CN106460030A

CN106460030A - 用于稳定和维持顽强微生物的生存力的组合物和方法

Info

Publication number: CN106460030A
Application number: CN201580027751.5A
Authority: CN
Inventors: H·哈依姆·伯恩博伊姆; 卡珊德拉·凯利·奇利诺; 比塔皮·雷; 雅克·奥斯卡·埃弗拉德·奈尔斯; 奥勒·马尔滕·德布莱恩
Original assignee: DNA Genotek Inc
Current assignee: DNA Genotek Inc
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2017-02-22
Also published as: WO2015179976A1; SG10201810541XA; US11753616B2; EA201692258A1; CA2950419A1; JP2017516477A; MX2016015462A; PH12016502414A1; AU2015268067A1; EP3149191A1; SG11201609793TA; BR112016027693A2; CA2950419C; US20170226469A1; EP3149191A4; US20230416671A1; AP2016009581A0

Abstract

本申请将提供从样品收集至下游分析用于稳定和维持顽强微生物的生存力的组合物和方法。特别地，存在用于保存生物样品中有活力的顽强细菌，(例如，分枝杆菌(Mycobacteria)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、或艰难梭菌(Clostridium difficile))的方法，该方法包括使生物样品与稳定组合物接触，其中稳定组合物包含螯合剂、变性剂、盐，并且具有约6至约11之间的pH。

Description

用于稳定和维持顽强微生物的生存力的组合物和方法

技术领域

本申请与样品收集和储存领域有关。更具体地，本申请涉及用于维持顽强(hardy)微生物从样品收集至分析的生存力的组合物和方法。

背景技术

结核病(TB)仍然是主要的全球健康问题。大多数的新感染和死亡发生在发展中国家。仅在2012年，世界卫生组织(WHO)估计860万人发展了TB并且130万人死于该疾病，包括HIV-阳性个体中的320,000人死亡(全球结核病报告2013，WHO)。TB死亡的数量是不可接受的大，考虑到多数是可预防的。WHO估计约三分之一的世界人口或20亿人感染有结核病，因此处于发展活动性疾病的风险中。惊人地，WHO估计在2001年仅报道了360万涂片-阳性TB病例中的三分之一(WHO，2001，全球结核病控制，WHO/CDS/TB/2001287:18-19)。TB的早期诊断仍然是缩减这种疾病扩散的主要障碍之一。不幸的是，存在无数与鉴定全世界大约3000万具有活动性TB的个体相关的问题。

从收集之时通过运输、存储和加工的所有阶段，生物样本的适当处理对获得既及时又临床相关的微生物试验结果是重要的(Wilson，1996)。提交用于微生物测试的所有临床样本的共同问题不仅包括适当的鉴定，还包括使微生物病原体回收最大化和使由非病原体引起的污染最小化的收集技术。对于样本如痰、粪便和尿液，必须保持存在于体内的微生物的相对比例，否则培养结果可能是误导性的。如果适当地处理样本，则培养结果更易于解释，患者护理得到改善，并且成本被潜在地降低。

最近，对样本处理的指导方针加以重视以改变传统实践来减少或消除不必要的工作，提高实验室效率，并且使微生物测试更具成本效益。已有长期存在的医疗科学目标来开发快速且精确的程序用于感染性疾病的诊断，以便提高病例发现，减少诊断和治疗开始的时间，改善疾病监控，并且使较少的患者从诊断途径退出。肠道感染的实验室诊断特别有挑战性。问题包括潜在病原体的数目、这些有机体的生物多样性、新病原体的出现、一些病原体的间歇性脱落、从相同患者提交多个样本、在大多数临床环境中(特别是在门诊患者和远程设置中)不可实行新鲜样本的测试、以及样本运输至实验室用于培养和分子诊断测试的成本。

咳出的痰是最常收集的呼吸样本，该呼吸样本用于细菌培养以检测最常见的TB病原体，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)。因为呼吸道样本将包含“污染的”微生物，样本应当被迅速地收集和运输到实验室以避免非病原体的过度生长。传统上，收集和培养接种之间的延迟不应超过7天，并且样本应被冷冻直至它们可以被处理。迅速运输、处理和冷冻帮助防止分枝杆菌的死亡和样本中正常快速生长菌群的过度生长，否则其使病原体的回收和检测复杂化。当痰在室温下储存长于3天时，如果可行，处理过度生长或腐烂的样本导致(entail)另外的人工成本和培养灵敏度的降低(Parmasivan等人，1983)。除非样本是在极为谨慎下收集并且在适当的条件下被迅速地运输到实验室，否则培养的优点将不会充分实现。

适当的痰收集对于最佳结果是重要的。理想地，从新的患者中，三个样本(每个2-10mL)应在连续几天的清晨收集，并且应该被单独地处理。WHO推荐两个清晨样本和当患者访问诊所时的第三个现场样本。用于筛选TB病例的待检查样本的数量从三个减少到两个在具有高工作负荷和有限的人力资源的地方已经被接受，条件是实现了质量保证方案。

一旦被实验室接收，在涂片显微镜检查和培养之前，这些高度黏液状样本必须被液化和“去污”。疾病控制与预防中心(CDC)推荐的标准程序是N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)-氢氧化钠(NaOH)程序(肯特(PT Kent)和库比卡(GP Kubica)；公共卫生微生物学(Public Health Microbiology)，第三级实验室指南(Guide for the Level IIILaboratory)，CDC，实验室培训与咨询实验室(Laboratory of Laboratory Training andConsultation)，1985)。NALC液化黏液状样本，然而NaOH对于污染的/背景细菌是杀菌的，并且有助于液化。NaOH也杀死分枝杆菌，但是以小得多的程度。“涂片阳性的”病例被定义为具有至少两个初始痰涂片检查(直接涂片显微镜检查)对于抗酸杆菌(AFB+)呈阳性的患者。

