CN106561631B - 一种唾液保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种唾液保存液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种唾液保存液及其制备方法和应用。所述唾液保存液，包括：DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐和酒石酸以及氨基三乙酸和二羟基乙基甘氨酸的中的至少一种；微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素和遗传霉素以及山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金乙酯钠、酮康唑和嘌呤霉素中的至少一种；以及缓冲液，包括TE缓冲液和PBS缓冲液或氯化钠葡萄糖缓冲液中的至少一种。本发明通过配制唾液保存液达到既能维护唾液拭子中的细胞形态，使其不发生裂解，又能抑制唾液拭子及保存液中微生物生长的目的。

Description

一种唾液保存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种唾液保存液及其制备方法和应用。
背景技术
在分子生物学领域，核酸DNA样本提取在基因工程和分子生物学研究中占有重要地位，并且核酸DNA样本在法医鉴定、疾病检测和治疗等领域应用广泛。核酸DNA样本通常提取自人体组织及体液，用于PCR反应和其他分子测试的DNA主要从抗凝血中提取，但保存时间较长的血样，即使添加枸橼酸钠或EDTA抗凝剂，也会形成血块，给提取带来不便。
由于人体唾液中含有口腔黏膜脱落细胞，近年来，科研和医药领域逐渐采用唾液取样的方式获取个体的DNA样本。收集唾液作为DNA样本来源具有无穿刺、无伤害取样的优点，并且当大范围收集样本时，唾液样本适合在各地区的实验室和收集点之间传递。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：冷冻保存法能够有效抑制微生物的生长，但是口腔上皮细胞经过反复冻融，容易导致细胞裂解，不利于维护遗传物质的稳定。生理盐水保存法虽然能够维护口腔上皮细胞细胞形态的稳定，但长时间存放易滋生细菌、真菌等微生物。本发明通过配置唾液保存液达到既能维护细胞形态，使其不发生裂解，又能抑制唾液拭子及保存液中微生物生长的目的。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
第一方面，本发明提供了一种唾液保存液，包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐和酒石酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素和遗传霉素(G418)；以及
缓冲液，包括TE缓冲液；
其中，以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·2Na)为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)为5mM～20mM。
优选的，其中，以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～5mM，酒石酸为26.65mM～33.32mM，青霉素为50U/mL～100U/mL，链霉素为86.00mM～170mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.280mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～10mM。
优选的，其中，以唾液保存液每升计，所述DNA稳定剂还包括0.523mM～5.23mM的氨基三乙酸和3mM～100mM的二羟基乙基甘氨酸中的至少一种。
优选的，其中，以唾液保存液每升计，所述微生物抑制剂还包括6.66mM～66.6mM的山梨酸钾，69.4mM～694mM的苯甲酸钠，6mM～60mM的尼泊金乙酯钠，0.1μM～10μM的酮康唑和0.184μM～1.84μM的嘌呤霉素中的至少一种。
优选的，其中，所述缓冲液还包括PBS缓冲液或氯化钠葡萄糖缓冲液，以唾液保存液每升计，所述PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4；所述氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
优选的，其中，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐、酒石酸和氨基三乙酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素(G418)、山梨酸钾、苯甲酸钠和尼泊金乙酯钠；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和PBS缓冲液；
以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，氨基三乙酸为0.523mM～5.23mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，尼泊金乙酯钠为6mM～60mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4。
优选的，其中，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐、酒石酸和二羟乙基甘氨酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素(G418)和酮康唑；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和PBS缓冲液；
以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，二羟乙基甘氨酸为3mM～100mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，酮康唑为0.1μM～10μM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4。
优选的，其中，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐、酒石酸和氨基三乙酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素(G418)、嘌呤霉素、山梨酸钾、苯甲酸钾、尼泊金乙酯钠；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和氯化钠葡萄糖缓冲液；
以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，氨基三乙酸为0.523mM～5.23mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，嘌呤霉素为0.184μM～1.84μM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，尼泊金乙酯钠为6mM～60mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
