CN101363011A - 一种宫颈脱落细胞保存液 - Google Patents

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本发明涉及一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：醇类20％－50％；抗聚集试剂15％－50％；缓冲液5％－10％；离子强度维持试剂1％－20％；抗微生物试剂0.01％－0.5％；粘液溶解试剂0.1－5％；清洁剂0－0.5％。与现有技术相比，本发明保存液不但能够使细胞在体外液体悬浮液环境中可以保持形态，最小化蛋白沉淀，溶解较大的蛋白物质如血液、粘液，减少细胞聚集，而且还能够选择性消除或减少红细胞，有效杀灭微生物，阻止逆转录酶活性，保留核酸和蛋白完整以便以后分析；此外，本发明大大降低TCT检测的耗材成本，提高***筛查的灵敏度和特异度，加速TCT技术在医疗***的推广和普及。

Description

一种宫颈脱落细胞保存液
技术领域
本发明涉及细胞保存液，尤其涉及一种宫颈脱落细胞保存液。
背景技术
作为宫颈病变的筛查方法，传统的巴氏涂片过程中涉及到的取材、涂片质量、细胞分离等诸多因素都会严重降低细胞的阳性率。细胞工程专家推出了一种制片新技术——液基薄层细胞学技术(TCT)，它主要通过技术处理丢掉非诊断杂质，制成观察清晰的薄层细胞片，使阅片者更易观察，诊断准确性明显提高。
液基薄层细胞学技术(TCT)改变了以往巴氏涂片的操作方法，标本取出后立即洗入细胞保存液中，避免了常规巴氏涂片过程中遗留在取材器上的细胞随取材器一起被抛弃和细胞过度干燥的现象。保存液中的细胞经程序化处理，随机取样制成均匀的薄层涂片，在薄片中的不正常细胞容易被观察，并且湿固定的细胞核结构清晰，易于鉴别，可以检测出较多的低级病变和一些更严重的病变，是目前国际上比较推行的新技术。采用液基薄层细胞学技术对异常细胞的诊断率提高了13％，对低度鳞状上皮以上病变的检出率提高了65％，具有传统涂片无法比拟的优点。
TCT技术中最为关键的试剂是细胞保存液。目前，市场上常用40-50％醇类作为保存液，在运输和微观玻片贮存中用来支持细胞，大于50％可以固定流动性高的蛋白质，但随即蛋白质就形成沉积物，不能转化成玻片，这给细胞学检查带来困难，同时会导致细胞表面变形。若小于20％细胞不能长时间固定保存，易导致细胞退化。
TCT技术已成为筛查***最好的推荐方法之一，为***的早期诊断和治疗提供了非常明确的诊断依据，尤其在现代文明技术高速发展的今天广泛的推广应用就显得尤为迫切和重要，因此开发出合适的宫颈脱落细胞保存液已迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种细胞固定良好、成本较低、提高筛查灵敏度和特异度的宫颈脱落细胞保存液。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
醇类                     20％-50％；
抗聚集试剂               15％-50％；
缓冲液                   5％-10％；
离子强度维持试剂         1％-20％；
抗微生物试剂             0.01％-0.5％；
粘液溶解试剂             0.1-5％；
清洁剂                   0-0.5％。
所述的醇类包括甲醇、乙醇、异丙醇；所述的抗聚集试剂包括乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐、肝激酶、链激酶。
所述的乙二胺四乙酸盐首选乙二胺四乙酸二钠。
所述的缓冲液包括醋酸-醋酸盐缓冲液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、双(2-羟乙基)-三羟甲基氨基甲烷(BIS-TRIS)、2-(N-***啉)乙磺酸(MES)、哌臻-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)；所述的离子强度维持试剂包括氯化钾。
所述的醋酸盐选自醋酸钠、醋酸镁、醋酸钙中的一种或几种。