活动性结核病的最后诊断依赖于来自患者分泌物、体液、或组织的致病微生物的回收和后续鉴定。由于当前的培养方法需要延长的时间来完成(长达42天)，患者的初始管理通常是基于所提交的临床样本的显微镜检查结果。具体地，在从临床痰样本制成的涂片中抗酸杆菌(AFB)的显示提供了分枝杆菌疾病的初步诊断，而在培养物上分枝杆菌的分离提供了由于除结核分枝杆菌(M.tuberculosis，MOTT杆菌)或非结核分枝杆菌(NMT)之外的分枝杆菌引起的结核病或类似疾病的明确诊断。虽然涂片显微镜检查是目前最广泛使用的筛选工具，关于这种程序的预测性价值存在大量的争论。据估计，显微镜检查可能错过三分之二的培养阳性病例(利普斯基(Lipsky)等人，1984)。其结果是，培养技术仍然在分枝杆菌疾病的诊断中起关键作用。

痰样本和标准处理方法(NALC/NaOH)两者的性质损害了MTB的检测(桑顿(Thornton)等人，1998)。首先，样本以及用于处理样本的溶液可以抑制核酸扩增。大多数样本含有大量的干扰培养方法的腐生和/或感染性微生物；因此，去污步骤是必要的。然而，已知去污显著地损害分枝杆菌的生存力(Burdz等人，2003；克拉斯诺(Krasnow)和韦恩(Wayne)，1966)，并且因此处理也降低了通过培养检测的灵敏度。第二，疾病的先天性质产生低拷贝数和仅生物体的间隙性脱落。第三个问题涉及分枝杆菌自身的固有生理性质，其包括i)聚集、聚丛和成捆；ii)由蜡质细胞壁引起的表面张力；iii)浮力(范围从0.79到1.07，平均值低于1)(Silverstolpe，1948)；(iv)缓慢生长；和iv)厚的细胞壁使得结核分枝杆菌难以裂解。连同痰的黏液状性质，这些特性使通过离心收集分枝杆菌复杂化，引起这些杆菌的低效沉降。不可避免地，一些杆菌在离心后与上清部分一起流出。由CDC批准的制备临床样本用于检测的所有方法都涉及离心步骤。净效应是，分枝杆菌在处理的沉积物中是如此稀有以至于一些等分试样没有目标杆菌，并且少数收集的微生物必须有效地裂解或必须是存活的以便与污染的细菌竞争。最后，MTB的低拷贝数需要大的样本体积，这进而要求浓缩-去污步骤。

若干组已经尝试发展保存痰样本的方法，这样样品可以在偏远地区被收集并且递送至较大的中心用于处理。霍尔兹(Holz)等人(2001)和波波夫(Popov)等人(2004)证明了样品在处理前可以被成功地冷冻长达10天。然而，运输冷冻样品是昂贵的，并且如果不能获得液氮，该方法在远程和农村地区可能不可行。凯利(Kelly)等人(2003)测试了更加成本有效的运输样品的方法，即，在处理之前在甲醛中固定。然而，这种方法需要样本处理方法的显著改变，增加了处理的成本，并且对于历史上“黄金”标准测试培养而言，MTB生物体不再是活的。类似地，多尔曼(Dorman)等人(2010)使用酒精(50％乙醇(以体积计))来保存诱发的痰样品；而且使得MTB对于培养不再可行。

仍然需要可以液化痰和保持MTB和其他顽强微生物的活力同时杀死背景菌群的收集方法和组合物。

提供以上信息是出于使得申请人认为已知的信息成为与本发明可能相关的目的。绝不意图承认，也不应该被解释为任何前述信息构成违反本发明的现有技术。

发明内容

本申请的一个目的是提供用于稳定和维持顽强微生物的生存力的组合物和方法。依照本申请的一个方面，提供了用于保存生物样品中有生存力的顽强细菌(例如分枝杆菌、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、艰难梭菌(Clostridium difficile)或酵母)的方法，该方法包括使生物样品与稳定组合物接触，其中稳定组合物包含螯合剂、变性剂、盐，并且具有约6至约11之间的pH。

依照本申请的另一个方面，提供了用于液化生物样品的方法，该方法包括使生物样品与稳定组合物接触，其中稳定组合物包含螯合剂、洗涤剂、盐，并且具有6至11之间的pH。

依照本申请的另一个方面，提供了用于稳定生物样品内微生物组的方法，该方法包括使生物样品与稳定组合物接触，其中该稳定组合物包含螯合剂、洗涤剂、盐，并且具有6至11之间的pH。