优选的，其中，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐、酒石酸和二羟乙基甘氨酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素(G418)、嘌呤霉素、山梨酸钾、苯甲酸钾和酮康唑；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和氯化钠葡萄糖缓冲液；
以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，二羟乙基甘氨酸为3mM～100mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，嘌呤霉素为0.184μM～1.84μM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，酮康唑为0.1μM～10μM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
优选的，其中，所述三羟甲基氨基甲烷-HCl的pH值为8.0。
第二方面，本发明提供了一种唾液保存液的制备方法，包括将DNA稳定剂，微生物抑制剂，以及缓冲液混合，然后加入水搅拌至溶解，接着定容；
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐和酒石酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素和遗传霉素(G418)；以及缓冲液，包括TE缓冲液；
其中，以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·2Na)为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)为5mM～20mM。
第三方面，本发明提供上述唾液保存液在保存唾液中的用途。
优选的，其中，所述唾液收集在唾液拭子中。
本发明的唾液保存液可以有效的保护唾液口腔上皮细胞中的基因组在数周内不被破坏且唾液不被微生物污染。
附图说明
图1a是唾液拭子在保存液1a#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。图2a是唾液拭子在保存液2a#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图2b是唾液拭子在保存液2b#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图2c是唾液拭子在保存液2c#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图3a是唾液拭子在保存液3a#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图3b是唾液拭子在保存液3b#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图3c是唾液拭子在保存液3c#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图4a是唾液拭子在保存液4a#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图4b是唾液拭子在保存液4b#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图4c是唾液拭子在保存液4c#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图5a是唾液拭子在保存液5a#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图5b是唾液拭子在保存液5b#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
图5c是唾液拭子在保存液5c#中保存不同时间后获取的DNA进行PCR扩增的曲线图，其中1为保存0天，2为保存60天，3为保存120天，4为保存180天，5为保存240天，6为保存300天。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明所做的限制。
本发明获得了一种能够较为长久地保存唾液样本拭子的保存液，使唾液拭子在该保存液中放置较长时间后，仍能够作为模板用于qPCR实验。
要使唾液拭子能够长期保存，使其仍然能够作为模板进行qPCR实验主要需要解决两个技术问题：其一，要保持唾液中口腔上皮细胞的基因组不被降解；其二，要保证唾液保存液中不滋生细菌、霉菌等微生物。要达到这两个目的需要在唾液保存液中加入具有维护基因组DNA稳定的试剂和抑制微生物生长的试剂。
本发明提供了一种唾液保存液，包括：DNA稳定剂、微生物抑制剂以及缓冲液。
本发明中，以唾液保存液每升计，所述DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·2Na)和26.65mM～66.63mM的酒石酸。作为DNA稳定剂的乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM。本发明中，乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·2Na)，起到DNA稳定剂的作用。因为DNA酶的活性需要Mg2+离子来维持，而EDTA是重要的Mg2+离子螯合剂，因此乙二胺四乙酸二钠盐是一种理想的DNA稳定剂。
本发明中，以唾液保存液每升计，所述微生物抑制剂，包括50U/mL～200U/mL的青霉素、86.00mM～343.9mM的链霉素和0.144mM～0.577mM的遗传霉素(G418)。优选的，所述微生物抑制剂还可以包括6.66mM～66.6mM的山梨酸钾，69.4mM～694mM的苯甲酸钠，6mM～60mM的尼泊金乙酯钠，0.1μM～10μM的酮康唑和0.184μM～1.84μM的嘌呤霉素中的至少一种，0.523mM～5.23mM的氨基三乙酸和3mM～100mM的二羟基乙基甘氨酸中的至少一种。
能够抑制微生物生长的化合物种类繁多，而由于收集口腔上皮细胞的操作(诸如拭子收集)是由非专业人士来完成的，甚至儿童亦有可能接触到该种唾液保存液，因此所选成分要避免误食造成的伤害。青霉素，链霉素，嘌呤霉素和G418作为抗生素可对不同种类的微生物起到抑制作用。山梨酸钾、苯甲酸钠作为国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂，可以广泛应用于食品、饮料、烟草、农药、化妆品等行业。尼泊金乙酯钠在食品工业中被广泛应用。合成的咪唑二烷衍生物酮康唑作为一种常用药对皮真菌、酵母菌、双相真菌具有抑菌和杀菌活性，因此可以应用于本发明。
