CN114539359A - 一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽、制备方法及其应用 - Google Patents

一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽、制备方法及其应用，抗菌肽的氨基酸序列为Gly‑Asn‑Asn‑Arg‑Pro‑Val‑Tyr‑Ile‑Pro‑Arg‑Pro‑Arg‑Arg‑Pro‑His‑Pro‑Arg‑Leu‑NH2。制备方法为固相化学合成法，其可作为药物或饲料添加剂应用于蜜蜂幼虫白垩病的防治。该抗菌肽能够显著提高感染球囊菌的蜜蜂幼虫的存活率。一方面，抗菌肽可直接作用于球囊菌，降低球囊菌增殖；另一方面，抗菌肽还可诱导其他内源性抗菌肽的表达，增强蜜蜂幼虫的免疫防御力，使染毒幼虫减少发病概率。本发明所公开的抗菌肽可用于预防和治疗蜜蜂白垩病，且具有明显的防治效果。

Description

一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及用于防治蜜蜂幼虫白垩病技术领域，尤其涉及一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽、制备方法及其应用。
背景技术
白垩病是一种蜜蜂幼虫的传染性真菌病，在全国范围内的西方蜜蜂中流行。蜜蜂白垩病是由一种叫做蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)的真菌所引起的，这种真菌只侵袭蜜蜂幼虫，并且具有很强的生命力，在自然界中保存15年以上仍有活性。白垩病的发生在很大程度上取决于当时的温湿度，有着较明显的季节性，一般此病多流行于春季和初夏，特别是在阴雨潮湿，温度变化频繁的气候条件下容易产生。在这段时间，蜂群多处于繁殖期，巢脾上子圈比较大，巢脾边缘受冷的机会比较大，发病率就高。在蜂群里，患病幼虫的尸体以及被污染的饲料与巢脾是疾病传播的主要来源。目前，治疗白垩病最常用的是各种抗真菌药物及制霉素。虽然使用该方法能够阻止蜜蜂球囊菌的生长，但是对蜜蜂本身也是有害的。而且，该类化学成分毒副作用强、易产生耐药性和蜂产品药物残留等问题，应用受到很大限制。
蜜蜂抗菌肽是蜜蜂在受到病原物或其他外源物侵染后，在脂肪体迅速合成的一类具有抗菌活性的生物活性小分子。蜜蜂抗菌肽抗菌肽在昆虫血淋巴中发挥抑制细菌、真菌、病毒的作用，是一种快速有效的免疫防御机制。目前，抗菌肽已应用于蜜蜂病毒病的防控，在蜜蜂绿色经济饲养方面具有巨大的应用市场。抗菌肽(apidaecin 1b P13R L-NH2)是在已知天然抗菌肽apidaecin 1b序列的基础上人工改造的多肽，该抗菌肽相比天然抗菌肽具有更高的抑菌活性，特别是***如金黄色葡萄球菌的活性，但该抗菌肽是否具有抗蜜蜂真菌病的作用还未进行研究。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽、制备方法及其应用，所述抗菌肽能够抑制球囊菌的增殖，降低蜜蜂体内球囊菌的菌落数，还能够诱导蜜蜂内源性抗菌肽的表达，提高蜜蜂的先天性免疫防御力，抵抗体内球囊菌对幼虫的侵害并防止球囊菌以及其他病原微生物的进一步感染。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的氨基酸序列为：Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-His-Pro-Arg-Leu-NH2，其序列特征为含有18个氨基酸残基且羧基端酰胺化修饰，分子量为2211.58Da，等电点为12.18。
一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述制备方法采用固相化学合成法合成。
一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽的应用方式包括药物及饲料添加剂。