依照本申请的另一个方面，提供了用于表征生物样品中细菌核酸的方法，该方法包括：

使生物样品与稳定组合物接触，其中稳定组合物包含螯合剂、洗涤剂、盐，并且具有6至11之间的pH；以及

扩增样本中的核酸，其中扩增的核酸的水平保持基本上不变如果扩增步骤立即发生在收集之后或稍后。

依照本申请的另一个方面，提供了组合物，该组合物包括：螯合剂；洗涤剂；和有生存力的顽强微生物。

附图说明

为了更好地理解本发明连同它们的其他方面和进一步的特性，参考以下描述，其将与附图结合使用，其中：

图1是储存在室温下在BD2缓冲液中的痰的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析的凝胶照片；

图2是储存在室温下在BD3缓冲液中的痰的DGGE分析的凝胶照片；

图3是NaOH处理后储存在4℃下的痰的DGGE分析的凝胶照片；

图4图示地描绘了低、中和高TB负载的痰样品的实时PCR分析的结果；并且

图5图示地描绘了炭疽杆菌孢子在用样品运输化学(STC)处理后的生存力。

图6是来自人类唾液的结核分枝杆菌存在的t＝2天时间点的凝胶结果的照片。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如说明书和权利要求书中使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外清楚规定。

如本文使用的，术语“包含”将被理解为指以下列表是非详尽的，并且可以包括或可以不包括任何其他附加的适合项目，例如合适的进一步的特性(一个或多个)、组分(一个或多个)和/或成分(一个或多个)。

如本文使用的，术语“样品”将被理解为是指潜在地包含感兴趣的物质的任何样本，其可任选地是核酸、蛋白质或其他感兴趣的生物分子。术语“样品”可以包括溶液，例如水溶液、细胞、组织、活组织检查、粉末、固体、或它们的一个或多个的群体。样品可以是生物样品，如唾液、痰、口腔拭子样品、血清、血浆、血液、血沉棕黄层、咽、鼻/鼻咽部或鼻窦拭子或分泌物、咽喉拭子或刮屑、尿液、粘液、粪便、直肠拭子、病灶拭子、食糜、呕吐物、胃液、胰液、胃肠液、***/***、尿道拭子和分泌物、脑脊髓液、泌乳或月经产物、卵黄、羊水、房水、玻璃状液、宫颈分泌物或拭子、***液/分泌物/拭子或刮屑、骨髓样品和抽出物、胸膜液和流出物、汗液、脓汁、泪液、淋巴液、支气管或肺灌洗或抽出物、腹膜渗漏物、细胞培养物和细胞悬浮液、***、上皮、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉组织、胎盘组织、活组织检查、渗出液、器官组织、神经组织、毛发、皮肤、指甲、植物、植物提取物、藻类、土壤样品、环境样品、污水、废水、食品、肉类加工设备拭子或类似物。

如本文使用的，术语“微生物”将被理解为是指任何微观生物和孢子，包括所有的原核生物、即真细菌和古细菌、和各种形式的真核生物，包括原生动物、真菌(例如，酵母)、藻类、和动物(例如轮虫和真涡虫)。

如本文使用的，术语“顽强微生物”是指通常抵抗标准裂解或核酸提取技术的微生物和孢子，例如，分枝杆菌属(Mycobacterium)的一个或多个种，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合体的一个或多个种、结核分枝杆菌的MDR菌株、梭菌属(Clostridium)的一个或多个种、芽孢杆菌(Bacillus)(例如炭疽杆菌)的一个或多个种、以及具有顽强的细胞壁的其他微生物。

如本文使用的，术语“样品运输化学组合物”和“STC组合物”是指用于治疗和/或存储生物样品以维持顽强微生物的生存力的组合物，该顽强微生物可存在或可不存在于生物样品中。

本申请提供了用于稳定生物样品中的顽强微生物的组合物和方法。本发明的组合物和方法对于液化粘性生物样品和/或对于消除或最小化生物样品中背景细菌菌群在环境温度储存过程中的生长也有用。

样品运输化学

本发明的稳定组合物包含样品运输化学(“STC”)混合物，该STC混合物已被发现成功地在稳定储存样品中的顽强微生物(例如分枝杆菌)中发挥作用，使得顽强微生物在下游临床测试中保持有活力的。特别地，在STC组合物中储存的顽强微生物对于甚至在室温下储存之后在标准培养条件下培养是有活力的。已经发现这些顽强微生物在室温下在STC组合物中储存1天或更长、5天或更长、一周或更长之后对于稍后的培养仍然是有活力的。在一个实施方式中，STC组合物对于在室温下储存在生物样中有活力的顽强微生物约一周是有用的。在这个背景下，如果顽强细菌对于细菌培养仍然保持有活力，如通过在标准培养条件下顽强细菌的菌落形成单位的形成所确定的，则它被理解为是“稳定的”。

本申请的STC组合物是水性组合物，这些水性组合物包含螯合剂、变性剂和盐，并且具有约6至约11之间的pH。可选地，本申请的STC组合物包括螯合剂、变性剂、盐和，任选地，缓冲剂，该缓冲剂可以通过与水、水性溶液、或样品的混合重构使得最终混合物的pH是在约6至约11之间。

螯合剂是这样的任何化学制品，其将与某些金属离子形成稳定复合物，螯合这些离子使得它们不能正常与其他组分反应。螯合剂可以是例如，乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或它们的任意组合。在一个实施方式中，螯合剂是CDTA。

变性剂是可以引起蛋白质失去它们的天然二级和/或三级结构的任何化学制品。变性剂可以是，例如，阴离子洗涤剂(如，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂、月桂酰肌氨酸钠(SLS)、月桂醇聚醚硫酸钠(SLES))、阳离子洗涤剂(如，例如，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，其可以用于某些实施方式中)或非离子洗涤剂(如，例如，吐温(Tween)、曲拉通(Triton)X、或布里杰(Brij))。在一个实施例中，变性剂是SDS。

在一个实施方式中，STC组合物包含2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，并且具有pH 10.5。在可选的实施方式中，STC缓冲液包括4％SDS、50mM CDTA、250mMLiCl、140mM LiOH，并且具有pH 6.8。