以唾液保存液每升计，所述缓冲液，包括TE缓冲液，优选的，还可以包括PBS缓冲液和/或氯化钠葡萄糖缓冲液。TE缓冲液由EDTA·2Na和三羟甲基氨基甲烷-HCl组成，其中，三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)为5mM～20mM，作为DNA稳定剂的EDTA·2Na为1mM～10mM。所述PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4；所述氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
在维持动物细胞结构方面，本发明还采用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)，在本发明中加入磷酸盐缓冲液的组成成分可以起到维持口腔上皮细胞内外渗透压平衡的目的。另外，氯化钠葡萄糖缓冲液作为一般注射用缓冲液也具有维持细胞内外渗透压的作用。
在一个优选的具体实施方式中，所述唾液保存液，包括
DNA稳定剂，包括EDTA·2Na、酒石酸和氨基三乙酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素(G418)、山梨酸钾、苯甲酸钠和尼泊金乙酯钠；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和PBS缓冲液；
以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的EDTA·2Na为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，氨基三乙酸为0.523mM～5.23mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，尼泊金乙酯钠为6mM～60mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4。
在又一个优选的具体实施方式中，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括EDTA·2Na、酒石酸和二羟乙基甘氨酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素(G418)和酮康唑；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和PBS缓冲液；
以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的EDTA·2Na为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，二羟乙基甘氨酸为3mM～100mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，酮康唑为0.1μM～10μM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4。
在更又一个优选的具体实施方式中，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括EDTA·2Na、酒石酸和氨基三乙酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素(G418)、嘌呤霉素、山梨酸钾、苯甲酸钾、尼泊金乙酯钠；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和氯化钠葡萄糖缓冲液；
以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的EDTA·2Na为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，氨基三乙酸为0.523mM～5.23mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，嘌呤霉素为0.184μM～1.84μM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，尼泊金乙酯钠为6mM～60mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
在更又一个优选的具体实施方式中，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括EDTA·2Na、酒石酸和二羟乙基甘氨酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素(G418)、嘌呤霉素、山梨酸钾、苯甲酸钾和酮康唑；以及缓冲液，包括TE缓冲液和氯化钠葡萄糖缓冲液；
以唾液保存液每升计，作为DNA稳定剂的EDTA·2Na为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，二羟乙基甘氨酸为3mM～100mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素(G418)为0.144mM～0.577mM，嘌呤霉素为0.184μM～1.84μM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，酮康唑为0.1μM～10μM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
本发明唾液保存液用于保存唾液。所述唾液收集在医用棉签上或者唾液拭子中。本发明唾液保存液能够长期有效保护唾液中的口腔上皮细胞结构完整，其遗传物质不被降解，且能够保护唾液拭子不被微生物污染。
以下以非限制方式更具体地介绍适用于本发明的唾液保存液及其制备方法和用途。
下面实施例中所用到各试剂来源如表1所示。
表1：实施例中用到的试剂及型号信息表
试剂名称 等级 厂家
EDTA·2Na 试剂级 生工生物工程(上海)有限公司
二羟乙基甘氨酸 试剂级 生工生物工程(上海)有限公司
KH2PO4 分子生物学级 生工生物工程(上海)有限公司
NaCl 分子生物学级 北京索莱宝科技有限公司
KCl 试剂级 生工生物工程(上海)有限公司
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 试剂级 北京索莱宝科技有限公司
生理盐水 试剂级 生工生物工程(上海)有限公司
葡萄糖 分子生物学级 生工生物工程(上海)有限公司
1M Tris-HCl(pH8.0) 分子生物学级 生工生物工程(上海)有限公司
尼泊金乙酯钠 食品级 生工生物工程(上海)有限公司
氨基三乙酸 试剂级 生工生物工程(上海)有限公司
酮康唑 试剂级 北京索莱宝科技有限公司
山梨酸钾 食品级 北京索莱宝科技有限公司
苯甲酸钠 试剂级 北京索莱宝科技有限公司
青霉素 分子生物学级 生工生物工程(上海)有限公司
链霉素 分子生物学级 生工生物工程(上海)有限公司
嘌呤霉素 分子生物学级 北京索莱宝科技有限公司
G418 分子生物学级 生工生物工程(上海)有限公司
酒石酸 分子生物学级 北京索莱宝科技有限公司
实施例1
实施例1a
在1000mL烧杯中，将EDTA·2Na 0.372g，酒石酸4g，青霉素50000U，链霉素50g，G418 100mg，浓度为1M的Tris-HCl(pH8.0)5mL混合，先加入800mL蒸馏水，用玻璃棒不停搅拌，直至固体粉末全部溶解，然后用量筒定容至1L，得到唾液保存液1a#。