优选的，所述药物成分包含除抗菌肽以外的其它能够提高蜜蜂免疫力或抗真菌能力的活性成分，包括王浆主蛋白，蜂胶提取物、具有抗菌功能的中草药提取物。
优选的，所述药物还可包含赋形剂蜂蜜或糖浆，所述糖浆为可溶性粉剂白砂糖的水溶液，白砂糖与水的质量比为1:1。
优选的，所述饲料添加剂包含所述抗菌肽或其同源异构体。
优选的，所述饲料添加剂还包含除抗菌肽以外的其它能够提高蜜蜂免疫力或抗真菌能力的活性成分。
优选的，所述活性成分包括花粉、蜂王浆、糖类、酵母粉、无机盐、维生素和水。
本发明所述饲料可为固体饲料、半固体饲料或液体饲料。
本发明的有益效果是：本发明首次发现抗菌肽(apidaecin 1b P13R L-NH2)能够抑制蜜蜂球囊菌生长，显著提高感染蜜蜂白垩病的幼虫存活率。一方面该抗菌肽可直接作用于蜜蜂球囊菌，降低球囊菌的扩增；另一方面本抗菌肽可诱导内源性抗菌肽基因的转录，提高内源性抗菌肽(膜翅目抗菌肽(Hymenoptaecin)，蜜蜂防卫素(Defensin)，和蜂蛾抗菌肽(Abaecin)的表达水平，增强蜜蜂幼虫的免疫防御力。
本发明的实验结果表明，使用该抗菌肽干预后感染白垩病的蜜蜂幼虫的死亡率大幅下，且存活幼虫可化蛹并羽化为成蜂。因此，本发明所提供的抗菌肽可用于预防和治疗蜜蜂白垩病，且具有明显的防治效果，还可以制备用于提高蜜蜂免疫力的药物及饲料添加剂。本发明采用固相合成方法人工合成了一种具有强效抑菌作用的多肽，效果显著，方法简单，成本低廉，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明抗菌肽HPLC色谱图。
图2为本发明抗菌肽的质谱图。
图3为本发明实验例2中分离的球囊菌的PCR产物在NCBI在线比对的结果图(图示中分离菌与蜜蜂球囊菌同源性最高)。
图4为本发明实验例2抗菌肽的抑菌效果。A图为对照组，B图为抗菌肽组(图示中，培养基中加入100ng/mL抗菌肽(apidaecin 1b P13R L-NH2)后，蜜蜂球囊菌的生长被显著抑制)。
图5为本发明实验例4中抗菌肽干预7日龄健康幼虫和染病幼虫的存活率统计结果。
图6为本发明实验例4中抗菌肽干预后4-7日龄幼虫的每日死亡率统计结果。
图7为本发明实验例4中健康幼虫和染病后抗菌肽干预后幼虫的化蛹情况(图示中，抗菌肽干预组化蛹幼虫数量比感染组显著增加，圆圈指示成功化蛹的幼虫)。
图8为本发明实验例5中患病幼虫及抗菌肽干预后蜜蜂抗菌肽(Apidaecin)、膜翅目抗菌肽(Hymenoptaecin)、蜜蜂防卫素(Defensin)、蜂蛾抗菌肽(Abaecin)的相对表达量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的数据统计分析均利用SPSS 19.0(美国芝加哥SPSS公司)完成。
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1抗菌肽(apidaecin 1b P13R L-NH2)制备
抗菌肽的氨基酸序列为：甘氨酸-色氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-缬氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-组氨酸-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸-羧基端酰胺化修饰(Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-His-Pro-Arg-Leu-NH2、GNNRPVYIPRPR RPHPRL-NH2)。序列特征:含有18个氨基酸残基且羧基端酰胺化修饰，分子量为2211.58Da，等电点为12.18。本实施例抗菌肽采用固相化学合成法，最终得到的抗菌肽经高效液相色谱及质谱分析，其纯度为95％。
具体包括以下步骤：
(1)树脂的称取：选取2-Chlorotrityl Chloride Resin，把称取好的树脂放入反应柱里面，然后加入DCM溶剂振荡30min，终浓度为0.2mmol/g。DCM加的量为树脂高度的2～3倍，将树脂充分溶胀完全。