STC组合物另外包括盐，其优选是无机盐。在一个实例中，盐是LiCl。在另一个实例中，盐可以是，例如，溴化锂、碘化锂、醋酸锂、或它们的任意组合。在又另一个实例中，盐可以是，例如，硼酸钠、溴化钠、碘化钠、碘酸钠、氯化钠、氟化钠、醋酸钠、磷酸钠、硫酸钠、或它们的任意组合。

STC组合物具有中性或碱性pH。在某些实施方式中，pH处于从6至11的范围，例如，STC组合物的pH可以是约6.8，或约10.5。为了保持该pH，组合物可以进一步包括缓冲剂，例如甘氨酸。可选地，使用酸或碱(例如LiOH)将组合物调节到合适的pH。

本申请进一步提供了这样的组合物，所述组合物包括STC组合物组分，如上面所定义的，和来自样品(例如生物样品)的有活力的顽强细菌。在某些实施方式中，顽强细菌是分枝杆菌，例如结核分枝杆菌、炭疽杆菌(任选地以孢子的形式)、或艰难梭菌。

运输和储存方法

本申请进一步提供了用于储存样品(例如生物样品)的方法。该方法对于存储生物样品尤其有用，使得它们以适合用于下游临床诊断测试的形式稳定。下游临床诊断测试可以是，例如，体外培养或分子诊断学，例如基于PCR的诊断或测序。然而，其它诊断测试可以应用于使用本发明的STC组合物稳定的样品。

本发明的存储方法包括使生物样品与一定量的STC组合物混合或接触的步骤。所得混合物可存储在室温或环境温度或在约4℃至约40℃范围内的温度下。可以改变与样品混合的STC的量以适应使用者的需要。例如，它可以基于样品类型和/或体积、下游分析的需求、方便性等而改变。在一个实施方式中，样品体积与STC组合物体积的比在从约5:1至约1:5的范围内。在具体的实施方式中，样品与等体积的STC组合物混合。

优选地，在样品收集的时间进行储存方法以避免分析前样品后期处理的需求。这样，最小化污染的可能性和/或对于专门的样本处理设备的需要。这可以通过，例如，在样品收集装置中提供STC组合物来实现。

本发明的发明人已经确定本发明的存储方法在稳定样品的微生物组中有用。具体地，STC组合物在抑制样品中的微生物生长中起作用，同时保持样品中顽强细菌有活力用于将来的培养。这样，研究人员或临床医生能够在样品收集后很好地分析样品，并且确定使用STC组合物存储的样品中的微生物组分和微生物的相对量。

因此，本申请进一步提供了用于稳定样品的微生物组的方法，该方法包括使样品与如上文所定义的一定量的STC组合物混合或接触的步骤。

使用STC组合物处理生物样品之后，样品可以使用如使用者要求的标准技术来运输、储存、或分析。在一个实施方式中，样品中的微生物核酸从样品中回收或分离。这可以使用标准技术来进行，或者它可以使用包括氧化剂和缓冲剂的组合物来进行，其中氧化剂是高碘酸、高碘酸盐或过硫酸盐(如在共同未决的美国临时申请号61/977,953中所描述的，其通过引用结合在此)。

高粘性样品的液化

本申请进一步提供了用于液化粘性的黏液状生物样品的方法。许多生物的、或身体的样品为粘性的。这可以为准确的诊断测试呈现重大的挑战，因为样品难以处理并且分析物、细菌等可能不均匀地分散在此类粘性样品中。因此，具有可以降低样品的黏度和改善样品内样品组分的分布均匀性的用于样品处理的方法特别有益。

诊断程序通常要求生物样品(如体液)的分析。特别地，基于核酸的诊断方法正变得越来越重要。然而，此类方法通常需要生物样品的初始处理，该初始处理可以是耗时的、费力的、并且与污染的风险相关。例如，结核病的诊断涉及高度粘性液体生物样品的分析，所述高度粘性液体生物样品例如痰、脓汁、胸膜液、胃抽吸物、气管内抽吸物、经气管抽吸物、支气管肺泡灌洗、喉拭子、和鼻咽拭子，其通常为不同化学和物理行为的许多不同组分的不均匀混合物。这可以为准确的诊断测试呈现重大的挑战，因为样品难以处理并且分析物、细菌等可能不均匀地分散在此类样品中。具有可以降低样品的黏度和改善样品内样品组分的分布均匀性的用于样品收集的方法将是有益的。

痰由可变量的糖蛋白(黏蛋白)、唾液、免疫细胞、宿主组织颗粒、释放的DNA、脂类、和来自裂解宿主组织的蛋白质组成。生物化学分析已经揭示由沿呼吸道排列的细胞分泌的黏蛋白MUC5AC和MUC5B是气道黏液的主要的凝胶形成聚合物组分。存在于这些黏蛋白上的半胱氨酸结构域有助于聚合物形成和可能通过二硫键与相邻黏蛋白链相互作用。某些痰可含有可变量的血液或残余食物颗粒作为污染物。这导致痰液组合物的非常广泛的样本与样本的差异，所述差异的范围一方面从均匀的至多相位的，另一方面从液体至高度粘性的。取决于个体患者的疾病状态，痰可能进一步包含炎性病原体，并且某些样品组分可以是极其显著的，例如，由于肺部炎症导致的血液污染或由于囊性纤维化或支气管炎患者广泛的DNA释放导致的升高黏度。

