CN106568909A - 草龙药材的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草龙药材的质量控制方法，主要包括药材性状鉴别和显微鉴别，还改进了已有的没食子酸含量测定和薄层鉴别。该法具有较强的专属性和良好的重现性，可全面评价草龙药材质量，有效保证草龙药材的产品质量，为规范草龙药材质量提供了科学依据。

Description

草龙药材的质量控制方法

技术领域

本发明属于中药药材质量控制技术领域，尤其涉及一种草龙药材的质量控制方法。

背景技术

草龙，又名细叶水丁香、线叶丁香蓼，为柳叶菜科草龙Ludwigia hyssopifolia(G.Don)Exell的干燥全草，为广西壮族民间常用中草药，具有清热解毒、祛腐生肌功效，用于治疗感冒、咽喉肿痛、疮疥等。民间使用已证明该药有较显著的疗效，具有很好的应用价值。草龙全草入药，有清热解毒、去腐生肌的功效，可治感冒、咽喉肿痛、疮疥等。《广西本草选编》、《云南植物志》、《海南植物志》、《壮药选编》等书籍均有相关记载。草龙产于中国台湾、广东、香港、海南、广西、云南南部，生于田边、水沟、河滩、塘边、湿草地等湿润向阳处，海拔50～750米，分布于印度、斯里兰卡、缅甸、中南半岛经马来半岛至菲律宾、密克罗尼西亚与澳大利亚北部，西达非洲热带地区。

草龙多以全草入药，全草中分离出没食子酸、棕榈酸、异香草醛、β-谷甾醇、豆甾醇-3-O-B-D-葡萄糖苷、齐墩果酸、2，4，6-三羟基苯甲酸、没食子酸乙酯、熊果酸、山柰酚、人参皂苷Rb1等化合物。广西民间全年均可采收，除去杂质、切段、晒干。目前草龙以野生采集为主。目前有关草龙的药理作用研究主要在抗菌方面，研究发现，草龙醋酸乙酯部位和正丁醇部位有明显的体外抑菌作用，抑菌作用最强的是醋酸乙酯部位。有学者采用琼脂稀释法测定草龙各个部位提取物及单体成分对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌及绿脓杆菌的抑菌效果，发现草龙中抗菌作用的物质存在于提取极性较大的部位，即醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物，而石油醚部位没有抗菌活性，草龙中化学成分没食子酸的抗菌作用效果良好。

草龙特有的药效已被民间广泛认同，作为广西的常用中草药，目前市场上已开始对草龙作为保健药品开发，但由于缺少好的质量控制方法，难以控制草龙药材的质量，给正常的生产经营带来了困难，因此需要对其质量控制方法进行规范，以控制草龙药材的质量。目前，草龙药材尚未建立相关标准。现有技术仅对草龙药材进行薄层色谱鉴别和高效液相色谱法含量测定的方法不完整，针对性不强，使用这些方法难以达到真正控制药材质量的目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种科学、完整、可靠、有效的草龙药材的质量控制 方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：草龙药材的质量控制方法，主要包括药材性状鉴别和显微鉴别，

药材性状鉴别中，药材根呈圆柱形，灰黄色，稍弯曲，多须根，直径0.3～0.8cm；茎表面灰绿色至灰褐色，具细纵皱纹，表皮脱落处呈深灰色，质软，易折断，断面皮部薄，黄白色，木部浅黄白色，中心有宽广的髓部；叶纸质，披针形，多皱宿，全缘，有稀柔毛，上表面灰绿色，下表面灰褐色，长8～13cm，宽2～5cm；气微，味苦；药材中水分不得超过15.0％，总灰分不得超过13.0％，酸不溶性灰分不得超过2.0％，水溶性浸出物不得低于10.0％；

显微鉴别中，药材粉末呈黄白色，草酸钙针晶及簇晶多见，针晶长28～71μm，簇晶直径15～28μm；可见螺纹导管或网纹导管，螺纹导管直径6～23μm，网纹导管直径9～51μm；有少量非腺毛，长12～184μm。

上述的草龙药材的质量控制方法，还包括薄层鉴别，薄层鉴别采用硅胶H薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸溶液作为展开剂，以1％铁***溶液-1％三氯化铁溶液混合溶液为显色剂。

薄层鉴别按以下操作进行：取供试品溶液5μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以体积比5∶4∶0.5∶0.5的甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸溶液作为展开剂，展开，取出，晾干；喷以体积比1∶1的1％铁***溶液-1％三氯化铁溶液的混合溶液，日光检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

