CN106588937B - 咪唑并吡嗪类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
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    • A61K31/4985—Pyrazines or piperazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及咪唑并吡嗪类化合物及其制备方法和应用。具体地，本发明涉及具有式(I)所示结构的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药，以及所述化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者的与布鲁顿酪氨酸激酶过度活性相关的疾病和/或症状。本发明还涉及所述化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药用于制备制剂的用途，所述制剂用于降低或抑制细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶活性。

Description

咪唑并吡嗪类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及咪唑并吡嗪类化合物，制备所述化合物的方法，以及所述化合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者的与布鲁顿酪氨酸激酶过度活性相关的疾病和/或症状。
背景技术
布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase，BTK)是B细胞受体信号复合体中的一种关键信号分子，是淋巴细胞生存和增殖的关键蛋白激酶。BTK在恶性B细胞的生存及扩散中起着重要作用。
BTK抑制剂通过抑制肿瘤细胞BTK而起到抗癌的作用。首创BTK抑制剂依鲁替尼(Ibrutinib)是一种4’-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶化合物(Honigberg L.A.,et al.ProcNatl Acad Sci USA,107:13075,2010)，通过与靶蛋白BTK活性位点半胱氨酸残基(Cys-481)选择性地共价结合,不可逆性地抑制BTK，从而有效地阻止肿瘤从B细胞迁移到适应于肿瘤生长环境的淋巴组织。2013年以来，美国FDA批准依鲁替尼用于难治套细胞淋巴瘤(MCL)、难治慢性淋巴细胞白血病(CLL)、携带del 17p删除突变的CLL的治疗和原发性巨球蛋白血症的治疗。
BTK抑制剂除了依鲁替尼以外，AVL-292(CC292)、ONO-4059、BGB-3111和Acalabrutinib(ACP-196)也进入临床开发阶段，用于B-细胞非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、毛细胞白血病、成人急性淋巴细胞白血病等治疗。依鲁替尼与化疗药物或其它靶向抗癌药联合治疗，可以增加对肿瘤的疗效。临床试验中，可与BTK抑制剂联合使用的药物包括利妥昔单抗(rituximab)、来那度胺、氟达拉滨、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松。
与正常造血细胞相比，大约80％的急性髓系白血病(AML)患者原始细胞中BTK活性增高，导致细胞在体外对口服BTK抑制剂依鲁替尼敏感(Marcel Spaargaren M.LancetHeamat.2:e180,2015)。一项依鲁替尼单用或与阿糖胞苷联合用药治疗急性髓系白血病的临床研究已进入II期临床阶段。
近年来还发现，BTK在实体瘤(如***癌)细胞和组织中表达，表达水平与癌症分级相关(Guo W.et al.Cell Death Dis.5:e1409,2014)。依鲁替尼抑制B细胞和巨噬细胞BTK，恢复T细胞依赖性抗肿瘤免疫反应(Gunderson A.J.et al.Cancer Discov.6:270,2016)。依鲁替尼和Acalabrutinib用于治疗多种实体瘤(例如NSCLC、乳腺癌、***癌、胃癌、结肠癌等)的II期临床试验正在开展(Clinical Trials.gov)。
正常B细胞发育和活化过程中，BTK在B细胞受体(BCR)信使***中的作用至关重要。BCR信号异常与自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎(RA))有关。此外，BTK也在髓系细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞中表达。这些细胞浸润滑膜腔，并产生炎性细胞因子，加重关节炎症状。BTK抑制剂可以阻断B细胞受体依赖性细胞增殖，减少炎性因子产生(Whang J.A.,Chang B.Y.Drug Discov Today.19:1200,2014)。临床前研究表明，BTK抑制剂还对多种炎症和自身免疫性疾病，如类风湿关节炎的动物模型有效。除了类风湿关节炎与红斑狼疮之外，这类药物有可能会用于狼疮性肾炎、多发性硬化症、肖格伦综合征及潜在疾病哮喘等。CC-292和HM71224等BTK抑制剂用于自身免疫性疾病的治疗(如类风湿关节炎)已进入临床试验阶段(Clinical Trials.gov ID:NCT01975610,NCT01765478)。
Acalabrutinib(ACP-196)是第二代BTK抑制剂，对BTK的选择性高于对其他激酶。Acalabrutinib不抑制EGFR、ITK和TEC，对EGFR在Y1068和Y1173位点的磷酸化没有影响。相对于第一代BTK抑制剂依鲁替尼，Acalabrutinib具有更高的IC50值。与第一代BTK抑制剂不同的是，临床前及临床实验数据显示，Acalabrutinib能够选择性地阻断BTK通路，不影响正常EGFR，并且不会破坏保持血小板和免疫功能的关键分子通路，因而避免或减少了与癌症治疗相关的某些不良反应(Byrd J.C.et al.N Engl J Med 374:323,2016)。
上述研究都表明，BTK抑制剂，尤其是选择性BTK抑制剂，作为防治肿瘤、多种炎症和自身免疫性疾病的药物有很大的潜在价值。
发明内容
发明人通过大量研究发现，如式(I)所示的化合物具有BTK抑制活性，因此，所述化合物可作为BTK抑制剂发挥作用，例如，可用于预防和/或治疗与BTK相关的疾病(例如，肿瘤、炎症和自身免疫性疾病)。
因此，本申请的一个方面涉及具有式(I)所示结构的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药：
其中，
A选自CH或N；
n为0、1、2或3；
R1选自如下基团：
其中，R3、R4分别独立地选自H和C1-C6烷基；
R5选自H、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C4烷基、氨基取代的C1-C4烷基、C1-C3烷基氨基取代的C1-C4烷基、二C1-C3烷基氨基取代的C1-C4烷基、杂环基取代的C1-C4烷基；
X1、X2、X3和X4分别独立地选自C(R2)和N；
R2选自H、卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基；
W和Y分别独立地选自O、N(R6)、S、C1-C6亚烷基，并且W和Y中，至少一个选自C1-C6亚烷基；
R6选自H或C1-C6烷基；
Ar选自苯基或5-6元杂芳基(例如5-6元含氮杂芳基)，任选地，所述苯基或5-6元杂芳基被选自以下的基团所取代：卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基。
在某些实施方案中，A为CH。
在某些实施方案中，X1、X2、X3和X4各自选自C(R2)；或者，X1、X2、X3和X4中的一个为N，其余各自选自C(R2)。
在某些实施方案中，X1、X2、X3和X4各自为CH。
在某些实施方案中，X1为N，X2、X3和X4各自选自C(R2)，更优选地，X2、X3和X4各自为CH。
在某些实施方案中，X2为N，X1、X3和X4各自选自C(R2)，更优选地，X1、X3和X4各自为CH。
在某些实施方案中，X3为N，X1、X2和X4各自选自C(R2)，更优选地，X1、X2和X4各自为CH。
在某些实施方案中，X4为N，X1、X2和X3各自选自C(R2)，更优选地，X1、X2和X3各自为CH。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(II)所示的结构：
其中，X5、X6、X7、X8和X9分别独立地选自C(R7)或N；
R7选自H、卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基。
在某些实施方案中，X5、X6、X7、X8和X9各自选自C(R7)；或者，X5、X6、X7、X8和X9中的一个为N，其余各自选自C(R7)。
在某些实施方案中，X5为N，X6、X7、X8和X9各自选自C(R7)；
在某些实施方案中，X6为N，X5、X7、X8和X9各自选自C(R7)。
在某些实施方案中，X7为N，X5、X6、X8和X9各自选自C(R7)。
在某些实施方案中，X8为N，X5、X6、X7和X9各自选自C(R7)。
在某些实施方案中，X9为N，X5、X6、X7和X8各自选自C(R7)。
在某些实施方案中，X5、X6、X7、X8和X9各自为CH。
在某些实施方案中，X6、X7、X8和X9各自为CH，X5为C(R7)，并且R7选自卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基。
在某些实施方案中，X5、X7、X8和X9各自为CH，X6为C(R7)，并且R7选自卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基。
在某些实施方案中，X5、X6、X8和X9各自为CH，X7为C(R7)，并且R7选自卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基。
在某些实施方案中，X5、X6、X7和X9各自为CH，X8为C(R7)，并且R7选自卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基。
在某些实施方案中，X5、X6、X7和X8各自为CH，X9为C(R7)，并且R7选自卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基。
在某些实施方案中，W选自O、N(R6)、S，R6选自H或C1-C6烷基；Y选自C1-C6亚烷基。
在某些实施方案中，Y选自C1-C3亚烷基，例如亚甲基、1,1-亚乙基、1,2-亚乙基。
在某些实施方案中，n为1或2。
在某些实施方案中，n为1。
在某些实施方案中，中的手性碳原子为S构型。
在某些实施方案中，R1选自如下基团：
在某些实施方案中，R1选自
在某些实施方案中，R5选自H、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C4烷基、C1-C3烷基氨基取代的C1-C4烷基、二C1-C3烷基氨基取代的C1-C4烷基、5-6元饱和含氮杂环基取代的C1-C4烷基。
在某些实施方案中，R1为
在某些实施方案中，R3为H。
在某些实施方案中，R4为H。
在某些实施方案中，R5选自H、C1-C3烷氧基取代的C1-C4烷基、C1-C3烷基氨基取代的C1-C4烷基、二C1-C3烷基氨基取代的C1-C4烷基、5-6元饱和含氮杂环基取代的C1-C4烷基。
在某些实施方案中，R1为
在某些实施方案中，R5选自H、C1-C4烷基、C3-C6环烷基。
在某些实施方案中，A为CH；
X1、X2、X3和X4各自为CH；或者
X1为N，X2、X3和X4各自为CH；或者
X2为N，X1、X3和X4各自为CH；或者
X3为N，X1、X2和X4各自为CH；或者
X4为N，X1、X2和X3各自为CH；
W为O、N(R6)、S，R6选自H或C1-C3烷基；
Y选自C1-C3亚烷基；
n为1；
R1选自
其中，R3为H；
R4为H；
R5选自H、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C4烷基、C1-C3烷基氨基取代的C1-C4烷基、二C1-C3烷基氨基取代的C1-C4烷基、5-6元饱和含氮杂环基取代的C1-C4烷基；
Ar选自苯基或6元含氮杂芳基，任选地，所述苯基或6元含氮杂芳基被选自以下的基团所取代：卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(III)所示的结构；
其中，X1为CH或N；
W选自O、S、N(R6)，R6选自H或甲基；
Y选自亚甲基、1,1-亚乙基、1,2-亚乙基；
X6和X7独立地选自C(R7)，R7选自H、F、三氟甲基、甲氧基；
X9选自CH或N；
R1为其中，R3为H，R4为H，R5选自H、甲氧基取代的甲基、二甲基氨基取代的甲基、哌啶基取代的甲基；或者
R1为其中，R5选自H、甲基、乙基、异丙基、环丙基；或者
R1为其中，R3、R4、R5各自为H。
在某些实施方案中，本申请的化合物选自：
本申请的一个方面涉及一种药物组合物，包含本申请的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药。
任选地，本申请的药物组合物还包含一种或多种药用辅料。
本申请的药用辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋型、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。药用辅料根据来源可分为天然物、半合成物和全合成物；根据其作用与用途可分为：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等；根据其给药途径可分为口服、注射、黏膜、经皮或局部给药、经鼻或口腔吸入给药和眼部给药等。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。
本申请的药物组合物可根据给药途径制成各种适宜的剂型。
当口服用药时，所述药物组合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂和口服乳剂等。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当经皮或局部施用时，所述药物组合物可制成适当的软膏、洗剂或搽剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或搽剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