因为广泛的样本异质性，痰样品(例如从痰中分离用于诊断目的的DNA)的处理是相当有挑战性的。例如，如果炎性病原体被困在固体和粘性的环境中，它们的可及性和裂解可能较低效。

如本文所提到的，痰样品的分析对于疑似患有结核病的患者是标准的诊断程序。用于诊断的经典方法包括对于抗酸分枝杆菌在显微镜下检查痰涂片和对从痰中分离的培养分枝杆菌的微生物学分析，该微生物学分析是当前在结核病诊断中鉴定病原体和抗性的金标准。此外，已经开发一些分子测试。通常，所有这些旨在检测痰样品中分枝杆菌的诊断方法都需要使用酶(例如，蛋白酶、脂肪酶、DNA酶、或糖苷酶)、洗涤剂、离液剂、螯合剂和还原剂等的费力的样品处理来去污和液化。由于高感染风险，任何疑似结核病痰的处理都需要具有确认的层流和广泛保护措施的S3环境以排除任何人员暴露于活细菌。因此，对于分子测试，直接使用痰用于核酸诊断和规避处理密集去污和液化程序将是有利的。

本发明的发明人已经出人意料地发现，STC组合物在低得多的pH下在液化黏液状生物样品中起作用，而不是在NALC/NaOH中使用，从而提高诊断测试的准确度和/或轻松性，并且能够抽取多个一致的样本用于大量的诊断测试(如涂片显微镜检查、培养、和分子诊断学)。

在一方面，提供了液化样品(例如生物样本)的方法，所述方法包括使样品与一定量的STC组合物混合或接触的步骤。所得混合物可储存在环境温度或更低温度。可以改变与样品混合的STC的量以适应使用者的需要。例如，可以基于样品类型和/或体积、下游分析的需求、方便性等而改变。在一个实施方式中，样品体积与STC组合物体积的比在从约5:1至约1:5的范围内。在具体的实施方式中，样品与等体积的STC组合物混合。

优选地，在样本收集的时间进行液化样品的方法以避免分析前样品后期处理的需要。这样，最小化了污染的可能性和/或对于专门的样本处理设备的需要。这可以通过，例如，在样品收集装置中提供STC组合物来实现。

用于核酸检测的方法

如以上所提到的，分子诊断方法在被研究人员以及临床医生用于分析患者样品以鉴定潜在病原体是否存在的工具库(arsenal)中正变得更加重要。另外，当存在致病性生物体时，这些分子方法可以用于定量感染的程度。然而，分子诊断方法通常十分敏感，具有低水平病原体存在的样品可能难以精确地处理以鉴定或量化存在的病原体，特别是当病原体是顽强细菌和/或来自病原体的核酸不能有效地从样品释放或分离时。

本发明的发明人已经出人意料地发现STC组合物起作用以有效地释放核酸。发明人已经显示用STC组合物处理的样本具有足够数量可用的DNA在测试的第0天针对抗生素抗性标记进行测试。相比之下，标准治疗方法需要培养样品来产生足够的细菌培养以产生阳性结果。

因此，本申请提供了用于表征生物样品中的细菌核酸的方法，该方法包括使生物样品与稳定化组合物接触，其中稳定化组合物包含螯合剂、洗涤剂、盐，并且具有6和11之间的pH；以及扩增样品中的核酸，其中如果扩增步骤在收集后即刻或稍后发生，则扩增核酸的水平基本上保持不变，并且其中样品在扩增核酸之前不需要培养。

试剂盒

通过提供用于此类方法的试剂盒形式的STC组合物，方便地实施本发明的方法。此类试剂盒优选包含STC组合物作为干燥组分的混合物或作为水性混合物。

任选地，该试剂盒包括容器，其含有本发明的STC组合物，并适合用于样品收集。适合的容器的实例是描述于国际PCT申请号WO 03/104251和WO 07/068094中的那些，其各自通过引用并入本文。

为了对本文描述的发明获得更好的理解，提供了以下实施例。应当理解，这些实施例仅是出于说明的目的。因此，它们不应以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：储存在样本运输化学中掺入(spiked)结核分枝杆菌的痰的环境温度稳定性

在人类中TB的全球控制主要目标之一是结核分枝杆菌(TB的病原体)的实验室诊断，接着是适当的治疗。涉及痰样本的收集、运输、和处理的困难已经成为当前全球TB控制努力中的主要问题。结核分枝杆菌存在于痰样本中，该痰样本通常被其他快速生长的微生物群落污染。某些临床相关较小的种在环境温度下的快速生长可以杀死或长得超过医学上重要的病原体。因此，样本运输至实验室或者进行处理的专门人才或基础设施的可用性的耽搁是有问题的。

在高负担国家、痰抗酸杆菌(AFB)显微镜检查服务在许多医疗保健设施中不可用，这会迫使相当大比例的肺TB患者行进长距离以利用诊断设施(塞尔文(Selvam)等人，2007)。这种基础设施的缺乏导致许多治疗期间的患者的损失，并且意味着传染性患者在他们的社区内外传播传染病。为了防止这个，例如，印度基于DOTS的改进的国家结核病控制计划(RNTCP)，推荐痰样本至显微镜检查中心的运输。然而，这种服务的组织因为几个原因而存在困难，包括需要运输高度传染性痰样品的事实。而且，样本转移到一个集中的实验室设施可能有些不稳定，并且可能影响微生物的产率和完整性。

