNA分子之间拼接得到的就是完整的双链。这个过程继续进行，可以同时拼接多段DNA分子。
在这个专利中同时也提到了两种基于3‘-5’外切酶的方法，分别为：
1)基于温度循环的核酸外切酶III方法，在这个方法中，核酸外切酶III代替T5外切酶产生单链区。不同的是，其反应是在一个温度循环中进行的，而不是一个等温过程。在37摄氏度时，核酸外切酶水解产生单链区，此时体系中同时存在的Taq DNA聚合酶需要被抑制活性，因为其5‘-3的聚合过程与核酸外切酶III的3’-5‘水解活性刚好相反。单链区产生后，反应体系被转移到75度，此时核酸外切酶III被热失活，而之前被抑制的Taq DNA聚合酶的活性被激活。反应再次转移到60摄氏度，单链杂交产生的空隙被聚合酶补齐，补齐产生的缺刻被连接酶修复。
2)基于T4 DNA聚合酶的两步法，T4 DNA聚合酶在没有dNTPs时表现出3’-5‘外切酶活性，所以同源序列的单链区由T4 DNA聚合酶在没有dNTPs的反应体系中产生，不同于核酸外切酶III的方法的地方在于，后续的空隙补齐需要额外添加dNTPs，所以这个是两步法。
以上两种基于3’-5‘外切酶的方法都是将3’-5‘外切活性与5’-3‘聚合活性分开进行，而不会互相交叉。因此当反应需要某一个活性时，另一个活性需要被抑制，这或者通过改变反应温度来实现，或者通过额外添加物质来控制。
发明内容
本发明利用核酸外切酶III与DNA聚合酶之间不同的持续作用机制，将两种活性共置于一个反应体系，两种活性同时进行。操作更加简单，拼接效率也非常高。
本发明的一方面提供一种在多种酶协同作用下将两段或更多双链DNA分子有序拼接起来的方法，这种拼接发生在生物体外，并且是在一个恒温的反应条件下，被拼接的DNA分子相邻末端之间存在相同或相似的序列，该方法同时需要核酸外切酶III、一种高持续合成能力的DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶和一种DNA连接酶。其协同作用如下：
1)核酸外切酶III将双链DNA分子的末端以3‘-5’方向水解，产生单链区域；
2)T4多聚核苷酸激酶将未磷酸化的5‘末端磷酸化；
3)DNA分子之间的两个相邻末端由于存在同源序列而发生单链之间的杂交；
4)高持续合成能力的聚合酶将杂交后的空隙补齐；
5)DNA连接酶将聚合酶补齐之后的缺刻修复。
在一些实施方案中，所述的恒温的反应条件是指，在反应体系设立之后，将反应容器置于一个恒温的条件下一段时间。拼接期间无需改变反应容器的温度，也无需在反应容器中添加额外的物质。
在一些实施方案中，所述的一段时间，是指10分钟-120分钟，特别是指30分钟-60分钟。
在一些实施方案中，所述恒温，是指将温度固定在37-50摄氏度之间的某一个温度，特别是指39-45之间的某一个温度。恒温设备包括但不限于水浴锅、恒温培养箱、核酸扩增仪等能保持一个设定温度的设备。
在一些实施方案中，所述的高持续合成能力的DNA聚合酶，是指一个DNA聚合酶，其在一个结合底物-脱离底物周期内聚合的平均碱基数高的DNA聚合酶，包括但不限于Phusion DNA聚合酶、Q5 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶。特别是指Q5 DNA聚合酶。
在一些实施方案中，所述一种DNA连接酶，包括但不限于T4 DNA连接酶、9°NTMDNA连接酶、Taq DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶等，特别是指9°NTMDNA连接酶和T4DNA连接酶。
在一些实施方案中，所述的反应体系，其基本组成为：被拼接的双链DNA分子、一个合适的反应缓冲液、dNTPs混合液、ATP或NAD+、核酸外切酶III、一种高持续合成能力的DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、一种DNA连接酶。
在一些实施方案中，所述的有序拼接，是指两段或更多双链DNA分子是按照设定的顺序拼接的。
在一些实施方案中，所述的DNA分子相邻末端，是指按照有序的方式排列的双链DNA分子中，某一段序列的3’末端和这段序列后面的那段序列的5‘末端。
本发明的另一方面提供一种按照上述方法开发的试剂盒，其特征在于，这个试剂盒由浓缩的反应液组成，在按照一定的体积比例稀释后，反应液中的各种成分处于合适的工作状态。
在一些实施方案中，所述的浓缩的反应液，其组成是：一个合适的反应缓冲液、dNTPs混合液、ATP或NAD+、核酸外切酶III、一种高持续合成能力的DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、一种DNA连接酶、甘油。
在一些实施方案中，所述的浓缩的反应液，需要保存在零下10摄氏度以下，特别是保存在零下20摄氏度，可保存半年以上。
在一些实施方案中，所述的按照一定的体积比例稀释，是指在单位体积浓缩反应液中，额外添加的溶液体积与单位体积之间的比例关系。在满足这个条件之后得到的稀释反应液，其各成分都处于预期的工作状态。
在一些实施方案中，所述的额外添加的溶液，是指被拼接的DNA分子水溶液以及为了满足体积比例稀释而增加的水的体积。
附图说明
通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明，其中：
图1显示了两段双链DNA的拼接图示。
具体实施方式