所述的抗微生物试剂包括抗生素；所述的粘液溶解试剂包括二硫键打开试剂。
所述的抗生素包括青霉素、链霉素、四环素或氨苄青霉素。
所述的二硫键打开试剂包括甲基半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、二硫苏糖醇或二羟基二硫苏糖醇。
所述的清洁剂包括非离子型、阳离子型、阴离子型或双性离子型表面活性剂。
所述的非离子型表面活性剂包括聚乙烯吡咯烷酮K30、聚氧乙烯醚辛烷基酚、吐温-20或吐温-80，所述的阳离子型表面活性剂包括十六烷基二甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵、阳离子瓜尔胶、阳离子泛醇、阳离子硅油或十二烷基二甲基氧化胺，所述的阴离子型表面活性剂包括直链烷基苯磺酸钠、α-烯基磺酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠或十二烷基硫酸钠，所述的双性离子型表面活性剂包括十二烷基二甲基甜菜碱或羧酸盐型咪唑啉。
本发明中的第一个成分醇类可以维持细胞DNA和蛋白质完整性，首选甲醇，也可选用乙醇、异丙醇，比例为20-50％；
第二个成分是抗聚集试剂，选用可以溶解在甲醇或其他醇类中的抗聚集试剂，包括鳌合试剂—EDTA，首选碳酸氢二钠合成的EDTA，也可选用肝激酶、链激酶等，浓度大约是：15％-50％；
第三种成分是缓冲液，用来调节pH值，适应标本中细胞释放自溶副产物所导致的pH变化，以维持细胞形态特征，首选醋酸盐缓冲液，如醋酸钠、醋酸镁、醋酸钙或联合，也可选用其他如N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、双(2-羟乙基)-三羟甲基氨基甲烷(BIS-TRIS)、2-(N-***啉)乙磺酸(MES)、哌臻-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)，浓度大约为5％-10％；
第四种成分是为了维持离子强度、防止细胞变型，不仅要溶解在保存液中还不能产生抗凝试剂(EDTA)沉淀，选用氯化钾，浓度大约为1％-20％，维持离子强度的物质要在先前溶液中额外加入，或另外兼容于缓冲液中；
第五种成分是抗微生物试剂，用以抑制待测样本的保存液中的微生物：白色念球菌、曲霉菌、大肠杆菌、假单胞菌和葡萄球菌，考虑随收集、运输、分析时间而降解的因素选取抗生素，包括青霉素、链霉素、四环素或氨苄青霉素等，抗生素的含量大约是0.01％-0.5％；
第六种成分是粘液溶解试剂，包括甲基半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、二硫苏糖醇(DTT，一种蛋白质变性剂)、二羟基二硫苏糖醇或是其他可以打破二硫键的试剂，浓度为0.1％-5％；
此外，本发明保存液中还含有清洁剂，包括非离子型、阳离子型、阴离子型或双性离子型表面活性剂。
与现有技术相比，本发明的保存液不但能够使细胞在体外液体悬浮液环境中可以保持形态，最小化蛋白沉淀，溶解较大的蛋白物质如血液、粘液，减少细胞聚集，而且还能够选择性消除或减少红细胞，有效杀灭微生物，阻止逆转录酶活性，保留核酸和蛋白完整以便以后分析；此外，本发明大大降低TCT检测的耗材成本，提高了***筛查的灵敏度和特异度，加速了TCT技术在医疗***的推广和普及。
附图说明
图1为采用本发明制作的病理标本的示意图；
图2为采用第一种现有保存液制作的病理标本的示意图；
图3为采用第二种现有保存液制作的病理标本的示意图。
具体实施方式
下面对照附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
 
组分 含量(Kg)
醇类 甲醇 20
抗聚集试剂 乙二胺四乙酸二钠 49.89
缓冲液 醋酸-醋酸钠缓冲液 10
离子强度维持试剂 氯化钾 20
抗微生物试剂 青霉素 0.01
粘液溶解试剂 甲基半胱氨酸 0.1
将上述组分按照含量要求均匀混合得到一种宫颈脱落细胞保存液。
实施例2
一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
 