(2)去保护：把DCM溶剂抽干，然后用DMF溶液洗涤3遍，去除DCM，然后用20％六氢吡啶孵育两次去保护，第一次5分钟，第二次10分钟，中间用DMF洗涤一遍。
(3)去保护后洗涤：用DMF溶液洗涤6遍。
(4)偶联：按照3倍量投氨基酸，即0.2mmol的树脂，需投氨基酸的量为0.2mmol*3＝0.6mmol，同时添加HOBT作为激活剂。
(5)偶联时检测。抽掉DMF溶液后，用滴管取少许树脂，乙醇清洗三次后，分别滴加茚三酮、KCN，苯酚各2滴，110℃加热3分钟。然后取出来看树脂是否变蓝，若树脂检测为蓝色，即可以偶联下一个氨基酸。
(6)再次去保护：最后一个氨基酸偶联好后，用DMF洗涤3遍，DCM溶剂3遍，甲醇3遍，抽干肽树脂。
(7)裂解多肽：将制备好的干肽树脂，加入裂解液(10ml/g)(TFA94％、EDT 2.5％、超纯水2.5％、TIS 1％)，25℃摇床振荡120min。反应结束后，抽滤，溶液倒入冰***中沉淀，2000rmp离心10min，一般离心3～4遍。将离心好后的抗菌肽用氮气吹干，然后放入真空干燥器中抽干。
(8)HPLC纯化多肽：上述粗提多肽加入5ml浓度50％的色谱级乙腈溶液充分溶解，经0.45pm滤膜过滤后，用分析级HPLC分离洗脱。梯度洗脱：先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度为0.1％三氟乙酸80％，乙腈20％；然后运行0.1％三氟乙酸45％，乙腈55％，梯度时间25min；结束梯度乙腈100％，梯度时间5min。从检测器收集洗脱出来的样品(图1所示)。
(9)LC-MS/MS鉴定:将收集下来的样品,取样进行纯度和MS的鉴定(图2所示)。
(10)将纯化后的溶液冻干，得到白色粉末状的多肽，-20度保存。
实施例2抗菌肽体外抑菌试验
1、球囊菌孢子悬浮液的制备
采集患白垩病的蜜蜂幼虫，用75％乙醇进行表面消毒2min，将患病蜜蜂幼虫切成适宜小块，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(采购于coolaber公司)，于30℃培养箱7天，观察生长变化情况。将分离菌进行PCR检测，扩增片段大小约为600bp，并将目的条带切胶回收的片段进行测序。
扩增的ITS片段序列：(562bp)
CGGCTAGGTGCCCCTAAACAAGGCCCTGCCGCGCACTCCCACCCTTGTCTACCTTACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCGGGTTCTCGCGAGCCTGCTGCCGGAGGGGTTAGTTCCCCCCTGGCTAGCGTCCGCCGAAGATAAACGAACTCCAGTCGAAGATTGAAGTCTGAAGAAAATTGATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGACATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCAACCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCGATCGTCCCGTCTTAGGAGGGACGCGCCCGAAAGGCAGTGACGGCGTCGTGTTCCGGTGCCCGAGCGTATGGGGCTTTGTCTTTCGCTCTAGTGGCCTGGCCGACTGTCCGGTCTAACCATCATTTACTTCTAGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATC
将测序结果用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的BLAST进行序列在线比对，结果见图3，与前8个菌株的序列相似性均达到100％，经鉴定为蜜蜂白垩病病原菌Ascosphaera apis。待雌雄菌丝交配产生黑色孢囊后，向培养皿加入10mL的灭菌去离子水，用接种环轻轻刮取孢子，尽量避免刮下菌丝，置于4℃冰箱保持15min，取出室温下放置10-30min，经4000r/min离心10min，去上清后重悬孢子，用磁力搅拌器上充分搅拌后过滤，获得孢子悬浮液。用血细胞计数板测量孢子浓度，用无菌水稀释成浓度为106个/mL的孢子母液。