以DNA为底物的外切酶和聚合酶在作用于DNA时，都存在一个参数---持续作用能力(processivity)。这个能力衡量的是这个酶在一次与底物结合/底物分离循环中，平均作用的碱基数。有些DNA外切酶具有很高的持续作用能力，比如lambda核酸外切酶(K.R.Thomas,and B.M.Olivera.(1978).Processivity of DNA exonucleases.J BiolChem 253:424)，其一次结合底物后会一直水解到DNA的另一端。而有些聚合酶具有很弱的持续作用能力，比如pfu DNA聚合酶，其结合底物后，平均只聚合6个碱基(Wang Y(2004).Anovel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity andimproved performance in vitro.Nucleic Acids Res 32,1197–1207)。
本发明使用的核酸外切酶III可以具有中度的持续作用能力，从测试结果来看，其持续作用能力可以在十几个到几十个碱基不等(K.R.Thomas,and B.M.Olivera.(1978).Processivity of DNA exonucleases.J Biol Chem 253:424)。本发明使用的聚合酶需要有高的持续作用能力，比如添加了Sso7d多肽的聚合酶，这类酶包括Phusion DNA聚合酶和Q5 DNA聚合酶等，其持续合成能力都超过50个碱基。
以Q5 DNA聚合酶为例，当体系中同时存在核酸外切酶III和Q5 DNA聚合酶时，作为底物的双链DNA分子将处于两种状态，一种是其末端被核酸外切酶III从3’-5‘水解，等外切酶从DNA分子脱离时，DNA分子的末端增加了几十个碱基的单链区。另一种是其末端被Q5DNA聚合酶聚合，等聚合酶从DNA分子脱离时，DNA分子的末端会减少几十个碱基的单链区。当这两种酶的活性处于一种平衡时，反应体系中DNA分子的末端会处于一种“产生单链区”与“单链区被消灭”这两种状态的动态平衡中。
在体系处于平衡态时，双链DNA分子的末端中会有一定比例是单链状态的。此时，如果DNA分子末端之间存在同源序列，这些单链区会依据碱基配对原则发生杂交，并在聚合酶的作用下，杂交产生的空隙(空隙是指DNA双链内部，其中一条链缺失一个碱基及以上的结构)被补齐，补齐产生的缺刻(指DNA双链中其中一条链在序列中间发生断裂，但不缺失碱基)被连接酶修复。这个进程不断消耗单链状态，导致之前的平衡被破坏，从而更多的单链末端被产生。图1显示了两段双链DNA在拼接时各种状态的变化方向。如果有超过两段DNA需要拼接，只需再增加一轮拼接即可。
之所以选用高持续合成能力的聚合酶，是为了减少DNA末端处于中间态的可能性。在选用高持续合成能力的聚合酶时，核酸外切酶III一次性水解产生的几十个碱基单链区会被一次补平，从而使DNA末端总是处于长度合适的单链区和没有单链区两种状态。如果选用持续作用能力不足的聚合酶，那么会产生大量单链区长度不够的中间态末端，为了提高有效末端的比例，就需要增加核酸外切酶的用量，这很容易导致聚合与水解这两种状态的平衡被破坏，从而导致一些DNA分子失去所有双链区，失去参与拼接的可能，或者空隙迟迟无法补齐，减少最终产物的产量。这也是为什么在用pfu DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶代替Q5 DNA聚合酶而进行的测试中，都只能观察到极少量的拼接，而且***稳定性很低。
优选地，在上述反应体系中再增加T4多聚核苷酸激酶，可以将5’羟基的DNA磷酸化，这样5‘羟基的双链DNA也可以参与拼接，有效扩展被拼接的双链DNA的形态。
优选地，本发明中所述的DNA聚合酶是Q5 DNA聚合酶(NEB公司产品)。
优选地，本发明中所述的连接酶是9°NTMDNA连接酶(NEB公司产品)。
优选地，本发明中所述的合适的反应缓冲液中，含有终浓度为：10-100mM Tris盐酸(pH7.0-8.5)、5-15毫摩尔/升的镁离子、1-10毫摩尔/升的DTT。
优选地，本发明中所述的dNTPs混合液，其工作浓度是每种200纳摩尔/升。
优选地，本发明中所述的ATP，其工作浓度是0.1-1毫摩尔/升。
与Gibson assembly相比，本发明有以下优势：
1)Gibson assembly中用T5外切酶产生单链区，T5外切酶除了有5‘-3’的双链外切酶活性，其还有单链内切酶活性，因此在这个方法中，任何单链形态存在的DNA都有可能被T5外切酶水解。这在Gibson assembly中是无法避免的，因为单链形态DNA在拼接过程中一直存在。其结果是拼接效率下降，甚至导致有些DNA分子无法参与拼接。本发明用核酸外切酶III产生单链区，这个酶不会水解单链DNA，因此不会有太多的副产物。
2)3‘-5’水解的DNA外切酶不会对DNA的5‘端序列产生破坏，这对保持DNA分子的完整性非常重要。所有的DNA聚合酶都是以5’-3‘方式进行聚合的，一旦5’端的序列被水解，聚合酶无法通过聚合来修复。而3‘端序列被水解，聚合酶是可以很快补齐的。因此在本发明中最后得到的双链是包含完整序列的。但Gibson assembly拼接完成的线性DNA分子两端会缺失一部分碱基。
与基于温度循环的核酸外切酶III方法(US8968999B2)和基于T4 DNA聚合酶的两步法相比，本发明的方法具有更少的操作和控制，实现起来更加容易。本发明选取了高持续合成能力的聚合酶代替持续合成能力弱的Taq DNA聚合酶。减少了DNA末端处于中间态的比例，使得等温拼接成为可能。
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。
实施例1：三段线性DNA的拼接
1、用PCR的方法获得3段线性双链DNA，其序列分别为：
(1)D1
AGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGATGAGGGCCCAAATGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCAGTCCAGTTACGCTGGAGTCAATAGGCGTATCACGAGGCC
(2)D2
AATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTTGTAAAACGACGGCCAGTCCTTCTCTATCCGTTCTCGATCCGCAGTCTCTTGGCACAGGGTGCTTGAGACGCTCGACAGCATCGACGTGCACGTGGAGCTGAAACACGAACTGCAGGGCCTCGACGCGGAACAGCAGAAGCTGATCGGCAACGAACTGGGCAAGCAGATCAAGACCCATATCGGCATCAGCGCGCAGGTGCTGATCCAGCCCTGCCACAGCCTCAAGCGCTCGGAAGGCAAGGCCTGCCACGTCTACGACAAGCGCAACCAGGGTTGAGAGCTCAAGAAGGAGATATACATATGGCGATGTTCACAACGACCGCTAAAGTTATTCAGCCGAAGATCCGTGGCTTTATTTGCACCACCACTCATCCTATCGGTTGCGAGAAACGTGTTCAGGAAGAAATTGCCTATGCGCGTGCCCACCCGCCGACCTCTCCGGGTCCGAAGCGCGTACTGGTGATTGGGTGTAGCACAGGCTATGGCCTGAGCACCCGTATTACTGCCGCTTTCGGTTATCAGGCAGCCACGCTGGGTGTGTTTCTGGCGGGTCCACCAACGAAAGGTCGCCCGGCGGCGGCTGGTTGGTACAATACTGTAGCGTTCGAGAAAGCTGCTCTGGAGGCTGGCCTGTATGCTCGCTCTCTGAACGGCGACGCATTTGATAGTACGACGAAAGCGCGCACTGTTGAAGCTATTAAGCGCGATCTGGGTACAGTTCGTCTCACACACCGTGCGAGTTACTGCCAACCGAGATCCAACCGAGATGGGTCATAGCTGTTTCCAGTGTGCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTT
(3)D3
ACTCGCTGCGCTCGGTCGTTACTGACCATTTAAATCATACCTGACCTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTACGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTCACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGGCAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGATCACTTCTGCGCTCGGCCCTCCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCCCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGCATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGT
2、D1与D2之间有同源序列“AATAGGCGTATCACGAGGCC”。
3、D2与D3之间有同源序列“ACTCGCTGCGCTCGGTCGTT”。
4、D3与D1之间有同源序列“AGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGT”。
5、由于D3与D1也有同源序列，所以这个拼接结果有一定几率是环状的质粒，又由于序列本身含有pBR322复制子和青霉素抗性基因，理论上这个环状质粒可以转化大肠杆菌得到含有序列为D123的克隆。D123的序列如下：
TGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCAGTCCAGTTACGCTGGAGTCAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTTGTAAAACGACGGCCAGTCCTTCTCTATCCGTTCTCGATCCGCAGTCTCTTGGCACAGGGTGCTTGAGACGCTCGACAGCATCGACGTGCACGTGGAGCTGAAACACGAACTGCAGGGCCTCGACGCGGAACAGCAGAAGCTGATCGGCAACGAACTGGGCAAGCAGATCAAGACCCATATCGGCATCAGCGCGCAGGTGCTGATCCAGCCCTGCCACAGCCTCAAGCGCTCGGAAGGCAAGGCCTGCCACGTCTACGACAAGCGCAACCAGGGTTGAGAGCTCAAGAAGGAGATATACATATGGCGATGTTCACAACGACCGCTAAAGTTATTCAGCCGAAGATCCGTGGCTTTATTTGCACCACCACTCATCCTATCGGTTGCGAGAAACGTGTTCAGGAAGAAATTGCCTATGCGCGTGCCCACCCGCCGACCTCTCCGGGTCCGAAGCGCGTACTGGTGATTGGGTGTAGCACAGGCTATGGCCTGAGCACCCGTATTACTGCCGCTTTCGGTTATCAGGCAGCCACGCTGGGTGTGTTTCTGGCGGGTCCACCAACGAAAGGTCGCCCGGCGGCGGCTGGTTGGTACAATACTGTAGCGTTCGAGAAAGCTGCTCTGGAGGCTGGCCTGTATGCTCGCTCTCTGAACGGCGACGCATTTGATAGTACGACGAAAGCGCGCACTGTTGAAGCTATTAAGCGCGATCTGGGTACAGTTCGTCTCACACACCGTGCGAGTTACTGCCAACCGAGATCCAACCGAGATGGGTCATAGCTGTTTCCAGTGTGCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTACTGACCATTTAAATCATACCTGACCTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTACGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTCACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGGCAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGATCACTTCTGCGCTCGGCCCTCCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCCCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGCATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGATGAGGGCCCAAA
6、制备以下反应体系，反应总体积为5μl：
(1)50mM Tris盐酸，pH为7.8
(2)10mM MgCl2
(3)10mM DTT
(4)10ng PCR产物D1
(5)10ng PCR产物D2
(6)10ng PCR产物D3
(7)200nM dNTPs(每种)
(8)0.5mM ATP
(9)1U T4多聚核苷酸激酶(NEB公司产品)
(10)4U 9°NTMDNA连接酶(NEB公司产品)
(11)0.25U Q5DNA聚合酶(NEB公司产品)
(12)0.375U核酸外切酶III(NEB公司产品)
用水补充体积到5微升。
7、将上述反应体系置于40度1小时，取2微升样品转化DH5alpha大肠杆菌。
8、第二天在含有50微克/毫升羧苄青霉素的培养皿上得到256个菌落。
9、挑取5个菌落进行测序验证，结果显示这5个菌落中含有的质粒序列都符合预期。
实施例2：测试拼接预制试剂盒
1、配制用于实施例1的方法的浓缩的反应液，其组成如下：
(1)190mM Tris盐酸，pH为7.8
(2)38mM MgCl2
(3)38mM DTT
(4)760nM dNTPs(每种)
(5)1.9mM ATP
(6)200U T4多聚核苷酸激酶(NEB公司产品)
(7)800U 9°NTMDNA连接酶(NEB公司产品)
(8)50U Q5DNA聚合酶(NEB公司产品)
(9)75U核酸外切酶III(NEB公司产品)
(10)50％甘油
最终体积为270微升。
该浓缩反应液可以在-20摄氏度存放至少6个月而不会对功能产生明显的影响。
3、测试这个试剂盒的作用
(1)取1.3微升上述浓缩反应液；
(2)加入10ng实施例1中的PCR产物D1；
(3)加入10ng实施例1中的PCR产物D2；
(4)加入10ng实施例1中的PCR产物D3；
(5)用水补充体积到5微升。
(6)将上述反应体系置于40度1小时，取2微升样品转化DH5alpha大肠杆菌。
(7)第二天在含有50微克/毫升羧苄青霉素的培养皿上得到270个菌落。
(8)挑取5个菌落进行测序验证，结果显示这5个菌落中含有的质粒序列都符合预期。
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种在多种酶协同作用下将两段或更多双链DNA分子有序拼接起来的方法，所述方法包括在生物体外，将包含核酸外切酶III、高持续合成能力的DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、DNA连接酶和两段或更多双链DNA分子的反应体系置于恒温反应条件下一段时间，其中被拼接的双链DNA分子相邻末端之间存在相同或相似的序列，其拼接过程如下：
(1)核酸外切酶III将双链DNA分子的末端以3‘-5’方向水解，产生单链区域；
(2)T4多聚核苷酸激酶将未磷酸化的5‘末端磷酸化；
(3)DNA分子之间的两个相邻末端由于存在同源序列而发生单链之间的杂交；
(4)高持续合成能力的聚合酶将杂交后的空隙补齐；
(5)DNA连接酶将聚合酶补齐之后的缺刻修复；
其中所述有序拼接是指两段或更多双链DNA分子按照设定的顺序拼接。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述置于恒温反应条件下一段时间是将含有所述反应体系的反应容器置于恒温的条件下一段时间，拼接反应期间不改变反应容器的温度，也不在反应容器中添加额外的物质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的一段时间是10分钟-120分钟，优选是30分钟-60分钟。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述恒温是温度固定在37-50摄氏度之间的某一个温度，优选固定在39-45之间的某一个温度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述高持续合成能力的DNA聚合酶是在一个结合底物-脱离底物周期内聚合的平均碱基数较高的DNA聚合酶，优选是Phusion DNA聚合酶、Q5DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶，更优选是Q5 DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA连接酶是T4 DNA连接酶、9°NTMDNA连接酶、Taq DNA连接酶、T3 DNA连接酶或T7 DNA连接酶，优选是9°NTMDNA连接酶或T4 DNA连接酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应体系包含：被拼接的双链DNA分子、反应缓冲液、dNTPs混合液、ATP或NAD+、核酸外切酶III、高持续合成能力的DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶和DNA连接酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的DNA分子相邻末端，是按照有序的方式排列的双链DNA分子中，某一段序列的3’末端和这段序列后面的那段序列的5‘末端。