所述药物组合物还可以注射剂形式用药，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
任选地，本申请的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药可与第二治疗剂联合施用。因此，任选地，本申请的药物组合物还包含一种或多种第二治疗剂。在某些实施方案中，所述第二治疗剂为化疗药物、靶向抗癌药或免疫治疗药。在某些实施方案中，所述第二治疗剂选自利妥昔单抗、来那度胺、氟达拉滨、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松。
本申请的一个方面涉及本申请的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者的与布鲁顿酪氨酸激酶过度活性相关的疾病和/或症状。
在某些实施方案中，所述与布鲁顿酪氨酸激酶过度活性相关的疾病和/或症状选自肿瘤(例如血液肿瘤或实体瘤)、炎症或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，所述血液肿瘤选自淋巴瘤、骨髓瘤、淋巴细胞白血病、急性髓系白血病。
在某些实施方案中，所述实体瘤选自肺癌、乳腺癌、***癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌。
在某些实施方案中，所述炎症或自身免疫性疾病选自类风湿关节炎、红斑狼疮、狼疮性肾炎、多发性硬化症、肖格伦综合征及潜在疾病哮喘。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人。
在某些实施方案中，所述药物还包含一种或多种第二治疗剂。在某些实施方案中，所述第二治疗剂为化疗药物、靶向抗癌药或免疫治疗药。在某些实施方案中，所述第二治疗剂选自利妥昔单抗、来那度胺、氟达拉滨、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松。
本申请的一个方面涉及一种预防和/或治疗受试者的疾病和/或症状的方法，所述疾病和/或症状与布鲁顿酪氨酸激酶过度活性相关，所述方法包括给有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的本申请的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药，或者本申请的药物组合物。
在某些实施方案中，所述与布鲁顿酪氨酸激酶过度活性相关的疾病和/或症状选自肿瘤(例如血液肿瘤或实体瘤)、炎症或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，所述血液肿瘤选自淋巴瘤、骨髓瘤、淋巴细胞白血病、急性髓系白血病。
在某些实施方案中，所述实体瘤选自肺癌、乳腺癌、***癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌。
在某些实施方案中，所述炎症或自身免疫性疾病选自类风湿关节炎、红斑狼疮、狼疮性肾炎、多发性硬化症、肖格伦综合征及潜在疾病哮喘。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人。
在某些实施方案中，所述方法还包括，给所述受试者施用一种或多种第二治疗剂。在某些实施方案中，所述第二治疗剂为化疗药物、靶向抗癌药或免疫治疗药。在某些实施方案中，所述第二治疗剂选自利妥昔单抗、来那度胺、氟达拉滨、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松。
本申请的另一个方面涉及本申请的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药用于制备制剂的用途，所述制剂用于降低或抑制细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶活性。
在某些实施方案中，所述制剂被施用至受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内，以降低或抑制受试者体内细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶的活性；或者，所述制剂被施用至体外细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞)，以降低或抑制体外细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶活性。
在某些实施方案中，所述细胞选自肿瘤细胞(例如实体瘤细胞，例如肺癌细胞、乳腺癌细胞、***癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞)。
在某些实施方案中，所述细胞选自髓系细胞或淋巴细胞。
在某些实施方案中，所述细胞为来自受试者的原代细胞或其培养物，或已建立的细胞系。
本申请的另一个方面涉及一种降低或抑制细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶活性的方法，包括给所述细胞使用有效量的本申请的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药。
在某些实施方案中，所述方法在体内或者体外进行；优选地，所述方法在体内进行，例如应用于受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内，以降低或抑制受试者体内细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶的活性；或者，所述方法在体外进行，例如应用于体外细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞)，以降低或抑制体外细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶的活性。
在某些实施方案中，所述细胞选自肿瘤细胞(例如实体瘤细胞，例如肺癌细胞、乳腺癌细胞、***癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞)。
在某些实施方案中，所述细胞选自髓系细胞或淋巴细胞。
在某些实施方案中，所述细胞为来自受试者的原代细胞或其培养物，或已建立的细胞系。
本申请的另一个方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括本申请的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药，且任选地还包括使用说明。
在某些实施方案中，所述试剂盒用于降低或抑制细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶活性。
在某些实施方案中，所述细胞选自肿瘤细胞(例如实体瘤细胞，例如肺癌细胞、乳腺癌细胞、***癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞)。
在某些实施方案中，所述细胞选自髓系细胞或淋巴细胞。
在某些实施方案中，所述细胞为来自受试者的原代细胞或其培养物，或已建立的细胞系。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“立体异构体”包括构象异构体和构型异构体，其中所述构型异构体主要包括顺反异构体和旋光异构体。本发明所述化合物可以以立体异构体的形式存在，并因此涵盖所有可能的立体异构体形式，及其任何组合或任何混合物。例如单一对映异构体，单一非对映异构体或以上的混合物。当本发明所述的化合物含有烯烃双键时，除非特别说明，否则其包括顺式异构体和反式异构体，以及其任何组合。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指，(1)本发明化合物中存在的酸性官能团(例如-COOH、-OH、-SO3H等)与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，例如本发明化合物与碱金属或碱土金属形成的盐、本发明化合物的铵盐，和本发明化合物与含氮有机碱形成的盐；以及(2)本发明化合物中存在的碱性官能团(例如-NH2等)与适当的无机或者有机阴离子(酸)形成的盐，例如本发明化合物与无机酸或有机羧酸形成的盐。
因此，本发明化合物的“药学上可接受的盐”包括但不限于，碱金属盐，如钠盐、钾盐、锂盐等；碱土金属盐，如钙盐、镁盐等；其他金属盐，如铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等；无机碱盐，如铵盐；有机碱盐，如叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己基胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基胺盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐；氢卤酸盐，如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐等；无机酸盐，如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；低级烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐等；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐、对苯磺酸盐等；有机酸盐，如醋酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等；氨基酸盐，如甘氨酸盐、三甲基甘氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐等。
如本文中所使用的，术语“前药”，也称前体药物、药物前体、前驱药物等，是指本申请的化合物经修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效的化合物。前药的设计原理以及制备方法为本领域技术人员已知。
如本文中所使用的，术语“C1-C6烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。具体的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基。术语“C1-C4烷基”指C1-C6烷基中的含有1-4个碳原子的具体实例。术语“C1-C3烷基”指C1-C6烷基中的含有1-3个碳原子的具体实例。
如本文中所使用的，术语“C1-C6烷氧基”是指以“C1-C6烷基-O-”方式形成的基团，其中“C1-C6烷基”的定义如前文所述。具体的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。术语“C1-C3烷氧基”指C1-C6烷氧基中的含有1-3个碳原子的具体实例。
如本文中所使用的，术语“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
本发明所述的“卤代C1-C6烷基”指一个或多个卤素原子取代C1-C6烷基上的一个或多个氢原子所衍生的基团，所述“卤素原子”和“C1-C6烷基”如前文所定义。本发明所述的“卤代C1-C4烷基”指卤代C1-C6烷基中的含有1-4个碳原子的具体实例。
如本文中所使用的，术语“C1-C3烷基氨基”是指以“C1-C3烷基-NH-”方式形成的基团，其中“C1-C3烷基”的定义如前文所述。具体的实例包括但不限于甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基。
如本文中所使用的，术语“二C1-C3烷基氨基”是指以“2(C1-C3烷基)-N-”方式形成的基团，其中“C1-C3烷基”的定义如前文所述。具体的实例包括但不限于二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、甲基乙基氨基等。
如本文中所使用的，术语“C1-C6亚烷基”指C1-C6烷基去除一个氢原子衍生的基团，例如C1-C3亚烷基、C1-C4亚烷基、C2-C4亚烷基，其中“C1-C6烷基”的定义如前文所述。具体的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、1,2-亚乙基(-CH2CH2-)、1,1-亚乙基(-CH(CH3)-)、三亚甲基(-CH2CH2CH2-)等。所述的“C1-C3亚烷基”指上述实例中的含有1-3个碳原子的具体实例。
如本文中所使用的，术语“杂环基”是指环原子中至少一个为杂原子(例如氧原子、硫原子、氮原子)的环状基团，例如3-8元杂环基、5-6元杂环基、含氮杂环基、含氧杂环基、含硫杂环基、饱和杂环基、不饱和杂环基、3-8元饱和杂环基、5-6元饱和杂环基、3-8元含氮杂环基、3-8元含氧杂环基、3-8元含硫杂环基、5-6元含氮杂环基、3-8元饱和含氮杂环基、5-6元饱和含氮杂环基。具体的实例包括但不限于：氮杂环丙烷基、2H-氮杂环丙烷基、二氮杂环丙烷基、3H-二氮杂环丙烯基、氮杂环丁烷基、1,4-二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、1,4-二氧杂环己二烯基、四氢呋喃基、二氢吡咯基、吡咯烷基、咪唑烷基、4,5-二氢咪唑基、吡唑烷基、4,5-二氢吡唑基、2,5-二氢噻吩基、四氢噻吩基、4,5-二氢噻唑基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、六氢嘧啶基、六氢哒嗪基、4,5-二氢噁唑基、4,5-二氢异噁唑基、2,3-二氢异噁唑基、2H-1,2-噁嗪基、4H-1,2-噁嗪基、6H-1,2-噁嗪基、4H-1,3-噁嗪基、6H-1,3-噁嗪基、4H-1,4-噁嗪基、4H-1,3-噻嗪基、6H-1,3-噻嗪基、2H-吡喃基、2H-吡喃-2-酮基、3,4-二氢-2H-吡喃基等。
如本文中所使用的，术语“芳基”是指具有芳香性的单环或多环烃基，例如6-10元芳基等。具体的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基、菲基等。