2、含抗菌肽培养基的配制
用灭菌后的超纯水与本发明制备的纯度为95％的抗菌肽配制成1mg/mL的母液后备用。将抗菌肽母液加入PDA培养基中，使抗菌肽在培养基中的最终浓度为100ng/mL。
3、抗菌肽抑制蜜蜂球囊菌的生长
用无菌水将孢子悬浮液稀释后，分别将100μL的浓度为103个/mL、104个/mL、105个/mL的球囊菌孢子均匀涂抹在不含抗菌肽或含抗菌肽的PDA培养基中，30℃培养箱培养7天。
实施例3利用抗菌肽干预感染白垩病的幼虫
1、蜜蜂幼虫饲料的制备
参照2016年饲喂意大利蜜蜂幼虫的标准并在此基础上进行调整(KarlCrailsheim，Robert Brodschneider，Pierrick Aupinel,Dieter Behrens,ElkeGenersch,Jutta Vollmann&Ulrike Riessberger-Gallé.Standard methods forartificial rearing of Apis mellifera larvae.Journal of Apicultural Research,2013,52(1):1-15.)。饲料含有：1体积的蜂王浆和1体积的水溶液组成含有12％(w/v)葡萄糖、12％果糖和2％酵母的溶液提取物(饲料A)；15％葡萄糖、15％果糖和3％酵母提取物(饲料B)；或18％葡萄糖、18％果糖和4％酵母提取物(饲料C)。从第1-2天开始饲喂幼虫20μL饲料A，第3天20μL饲料B，以及30、40和50μL饲料C分别在第4天、第5天和第6天喂食。
2、含球囊菌饲料的制备
将原始孢子储藏液加入相应的蜜蜂幼虫饲料，根据预实验球囊菌感染的检测结果，使饲料中孢子的最终浓度为105个/mL。
3、含抗菌肽饲料的制备
作为幼虫饲料进行试验时按各日龄需要用幼虫饲料进行稀释，抗菌肽的终浓度为1μg/mL。
4、抗菌肽干预染白垩病幼虫试验
在超净台内利用移虫针将1日龄的意大利蜜蜂幼虫从巢脾移至48孔无菌细胞培养板(STPCs)中，每孔1只幼虫，孔板内预先加入20μL的幼虫饲料A。将装有1日龄幼虫的培养板置于温度35℃、湿度94％、黑暗的人工气候中饲养，第2天无需饲喂幼虫。第3、4、5、6天分别饲喂20μL、30μL、40μL、50μL饲料。从培养箱中取出预培养1天后的幼虫(2日龄)，将健康状况良好的幼虫分别放入48孔无菌细胞培养板(STPCs)中，随机分为对照组，抗菌肽组，感染组和干预组，每组48只样本，重复三次。
对照组整个饲养过程中只饲喂蜜蜂幼虫饲料；
抗菌肽组整个饲养过程中只饲喂含抗菌肽的蜜蜂幼虫饲料；
感染组3-4日龄幼虫饲喂含球囊菌饲料，5-6日龄饲喂蜜蜂幼虫饲料；
干预组3-4日龄幼虫饲喂含球囊菌饲料，5-6日龄饲喂含抗菌肽制剂的幼虫饲料。
从7日龄开始全部幼虫停止饲喂饲料。
将上述饲喂的食物放在培养板底部一侧，避免接触幼虫，每24小时饲喂一次，观察并记录幼虫的死亡率。从3日龄饲喂含有不同处理的饲料开始，之后的每天需要检查并记录幼虫死亡情况，直至移虫后第7天结束，死亡幼虫应迅速从培养板中取出。其余幼虫迅速转移到化蛹的一次性48孔无菌细胞培养板(STCPs)中，置于温湿度为35℃、75％、黑暗的人工气候箱内培养直到化蛹(第18天)，其中可通过目测判断蛹的存活状态。记录抗菌肽干预健康幼虫和染病幼虫后的存活率(7日龄)和化蛹率。
5、内源性抗菌肽转录水平检测