样本完整性的快速损失也对国际传染性疾病研究合作，以及偏远地区的病原体研究两者呈现显著阻碍。将诊断标本从偏远地区转移到更专业的实验室并确保诊断准确度非常困难；考虑到国际运输期间的延迟和温度波动的可能性，这是特别相关的。在临床诊断学中需要可靠的方法用于储存和运输痰和其他生物样品，使得甚至在重大的储存和运输之后病原体可被鉴定或定量。

在发达国家，痰样品在4℃下运输到实验室，这显著增加了总的成本。在许多发展中国家，部分地归因于成本和基础设施的缺乏，痰样本典型地在环境温度下被运输到实验室(即，不冷链保持)。已知在室温下储存痰样本多于3天甚至导致培养活力的显著损失并增加污染率(Paramasivan等人，1983)。不幸的是，由开始的显微镜诊断制成的初始误差可能直到数周之后才被知晓，当临床指征更明显时(假阴性)。结果，若干组已经尝试开发保持痰样品的方法，以将它们发送到较大中心用于处理。霍尔兹(Holz)等人(2001)和波波夫(Popov)等人(2004)证明了样品在处理前可被成功地冷冻储存长达10天。凯利(Kelly)等人(2003)和多尔曼(Dorman)等人(2010)提出在处理前将痰分别在甲醛和乙醇中固定。然而，所有这些保存方法都可能影响分枝杆菌的生存力、影响它们在培养基中随后的生长和检测。

本发明人已经开发了化学收集或运输组合物，该化学收集或运输组合物出人意料地使在复杂痰样本中坚韧的微生物在运输和储存期间稳定，同时保持分枝杆菌的活力用于利用涂片显微镜检查、培养、和实时或定量PCR(qPCR)的诊断。有利的是，本发明的运输组合物在与痰接触时杀死大部分背景微生物。在此实施例中，掺入减毒结核分枝杆菌的痰样品与痰运输化学(STC)组合物混合，并且在培养、DNA提取和qPCR之前被储存在典型的温度环境下(35℃、室温、和4℃)长达30天。

实验方法

对于本实施例，来自健康的TB阴性患者的冷冻的原始痰样品由创新诊断基金会(FIND)结核病标本库惠赠。使用培养和涂片分析，FIND将患者样品分类为‘涂片阴性、培养阴性。’

掺入结核分枝杆菌的生物样品的制备

被确认为TB阴性的原始痰样品从FIND冷冻运送。痰样品在冰上慢慢解冻并且合并形成两个8mL样品。为了安全地模拟结核病阳性痰，将适度浓度的减毒结核分枝杆菌H37Ra(aMTB)以5×10⁶菌落形成单位/毫升(cfu/mL)掺入痰中。将一个8mL合并的掺过的样品分成相等的三个小部分，每个小部分与等体积的BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)或样品运输化学(STC)混合，然后这些小部分保持在4℃、35℃或室温长达30天。第二个8mL合并的掺过的样品没有被处理，即，保持纯净的，分成相等的三个小部分，然后保持在4℃、35℃或室温，持续长达30天。

在指定的时间点(T＝0天、7天、14天和30天)，从储存在不同温度下的小部分取出等分试样。将等分试样用于接种培养物，或利用3种不同的方法(高碘酸盐、异硫氰酸胍、珠粒-打浆(bead-beating))从等分试样中提取DNA，并且使用qPCR和分枝杆菌特异性引物对提取的DNA进行定量。在培养和qPCR之前，所有掺有aMTB的小部分都储存在35℃、4℃和室温(RT)下7天、14天、和30天。

用于掺有MTB的痰小部分的培养条件

在每个时间点，从每个小部分中分离等分试样(400μL)用于培养。

对于BD2缓冲液处理的小部分，400μL等分试样在5,000rpm下离心20分钟以沉淀细菌。弃去上清并且将沉淀重悬于400μL无菌PBS，并且涡旋直至充分混合。

对于未处理的(NT)小部分，400μL等分试样与200μL新鲜NaOH(2％)-NALC(0.5％)-柠檬酸盐(1.45％)混合，并且在室温下温育15分钟。将600μL无菌PBS加至每个管并且在5,000rpm下离心20分钟。弃去上清并且将沉淀重悬于400μL无菌PBS，并且涡旋直至充分混合。

对于BD2缓冲液处理的和未处理的小部分，然后使用扩展平板法将100μL重新悬浮的细菌直接涂板在三个LB板上，并且在37℃温育。在大约第4天，对菌落的数量进行计数。

使用高碘酸盐方法从掺有aMTB的BD2缓冲液处理的痰中提取DNA

1.在每个指定的时间和温度(第0、7、14、和30天在35℃、4℃和RT)下，将来自BD2缓冲液处理的小部分的400μL等分试样转移至新管，并且在5,000rpm下离心20分钟以沉淀细菌。

2.弃去上清并且将沉淀物重悬于400μL BD2缓冲液。

3.将(间)高碘酸钠加至15mM的终浓度，涡旋混合。

4.将混合物在70℃水浴中温育20分钟。

5.将样品在室温冷却2分钟。

6.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

7.将混合物在室温下温育10分钟。

8.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM的终浓度，涡旋混合。

9.将混合物在冰上温育10分钟，然后在13,000rpm下离心5分钟。

10.将上清转移到干净的、标记的管并且丢弃沉淀。

11.将两体积的室温95％乙醇加到管中的上清，并且将管倒置20次混合。

12.将混合物在室温下温育10分钟以沉淀DNA，然后在15,000rpm下离心2分钟以沉淀DNA。

13.轻轻取出并丢弃上清，小心不要打乱沉淀。

14.将沉淀溶于200μL TE(将混合物短暂地涡旋以充分重悬DNA)。

使用异硫氰酸胍方法从掺有aMTB的NT痰中提取DNA

1.新鲜制备并高压灭菌4％氢氧化钠(NaOH)溶液。

2.新鲜制备和高压灭菌2.9％柠檬酸钠溶液。

3.将等体积的NaOH和柠檬酸钠溶液混合，并且添加N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)粉末以实现0.5％的终浓度；将溶液充分混合并且在同一天使用。