组分 含量(Kg)
醇类 乙醇 30
抗聚集试剂 肝激酶 38.9
缓冲液 N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES) 10
离子强度维持试剂 氯化钾 20
抗微生物试剂 链霉素 0.1
粘液溶解试剂 N-乙酰基-L-半胱氨酸 1
将上述组分按照含量要求均匀混合得到一种宫颈脱落细胞保存液。
实施例3
一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
 
组分 含量(Kg)
醇类 异丙醇 35
 
抗聚集试剂 链激酶 39.3
缓冲液 N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA) 8
离子强度维持试剂 氯化钾 15
抗微生物试剂 四环素 0.2
粘液溶解试剂 二硫苏糖醇 2
清洁剂 α-烯基磺酸钠 0.5
将上述组分按照含量要求均匀混合得到一种宫颈脱落细胞保存液。
实施例4
一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
 
组分 含量(Kg)
醇类 甲醇 40
抗聚集试剂 链激酶 28.4
缓冲液双 (2-羟乙基)-三羟甲基氨基甲烷(BIS-TRIS)                          8
离子强度维持试剂 氯化钾 20
抗微生物试剂氨苄 青霉素 0.3
粘液溶解试剂 二羟基二硫苏糖醇 3
清洁剂 十二烷基二甲基甜菜碱 0.3
将上述组分按照含量要求均匀混合得到一种宫颈脱落细胞保存液。
实施例5
一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
 
组分 含量(Kg)
醇类 甲醇 45
抗聚集试剂 链激酶 27.4
缓冲液双 2-(N-***啉)乙磺酸(MES) 8
离子强度维持试剂 氯化钾 15
抗微生物试剂氨苄 青霉素 0.4
粘液溶解试剂 甲基半胱氨酸 4
清洁剂 吐温-20 0.2
将上述组分按照含量要求均匀混合得到一种宫颈脱落细胞保存液。
实施例6
一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
 
组分 含量(Kg)
醇类 甲醇 50
抗聚集试剂 链激酶 19.5
缓冲液 双哌臻-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES) 10
离子强度维持试剂 氯化钾 15
抗微生物试剂氨苄 青霉素 0.5
粘液溶解试剂 二硫苏糖醇 5
将上述组分按照含量要求均匀混合得到一种宫颈脱落细胞保存液。
实施例7
一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
 
组分 含量(Kg)
醇类 甲醇 50
抗聚集试剂 乙二胺四乙酸二钠 40.6
缓冲液 醋酸-醋酸钠缓冲液 5
离子强度维持试剂 氯化钾 1
抗微生物试剂 青霉素 0.3
粘液溶解试剂 甲基半胱氨酸 3
清洁剂 聚乙烯吡咯烷酮K30 0.1
将上述组分按照含量要求均匀混合得到一种宫颈脱落细胞保存液。
实施例8
一种宫颈脱落细胞保存液，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
 
组分 含量(Kg)
醇类 乙醇 50
抗聚集试剂 肝激酶 15
缓冲液 N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES) 10
离子强度维持试剂 氯化钾 19
 