如本文中所使用的，术语“杂芳基”是指含有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的芳基，例如6-10元杂芳基、5-6元杂芳基、含氮杂芳基、含氧杂芳基、含硫杂芳基、5-6元含氮杂芳基、6-10元含氧杂芳基。具体的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-***基、1,2,4-***基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、嘧啶基、2H-1,2-噁嗪基、4H-1,2-噁嗪基、6H-1,2-噁嗪基、4H-1,3-噁嗪基、6H-1,3-噁嗪基、4H-1,4-噁嗪基、哒嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4,5-四嗪基、氮杂环庚三烯基、1,3-二氮杂环庚三烯基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并***基、喹啉基、2-喹啉酮、4-喹啉酮、1-异喹啉酮、异喹啉基、吖啶基、菲啶基、苯并哒嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、酚嗪基、喋啶基、嘌呤基、萘啶基、吩嗪、吩噻嗪等。
如本文中所使用的，术语“C3-C6环烷基”是指含有3-6个环原子的单环饱和烷基，例如3-4元环烷基、3-5元环烷基、4-6元环烷基、5-6元环烷基、3元、4元、5元、6元环烷基。具体的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
发明的有益效果
本申请的化合物对BTK有强的抑制作用，而对EGFR、Tec、Txk、ITK无明显抑制作用，并且能够剂量依赖地抑制肿瘤生长。与第一代BTK抑制剂相比，本申请的化合物具有良好的选择性，与第二代BTK抑制剂相比，本申请的化合物具有优良的药代特性，更加安全有效。
本申请的化合物能够用于治疗BTK所参与的各种疾病，特别地，对血液恶性肿瘤、实体瘤、炎症以及自身免疫性疾病的治疗有较大的应用价值。
附图说明
图1显示了化合物1和ACP-196分别对大鼠口服给药(20mg/kg)的血药浓度-时间曲线。如图所示，化合物1具有更短的半衰期和更高的血暴露量。
图2显示了化合物1抑制TMD-8淋巴瘤细胞株移植肿瘤生长的量效关系，其中，图2A显示了各组小鼠肿瘤体积的变化，图2B显示了各组小鼠的体重变化。结果表明，化合物1能够通过口服给药剂量依赖性地抑制TMD-8移植肿瘤生长。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的化合物可通过以下合成方案制得：
方案1：
方案2：
方案3：
实施例
实施例1：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(苄氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-(benzyloxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)p yrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物1)的制备
步骤1a：(3-氯吡嗪-2-基)甲胺盐酸盐((3-chloropyrazin-2-yl)methanaminehydrochloride)(化合物102)的制备：向3-氯吡嗪-2-腈(化合物101)(6.00g,43.0mmol，1.0当量)的醋酸溶液(50mL)中加入雷尼镍(4.00g)，在氢气球下室温反应1.5天。将反应液过滤，滤液旋干，剩余物依次用甲苯(40mL)、1N HCl(15mL)、甲苯(40mL)带旋，剩余物用四氢呋喃(30mL)超声溶解，过滤，滤饼旋干，得到(3-氯吡嗪-2-基)甲胺盐酸盐(8.75g，收率：100％)。黑色固体；LCMS(ESI)：m/z 144[M+1]+。
步骤1b：苄基(S)-2-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-甲酸酯(benzyl(S)-2-(((3-chloropyrazin-2-yl)methyl)carbamoyl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物104)的制备：在0℃下，向(3-氯吡嗪-2-基)甲胺盐酸盐(化合物102)(2.48g，13.8mmol，1.0当量)的二氯甲烷溶液(80mL)中加入三乙胺(5.58g，55.2mmol，4.0当量)和((苄氧基)羰基)-L-脯氨酸(化合物103)(3.43g，13.8mmol，1.0当量)，在0℃下搅拌15分钟，再加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU,5.50g，14.5mmol，1.05当量)，反应液在0℃至室温下反应5分钟。反应液用二氯甲烷(200mL)稀释，依次用氯化铵溶液(200mL×1)、饱和碳酸氢钠溶液(200mL×1)、饱和食盐水(200mL×1)洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝80:1)得到苄基(S)-2-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-甲酸酯(2.85g，收率：55.1％)。浅棕色油状物；LCMS(ESI)：m/z 375[M+1]+。
步骤1c：苄基(S)-2-(8-氯咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(benzyl(S)-2-(8-chloroimidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物106)的制备：在0℃下，向苄基(S)-2-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物104)(2.85g，7.6mmol，1.0当量)的乙腈溶液(60mL)中加入1,3-二甲基咪唑啉酮(化合物105)(2.60g，22.8mmol，3.0当量)，再缓慢滴加三氯氧磷(4.66g，30.4mmol，4.0当量)，反应液在0℃下反应5分钟，恢复至室温，再在氮气的保护下加热至65℃回流2天。将反应液缓慢倒入到氨水-冰水(150mL-300mL)中，搅拌15分钟，用乙酸乙酯(300mL×2)萃取，合并有机相并旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝500:6)得到苄基(S)-2-(8-氯咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(2.06g，收率：76.3％)。浅棕色油状物；LCMS(ESI)：m/z 357[M+1]+。
步骤1d：苄基(S)-2-(1-溴-8-氯咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(benzyl(S)-2-(1-bromo-8-chloroimidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物107)的制备：向苄基(S)-2-(8-氯咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物106)(2.06g，5.8mmol，1.0当量)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(24mL)中加入N-溴代丁二酰亚胺(1.03g，5.8mmol，1.0当量)，反应液在室温下反应3小时。将反应液用乙酸乙酯(300mL)稀释，用半饱和食盐水(300mL×3)洗，有机相拌样旋干，用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝100:1)，得到苄基(S)-2-(1-溴-8-氯咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(1.76g，收率：69.6％)。粉红色固体；LCMS(ESI)：m/z 435[M+1]+。
步骤1e：苄基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(benzyl(S)-2-(8-amino-1-bromoimidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物108)的制备：向密封管中加入苄基(S)-2-(1-溴-8-氯咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物107)(1.76g，4.0mmol，1.0当量)、异丙醇(30mL)、氨水(10mL)，在氮气保护下加热至110℃反应过夜。将反应液旋干，剩余物用甲醇溶解后再旋干，用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝100:1)，得到苄基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(1.32g，收率：79.5％)。白色泡沫状物；LCMS(ESI)：m/z 416[M+1]+。
步骤1f：(S)-1-溴-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺氢溴酸盐((S)-1-bromo-3-(pyrrolidin-2-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-8-amine hydrobromide)(化合物109)的制备：向反应瓶中加入苄基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物108)(1.32g，3.2mmol，1.0当量)，33％氢溴酸的醋酸溶液(12mL)，超声溶解，室温下反应20分钟。将反应液倒入二氯甲烷溶液(100mL)中，有固体析出，过滤，滤饼用甲醇带旋三次，旋干后得到(S)-1-溴-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺氢溴酸盐(1.16g，收率：～100％)。浅棕色固体；LCMS(ESI)：m/z 282[M+1]+。
步骤1g：叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(tert-butyl(S)-2-(8-amino-1-bromoimidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carbox ylate)(化合物110)的制备：在0℃下，向(S)-1-溴-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺氢溴酸盐(化合物109)(1.16g，3.2mmol，1.0当量)的二氯甲烷溶液(30mL)中加入三乙胺(0.81g，8.0mmol，2.5当量)，再缓慢滴加BOC酸酐(0.72g，3.3mmol，1.05当量)的二氯甲烷溶液(5mL)，反应液在0℃下反应25分钟。将反应液用二氯甲烷(150mL)稀释，用盐水(100mL×2)洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝80:1)，得到叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(1.08g，收率：88.5％)。白色泡沫状物；LCMS(ESI)：m/z 382[M+1]+。
步骤1h：叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-(苄氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(tert-butyl(S)-2-(8-amino-1-(4-(benzyloxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrro lidine-1-carboxylate)(化合物301-1)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物110)(0.86g，2.3mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(36mL)中加入4-苄氧基苯硼酸(0.77g，3.4mmol，1.5当量)，碳酸钾(0.95g，6.9mmol，3.0当量)的水(12mL)溶液，和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.17g，0.23mmol，0.1当量)。将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流过夜。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝60:1)，得到叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-(苄氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(0.95g，收率：85.0％)。浅棕色泡沫状物；LCMS(ESI)：m/z 486[M+1]+。
步骤1i：(S)-1-(4-(苄氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺((S)-1-(4-(benzyloxy)phenyl)-3-(pyrrolidin-2-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-8-amine)(化合物302-1)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-(苄氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物301-1)(0.95g，1.96mmol，1.0当量)的二氯甲烷溶液(20mL)中加入三氟醋酸(4.0mL)，室温下搅拌1小时。将反应液倒入饱和碳酸钠溶液(100mL)中，用二氯甲烷(100mL×4)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇:三乙胺＝15:1:0.05)，得到(S)-1-(4-(苄氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(0.57g，收率：75.4％)。浅黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 386[M+1]+。