4.在每个指定的时间和温度(第0、7、14、和30天在35℃、4℃和RT)下，将来自NT小部分的400μL等分试样转移至新管，并且添加200μL新鲜的NaOH-NALC-柠檬酸盐；将管充分涡旋混合。

5.在添加600μL无菌PBS之前，将混合物在室温下温育15分钟，并且在5,000rpm下离心20分钟以沉淀细菌。

6.丢弃上清并将400μL无菌PBS添加至沉淀；将管涡旋混合。

7.将混合物在5,000rpm下离心20分钟以重新沉淀细菌。

8.弃去上清并且将沉淀物重悬于400μL无菌PBS。

9.向200μL重悬的沉淀添加1mL DNAzol试剂(异硫氰酸胍-洗涤剂裂解溶液，目录号10503-027，生命技术公司(Life Technologies))，并将混合物上下移液以裂解细胞；然后添加0.5mL的100％乙醇，并将管颠倒10次以混合。

10.将混合物在室温下温育3分钟，然后在14,000rpm下离心2分钟以沉淀DNA。

11.将DNA沉淀用1mL的75％乙醇洗涤两次。

12.除去所有痕量的乙醇，并将DNA沉淀溶解于200μL的8mM NaOH。

使用“珠粒打浆”方法(“标准治疗”)从掺有MTB的NT痰中提取DNA

1.在每个指定的时间和温度(第0、7、14、和30天在35℃、4℃和RT)下，将400μL等分试样从NT小部分转移至新管，并添加200μL新鲜的NaOH-NALC-柠檬酸盐；将管充分涡旋混合。

2.在添加600μL无菌PBS之前，将混合物在室温下温育15分钟，并且在5,000rpm下离心20分钟以沉淀细菌。

3.丢弃上清并将400μL无菌PBS添加至沉淀；将管涡旋混合。

4.将混合物在5,000rpm下离心20分钟以重新沉淀细菌。

5.弃去上清并且将沉淀物重悬于400μL无菌PBS。

6.将200μL的重悬细菌在80℃下加热1-2小时。

7.将200mg的105-150微米的玻璃珠粒加到加热的细菌混合物。

8.将含有玻璃珠粒的混合物剧烈摇晃2个周期，每个周期1分钟，各自使用微型珠粒打浆机^TM(Mini-BeadBeater)(BioSpec产品公司)；每个周期之后在冰上1分钟。

9.在PCR之前，将混合物在95℃下加热2分钟。

rtPCR条件

在这个实施例中，使从掺有aMTB的痰等分试样中分离的DNA经受对分枝杆菌特异的rtPCR试验(qPCR)，RD4 Taqman实时PCR测定。针对RD4的引物如下：RD4-正向5’-CCA CGACTA TGA CTA GGA CAG CAA-3’和RD4-反向5’-AAG AAC TAT CAA TCG GGC AAG ATC-3’(哈尔斯(Halse)等人(2011))。小于37的阈值循环(Ct)值报道为阳性，并且值大于37的样本被重测；如果结果是相同的，结果被报告为阴性，并且如果它们不同，它们被报告为不确定的。

结果与讨论

通常，在标准治疗(SOC)情景中，痰样本在收集和运输到实验室期间保持未处理(NT)。在实验室接收后，添加NALC-NaOH-柠檬酸盐使痰经受液化和去污，紧接着进行培养。本实施例证明在保持在室温和4℃下长达30天的未处理痰中减毒MTB在一定程度上保持有活力，但当保持在35℃时不会，因为随后的培养显示无生长(NG)(表1)。

当实施本申请中所述的方法时，理想地将痰样本在收集点与样品运输化学(如BD2缓冲液)混合，并在整个运输和储存期间保持在这种状态，直到在实验室被处理。在任何时候都不应用NALC-NaOH-柠檬酸盐处理。与NT痰相似，本实施例证明aMTB在室温和4℃下在单独的STC中至少30天保持有活力(表1)。STC和NT两种方法在35℃下都不支持aMTB存活7至30天。已经令人惊讶地发现，可以在收集点(T＝0)将STC添加到痰中，以便在背景菌群有机会超过样本之前立即液化样本并消除或最小化背景菌群的生长，而不会负面地影响目标分枝杆菌(如果存在)生存力持续至少30天。

表1.在培养中分枝杆菌的生存力

在35℃、4℃和室温下收集和储存于STC中长达30天的掺有aMTB的痰样本中，实时PCR显示随后提取的aMTB DNA的浓度保持稳定，无论储存温度和时间(参见表2)。与使用珠粒打浆的热和物理破坏aMTB相比，发现高碘酸盐处理在从减毒分枝杆菌中释放功能性qPCR-质量的DNA方面同样有效。相比之下，使用DNAzol(异硫氰酸胍-洗涤剂)处理的提取证明比高碘酸盐或珠粒打浆方法对于释放DNA的有效性显著更低。值得注意的是，与结合DANAzol处理的SOC方法相比，STC与高碘酸盐组合使得分枝杆菌特异性测定的灵敏度增加1log(3+C_t值)。因此，标准NALC-NaOH-柠檬酸盐实验室程序，接着机械的珠粒打浆，可以成功地被STC接着在实验室处理样本期间的高碘酸盐处理替代。重要的是，STC可以在收集点与痰混合，以控制背景菌群而不负面影响分枝杆菌的生存力。