9.用于根据权利要求1-8任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包括浓缩反应液，所述浓缩反应液在用额外添加的溶液按照一定的体积比例稀释后，其中的各种成分处于合适的工作状态；所述浓缩反应液包含：反应缓冲液、dNTPs混合液、ATP或NAD+、核酸外切酶III、高持续合成能力的DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、DNA连接酶和甘油。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的额外添加的溶液是被拼接的DNA分子水溶液以及为了满足体积比例稀释而增加的水。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116218953A (zh) * | 2023-01-03 | 2023-06-06 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种连接核酸片段与接头的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102016070A (zh) * | 2008-02-15 | 2011-04-13 | 合成基因组公司 | 体外连接和组合装配核酸分子的方法 |
| CN106591294A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-04-26 | 中山大学 | 一种一管反应式的dna分子克隆拼接方法 |
| WO2017066943A1 (zh) * | 2015-10-21 | 2017-04-27 | 深圳华大基因研究院 | 一种dna片段体外组装方法和试剂盒 |
| CN106661631A (zh) * | 2014-06-06 | 2017-05-10 | 康奈尔大学 | 使用组合的核酸酶、连接酶、聚合酶和测序反应识别和枚举核酸序列、表达、拷贝或dna甲基化变化的方法 |
| CN106715694A (zh) * | 2014-06-23 | 2017-05-24 | 瑞泽恩制药公司 | 核酸酶介导的dna组装 |
| CN106754883A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-31 | 中山大学 | 一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接改造方法及其试剂盒 |
-
2019
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102016070A (zh) * | 2008-02-15 | 2011-04-13 | 合成基因组公司 | 体外连接和组合装配核酸分子的方法 |
| CN106661631A (zh) * | 2014-06-06 | 2017-05-10 | 康奈尔大学 | 使用组合的核酸酶、连接酶、聚合酶和测序反应识别和枚举核酸序列、表达、拷贝或dna甲基化变化的方法 |
| CN106715694A (zh) * | 2014-06-23 | 2017-05-24 | 瑞泽恩制药公司 | 核酸酶介导的dna组装 |
| WO2017066943A1 (zh) * | 2015-10-21 | 2017-04-27 | 深圳华大基因研究院 | 一种dna片段体外组装方法和试剂盒 |
| CN106591294A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-04-26 | 中山大学 | 一种一管反应式的dna分子克隆拼接方法 |
| CN106754883A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-31 | 中山大学 | 一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接改造方法及其试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DANIEL G GIBSON, ET AL.: "Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases", NATURE METHODS * |
| 张双华等: "DNA拼接技术研究进展", 生命科学 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116218953A (zh) * | 2023-01-03 | 2023-06-06 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种连接核酸片段与接头的方法 |
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