步骤1j：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(苄氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-(benzyloxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)p yrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物1)的制备：在0℃下，向2-丁炔酸(0.14g，1.63mmol，1.1当量)的二氯甲烷溶液(17mL)中加入三乙胺(0.22g，2.22mmol，1.5当量)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.62g，1.63mmol，1.1当量)，再缓慢滴加(S)-1-(4-(苄氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-1)(0.57g，1.48mmol，1.0当量)的二氯甲烷(20mL)溶液，反应液在0℃下反应25分钟。反应液用二氯甲烷稀释并用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝60:1)，得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(苄氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮(545mg，收率：81.3％)。浅黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 452[M+1]+，1HNMR(CDCl3，500MHz)：δ7.75-7.76(m，1H)，7.53-7.57(m，2H)，7.28-7.46(m，5H)，7.05-7.10(m，3H)，5.42-5.45(m，1H)，5.12(s，2H)，5.09-5.25(m，2H)，3.82-3.91(m，2H),2.30-2.55(m，3H),2.01-2.04(m，1H)，1.97(s，3H)。
实施例2：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-((4-(trifluoromethyl)benzyl)oxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物2)的制备
步骤2a：1-溴-4-((4-(三氟甲基)苄氧基)苯(1-bromo-4-((4-(trifluoromethyl)benzyl)oxy)benzene)(化合物204-2)的制备：往100mL茄形瓶中加入对三氟甲基苄溴(化合物201-2)(1.20g，5mmol，1.0当量)，对溴苯酚(化合物203-2)(0.95g，5.5mmol，1.1当量),碳酸钾(1.38g，10mmol，2.0当量)和乙腈(50mL)，加热回流3小时。将反应液浓缩，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝20:1)得到1-溴-4-((4-(三氟甲基)苄氧基)苯(1.60g，收率：97.0％)。无色固体。
步骤2b：4,4,5,5-四甲基-2-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(4,4,5,5-tetramethyl-2-(4-((4-(trifluoromethyl)benzyl)oxy)phenyl)-1,3,2-dioxaborolane)(化合物206-2)的制备：向1-溴-4-((4-(三氟甲基)苄氧基)苯(204-2)(1.60g，4.80mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(500mL)中加入联硼酸频那醇酯(化合物205)(1.35g，5.30mmol，1.1当量)，醋酸钾(0.98g，9.60mmol，2.0当量)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.37g，0.50mmol，0.1当量)，将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流过夜。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝20:1)，得到4,4,5,5-四甲基-2-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(1.32g，收率：73％)。无色固体。
步骤2c：(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(tert-butyl(S)-2-(8-amino-1-(4-((4-(trifluoromethyl)benzyl)oxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物301-2)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物110)(0.08g，0.21mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(12mL)中加入4,4,5,5-四甲基-2-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(化合物206-2)(0.119g，0.31mmol，1.5当量)，碳酸钾(0.087g，0.63mmol，3.0当量)的水(3mL)溶液，和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.015g，0.02mmol，0.1当量)。将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流过夜。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝40:1)，得到(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.100g，收率：86.0％)。浅棕色泡沫状物；LCMS(ESI)：m/z 554[M+1]+。
步骤2d：(S)-3-(吡咯烷-2-基)-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺((S)-3-(pyrrolidin-2-yl)-1-(4-((4-(trifluoromethyl)benzyl)oxy)phenyl)imi dazo[1,5-a]pyrazin-8-amine)(化合物302-2)的制备：向(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(301-2)(0.10g，0.18mmol，1.0当量)的二氯甲烷溶液(10mL)中加入三氟醋酸(2.0mL)，室温下搅拌1小时。将反应液倒入饱和碳酸钠溶液(100mL)中，用二氯甲烷(100mL×4)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇:三乙胺＝15:1:0.05)，得到(S)-3-(吡咯烷-2-基)-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(0.065g，收率：80.0％)。浅黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 454[M+1]+。
步骤2e：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-((4-(trifluoromethyl)benzyl)oxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物2)的制备：在0℃下，向2-丁炔酸(0.013g，0.154mmol，1.1当量)的二氯甲烷溶液(10mL)中加入三乙胺(0.021g，0.21mmol，1.5当量)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.059g，0.154mmol，1.1当量)，再缓慢滴加(S)-3-(吡咯烷-2-基)-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-2)(0.065g，0.14mmol，1.0当量)的二氯甲烷(5mL)溶液，反应液在0℃下反应25分钟。反应液用二氯甲烷稀释并用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-(三氟甲基)苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮(50mg，收率：69.0％)。无色固体；LCMS(ESI)：m/z 520[M+1]+，1HNMR(CDCl3，500MHz)：δ7.78-7.77(d，1H)，7.67-7.65(d，2H)，7.58-7.54(t，4H)，7.09-7.00(m，3H)，5.42-5.39(m，1H)，5.19(s，2H)，5.09-5.25(m，2H)，3.91-3.82(m，2H),2.55-2.31(m，3H),2.07-2.01(m，1H)，2.00(s，3H)。
实施例3：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-((4-fluorobenzyl)oxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyra zin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物3)的制备
步骤3a：1-溴-4-((4-氟苄基)氧基)苯(1-bromo-4-((4-fluorobenzyl)oxy)benzene)(化合物204-3)的制备：向反应瓶中加入4-溴苯酚(化合物203-2)(0.60g，3.47mmol，1.3当量)的乙腈(12mL)溶液，加入碳酸钾(0.74g，5.34mmol，2.0当量)和4-氟苄基溴(化合物201-3)(0.50g，2.67mmol，1.0当量)，将反应液在氮气的保护下加热至80℃回流3.5小时。将反应液旋干，剩余物用乙酸乙酯(100mL)溶解，用水(100mL)洗，有机相拌样旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚)得到1-溴-4-((4-氟苄基)氧基)苯(0.92g，收率：～100％)。白色固体。
步骤3b：2-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷
(2-(4-((4-fluorobenzyl)oxy)phenyl)-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborola ne)(化合物206-3)的制备：向1-溴-4-((4-氟苄基)氧基)苯(化合物204-3)(0.92g，3.27mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(30mL)中加入联硼酸频那醇酯(205)(1.00g，3.93mmol，1.2当量)，醋酸钾(0.80g，8.18mmol，2.5当量)，和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.24g，0.33mmol，0.1当量)。将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流过夜。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝50:1)，得到2-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷(0.95g，收率：88.8％)。浅黄色油状物。
步骤3c：叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(tert-butyl(S)-2-(8-amino-1-(4-((4-fluorobenzyl)oxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物301-3)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物110)(0.15g，0.39mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(9mL)中加入2-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷(化合物206-3)(0.18g，0.55mmol，1.4当量)，碳酸钾(0.16g，1.17mmol，3.0当量)的水(3mL)溶液，和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.03g，0.04mmol，0.1当量)。将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流5小时。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝80:1)，得到叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(0.21g，收率：～100％)。浅棕色固体；LCMS(ESI)：m/z 504[M+1]+。