抗微生物试剂 链霉素 0.5
粘液溶解试剂 N-乙酰基-L-半胱氨酸 5
清洁剂 十六烷基二甲基氯化铵 0.5
将上述组分按照含量要求均匀混合得到一种宫颈脱落细胞保存液。
通过设计双盲实验对本发明进行质量评估，具体如下：
在同一时间段随机收集近期使用本产品和目前三级医院普遍使用的其它两种细胞保存液(下文中分别用B液和C液代替)制作的病理标本。所有片子由艾迪康临床检验中心病理室制作，共收集300张病理片，包括本产品A液100张，B液105张，C液95张。
专利申请人邀请浙江省最有经验的TCT诊断专家在不知道厂家品牌的前提下对三组不同标号的TCT保存液进行评估，以达到公正客观的目的，评估结果如下：
评估指标：总背景、总体细胞量、细胞形态和保存质量对诊断的影响。
评估结果：
A组(本发明)：如图1所示，总体细胞量尚可，细胞保存良好，淋巴细胞存在保存不佳，观察滴虫、疱疹等病变较费劲，应用于临床在一定程度上会影响诊断的阳性率和准确率，但三者的比较中属于较好的一种；
B组(注：B液)：如图2所示，细胞量相对前一种要少些，保存良好，优于前一种，但背景较乱，细胞退变情况也较常见，一定程度上会影响诊断的阳性率和准确率，总体与前者(即本发明)相差不大；
C组(注：C液)：如图3所示，三者比较中此组保存效果最差，细胞肿胀明显，影响诊断的片子量很多，不建议应用于实验室。
本发明可包装为20毫升/瓶，用于宫颈脱落细胞的保存，采用液基薄层细胞学技术制宫颈脱落细胞片子，供病理医师进行细胞学诊断。
液基薄层细胞学检测***(Thinprep Cytologic Test，TCT)主要方法是将宫颈脱落细胞放入装有保存液的小瓶中，再通过离心沉淀技术制片，按TBS法作出诊断报告，该法比传统涂片方法准确率高。
本发明宫颈脱落细胞保存液可以起到固定细胞，防止细胞聚集，分散粘液，去除红细胞，维持pH值和离子强度，防止细胞变形，常温保存等作用。
使用本发明的取样保存方法为：
第1步：将扫把样宫颈刷***子宫颈内管并轻压，刷毛吻合子***而倾斜；
第2步：维持压力，拇指和食指握住柄，顺时针旋转毛刷5-8次；
第3步：子宫颈刷置入液基瓶内，搅拌约10次，强力旋转刷毛，最后丢弃刷子；
第4步：拧紧保存液瓶的盖子；
第5步：于瓶身上注明病人姓名、病历信息等随申请单送检。

Claims (10)

1.一种宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，该保存液包括以下组分及含量(重量)：
醇类                       20％-50％；
抗聚集试剂                 15％-50％；
缓冲液                     5％-10％；
离子强度维持试剂           1％-20％；
抗微生物试剂               0.01％-0.5％；
粘液溶解试剂               0.1-5％；
清洁剂                     0-0.5％。
2.根据权利要求1所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的醇类包括甲醇、乙醇、异丙醇；所述的抗聚集试剂包括乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐、肝激酶、链激酶。
3.根据权利要求2所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的乙二胺四乙酸盐首选乙二胺四乙酸二钠。
4.根据权利要求1所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的缓冲液包括醋酸-醋酸盐缓冲液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、双(2-羟乙基)-三羟甲基氨基甲烷(BIS-TRIS)、2-(N-***啉)乙磺酸(MES)、哌臻-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)；所述的离子强度维持试剂包括氯化钾。
5.根据权利要求4所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的醋酸盐选自醋酸钠、醋酸镁、醋酸钙中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的抗微生物试剂包括抗生素；所述的粘液溶解试剂包括二硫键打开试剂。
7.根据权利要求6所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的抗生素包括青霉素、链霉素、四环素或氨苄青霉素。
8.根据权利要求6所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的二硫键打开试剂包括甲基半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、二硫苏糖醇或二羟基二硫苏糖醇。
9.根据权利要求1所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的清洁剂包括非离子型、阳离子型、阴离子型或双性离子型表面活性剂。
10.根据权利要求9所述的宫颈脱落细胞保存液，其特征在于，所述的非离子型表面活性剂包括聚乙烯吡咯烷酮K30、聚氧乙烯醚辛烷基酚、吐温-20或吐温-80，所述的阳离子型表面活性剂包括十六烷基二甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵、阳离子瓜尔胶、阳离子泛醇、阳离子硅油或十二烷基二甲基氧化胺，所述的阴离子型表面活性剂包括直链烷基苯磺酸钠、α-烯基磺酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠或十二烷基硫酸钠，所述的双性离子型表面活性剂包括十二烷基二甲基甜菜碱或羧酸盐型咪唑啉。
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