唾液样品采集和保存方法如下：
健康无口腔疾病的志愿者取口腔粘膜拭子，用漱口水进行漱口几次后，在口腔内侧反复擦拭二十下，取出拭子折下棉絮部分，置于装有500ul唾液保存液的2ml螺旋管中，置于室温下放置。唾液样品DNA的提取方法：
向每次取出的50ul上清中加入5wt％的Chelex 100于1.5ml离心管中，充分震荡混匀，再加人蛋白酶K(20mg/m1)10μl，漩涡混匀。50℃水浴消化过夜，煮沸10min，置于冰上静置3min，l 2 000r/min离心2min，吸取上清液于新的无菌1.5ml离心管中作为DNA模板进行验证，-20℃保存待用。
唾液保存液1a#保存唾液拭子，在保存60天、120天、180天、240天和300天后，从唾液拭子中获取DNA模板进行PCR扩增实验。
使用的β-actin引物和荧光探针如下所示：
Taqman b-actin F：TTGGCATGGCTTTATTTG
Taqman b-actin R：CCACATTGTGAACTTTGG
Taqman b-actin probe：FAM-ACTGCTGTCACCTTCACCGT-MGB
扩增β-actin序列如下SEQ ID NO.1：
ttggcatggctttatttgttttttttgttttgttttggttttttttttttttttggcttgactcaggatttaaaaactggaacggtgaaggtgacagcagtcggttggagcgagcatcccccaaagttcacaatgtgg
PCR反应体系和反应程序如下：
荧光定量检测：以上述处理过的DNA为模板，将β-actin基因的F和R的引物及相应的TaqMan-MGB探针按照如下体系至于一个PCR管中，同时用宏石SLAN-96P实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)进行PCR扩增。PCR反应体系为Vazyme的taqman-PCR预混试剂，引物各10μM，荧光标记的TaqMan-MGB探针10μM，取2μl模板DNA。PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃50秒，共40个循环。所得扩增曲线见图1a。从图1a看到，不同保存时间下，起峰处的循环数(ct值)随着保存时间的增加而略有增加，但保存300天和保存0天起峰处的循环数相差在2以内，表示用该种唾液保存液保存唾液拭子300天后qPCR效果没有明显的下降，说明唾液中口腔上皮细胞的基因组没有严重降解。
本实施例还研究了外源性细菌等微生物的污染情况。
取样：将含有口腔拭子和保存液的螺旋管震荡混匀，取10ul按照10倍的梯度进行稀释，稀释103倍。分别在不同的时间点进行取样，稀释。
计数：混匀后的各个稀释样本滴在计数板上，在显微镜下进行计数。
各个时间点保存液中微生物的数量比较：
0day：8438个菌
60days：8597个菌
120days：9086个菌
180days：9397个菌
240days：9701个菌
300days：9834个菌
实施例1b-1c
实施例1b-1c与实施例1a采用相同的制备方法制备唾液保存液1b#-1c#，不同之处在于各组分含量不同，如表2所示。
表2
试剂名称 实施例1a(1a#) 实施例1b(1b#) 实施例1c(1c#)
EDTA·2Na 0.372g(1mM) 3.72g(10mM) 1.86g(5mM)
1M Tris-HCl(pH8.0) 5mL(5mM) 20mL(20mM) 10mL(10mM)
青霉素 50000U(50U/mL) 200000U(200U/mL) 100000U(100U/mL)
链霉素 50g(86.00mM) 200g(343.9mM) 151.79g(170mM)
G418 100mg(0.144mM) 400mg(0.577mM) 200mg(0.28mM)
酒石酸 4g(26.65mM) 10g(66.63mM) 5g(33.32mM)
本实施例研究了使用唾液保存液1b#和1c#保存唾液拭子，在保存60天、120天、180天、240天和300天后，唾液保存液和唾液拭子中外源性细菌等微生物的污染情况。
取样：将含有口腔拭子和保存液的螺旋管震荡混匀，取10ul按照10倍的梯度进行稀释，稀释103倍。分别在不同的时间点进行取样，稀释。
计数：混匀后的各个稀释样本滴在计数板上，在显微镜下进行计数。
各个时间点保存液中微生物的数量比较见表3：
表3
1a# 1b# 1c#
0天 8438 8456 8416
60天 8597 8601 8540
120天 9086 8901 9212
180天 9397 9323 9322
240天 9701 9745 9622
300天 9834 9897 9812
唾液保存液1a#、1b#和1c#的组分相同含量不同，均包括乙二胺四乙酸二钠盐、TE缓冲液、青霉素、链霉素、G418和酒石酸。当唾液中的微生物含量达到105时便不可用于PCR模板使用。从表3可知，唾液拭子在唾液保存液1a#、1b#和1c#中保存60天后，唾液中的微生物数量略微有增加，随着保存时间的延长，唾液中的微生物数量增加，保存300天后，唾液中的微生物数量增加1396～1441，但微生物数量均低于105，唾液拭子DNA仍能作为PCR模板使用，说明制备的唾液保存液的保存效果好。实施例1d-1i
实施例1d-1i与实施例1a采用相同的制备方法制备唾液保存液1d#-1i#，不同之处在于组分组成不同，如表4所示。
表4
Figure BDA0001130477920000131
Figure BDA0001130477920000141
本实施例研究了外源性细菌等微生物的污染情况。
取样：将含有口腔拭子和保存液的螺旋管震荡混匀，取10ul按照10倍的梯度进行稀释，稀释103倍。分别在不同的时间点进行取样，稀释。
计数：混匀后的各个稀释样本滴在计数板上，在显微镜下进行计数。各个时间点保存液中微生物的数量比较见表5：
表5
1a# 1d# 1e# 1f# 1g# 1h# 1i#
0天 8438 8440 8434 8386 8397 8408 8457
60天 8597 8588 8579 8901 8907 8804 8847
120天 9086 9221 9088 9586 9926 9881 9997
180天 9397 9407 9421 10583 13911 12816 14400
240天 9701 9804 9711 17967 20017 19227 200898
300天 9834 10128 9822 21304 24151 23587 26988
表5显示：唾液拭子在唾液保存液1a#、1d#、1e#、1f#、1g#、1h#、1i#中保存60天后，唾液中的微生物数量略微有增加，随着保存时间的延长，唾液中的微生物数量增加明显，保存300天后，1d#、1f#、1g#、1h#、1i#唾液中的微生物数量增加明显比1a#、1e#多很多，保存效果不如1a#、1e#。
实施例2
实施例2a-2c
实施例2a-2c与实施例1a采用相同的制备方法制备唾液保存液2a#-2c#，不同之处在于组分组成不同，如表6所示。
表6
试剂名称 实施例2a 实施例2b 实施例2c
EDTA·2Na 0.372g(1mM) 3.72g(10mM) 1.86g(5mM)