步骤3d：(S)-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺((S)-1-(4-((4-fluorobenzyl)oxy)phenyl)-3-(pyrrolidin-2-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-8-amine)(化合物302-3)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物301-3)(0.21g，0.42mmol，1.0当量)的二氯甲烷溶液(10mL)中加入三氟醋酸(2.0mL)，室温下搅拌50分钟。将反应液倒入饱和碳酸钠溶液(100mL)中，用二氯甲烷(100mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，用薄层层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝5:1)，得到(S)-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(0.12g，收率：70.6％)。浅棕色固体；LCMS(ESI)：m/z 404[M+1]+。
步骤3e：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-((4-fluorobenzyl)oxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyra zin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物3)的制备。在0℃下，向2-丁炔酸(0.03g，0.33mmol，1.1当量)的二氯甲烷溶液(5mL)中加入N,N-二异丙基乙胺(0.06g，0.45mmol，1.5当量)和2-(7-偶氮)苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.13g，0.33mmol，1.1当量)，再缓慢滴加(S)-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-3)(0.12g，0.30mmol，1.0当量)的二氯甲烷(10mL)溶液，反应液在0℃下反应15分钟。反应液用二氯甲烷稀释并用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝30:1)得到粗产品(95mg)，再用薄层层析法纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)，得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮(75mg，收率：53.6％)。浅黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 470[M+1]+，1HNMR(CDCl3，500MHz)：δ7.75-7.77(m，1H)，7.54-7.58(m，2H)，7.41-7.44(m，2H)，7.03-7.11(m，5H)，5.41-5.44(m，1H)，5.08(s，2H)，3.78-3.94(m，2H),2.50-2.55(m，1H),2.29-2.35(m，1H)，1.98-2.07(m，2H)，1.93(s，3H)。
实施例4：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-(pyridin-2-ylmethoxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyra zin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物5)的制备
步骤4a：2-((4-溴苯氧基)甲基吡啶(2-((4-bromophenoxy)methyl)pyridine)(化合物204-5)的制备：在0℃下，向4-溴苯酚(化合物203-2)(1.00g，5.78mmol，1.0当量)的四氢呋喃溶液(30mL)中加入2-吡啶甲醇(化合物202-5)(0.63g，5.78mmol，1.0当量)和三苯基膦(1.67g，6.36mmol，1.1当量)，用氮气保护，再滴加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，1.29g，6.36mmol，1.1当量)，反应液在室温下反应2小时。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，得到2-((4-溴苯氧基)甲基吡啶(1.87g，收率：～100％)。无色固体；LCMS(ESI)：m/z 264[M+1]+。
步骤4b：2-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)甲基)吡啶(2-((4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phenoxy)methyl)pyri dine)(化合物206-5)的制备：向2-((4-溴苯氧基)甲基吡啶(化合物204-5)(1.87g，7.08mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(60mL)中加入联硼酸频那醇酯(化合物205)(2.16g，8.50mmol，1.2当量)，醋酸钾(1.74g，17.70mmol，2.5当量)，和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.52g，0.71mmol，0.1当量)，将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流过夜。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝10:1)得到2-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)甲基)吡啶(1.88g，收率：85.5％)。浅黄色油状物。
步骤4c：叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(tert-butyl(S)-2-(8-amino-1-(4-(pyridin-2-ylmethoxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物301-5)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物110)(0.25g，0.65mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(9mL)中加入2-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)甲基)吡啶(化合物206-5)(0.28g，0.92mmol，1.4当量)，碳酸钾(0.27g，1.95mmol，3.0当量)的水(3mL)溶液，和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.05g，0.07mmol，0.1当量)，将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流过夜。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝30:1)，得到叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(0.28g，收率：87.5％)。浅棕色泡沫状物；LCMS(ESI)：m/z 487[M+1]+。
步骤4d：(S)-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺((S)-1-(4-(pyridin-2-ylmethoxy)phenyl)-3-(pyrrolidin-2-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-8-amine)(化合物302-5)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基甲基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物301-5)(0.28g，0.58mmol，1.0当量)的二氯甲烷溶液(10mL)中加入三氟醋酸(3.0mL)，室温下搅拌1小时。将反应液倒入饱和碳酸钠溶液(100mL)中，用二氯甲烷(100mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇:三乙胺＝15:1:0.1)，得到(S)-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(0.21g，收率：95.1％)。浅棕色泡沫状物；LCMS(ESI)：m/z 387[M+1]+。
步骤4e：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-(pyridin-2-ylmethoxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyra zin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物5)的制备：在0℃下，向2-丁炔酸(0.05g，0.60mmol，1.1当量)的二氯甲烷溶液(6mL)中加入N,N-二异丙基乙胺(0.10g，0.81mmol，1.5当量)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.23g，0.60mmol，1.1当量)，再缓慢滴加(S)-1-(4-(吡啶-2-基甲基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-5)(0.21g，0.54mmol，1.0当量)的二氯甲烷(10mL)溶液，反应液在0℃下反应15分钟。反应液用二氯甲烷稀释并用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝30:1)，得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮(223mg,收率：92.6％)。浅棕色泡沫状物；LCMS(ESI)：m/z 453[M+1]+，1HNMR(CDCl3，500MHz)：δ8.61-8.62(m，1H)，7.71-7.75(m，2H)，7.52-7.57(m，3H)，7.23-7.30(m，1H)，7.04-7.12(m，3H)，5.42-5.45(m，1H)，5.27(s，2H)，3.68-3.89(m，2H),2.51-2.54(m，2H),2.31-2.32(m，1H)，2.03-2.05(m，1H)，1.97(s，3H)。
实施例5：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-氟吡啶-2-基)甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-((4-fluoropyridin-2-yl)methoxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物6)的制备
步骤5a：2-(溴甲基)-4-氟吡啶(2-(bromomethyl)-4-fluoropyridine)(化合物201-6)的制备:向反应瓶中加入2-甲基-4-氟吡啶(0.4g，3.60mmol，1.0当量)，NBS(0.64g，3.60mmol，1.0当量)，AIBN(59mg，0.36mmol，0.1当量)和四氯化碳(8mL)，加热到80℃反应过夜。反应液旋干，然后用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝20:1)得到2-(溴甲基)-4-氟吡啶(0.152g，收率：22％)。淡黄色油状液体；LCMS(ESI)：m/z 190[M+1]+。
步骤5b：2-(4-溴苯氧甲基)-4-氟吡啶(2-((4-bromophenoxy)methyl)-4-fluoropyridine)(化合物204-6)的制备：向反应瓶中加入对溴苯酚(化合物203-2)(0.138g，0.8mmol，1.0当量)，2-(溴甲基)-4-氟吡啶(化合物201-6)(0.152g，0.8mmol，1.0当量)，碳酸钾(0.166g，1.2mmol，1.2当量)和乙腈(8mL)，加热到80℃反应1.5小时。反应液旋干，然后用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，得到2-(4-溴苯氧甲基)-4-氟吡啶(0.224g，收率：99％)。淡黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 282[M+1]+。
步骤5c：4-(4-氟吡啶-2-甲氧基)苯硼酸频哪醇酯(4-fluoro-2-((4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phenoxy)me thyl)pyridine)(化合物206-6)的制备:将(2-(4-溴苯氧甲基)-4-氟吡啶(化合物204-6)(0.224g,0.794mmol,1.0当量)和双联频哪醇硼酸酯(化合物205)(0.222g,0.874mmol,1.1当量)溶于二氧六环(6mL)中，然后加入醋酸钾(0.234g,2.38mmol,3.0当量)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.058g,0.079mmol,0.1当量)。用氮气置换三遍，然后在100℃下反应过夜。反应完成后浓缩得到粗产品，通过柱层析法(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化得4-(4-氟吡啶-2-甲氧基)苯硼酸频哪醇酯(0.20g，收率：77％)。淡黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 330[M+1]+。