以草龙全草药材粉末制成的溶液为供试品，取药材粉末0.5g，加水20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，加入甲醇定容至1ml，作为供试品溶液；另取没食子酸对照品，加甲醇制成每ml含没食子酸1mg的溶液。

上述草龙药材的质量控制方法，还包括含量测定，含量测定采用流动相为甲醇-0.1％磷酸混合溶液，柱温25℃，检测波长为272nm。

含量测定按以下操作进行：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比1∶99的甲醇-0.1％磷酸混合溶液为流动相；柱温25℃，检测波长为272nm；理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

精密称没食子酸对照品适量，加水制成每1ml含没食子酸30μg的溶液，即得对照品溶液；取药材粉末(过四号筛)0.2g，精密称定，置具塞圆底烧瓶中，精密加入10％盐酸 溶液25ml，称定重量，置水浴上加热回流30mim，放冷，再称定重量，用10％盐酸补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

针对目前草龙药材缺乏相关质量标准的问题，发明人在现有技术手段的基础上，经过长期深入的研究，建立了一种科学、完整、可靠、有效的草龙药材的质量控制方法，主要包括药材性状鉴别(含水分、灰分和浸出物)和显微鉴别，还改进了已有的没食子酸含量测定和薄层鉴别。该法具有较强的专属性和良好的重现性，可全面评价草龙药材质量，有效保证草龙药材的产品质量，为规范草龙药材质量提供了科学依据。

附图说明

图1是草龙粉末的构造图(×400)，图中：1针晶，2网纹导管，3螺纹导管，4气孔，5非腺毛，6簇晶。

图2是草龙根横切面的构造图，图中：1枯萎的表皮，2皮层，3韧皮部，4形成层，5导管，6木射线，7初生木质部。

图3是草龙茎横切面的构造图，图中：1表皮，2皮层，3韧皮部纤维，4韧皮部，5木质部，6簇晶，7髓。

图4是草龙叶横切面的构造图，图中：1表皮，2栅栏组织，3韧皮部纤维，4韧皮部，5木质部，6簇晶，7髓。

图5是11种不同产地草龙的薄层鉴别图，图中：1-11分别是1#-11#不同产地的草龙药材；12、没食子酸对照品。

图6是HPLC图，图中：A对照品，B供试品，C阴性对照。

具体实施方式

以下各例所用草龙药材来自11个不同产地，经广西民族医药研究院黄瑞松研究员鉴定为柳叶菜科草龙Ludwigia hyssopifolia(G.Don)Exell的干燥全草。药材来源详细信息见表1。

表1不同产地草龙编号

实施例1性状鉴别

对自11个不同产地的草龙药材的性状进行了鉴别，结果显示：草龙药材根呈圆柱形，灰黄色，稍弯曲，多须根，直径0.3～0.8cm；茎表面灰绿色至灰褐色，具细纵皱纹，表皮脱落处呈深灰色，质软，易折断，断面皮部薄，黄白色，木部浅黄白色，中心有宽广的髓部；叶纸质，披针形，多皱宿，全缘，有稀柔毛，上表面灰绿色，下表面灰褐色，长8～13cm，宽2～5cm；气微，味苦。

实施例2显微鉴别(图1至图4)

对自11个不同产地的草龙药材的显微结构进行了鉴别，结果显示：药材粉末呈黄白色，草酸钙针晶及簇晶多见，针晶长28～71μm，簇晶直径15～28μm；可见螺纹导管或网纹导管，螺纹导管直径6～23μm，网纹导管直径9～51μm；有少量非腺毛，长12～184μm。

综上，草龙药材的显微鉴别要点系：粉末中草酸钙针晶众多，有的成簇，长15～75μm。草酸钙簇晶菊花状，直径约25μm。

此外，发明人还对所有草龙药材进行了根横切面、茎横切面、叶横切面的显微观察，结果如下：

根横切面(图2)——呈近圆形，木栓层由5-7列扁平长方形细胞组成，排列整齐。维管柱无限外韧放射状排列成环。维管射线明显；木质部分化到中心，无髓部，但木薄壁细胞较多，薄壁细胞中可见草酸钙针晶。

茎横切面(图3)——呈偏圆形。表皮具较厚的角质层；皮层较窄，维管束无限外韧型放射状排列成环；韧皮部较窄，外侧具较多韧皮纤维，常聚集成束构成断续的同心环，形成层约2层；木质部导管单个或成列，木纤维细胞较多，维管射线明显；髓部较大，髓部散生草酸钙簇晶。