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.12g(1mM) 0.6g(5mM) 0.3g(2.5mM)
NaCl 4g(68.5mM) 12g(205.5mM) 8g(103mM)
KCl 0.05g(0.675mM) 0.5g(6.75mM) 0.25g(3.4mM)
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.5g(3.47mM) 2g(13.9mM) 1g(7mM)
1M Tris-HCl(pH8.0) 5mL(5mM) 20mL(20mM) 10mL(10mM)
尼泊金乙酯钠 1g(6mM) 10g(60mM) 5g(30mM)
氨基三乙酸 0.1g(0.523mM) 1g(5.23mM) 0.5g(2.6mM)
山梨酸钾 1g(6.66mM) 10g(66.6mM) 5g(33.3mM)
苯甲酸钠 10g(69.4mM) 100g(694mM) 50g(347mM)
青霉素 50000U(50U/mL) 200000(200U/mL) 100000(100U/mL)
链霉素 50g(86.00mM) 200g(343.9mM) 100g(172mM)
G418 100mg(0.144mM) 400mg(0.577mM) 200mg(0.28mM)
酒石酸 4g(26.65mM) 10g(66.63mM) 5g(33.32mM)
唾液保存液2a#-2c#保存唾液拭子，在保存60天、120天、180天、240天和300天后，从唾液拭子中获取DNA模板进行PCR扩增实验。
使用的β-actin引物和荧光探针如下所示：
Taqman b-actin F：TTGGCATGGCTTTATTTG
Taqman b-actin R：CCACATTGTGAACTTTGG
Taqman b-actin probe：FAM-ACTGCTGTCACCTTCACCGT-MGB
PCR反应体系和反应程序如下：
荧光定量检测：以上述处理过的DNA为模板，将β-actin基因的F和R的引物及相应的TaqMan-MGB探针按照如下体系至于一个PCR管中，同时用宏石SLAN-96P实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)进行PCR扩增。PCR反应体系为Vazyme的taqman-PCR预混试剂，引物各10μM，荧光标记的TaqMan-MGB探针10μM，取2μl模板DNA。PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃50秒，共40个循环。
所得扩增曲线分别见图2a、2b和2c。
唾液拭子在唾液保存液2a#-2c#中保存60天、120天、180天、240天和300天后，获取唾液拭子DNA模板进行qPCR扩增。从图2a-2c可看到，不同保存时间下，起峰处的循环数随着保存时间的增加而略有增加，但保存300天和保存0天起峰处的循环数相差在2以内，表示用该种唾液保存液保存唾液拭子300天后qPCR效果没有明显的下降。
本实施例还研究了外源性细菌等微生物的污染情况。
取样：将含有口腔拭子和保存液的螺旋管震荡混匀，取10ul按照10倍的梯度进行稀释，稀释103倍。分别在不同的时间点进行取样，稀释。
计数：混匀后的各个稀释样本滴在计数板上，在显微镜下进行计数。
各个时间点保存液中微生物的数量比较见表7：
表7
2a# 2b# 2c#
0天 8332 8412 8316
60天 8607 8567 8540
120天 9096 9112 8901
180天 9407 9387 9322
240天 9678 9645 9620
300天 9802 9818 9782
唾液保存液2a#、2b#和2c#的组分相同含量不同，均包括乙二胺四乙酸二钠盐、TE缓冲液、PBS缓冲液、尼泊金乙酯钠、氨基三乙酸、山梨酸钾、苯甲酸钠、青霉素、链霉素、G418和酒石酸。从表7可知，唾液拭子在唾液保存液2a#、2b#和2c#中保存60天后，唾液中的微生物数量略微有增加，随着保存时间的延长，唾液中的微生物数量增加，保存300天后，唾液中的微生物数量增加1406～1470，但微生物数量均低于105，唾液拭子DNA仍能作为PCR模板使用，说明总体保存效果好。
实施例3
实施例3a-3c
实施例3a-3c与实施例1a采用相同的制备方法制备唾液保存液3a#-3c#，不同之处在于组分组成不同，如表8所示。
表8
试剂名称 实施例3a 实施例3b 实施例3c
EDTA·2Na 0.372g(1mM) 3.72g(10mM) 1.86g(5mM)
二羟乙基甘氨酸 0.490g(3mM) 16.317g(100mM) 8.16g(50mM)
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.12g(1mM) 0.6g(5mM) 0.3g(2.5mM)
NaCl 4g(68.5mM) 12g(205.5mM) 7.59g(130mM)
KCl 0.05g(0.675mM) 0.5g(6.75mM) 0.25g(3.4mM)
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.5g(3.47mM) 2g(13.9mM) 1g(7mM)
1M Tris-HCl(pH8.0) 5mL(5mM) 20mL(20mM) 10mL(10mM)
酮康唑 53.3μg(0.1μM) 5.33mg(10μM) 2.67mg(5μM)
青霉素 50000U(50U/mL) 200000U(200U/mL) 100000U(100U/mL)
链霉素 50g(86.00mM) 200g(343.9mM) 100g(172mM)
G418 100mg(0.144mM) 400mg(0.577mM) 200mg(0.28mM)
酒石酸 4g(26.65mM) 10g(66.63mM) 5g(33.32mM)
唾液保存液3a#-3c#保存唾液拭子，在保存60天、120天、180天、240天和300天后，从唾液拭子中获取DNA模板进行PCR扩增实验。
使用的b-actin引物和荧光探针如下所示：
Taqman b-actin F：TTGGCATGGCTTTATTTG
Taqman b-actin R：CCACATTGTGAACTTTGG
Taqman b-actin probe：FAM-ACTGCTGTCACCTTCACCGT-MGB
PCR反应体系和反应程序如下：
荧光定量检测：以上述处理过的DNA为模板，将β-actin基因的F和R的引物及相应的TaqMan-MGB探针按照如下体系至于一个PCR管中，同时用宏石SLAN-96P实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)进行PCR扩增。PCR反应体系为Vazyme的taqman-PCR预混试剂，引物各10μM，荧光标记的TaqMan-MGB探针10μM，取2μl模板DNA。PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃50秒，共40个循环。
所得扩增曲线分别见图3a、3b和3c。