步骤5d：叔丁基-(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-氟吡啶-2-基)甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(tert-butyl(S)-2-(8-amino-1-(4-((4-fluoropyridin-2-yl)methoxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物301-6)的制备：将叔丁基-(S)-2-(8-氨基-1-溴)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物110)(0.095g,0.248mmol,1.0当量)和4-(4-氟吡啶-2-甲氧基)苯硼酸频哪醇酯(化合物206-6)(0.098g,0.298mmol,1.2当量)溶于二氧六环(6mL)和水(2mL)中，然后加入碳酸钾(0.103g,0.744mmol,3.0当量)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(18mg,0.025mmol,0.1当量)。用氮气置换三遍，然后在100℃下反应10小时。反应完成后浓缩得到粗产品，通过柱层析法(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝30:1)纯化，得到叔丁基-(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-氟吡啶-2-基)甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(0.12g，收率：96％)。淡黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 505[M+1]+。
步骤5e：(S)-1-(4-((4-氟吡啶-2-基)甲氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺((S)-1-(4-((4-fluoropyridin-2-yl)methoxy)phenyl)-3-(pyrrolidin-2-yl)imid azo[1,5-a]pyrazin-8-amine)(化合物302-6)的制备：将叔丁基-(S)-2-(8-氨基-1-(4-((4-氟吡啶-2-基)甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物301-6)(0.12g，0.238mmol，1.0当量)溶于二氯甲烷(5mL)中，再向其中加入三氟乙酸(1mL)，然后在室温下反应0.5小时。将反应混合液用二氯甲烷(50mL)稀释，依次用饱和碳酸钠溶液(30mL×2)和饱和食盐水(20mL)洗涤，然后将有机层用硅胶拌样旋干，之后用柱层析法(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇:三乙胺＝100:10:1)纯化，得到(S)-1-(4-((4-氟吡啶-2-基)甲氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(95mg，收率：99％)。淡黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 405[M+1]+。
步骤5f：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-氟吡啶)-2-基-)甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-((4-fluoropyridin-2-yl)methoxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物6)的制备:将(S)-1-(4-((4-氟吡啶-2-基-)甲氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-6)(95mg，0.235mmol，1.0当量)、2-丁炔酸(22mg，0.258mmol，1.1当量)、HATU(98mg，0.258mmol，1.1当量)和碳酸钾(49mg，0.353mmol，1.5当量)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)，然后在0℃下反应0.5小时。反应液加水(20mL)稀释，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-((4-氟吡啶)-2-基-)甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮(18mg，收率：16％)。灰色固体，熔点：162.3-165.1℃。LCMS(ESI)：m/z 471[M+1]+，1HNMR(DMSO-d6，500MHz)：δ8.66-8.62(m,1H),7.79-7.72(m,1H),7.54-7.44(m,3H),7.34-7.30(m,1H),7.18(d,J＝9.0Hz,2H),7.08-7.03(m,1H),6.03-5.97(m,2H),5.69-5.43(m,1H),5.27(s,2H),3.82-3.79(m,1H),3.58-3.55(m,1H),2.40-2.08(m,3H),2.03-1.94(m,4H)。
实施例6：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(6-(benzyloxy)pyridin-3-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物9)的制备
步骤6a：2-(苄氧基)-5-溴吡啶(2-(benzyloxy)-5-bromopyridine)(化合物204-9)的制备：在0℃下，向氢化钠(1.04g，26.0mmol，1.3当量)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液中加入苯甲醇(2.59g，24.0mmol，1.2当量)，混合物在0℃下搅拌1小时，再加入2,5-二溴吡啶(4.74g，20mmol，1.0当量)，反应液在室温下反应过夜。将反应液用乙酸乙酯(300mL)稀释，用半饱和食盐水(300mL×4)洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液用石油醚带旋3次，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝200:1)得到2-(苄氧基)-5-溴吡啶(3.76g，收率：71.2％)。无色油状物；LCMS(ESI)：m/z 264[M+1]+。
步骤6b：2-(苄氧基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)吡啶(2-(benzyloxy)-5-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)pyridine)(化合物206-9)的制备：向2-(苄氧基)-5-溴吡啶(化合物204-9)(3.76g，14.2mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(50mL)中加入联硼酸频那醇酯(化合物205)(4.34g，17.1mmol，1.2当量)，醋酸钾(3.48g，35.5mmol，2.5当量)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(1.16g，1.4mmol，0.1当量)，将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流过夜。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：石油醚:二氯甲烷＝2:1)，得到2-(苄氧基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)吡啶(2.63g，收率：59.5％)。白色固体；LCMS(ESI)：m/z 312[M+1]+。
步骤6c：叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(tert-butyl(S)-2-(8-amino-1-(6-(benzyloxy)pyridin-3-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidine-1-carboxylate)(化合物301-9)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物110)(0.25g，0.65mmol，1.0当量)的1,4-二氧六环溶液(9mL)中加入2-(苄氧基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)吡啶(化合物206-9)(0.41g，1.31mmol，2.0当量)，碳酸钾(0.27g，1.95mmol，3.0当量)的水(3mL)溶液和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.05g，0.07mmol，0.1当量)，将反应液在氮气的保护下加热至100℃回流4小时。将反应液旋干，剩余物用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝50:1)得到叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(0.25g，收率：79.1％)。浅棕色泡沫状物；LCMS(ESI)：m/z 487[M+1]+。
步骤6d：(S)-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺((S)-1-(6-(benzyloxy)pyridin-3-yl)-3-(pyrrolidin-2-yl)imidazo[1,5-a]pyra zin-8-amine)(化合物302-9)的制备：向叔丁基(S)-2-(8-氨基-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物301-9)(0.25g，0.51mmol，1.0当量)的二氯甲烷溶液(10mL)中加入三氟醋酸(3.0mL)，室温下搅拌50分钟。将反应液倒入饱和碳酸钠溶液(100mL)中，用二氯甲烷(100mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇:三乙胺＝15:1:0.05)得到粗产品(0.15g)，用制备层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝5:1)，得到(S)-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(0.14g，收率：71.1％)。白色固体；LCMS(ESI)：m/z 387[M+1]+。
步骤6e：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(6-(benzyloxy)pyridin-3-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物9)的制备：在0℃下，向2-丁炔酸(0.034g，0.40mmol，1.1当量)的二氯甲烷溶液(4mL)中加入N,N-二异丙基乙胺(0.07g，0.54mmol，1.5当量)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.15g，0.40mmol，1.1当量)，再缓慢滴加(S)-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-9)(0.14g，0.36mmol，1.0当量)的二氯甲烷(11mL)溶液，反应液在0℃下反应15分钟。反应液用二氯甲烷稀释并用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝30:1)得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮(140mg，收率：85.9％)。白色固体；LCMS(ESI)：m/z 453[M+1]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)：δ8.42-8.43(m，1H)，7.77-7.89(m，2H)，7.33-7.49(m，5H)，6.91-7.13(m，2H)，5.42-5.46(m，3H)，3.68-3.90(m，2H)，2.01-2.53(m，4H),1.97(s，3H)。
实施例7：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-苯乙氧苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-phenethoxyphenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)p yrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物17)的制备
步骤7a：4,4,5,5-四甲基-2-(4-苯乙氧基苯基)-1,3,2-二氧硼戊烷(4,4,5,5-tetramethyl-2-(4-phenethoxyphenyl)-1,3,2-dioxaborolane)(化合物206-17)的制备：向反应瓶中加入4-羟基苯硼酸频哪醇酯(1.1g，5.0mmol，1.0当量)，苯乙醇(化合物202-17)(0.6g，5.0mmol，1.0当量)，三苯基膦(3.93g，15.0mmol，3.0当量)和偶氮二甲酸二异丙酯(2.87g，16.5mol，3.5当量)，室温反应4h。将反应液用二氯甲烷(50mL)稀释，用半饱和食盐水(50mL×3)洗涤，有机相拌样旋干，用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:正己烷＝1:2)得到4,4,5,5-四甲基-2-(4-苯乙氧基苯基)-1,3,2-二氧硼戊烷(0.9g，收率：56.2％)。粉红色色固体；LCMS(ESI)：m/z 326[M+1]+。