叶横切面(图4)——上下表皮细胞各1列，细胞类圆形，有少量非腺毛；叶肉组织分化明显，栅栏组织1列，细胞形状呈长柱形，不通过主脉；海棉组织由类圆形或长柱形 的薄壁细胞构成，排列疏松，有明显细胞间隙，具大量簇晶及少量针晶。叶脉上、下表皮内侧具厚角组织。维管束类圆形，外韧型，形成层不明显，叶片中脉及叶肉组织中多见簇晶，叶肉组织中富含针晶束。

实施例3薄层色谱分析

以草龙全草药材粉末制成的溶液为供试品，取药材粉末0.5g，加水20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，加入甲醇定容至1ml，作为供试品溶液；另取没食子酸对照品，加甲醇制成每ml含没食子酸1mg的溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)实验，取供试品溶液5μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸溶液(5∶4∶0.5∶0.5)作为展开剂，展开，取出，晾干；喷以1％铁***溶液-1％三氯化铁溶液(1∶1)的混合溶液，日光检视。

测定11批药材样品，结果如图5所示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，也说明TLC方法重复性较好。

实施例4水分、总灰分、酸不溶灰分和浸出物的检查

取不同产地草龙药材(过2号筛)约2.0g，按照《中国药典》2010年版一部水分测定法项下烘干法(附录IX H第一法)测定。取草龙约2g，平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量(％)。结果见表2。

表2草龙样品水分测定结果

结果表明，11批样品含水分在9.0～12.6％之间，其平均含水分为10.4％。故拟定本品标准含水分不得超过15.0％。

总灰分测定：参照《中国药典》2010年版一部附录IX K灰分测定法(1.总灰分测定法)对11批样品进行总灰分进行测定。取不同产地草龙药材(过2号筛)约4.0g，按照《中国药典》2010年版一部灰分测定法项下总灰分测定法(附录IX K)测定。测定用的样品须粉碎，使能通过二号筛，混合均匀后，取样品2～3g(如须测定酸不溶性灰分，可取供样品3～5g)，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量(准确至0.01)，缓缓灼热，注意避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化至恒重。根据残渣重量，计算样品中总灰分的含量(％)。结果见表3。

表3草龙样品总灰分测定结果

结果表明，11批样品总灰分在4.4％～12.7％，平均总灰分含量为7.8％。故拟规定本品标准总灰分不得过13.0％。

酸不溶灰分：参照《中国药典》2010年版一部附录IX K灰分测定法(2.酸不溶灰分测定法)对11批样品进行测定。按照《中国药典》2010年版一部灰分测定法项下酸不溶 性灰分测定法(附录IX K)测定。取上项所得的灰分，在坩埚中注意加入稀盐酸约10ml，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10分钟，表面皿用热水5ml冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤液连同滤纸移至同一坩埚中，干燥，炽灼至恒重。根据残渣重量，计算供试品中酸不溶性灰分重量(％)。结果见表4。

表4草龙样品酸不溶性灰分测定结果

根据上述测定结果，11批样品酸不溶性灰分含量在0.1％～1.5％之间，平均酸不溶性灰分含量为0.6％。故拟规定本品标准酸不溶性灰分不得超过2.0％。

浸出物按照《中国药典》2010年版一部热浸法测定。取供试品约2～4g，精密称定，置100～250ml的锥形瓶中，精密加水50～100ml，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥器滤过，精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(％)。结果见表5。

表5草龙样品浸出物测定结果

根据上述测定结果，11批样品浸出物在10.3％～34.2％之间，平均浸出物为21.6％。考虑到药材来源的差异，故拟定本品标准浸出物含量不少于10.0％。

实施例5含量测定

一、仪器与材料

LC-20AT高效液相色谱仪(带自动进样器)二极管阵列检测器，LCsolution色谱工作站(均为日本岛津公司)；KQ-100.DE型数控超声波清洗器(昆明市超声仪有限公司)；X205BDU电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；EASY PURE II超纯水器(美国热电公司)等。没食子酸对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，含量：98％，批号：MUST-13040103)；流动相所用甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)、水为超纯水，其余均为分析纯。

二、方法

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Gemini C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-0.1％磷酸(1∶99)为流动相；柱温25℃，检测波长为272nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000。精密称没食子酸对照品适量，加水制成每1ml含没食子酸30μg的溶液，即得对照品溶液。取本品粉末(过四号筛)0.2g，精密称定，置具塞圆底烧瓶中，精密加入10％盐酸溶液25ml，称定重量，置水浴上加热回流30mim，放冷，再称定重量，用10％盐酸补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：供试品溶液和照品溶液色谱图相应的位置上，有保留时间相同的色谱峰，而阴性对照液色谱图则无此色谱峰。见图6。