qRT-PCR分析分别对3日龄幼虫、4日龄(接种球囊菌后一天)、6日龄(接种抗菌肽后一天)的蜜蜂幼虫进行取样。在每个培养板中随机选择3只幼虫并将其汇集在一起，作为一个生物重复样本。将样品冷冻并储存在-80℃冰箱，直到提取RNA。将样品放入研钵中，加入液氮充分研磨后将组织粉末放入离心管中，室温静置15min后，使用TRIzol试剂盒按照产品说明书分离总RNA。总RNA用DNAse-I(Fermentas,Inc6)处理并用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)纯化。RNA质量使用NanoDrop 2000测定，RNA量使用Agilent 2100RNA Nano 6000检测试剂盒(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)测定。按照SuperscriptII Kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)使用说明书用寡d(T)18引物从1mg总RNA合成第一链cDNA。定量RT-PCR反应包含100ng cDNA，每种引物1pmol，2x Sybr Green PCR缓冲液(Bio-Rad，Hercules CA，USA)，终反应体系为20μL。
扩增的PCR条件如下：94℃预变性1min，94℃变性45s，54℃退火60s，72℃退火75s，进行30个循环。基因相对表达量根据看家基因β-actin计算得出。检测引物参照文献提供的引物序列，具体如下：Api daecin Forward TAGTCGCGGTATTTGGGAAT，Reverse TTTCACGTGCTTCATATTCTTCAAbaecin Forward CAGCATTCGCATACGTACCA，Rever seGACCAGGAAACGTTGGAAAC；Defensin Forward TGCGCTGCTAA CTGTCTCAG，ReverseAATGGCACTTAACCGAAACG；Hymenoptaecin Forward CTCTTCTGTGCCGTTGCATA，ReverseGCGTCTCCTGTCATTC CATT(参考文献Evans,J.D.Beepath:An ordered quantitative-PCRarra y for exploring honey bee immunity and disease.Journal of InvertebratePathology.2006,93,135-139.)；β-actin Forward TTGTATGCCAACAC TGTCCTTT，ReverseTGGCGCGATGATCTTAATTT。
实验例4利用抗菌肽干预健康蜜蜂幼虫和患病幼虫
对实施例2中的各组9日龄蜜蜂幼虫进行存活率统计，幼虫存活率＝幼虫的存活数量/样本数量×100％。
结果显示，饲喂的对照组和抗菌肽组对比，幼虫存活率都能达到80％左右，说明抗菌肽干预不会造成健康幼虫的异常死亡，不影响健康幼虫的生长发育，可以用于幼虫的辅助饲喂(图5所示)。感染组与干预组对比，感染组的幼虫存活率只有15.75％，抗菌肽干预组幼虫存活率大幅提高到65.28％以上，结果表明，采用抗菌肽干预能够使约50％的染病幼虫免于病死，使染病蜂群免于崩溃，对蜂群的恢复和繁衍起到了重要作用。
对实施例2中的各组蜜蜂幼虫进行每日死亡率统计，幼虫死亡率的测定方法如下：预培养(2日龄)及感染当日(3日龄)的幼虫死亡数不计入分析，以排除实验过程中幼虫机械致死的影响，从感染次日(4日龄)开始每天定时对幼虫的死亡数进行统计，并移除死亡幼虫，重复上述步骤至9日龄结束。
每日幼虫死亡率＝每天幼虫的死亡数量/每天幼虫存活的数量×100％；
结果显示，常规饲喂的对照组4-6日龄幼虫每天的死亡率低于6％，感染组幼虫接种球囊菌后2天后死亡率大幅上升，5-6每日死亡率均超过40％，到18日龄时实验仅有约10％的幼虫成功化蛹。与感染组相比，抗菌肽干预组各日龄幼虫死亡率大幅下降，到7日龄时幼虫死亡率仅为4.2％，且到18日龄有60％以上的幼虫成功化蛹(图6-图7)。
结果表明，采用抗菌肽干预能够大幅减少染毒幼虫的病死率，增加幼虫化蛹率，使染病蜂群免于崩溃，对蜂群的恢复和繁衍起到了重要作用。
实验例5球囊菌感染及抗菌肽干预对幼虫免疫相关基因表达量的影响