步骤7b：(S)-叔丁基-2-(8-氨基-1-(4-苯乙氧基苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯((S)-tert-butyl 2-(8-amino-1-(4-phenethoxyphenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidi ne-1-carboxylate)(化合物301-17)的制备：向反应瓶中加入(S)-叔丁基-2-(8-氨基-1-溴代咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(化合物110)(0.58g，1.5mmol，1.0当量)，4,4,5,5-四甲基-2-(4-苯乙氧基苯基)-1,3,2-二氧硼戊烷(化合物206-17)(0.58g，1.8mmol，1.2当量)，四(三苯基膦)钯(0.17g，0.15mmol，0.1当量)，碳酸钠(0.32g，3mol，2.0当量)，1,4-二氧六环(10mL)和水(3mL)，油浴80℃反应过夜。反应液用二氯甲烷(100mL)稀释，饱和食盐水(50mL×3)洗涤，有机相旋干，柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯:环己烷＝2:1)，得到(S)-叔丁基-2-(8-氨基-1-(4-苯乙氧基苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(0.6g，收率：80.0％)。黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 500[M+1]+。
步骤7c：(S)-1-(3-(4-苯乙氧基苯基)-吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺((S)-1-(4-phenethoxyphenyl)-3-(pyrrolidin-2-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-8-amine)(化合物302-17)的制备：向反应瓶中加入(S)-叔丁基-2-(8-氨基-1-(4-苯乙氧基苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸酯(301-17)(0.6g，1.2mmol，1.0当量)，三氟乙酸(15mL)和二氯甲烷(20mL)，室温反应1h。反应液用二氯甲烷(100mL)稀释，饱和碳酸氢钠调pH值至中性偏碱，有机相旋干，柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝10:1)得到(S)-1-(3-(4-苯乙氧基苯基)-吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(0.4g，收率：83.3％)。黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 500[M+1]+。
步骤7d：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-苯乙氧苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-phenethoxyphenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)p yrrolidin-1-yl)but-2-yn-1-one)(化合物17)的制备：向反应瓶中加入(S)-1-(3-(4-苯乙氧基苯基)-吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-17)(0.40g，1.0mmol，1.0当量)，丙炔酸(0.084g，1.0mmol，1.0当量)，HATU(0.46g，1.2mol，1.2当量)，DIEA(0.26g，2.0mmol，2.0当量)和二氯甲烷(10mL)，冰水浴反应15min。反应液柱层析(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-苯乙氧苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丁-2-炔-1-酮(200mg，收率：43％)，类白色固体，熔点：91-93℃。LCMS(ESI)：m/z 466[M+1]+，1HNMR(DMSO-d6，600MHz)：δ7.76(d,J＝5Hz,1H),δ7.71(d,J＝5Hz,1H),δ7.46(m,5H),7.33(m,10H),7.22(t,J＝7Hz,2H),7.05(m,6H),7.02(d,J＝5Hz,1H),5.90(m,5H),5.65(s,1H),5.42(s,1H),4.25(m,5H),3.77(m,3H),3.06(m,5H),2.00(s,5H),1.62(s,3H)。
实施例8：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(苄氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-(benzyloxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)p yrrolidin-1-yl)prop-2-en-1-one)(化合物21)的制备
将(S)-1-(4-(苄氧基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-1)(161mg，0.418mmol，1.0当量)溶于四氢呋喃(10mL)，用冰水浴冷却到0℃。丙烯酰氯(35mg，0.418mmol，1.0当量)溶于四氢呋喃(5mL)，然后逐滴滴加进去，滴加完成后继续在0℃下反应10分钟。反应完成后浓缩得到粗产品，通过薄层层析法(二氯甲烷:甲醇＝30:1)纯化得化合物(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(苄氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(35mg，收率：19％)。白色固体，熔点：100.2-103.1℃。LCMS(ESI)：m/z 440[M+1]+，1HNMR(CDCl3，500MHz)：δ7.79(d,J＝6.5Hz,1H),7.55-7.52(m,2H),7.46-7.26(m,5H),7.08-7.06(m,3H),6.49-6.43(m,1H),6.35-6.31(m,1H),5.69-5.66(m,1H),5.49-5.33(m,2H),5.12(s,2H),3.92-3.87(m,1H),3.76-3.70(m,1H),2.69-2.61(m,1H),2.50-2.43(m,1H),2.35-1.98(m,3H)。
实施例9：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(6-(benzyloxy)pyridin-3-yl)imidazo[1,5-a]pyrazin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)prop-2-en-1-one)(化合物25)的制备
在0℃下，向丙烯酸(0.04g，0.59mmol，1.1当量)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)中加入4-二甲氨基吡啶(0.18g，1.47mmol，3.0当量)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(0.14g，0.74mmol，1.5当量)，再缓慢滴加(S)-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-9)(0.19g，0.49mmol，1.0当量)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(7mL)溶液，反应液在0℃下反应15分钟，再加入N,N-二甲基甲酰胺溶液(8mL)，反应液在室温下反应7小时。反应液用乙酸乙酯(200mL)稀释，用半饱和食盐水(200mL×3)洗，有机相分别用2％醋酸溶液(100mL×1)、碳酸氢钠饱和溶液(100mL×1)、饱和食盐水(100mL×1)洗，水相调节pH≈7，用乙酸乙酯(100mL×1)萃取，所得有机相用饱和食盐水(100mL×1)洗，合并有机相，旋干，用甲醇重结晶，再用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到粗产品(30mg)，再用薄层层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)，得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(6-(苄基氧基)吡啶-3-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(23mg,收率：10.7％)。白色固体；LCMS(ESI)：m/z 441[M+1]+，1HNMR(CDCl3，500MHz)：δ8.42-8.43(m，1H)，7.81-7.88(m，2H)，7.33-7.49(m，5H)，7.11-7.12(m，1H)，6.91-6.93(m，1H)，6.31-6.50(m，2H)，5.67-5.70(dd，1H)，5.47-5.50(m，1H)，5.10-5.43(m，4H)，3.88-3.92(m，1H),3.73-3.75(m，1H),2.42-2.45(m，1H),2.29-2.34(m，1H),1.99-2.14(m，2H)。
实施例10：(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮((S)-1-(2-(8-amino-1-(4-(pyridin-2-ylmethoxy)phenyl)imidazo[1,5-a]pyra zin-3-yl)pyrrolidin-1-yl)prop-2-en-1-one)(化合物29)的制备
在0℃下，向丙烯酸(0.03g，0.48mmol，1.1当量)的二氯甲烷溶液(10mL)中加入N,N-二异丙基乙胺(0.11g，0.66mmol，1.5当量)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.18g，0.48mmol，1.1当量)，再缓慢滴加(S)-1-(4-(吡啶-2-基甲基)苯基)-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(化合物302-5)(0.17g，0.44mmol，1.0当量)的二氯甲烷(20mL)和四氢呋喃(10mL)混合溶液，反应液在0℃下反应15分钟。反应液用二氯甲烷稀释并用柱层析法纯化(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到粗产品(90mg)，再用薄层层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝8:1)得到(S)-1-(2-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(60mg,收率：30.9％)。淡黄色固体；LCMS(ESI)：m/z 441[M+1]+，1HNMR(CDCl3，500MHz)：δ8.61-8.62(m，1H)，7.71-7.79(m，2H)，7.47-7.55(m，3H)，7.23-7.25(m，1H)，7.05-7.11(m，3H)，6.31-6.50(m，2H)，5.66-5.69(dd，1H)，5.46-5.49(m，1H)，5.30(s，4H)，3.88-3.91(m，1H),3.70-3.76(m，1H),2.61-2.66(m，1H),2.44-2.48(m，1H),2.05-2.14(m，2H)。
根据实施例1-10的制备方法，本申请还合成了以下化合物：
实施例11生物活性试验
一、BTK酶活性抑制实验
1、实验方法
采用Caliper迁移率变动检测技术(Caliper mobility shift assay)测定BTK蛋白激酶活性(参见J Biomol Screen 14:31,2009)。将本申请的化合物用DMSO溶解后用激酶缓冲液(50mM HEPES-pH 7.5，0.0015％Brij-35,10mM MgCl2,2mM DTT)稀释10倍，在384孔板中加入5μl的10％DMSO溶解的5倍反应终浓度的化合物，无化合物对照孔和无酶活性对照孔中是5μl的10％DMSO。加入10μl 2.5倍反应终浓度的BTK酶溶液(BTK，Cat.No.08-080,Carna)，与化合物混合后在室温下孵育10分钟，其中无酶活对照孔中加入10μl激酶缓冲液。再加入10μl的2.5倍反应终浓度的底物FAM-labeled SRCtide peptide(Biochem,Cat.No.112394)和ATP(90μM)的底物溶液，起始反应。后在室温下孵育10分钟。28℃下孵育1小时后加25μl终止液(100mM HEPES，pH 7.5，0.015％Brij-35，0.2％Coating Reagent#3，50mM EDTA)终止反应。在Caliper EZ Reader II(Caliper Life Sciences)上读取转化率数据。计算抑制率，计算公式为抑制率％＝(max-转化)/(max-min)×100％。
2、实验结果
本申请的化合物能强有力地抑制BTK活性。表1中列出本发明中的代表性化合物在BTK检测中所具有的活性。在这些检测中，使用下述级别：对于IC50而言，I>750nM,750nM≥II>300nM,300nM≥III>100nM,IV≤100nM。
表1酶活性抑制结果
二、非特异性激酶EGFR、Tec、Txk、ITK抑制实验
1、实验方法
(1)EGFR活性抑制实验
采用Caliper迁移率变动检测技术(Caliper mobility shift assay)，Km ATP的情况下，测定EGFR T790M/L858R蛋白激酶活性(参见J Biomol Screen 14:31,2009)。
实验方法：将待测化合物用DMSO溶解后，用激酶缓冲液(50mM HEPES-pH7.5，0.0015％Brij-35，10mM MgCl2，2mM DTT)稀释，在384孔板中加入5μl的10％DMSO溶解的5倍反应终浓度的化合物，无化合物对照孔是5μl的10％DMSO，无酶活性对照孔是5μl激酶缓冲液。加入10μl的稀释2.5倍后的EGFR(Cama,Cat.No 08-115,Lot.13-CBS-0005M)酶溶液后在室温下孵育10分钟，再加入10μl的稀释2.5倍后的底物溶液Peptide FAM-P22(GL Biochem,Cat.No.112393,Lot.No.P130408-ZB112393)。28℃下孵育60分钟后加25μl终止液(100mMHEPES,pH 7.5，0.015％Brij-35，0.2％Coating Reagent#3，50m MEDTA)终止反应。在Caliper EZ Reader II(Caliper Life Sciences)上读取转化率数据。把转化率转化成抑制率数据。