唾液拭子在唾液保存液3a#-3c#中保存60天、120天、180天、240天和300天后，获取唾液拭子DNA模板进行qPCR扩增。从图3a-3c可看到，不同保存时间下，起峰处的循环数随着保存时间的增加而略有增加，但保存300天和保存0天起峰处的循环数相差在2以内，表示用该种唾液保存液保存唾液拭子300天后qPCR效果没有明显的下降。
本实施例还研究了外源性细菌等微生物的污染情况。
取样：将含有口腔拭子和保存液的螺旋管震荡混匀，取10ul按照10倍的梯度进行稀释，稀释103倍。分别在不同的时间点进行取样，稀释。
计数：混匀后的各个稀释样本滴在计数板上，在显微镜下进行计数。
各个时间点保存液中微生物的数量比较见表9：
表9
3a# 3b# 3c#
0天 8440 8426 8406
60天 8637 8601 8542
120天 8926 9101 8812
180天 9377 9328 9302
240天 9788 9745 9622
300天 9934 9896 9812
唾液保存液3a#、3b#和3c#的组分相同含量不同，均包括乙二胺四乙酸二钠盐、二羟乙基甘氨酸、PBS缓冲液、TE缓冲液、酮康唑、青霉素、链霉素、G418和酒石酸。从表9可知，唾液拭子在唾液保存液3a#、3b#和3c#中保存60天后，唾液中的微生物数量略微有增加，随着保存时间的延长，唾液中的微生物数量增加，保存300天后，唾液中的微生物数量增加1406～1494，但微生物数量均低于105，唾液拭子DNA仍能作为PCR模板使用，总体保存效果好。
实施例4
实施例4a-4c
实施例4a-4c与实施例1a采用相同的制备方法制备唾液保存液4a#-4c#，不同之处在于组分组成不同，如表10所示。
表10
试剂名称 实施例4a 实施例4b 实施例4c
EDTA·2Na 0.372g(1mM) 3.72g(10mM) 1.86g(5mM)
氨基三乙酸 0.1g(0.523mM) 1g(5.23mM) 0.5g(2.62mM)
生理盐水 8.5g(145.3mM) 9g(153.8mM) 8.72g(149mM)
葡萄糖 5g(27.8mM) 20g(111.1mM) 10g(56mM)
1M Tris-HCl(pH8.0) 5mL(5mM) 20mL(20mM) 10mL(10mM)
尼泊金乙酯钠 1g(6mM) 10g(60mM) 5g(30mM)
山梨酸钾 1g(6.66mM) 10g(66.6mM) 5g(33.3mM)
苯甲酸钠 10g(69.4mM) 100g(694mM) 50g(347mM)
青霉素 50000U(50U/mL) 200000U(200U/mL) 100000U(100U/mL)
链霉素 50g(86.00mM) 200g(343.9mM) 100g(172mM)
嘌呤霉素 0.1mg(0.184μM) 1mg(1.84μM) 0.446mg(0.82μM)
G418 100mg(0.144mM) 400mg(0.577mM) 200mg(0.28mM)
酒石酸 4g(26.65mM) 10g(66.63mM) 5g(33.32mM)
唾液保存液4a#-4c#保存唾液拭子，在保存60天、120天、180天、240天和300天后，从唾液拭子中获取DNA模板进行PCR扩增实验。
使用的b-actin引物和荧光探针如下所示：
Taqman b-actin F：TTGGCATGGCTTTATTTG
Taqman b-actin R：CCACATTGTGAACTTTGG
Taqman b-actin probe：FAM-ACTGCTGTCACCTTCACCGT-MGB
PCR反应体系和反应程序如下：
荧光定量检测：以上述处理过的DNA为模板，将β-actin基因的F和R的引物及相应的TaqMan-MGB探针按照如下体系至于一个PCR管中，同时用宏石SLAN-96P实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)进行PCR扩增。PCR反应体系为Vazyme的taqman-PCR预混试剂，引物各10μM，荧光标记的TaqMan-MGB探针10μM，取2μl模板DNA。PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃50秒，共40个循环。
所得扩增曲线分别见图4a、4b和4c。
唾液拭子在唾液保存液4a#-4c#中保存60天、120天、180天、240天和300天后，获取唾液拭子DNA模板进行qPCR扩增。从图4a-4c可看到，不同保存时间下，起峰处的循环数随着保存时间的增加而略有增加，但保存300天和保存0天起峰处的循环数相差在2以内，表示用该种唾液保存液保存唾液拭子300天后qPCR效果没有明显的下降。
本实施例还研究了外源性细菌等微生物的污染情况。
取样：将含有口腔拭子和保存液的螺旋管震荡混匀，取10ul按照10倍的梯度进行稀释，稀释103倍。分别在不同的时间点进行取样，稀释。
计数：混匀后的各个稀释样本滴在计数板上，在显微镜下进行计数。
各个时间点保存液中微生物的数量比较见表11：
表11
4a# 4b# 4c#
0天 8423 8411 8406
60天 8617 8603 8580
120天 8986 8891 8812
180天 9297 9223 9202
240天 9722 9689 9692
300天 9834 9897 9800
唾液保存液4a#、4b#和4c#的组分相同含量不同，均包括乙二胺四乙酸二钠盐、氨基三乙酸、生理盐水、葡萄糖、TE缓冲液、尼泊金乙酯钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、青霉素、链霉素、嘌呤霉素、G418和酒石酸。从表11可知，唾液拭子在唾液保存液4a#、4b#和4c#中保存60天后，唾液中的微生物数量略微有增加，随着保存时间的延长，唾液中的微生物数量增加，保存300天后，唾液中的微生物数量增加1394～1486，但微生物数量均低于105，唾液拭子DNA仍能作为PCR模板使用，总体保存效果好。
实施例5
实施例5a-5c
实施例5a-5c与实施例1a采用相同的制备方法制备唾液保存液5a#-5c#，不同之处在于组分组成不同，如表12所示。
表12
试剂名称 实施例5a 实施例5b 实施例5c
EDTA·2Na 0.372g(1mM) 3.72g(10mM) 1.86g(5mM)
二羟乙基甘氨酸 0.490g(3mM) 16.317g(100mM) 8.17g(50mM)
生理盐水 8.5g(145.3mM) 9g(153.8mM) 8.7g(149mM)
葡萄糖 5g(27.8mM) 20g(111.1mM) 13.67g(76mM)
1M Tris-HCl(pH8.0) 5mL(5mM) 20mL(20mM) 10mL(10mM)
酮康唑 53.3μg(0.1μM) 5.33mg(10μM) 2.67mg(5μM)
山梨酸钾 1g(6.66mM) 10g(66.6mM) 5g(33.3mM)
苯甲酸钠 10g(69.4mM) 100g(694mM) 50g(347mM)
青霉素 50000U(50U/mL) 200000U(200U/mL) 100000U(100U/mL)
链霉素 50g(86.00mM) 200g(343.9mM) 100g(172mM)
嘌呤霉素 0.1mg(0.184μM) 1mg(1.84μM) 0.45mg(0.82μM)
G418 100mg(0.144mM) 400mg(0.577mM) 200mg(0.28mM)