为分析球囊菌感染感染以及抗菌肽干预对于蜜蜂幼虫免疫***的影响，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对实施例1中各组蜜蜂幼虫中抗菌肽基因的表达水平进行检测，以β-actin作为内参基因，然后标准化为对照组的基因表达水平，检测Apidaecin，Hymenoptaecin，Abaecin和Defen sin的相对表达量。
如图8所示，在接种球囊菌24小时后(4日龄)，Apidaecin，Hyme noptaecin，Abaecin和Defensin的表达量在幼虫体内均有所升高，最高达到对照的8倍，但6日龄感染幼虫中Hymenoptaecin，Abaecin和Defensi n的相对表达量回落，维持在3倍左右。
对健康幼虫给予抗菌肽干预会引起内源略微Apidaecin下降，而Hym enoptaecin，Abaecin和Defensin表达量上调，Defensin相对表达量最高上调到9倍左右；在5日龄开始实施抗菌肽干预，干预组所有抗菌肽表达量均大幅度上升，6日龄幼虫Defensin表达量最高可达到38倍左右。
本发明以感染白垩病的蜜蜂幼虫为研究对象，利用荧光定量PCR的方法，对4种抗菌肽基因在感病和健康蜂幼虫发育阶段的表达情况进行定量检测和比较，明确了感染球囊菌后的免疫应答。抗菌肽干预强烈诱导了患病幼虫内源性抗菌肽Hymenoptaecin、Abaecin和Defensin的表达能力，从而抵御了球囊菌对幼虫的侵害，减少了幼虫的病死率，形成一种快速有效的防御机制，用来迅速杀死或清除外源的病原微生物，保护幼虫的生长发育。
综上所述，本发明所述抗菌肽能够抑制球囊菌的增殖，降低蜜蜂体内球囊菌的菌落数，还能够诱导蜜蜂内源性抗菌肽的表达，提高蜜蜂的先天性免疫防御力，抵抗体内球囊菌对幼虫的侵害并防止球囊菌以及其他病原微生物的进一步感染，因此本发明所公开的抗菌肽可用于预防和治疗蜜蜂白垩病。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的氨基酸序列为：Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-His-Pro-Arg-Leu-NH2，其序列特征为含有18个氨基酸残基且羧基端酰胺化修饰，分子量为2211.58Da，等电点为12.18。
2.根据权利要求1所述的一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述制备方法采用固相化学合成法合成。
3.根据权利要求1所述的一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽的应用方式包括药物及饲料添加剂。
4.根据权利要求3所述的一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的应用，其特征在于：所述药物成分包含除抗菌肽以外的其它能够提高蜜蜂免疫力或抗真菌能力的活性成分，包括王浆主蛋白，蜂胶提取物、具有抗菌功能的中草药提取物。
5.根据权利要求3所述的一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的应用，其特征在于：所述药物包含赋形剂蜂蜜或糖浆，所述糖浆为可溶性粉剂白砂糖的水溶液，白砂糖与水的质量比为1:1。
6.根据权利要求3所述的一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的应用，其特征在于：所述饲料添加剂包含所述抗菌肽或其同源异构体。
7.根据权利要求3所述的一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的应用，其特征在于：所述饲料添加剂包含除抗菌肽以外的其它能够提高蜜蜂免疫力或抗真菌能力的活性成分。
8.根据权利要求7所述的一种防治蜜蜂幼虫白垩病的抗菌肽的应用，其特征在于：所述活性成分包括花粉、蜂王浆、糖类、酵母粉、无机盐、维生素和水。
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