1>线性关系考察

取没食子酸对照品适量，加水制成0.5mg/ml的溶液，分别精密吸取0.2，1，2，3，4，5ml，各加水定容至5ml，摇匀。分别精密吸取上述供试品溶液各10μl，注入HPLC，以没食子酸峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。得到没食子酸的回归方程：Y＝2770704.84x-89286，r＝0.9999，没食子酸在0.1974～4.935μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2>精密度试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样测定5次。结果：5次测定没食子酸峰面积的RSD＝0.54％。表明仪器精密度良好。

3>重复性试验

取同一样品粉末6份，每份0.2g，精密称定，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果：6份供试品溶液中没食子酸含量的RSD为1.30％。表明本方法重现性良好。

4>稳定性试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于1，2，4，8，12，24h进样测定。结果：样品中没食子酸峰面积的RSD为0.85％。表明供试品溶液中的没食子酸在24h之内稳定性良好。

5>加样回收率试验

取已知含量同一样品粉末6份，各0.1g，精密称定，精密加入没食子酸对照品溶液(68μg/ml)25ml，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定没食子酸含量，计算平均回收率及RSD。结果：测定没食子酸含量平均回收率为97.54％，RSD＝1.99％。

三、样品测定

参照《中国药典》2010版一部附录VI D高效液相色谱法，按照上述方法对11批次药材样品进行测定，结果见表6。

表6样品含量测定结果(n＝2)

结果表明：11批样品没食子酸含量为0.69％～5.14％，平均含量为2.61％。根据11批样品的测定结果，考虑到药材来源差异情况，拟定本品标准按干燥品计算含没食子酸(C₇H₆O₅)不得少于0.50％。

Claims (7)

1.一种草龙药材的质量控制方法，其特征在于主要包括药材性状鉴别和显微鉴别，所述药材性状鉴别中，药材根呈圆柱形，灰黄色，稍弯曲，多须根，直径0.3～0.8cm；茎表面灰绿色至灰褐色，具细纵皱纹，表皮脱落处呈深灰色，质软，易折断，断面皮部薄，黄白色，木部浅黄白色，中心有宽广的髓部；叶纸质，披针形，多皱宿，全缘，有稀柔毛，上表面灰绿色，下表面灰褐色，长8～13cm，宽2～5cm；气微，味苦；药材中水分不得超过15.0％，总灰分不得超过13.0％，酸不溶性灰分不得超过2.0％，水溶性浸出物不得低于10.0％；

所述显微鉴别中，药材粉末呈黄白色，草酸钙针晶及簇晶多见，针晶长28～71μm，簇晶直径15～28μm；可见螺纹导管或网纹导管，螺纹导管直径6～23μm，网纹导管直径9～51μm；有少量非腺毛，长12～184μm。

2.根据权利要求1所述的草龙药材的质量控制方法，其特征在于还包括薄层鉴别，薄层鉴别采用硅胶H薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸溶液作为展开剂，以1％铁***溶液-1％三氯化铁溶液混合溶液为显色剂。

3.根据权利要求2所述的草龙药材的质量控制方法，其特征在于薄层鉴别按以下操作进行：取供试品溶液5μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以体积比5∶4∶0.5∶0.5的甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸溶液作为展开剂，展开，取出，晾干；喷以体积比1∶1的1％铁***溶液-1％三氯化铁溶液的混合溶液，日光检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

4.根据权利要求3所述的草龙药材的质量控制方法，其特征在于：以草龙全草药材粉末制成的溶液为供试品，取药材粉末0.5g，加水20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，加入甲醇定容至1ml，作为供试品溶液；另取没食子酸对照品，加甲醇制成每ml含没食子酸1mg的溶液。

5.根据权利要求1所述的草龙药材的质量控制方法，其特征在于还包括含量测定，含量测定采用流动相为甲醇-0.1％磷酸混合溶液，柱温25℃，检测波长为272nm。

6.根据权利要求5所述的草龙药材的质量控制方法，其特征在于含量测定按以下操作进行：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比1∶99的甲醇-0.1％磷酸混合溶液为流动相；柱温25℃，检测波长为272nm；理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

7.根据权利要求6所述的草龙药材的质量控制方法，其特征在于：精密称没食子酸对照品适量，加水制成每1ml含没食子酸30μg的溶液，即得对照品溶液；取药材粉末0.2g，精密称定，置具塞圆底烧瓶中，精密加入10％盐酸溶液25ml，称定重量，置水浴上加热回流30mim，放冷，再称定重量，用10％盐酸补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。