酒石酸 4g(26.65mM) 10g(66.63mM) 5g(33.32mM)
唾液保存液5a#-5c#保存唾液拭子，在保存60天、120天、180天、240天和300天后，从唾液拭子中获取DNA模板进行PCR扩增实验。
使用的b-actin引物和荧光探针如下所示：
Taqman b-actin F：TTGGCATGGCTTTATTTG
Taqman b-actin R：CCACATTGTGAACTTTGG
Taqman b-actin probe：FAM-ACTGCTGTCACCTTCACCGT-MGB
PCR反应体系和反应程序如下：
荧光定量检测：以上述处理过的DNA为模板，将β-actin基因的F和R的引物及相应的TaqMan-MGB探针按照如下体系至于一个PCR管中，同时用宏石SLAN-96P实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)进行PCR扩增。PCR反应体系为Vazyme的taqman-PCR预混试剂，引物各10μM，荧光标记的TaqMan-MGB探针10μM，取2μl模板DNA。PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃50秒，共40个循环。
所得扩增曲线分别见图5a、5b和5c。
唾液拭子在唾液保存液5a#-5c#中保存60天、120天、180天、240天和300天后，获取唾液拭子DNA模板进行qPCR扩增。从图5a-5c可看到，在不同保存时间下，起峰处的循环数随着保存时间的增加而略有增加，但保存300天和保存0天起峰处的循环数相差在2以内，表示用该种唾液保存液保存唾液拭子300天后qPCR效果没有明显的下降。
本实施例还研究了外源性细菌等微生物的污染情况。
取样：将含有口腔拭子和保存液的螺旋管震荡混匀，取10ul按照10倍的梯度进行稀释，稀释103倍。分别在不同的时间点进行取样，稀释。
计数：混匀后的各个稀释样本滴在计数板上，在显微镜下进行计数。
各个时间点保存液中微生物的数量比较见表13：
表13
5a# 5b# 5c#
0天 8338 8351 8306
60天 8697 8634 8610
120天 8996 8971 9012
180天 9392 9345 9302
240天 9701 9740 9667
300天 9812 9862 9833
唾液保存液5a#、5b#和5c#的组分相同含量不同，均包括乙二胺四乙酸二钠盐、二羟乙基甘氨酸、生理盐水、葡萄糖、TE缓冲液、酮康唑、山梨酸钾、苯甲酸钠、青霉素、链霉素、嘌呤霉素、G418和酒石酸。从表12可知，唾液拭子在唾液保存液5a#、5b#和5c#中保存60天后，唾液中的微生物数量略微有增加，随着保存时间的延长，唾液中的微生物数量增加，保存300天后，唾液中的微生物数量增加1474～1527，但微生物数量均低于105，唾液拭子DNA仍能作为PCR模板使用，总体保存效果好。
Figure BDA0001130477920000241
Figure IDA0001130477990000011

Claims (21)

1.一种唾液保存液，其特征在于，包括：
DNA稳定剂，所述DNA稳定剂包括乙二胺四乙酸二钠盐和酒石酸；
微生物抑制剂，所述微生物抑制剂包括青霉素、链霉素和遗传霉素；以及缓冲液，包括TE缓冲液；
其中，以唾液保存液每升计，乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素为0.144mM～0.577mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM；
以唾液保存液每升计，所述DNA稳定剂还包括0.523mM～5.23mM的氨基三乙酸和3mM～100mM的二羟基乙基甘氨酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的唾液保存液，以唾液保存液每升计，乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～5mM，酒石酸为26.65mM～33.32mM，作为微生物抑制剂的青霉素为50U/mL～100U/mL，链霉素为86.00mM～170mM，遗传霉素为0.144mM～0.280mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～10mM。
3.根据权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，以唾液保存液每升计，所述微生物抑制剂还包括6.66mM～66.6mM的山梨酸钾，69.4mM～694mM的苯甲酸钠，6mM～60mM的尼泊金乙酯钠，0.1μM～10μM的酮康唑和0.184μM～1.84μM的嘌呤霉素中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的唾液保存液，其特征在于，以唾液保存液每升计，所述微生物抑制剂还包括6.66mM～66.6mM的山梨酸钾，69.4mM～694mM的苯甲酸钠，6mM～60mM的尼泊金乙酯钠，0.1μM～10μM的酮康唑和0.184μM～1.84μM的嘌呤霉素中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，所述缓冲液还包括PBS缓冲液和/或氯化钠葡萄糖缓冲液，以唾液保存液每升计，所述PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4；所述氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
6.根据权利要求2所述的唾液保存液，其特征在于，所述缓冲液还包括PBS缓冲液和/或氯化钠葡萄糖缓冲液，以唾液保存液每升计，所述PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4；所述氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
7.根据权利要求3所述的唾液保存液，其特征在于，所述缓冲液还包括PBS缓冲液和/或氯化钠葡萄糖缓冲液，以唾液保存液每升计，所述PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4；所述氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
8.根据权利要求4所述的唾液保存液，其特征在于，所述缓冲液还包括PBS缓冲液和/或氯化钠葡萄糖缓冲液，以唾液保存液每升计，所述PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4；所述氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
9.根据权利要求1-8任一项所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐、酒石酸和氨基三乙酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素、山梨酸钾、苯甲酸钠和尼泊金乙酯钠；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和PBS缓冲液；