以化合物浓度和抑制率为横纵坐标，绘制曲线，使用XLFit excel add-inversion 4.3.1软件拟合曲线并计算IC50。抑制率％＝(max-转化率)/(max-min)×100，其中max是指DMSO无化合物对照孔的转化率，min是指无酶活对照的转化率。
(2)Tec、Txk、ITK活性抑制实验
化合物对人Tec、Txk、ITK的抑制活性由英国Eurofins Pharma DiscoveryServices UK Limited(UK)完成。Km ATP的情况下，采用放射蛋白激酶方法测定。反应前激酶用缓冲液(20mM MOPS,1mM EDTA,0.01％Brij-35,5％Glycerol,0.1％6-mercaptoethanol,1mg/mL BSA)稀释。用100％DMSO溶解化合物，是最终反应浓度的50倍。
ITK反应液包含8mM MOPS pH 7.0,0.2mM EDTA,0.33mg/mL髓鞘碱性蛋白,10mM醋酸镁和[γ-33P]-ATP(约500cpm/pmol)，加入200μM ATP镁混合后启动反应，室温下培养40分钟，加入3％磷酸溶液终止反应。10μl置于P30滤过膜上，75mM磷酸洗5分钟，甲醇一次干燥，然后闪烁计数。
激活型Tec反应包含8mM MOPS pH 7.0,0.2mM EDTA,1mM Na3VO4,5mM Na-6-磷酸甘油,400μM EFPIYDFLPAKKK,10mM醋酸镁和[γ-33P]-ATP(约500cpm/pmol)，加入120μM ATP镁混合后启动反应，室温下培养40分钟，加入3％磷酸溶液终止反应。10μl置于P30滤过膜上，75mM磷酸洗5分钟，甲醇一次干燥，然后闪烁计数。
TxK反应液包含8mM MOPS pH 7.0,0.2mM EDTA,250μM GEEPLYWSFPAKKK,10mM醋酸镁和[γ-33P]-ATP(约500cpm/pmol)，加入200μM ATP镁混合后启动反应，室温下培养40分钟，加入3％磷酸溶液终止反应。10μl置于P30滤过膜上，75mM磷酸洗5分钟，甲醇一次干燥，然后闪烁计数。
2、实验结果
化合物对EGFR的抑制活性如表2所示。第一代BTK抑制剂依鲁替尼是活性很高的EGFR抑制剂，依鲁替尼非选择性地抑制野生型EGFR，与该药物引起人体消化道副作用和皮肤丘疹等有关。第二代EGFR抑制剂ACP-196对EGFR在Y1068和Y1173位点的磷酸化没有影响，因此高浓度时对EGFR没有明显抑制作用。和ACP-196一样，化合物1不抑制EGFR，引起与EGFR抑制相关的毒副作用的可能性很低。
表2化合物的EGFR抑制活性
化合物 激酶 IC50(nM)
ACP-196 EGFR >10,000
依鲁替尼 EGFR 4.6nM
化合物1 EGFR >10,000
表3显示了化合物1和ACP-196对Itk、Tec和Txk的抑制活性。第一代BTK抑制剂依鲁替尼对BTK的抑制为非特异性，除了对EGFR有抑制作用外，还强力抑制ITK、Tec和Txk等激酶的活性(Byrd J.C.et al.N Engl J Med 374:323,2016)。第二代BTK抑制剂ACP-196对ITK、Tec和Txk没有明显抑制作用，能够选择性地阻断BTK通路，而不会破坏其他保持血小板和免疫功能的关键分子通路，因此，避免或减少了与癌症治疗相关的某些不良反应。和ACP-196相似，化合物1对ITK、Tec和TxK抑制活性极低。
表3化合物1和ACP-196的Itk、Tec和Txk抑制活性
三、肿瘤细胞增殖抑制实验
1、实验方法
采用CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒法(Promega，#G7572,Madison，WI)测定三磷酸腺苷(ATP)的含量来评估细胞活力。弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株TMD-8、HCC827NSCL细胞株购买自上海复旦IBS细胞资源中心和美国菌种保藏中心(ATCC)。用胰酶将细胞从细胞培养皿上消化以及DPBS培养基重悬后，用Scepter自动细胞计数仪(Millipore，#PHCC00000)计数测定细胞密度。将细胞稀释成每毫升含44,000个细胞的溶液。调整密度后的细胞溶液以每孔90μl加入细胞实验板中。孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养24小时后加入不同浓度的待测化合物。细胞在10％胎牛血清存在下与化合物一起培养72小时。使用Luminescent Cell Viability Assay kit(见厂家说明书)测定ATP的含量来评估细胞生长抑制。简要来讲，每个孔中加入30μl试剂，摇板10分钟，诱导细胞裂解，用荧光/化学发光分析仪Fluoroskan Ascent FL(ThermoScientific Fluoroskan Ascent FL)检测记录荧光信号。从二甲基亚砜(DMSO)处理72或120小时的细胞得到最大的信号值。从单独的培养基(细胞数为零)得到最小信号值定义为0。抑制率％＝(最大信号值-化合物信号值)/(最大信号值-最小信号值)×100％。使用GraphPad Prism V5.0(GraphPad Software,San Diego,CA)软件处理数据。通过S形剂量-反应曲线拟合计算IC50值。
2、实验结果
表4中列出本申请的化合物在基于细胞的检测中所具有的抗细胞增殖的活性。在这些检测中，使用下述级别：对于IC50而言，I>10μM,10μM≥II>1μM,1μM≥III>0.5μM,0.5μM≥IV>0.1μM,V≤0.1μM。本申请的化合物对肿瘤细胞如TMD-8有很强的抗细胞增殖的活性，而对HCC827NSCLC细胞活性较弱或没有活性。HCC827细胞株携带EGFR exon 19del，对EGFR抑制剂敏感。实验结果显示，本申请化合物有良好的选择性。
表4肿瘤细胞增殖抑制结果
四、药代动力学(PK)实验
1、实验方法
雄性SD大鼠，体重250-300克，试验前过夜禁食。待测化合物溶解在30％磺丁基-β-环糊精(SBE-β-CD)中，大鼠以20mg/kg的剂量灌胃给药。给药后15分钟、30分钟和1、2、3、4、6、8及24小时取血，每时间点约取血0.3mL。血液样品置于含K2-EDTA(乙二胺四乙酸二钾)的离心管中，离心处理(2,000g，10分钟，4℃)取血浆，储存在-80℃的超低温冰箱中。50μL的血浆样品与5μL内标(IS)混合，用乙酸乙酯萃取。真空干燥后残留物重新溶于乙腈中。对样品进行过滤，并注入到LC-MS/MS分析。
2、实验结果
图1显示了化合物1和ACP-196分别对大鼠口服给药(20mg/kg)的血药浓度-时间曲线。表5显示了化合物1和ACP-196在大鼠体内的药代动力学参数。
如图1和表5所示，化合物1在大鼠体内的半衰期为4.2小时，ACP-196的半衰期为7.9小时，而化合物1的Cmax和AUC比ACP-196高一倍以上。化合物1在大鼠体内吸收良好，血暴露量高。作为不可逆BTK抑制剂，ACP-196比第一代BTK抑制剂依鲁替尼更加安全有效，除了ACP-196对BTK选择性高外，还被认为与ACP-196的半衰期短和血暴露量高有关(ByrdJ.C.et al.N Engl J Med 374:323,2016)。与ACP-196相比，化合物1具有更短的半衰期和更高的血暴露量，因而更加可能安全有效。
表5化合物1和ACP-196在大鼠体内的药代动力学参数(20mg/kg口服给药)
注：表中Tmax是指达峰时间，Cmax是指最大血药浓度，T1/2为半衰期，AUC0-24是指0-24小时时间-浓度曲线下面积，AUCinf是指0-Inf时间-浓度曲线下面积。
五、肿瘤模型药效学实验
1、实验方法
本实验研究化合物在弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株TMD-8移植肿瘤模型中，抑制肿瘤生长的量效关系。当TMD-8肿瘤体积达到200mm3左右，将动物分为4个口服给药组，即赋形剂对照组、化合物1的50mg/kg﹑100mg/kg和200mg/kg口服给药组(n＝8/组)。将化合物1溶解在30％磺丁基-β-环糊精(SBE-β-CD)以及1.0mol等值的盐酸(pH 3-4)中，以10mL/kg灌胃给药，每日一次，连续给药21天。
测量肿瘤体积，计算相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)和相对肿瘤体积增比值(T/C)。RTV＝Vt/V0，其中Vt为分组给药后第t天的肿瘤体积均值，V0为分组当天的肿瘤体积均值。T/C＝治疗组RTV/对照组RTV×100％。
2、实验结果
赋形剂组给药后18天，因肿瘤体积超过3000mm3，停止实验。图2显示了化合物1抑制TMD-8淋巴瘤细胞株移植肿瘤生长的量效关系，其中，图2A显示了各组小鼠肿瘤体积的变化，图2B显示了各组小鼠的体重变化。如图所示，化合物1给药后18天，剂量50mg/kg给药能够轻度抑制肿瘤生长(T/C为71％，p<0.05)；剂量100mg/kg给药能够使肿瘤生长停滞(T/C为7％，p<0.001)，剂量200mg/kg给药能够使肿瘤基本消失(T/C为-91％，P<0.001)。与给药前比较，各给药组动物体重均有增加。赋形剂和低剂量组体重增加更加明显，可能与肿瘤快速增大有关。结果表明，化合物1能够通过口服给药剂量依赖性地抑制TMD-8移植肿瘤生长。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (37)

1.具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐：
2.一种药物组合物，包含权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。
3.权利要求2的药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种药用辅料。
4.权利要求2或3的药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种第二治疗剂。
5.权利要求4的药物组合物，其中，所述第二治疗剂为化疗药物、靶向抗癌药或免疫治疗药。
6.权利要求4的药物组合物，其中，所述第二治疗剂选自利妥昔单抗、来那度胺、氟达拉滨、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松。
7.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者的与布鲁顿酪氨酸激酶过度活性相关的疾病和/或症状。
8.权利要求7的用途，其中，所述与布鲁顿酪氨酸激酶过度活性相关的疾病和/或症状选自肿瘤、炎症或自身免疫性疾病。
9.权利要求8的用途，其中，所述肿瘤为血液肿瘤或实体瘤。
10.权利要求9的用途，其中，所述血液肿瘤选自淋巴瘤、骨髓瘤、淋巴细胞白血病、急性髓系白血病。
11.权利要求9的用途，其中，所述实体瘤选自肺癌、乳腺癌、***癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌。
12.权利要求8的用途，其中，所述炎症或自身免疫性疾病选自类风湿关节炎、红斑狼疮、狼疮性肾炎、多发性硬化症、肖格伦综合征及潜在疾病哮喘。
13.权利要求7的用途，其中，所述受试者为哺乳动物。
14.权利要求7的用途，其中，所述受试者选自牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。
15.权利要求7的用途，其中，所述受试者为人。
16.权利要求7的用途，其中，所述药物还包含一种或多种第二治疗剂。
17.权利要求16的用途，其中，所述第二治疗剂为化疗药物、靶向抗癌药或免疫治疗药。
18.权利要求16的用途，其中，所述第二治疗剂选自利妥昔单抗、来那度胺、氟达拉滨、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松。
19.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐用于制备制剂的用途，所述制剂用于降低或抑制细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶活性。
20.权利要求19的用途，其中，所述制剂被施用至受试者体内，以降低或抑制受试者体内细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶的活性；或者，所述制剂被施用至体外细胞，以降低或抑制体外细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶活性。
21.权利要求20的用途，其中，所述受试者为哺乳动物。
22.权利要求20的用途，其中，所述受试者选自牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。
23.权利要求20的用途，其中，所述受试者为人。
24.权利要求20的用途，其中，所述体外细胞为细胞系或者来自受试者的细胞。
25.权利要求19的用途，其中，所述细胞选自肿瘤细胞。
26.权利要求19的用途，其中，所述细胞为实体瘤细胞。
27.权利要求19的用途，其中，所述细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、***癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞。
28.权利要求19的用途，其中，所述细胞选自髓系细胞或淋巴细胞。
29.权利要求19的用途，其中，所述细胞为来自受试者的原代细胞或其培养物，或已建立的细胞系。
30.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。
31.权利要求30的试剂盒，所述试剂盒还包括使用说明。
32.权利要求30的试剂盒，所述试剂盒用于降低或抑制细胞中的布鲁顿酪氨酸激酶活性。
33.权利要求32的试剂盒，所述细胞选自肿瘤细胞。
34.权利要求32的试剂盒，所述细胞为实体瘤细胞。
35.权利要求32的试剂盒，所述细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、***癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞。
36.权利要求32的试剂盒，所述细胞选自髓系细胞或淋巴细胞。
37.权利要求32的试剂盒，所述细胞为来自受试者的原代细胞或其培养物，或已建立的细胞系。
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