以唾液保存液每升计，乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，氨基三乙酸为0.523mM～5.23mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素为0.144mM～0.577mM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，尼泊金乙酯钠为6mM～60mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4。
10.根据权利要求1-8任一项所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐、酒石酸和二羟乙基甘氨酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素和酮康唑；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和PBS缓冲液；
以唾液保存液每升计，乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，二羟乙基甘氨酸为3mM～100mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素为0.144mM～0.577mM，酮康唑为0.1μM～10μM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4。
11.根据权利要求1-8任一项所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐、酒石酸和氨基三乙酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素、嘌呤霉素、山梨酸钾、苯甲酸钾、尼泊金乙酯钠；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和氯化钠葡萄糖缓冲液；
以唾液保存液每升计，乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，氨基三乙酸为0.523mM～5.23mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素为0.144mM～0.577mM，嘌呤霉素为0.184μM～1.84μM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，尼泊金乙酯钠为6mM～60mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
12.根据权利要求1-8任一项所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液包括：
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐、酒石酸和二羟乙基甘氨酸；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素、遗传霉素、嘌呤霉素、山梨酸钾、苯甲酸钾和酮康唑；以及
缓冲液，包括TE缓冲液和氯化钠葡萄糖缓冲液；
以唾液保存液每升计，乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，二羟乙基甘氨酸为3mM～100mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素为0.144mM～0.577mM，嘌呤霉素为0.184μM～1.84μM，山梨酸钾为6.66mM～66.6mM，苯甲酸钠为69.4mM～694mM，酮康唑为0.1μM～10μM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，和氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
13.根据权利要求1-8任一项所述的唾液保存液，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷-HCl的pH值为8.0。
14.根据权利要求9所述的唾液保存液，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷-HCl的pH值为8.0。
15.根据权利要求10所述的唾液保存液，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷-HCl的pH值为8.0。
16.根据权利要求11所述的唾液保存液，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷-HCl的pH值为8.0。
17.根据权利要求12所述的唾液保存液，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷-HCl的pH值为8.0。
18.一种唾液保存液的制备方法，包括将DNA稳定剂，微生物抑制剂，以及缓冲液混合，然后加入水搅拌至溶解，接着定容；
DNA稳定剂，包括乙二胺四乙酸二钠盐和酒石酸；
所述DNA稳定剂还包括氨基三乙酸和二羟基乙基甘氨酸中的至少一种；
微生物抑制剂，包括青霉素、链霉素和遗传霉素；以及
缓冲液，包括TE缓冲液；
其中，以唾液保存液每升计，乙二胺四乙酸二钠盐为1mM～10mM，酒石酸为26.65mM～66.63mM，青霉素为50U/mL～200U/mL，链霉素为86.00mM～343.9mM，遗传霉素为0.144mM～0.577mM，TE缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷-HCl为5mM～20mM，氨基三乙酸为0.523mM～5.23mM，二羟基乙基甘氨酸为3mM～100mM。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述DNA稳定剂还包括0.523mM～5.23mM的氨基三乙酸和3mM～100mM的二羟基乙基甘氨酸中的至少一种；所述微生物抑制剂还包括6.66mM～66.6mM的山梨酸钾，69.4mM～694mM的苯甲酸钠，6mM～60mM的尼泊金乙酯钠，0.1μM～10μM的酮康唑和0.184μM～1.84μM的嘌呤霉素中的至少一种；所述缓冲液还包括PBS缓冲液或氯化钠葡萄糖缓冲液，以唾液保存液每升计，所述PBS缓冲液为1mM～5mM的KH2PO4、68.5mM～205.5mM的NaCl、0.675mM～6.75mM的KCl和3.47mM～13.9mM的Na2HPO4；所述氯化钠葡萄糖缓冲液为145.3mM～153.8mM的生理盐水和27.8mM～111.1mM的葡萄糖。
20.权利要求1-17任一项所述的唾液保存液在保存唾液中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，所述唾液收集在唾液拭子中。
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