表2.从STC处理和SOC处理的、掺有aMTB的痰中提取的DNA的qPCR。

实例2：接触时样品运输化学液化痰

来自人的痰被用于诊断结核病并检测囊性纤维化患者中的感染。细菌不是均匀分布在此类高度粘性的样本中，这对典型地用于鉴定分枝杆菌的抗酸染色造成问题。引人注目地，已经发现用于诊断结核病的这种技术仅具有约50％的灵敏度，即，当患者实际上患有疾病时，检测到TB的存在与检测不到有相等的机会。这种灵敏度的缺乏是由于现有样品制备方案不能产生细菌均匀分布的样品，使得从样品的任何部分获得用于染色的分枝杆菌存在相等的概率。因此，痰样本的液化和均质化对于确保准确、有代表性的痰培养和分子诊断学是至关重要的。

液化通过黏度的降低容易移取样品的能力以及致密团块的完全丧失来确定。先前已经使用多种黏液溶解剂来液化痰样本，包括，例如胰酶、胰酶-胰蛋白酶、和2-乙基己基硫酸钠(Tergemist)、淀粉酶、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)、和二硫苏糖醇(DTT，Sputolysin)(哈默施拉格(Hammerschlag)等人，1980)。NALC是更常见的液化剂之一，在体外对大多数囊性纤维化(CF)患者的痰中的主要病原体，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有相当可观的抑制活性。并且，通过这些黏液溶解剂从黏液不完全地释放的细胞倾向于染成暗黑色，使得正确鉴定困难。

令人惊奇的是，在处理黏液状痰样品期间，本发明人观察到单独的STC(BD2缓冲液：2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)足以用于痰液化。不需要还原剂，例如NALC或DTT，并且液化程度比得上使用当前的治疗标准(3.5％氢氧化钠(NaOH)处理方法)获得的液化程度。与NaOH-NALC-柠檬酸盐不同，其需要每12至24小时更新一次，BD2缓冲液在室温下稳定数月。通过使用荧光染料和荧光方法以及对16S rRNA基因特异的引物的qPCR分析DNA产率的高技术重复来确认液化的目视观测。

材料与方法

在这个实施例中，将来自健康供体的2mL痰进行合并并涡旋。添加等体积的BD2缓冲液，通过倒置进行混合，并在室温下温育15分钟。在这一点上，痰被完全液化。为了提取核酸，使用蛋白酶K(160μg)处理痰并在50℃下温育2小时。此温育之后，10x 200μL等分试样被移到新管作为高技术重复。向每个200μL等分试样添加10μL的3M醋酸钾(终浓度150mM)，并且将管在冰上保持10分钟。在13,000rpm下离心5分钟后，将上清转移到新管。用2体积的室温95％乙醇来沉淀DNA。在室温下15分钟后，在2分钟离心步骤中在13,000rpm下沉淀DNA。将DNA沉淀溶解在100μL的TE缓冲液(pH 7.1)中。

DNA浓度的荧光测定

使用荧光染料(200×；英杰公司(Invitrogen)，目录号P7581)对来自10个纯化样品的DNA进行定量；使用λDNA(英杰公司，目录号25250-010)产生标准曲线。是使低于纳克量的双链DNA(dsDNA)的灵敏定量成为可能的荧光双链DNA结合染料(485nm激发/535nm发射)。在黑色平底96孔微板(Greiner Bio-One公司，目录号655209)中处理每个纯化样品的等分试样和λDNA标准品，并使用Infinite M200酶标仪(TECAN公司)测量荧光。

rtPCR条件

使从10个痰等分试样提取的DNA经受对16S rRNA基因特异的rtPCR测定(qPCR)。针对16S rRNA基因的引物如下：BacrRNA173-F 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’和BacrRNA173-R5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’。每个PCR反应包括2μL模板、2.5μL的1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、2.5μL的10×PCR缓冲液、1.25μL的50mM MgCl₂、0.5μL的10mM dNTPs、0.5μL的10pMol正向引物、0.5μL的10pMol反向引物、0.5μL的0.5μM Syto 9、0.2μL的5U/μL Taq聚合酶、12.3μL的水。来自大肠杆菌的高度纯化的DNA用作PCR分析的参考。阴性对照包括在其中没有添加模板DNA的反应。C_t值是指在扩增曲线穿过检测阈值的点的部分循环数。转子基因(Rotorgene)仪器软件设定阈值线，并且计算各样本的Ct值。Ct值与样本中的DNA量成反比；一个Ct值的减小对应于检测出的DNA的量加倍。

结果与结论

表3.来自痰的高技术复制DNA产率。

痰黏度的完全降低对于减少取样误差和增加培养的准确度是至关重要的。实验已显示，痰通过本化学以5:1至1:5(痰:STC)的比率被液化。

本实例证明高度粘性的痰通过使用等体积的STC进行单一的15分钟的室温处理而被完全液化。从STC处理的痰中抽出和分析的每个等分试样在总DNA浓度上基本上相同，如通过PicoGreen荧光方法所显示的(表3)。这意味着存在均匀分布的DNA(来自任何来源)均匀地分布在整个样品，它指示了液化。而且，使用细菌特异性引物的qPCR表明每个技术复制包含相同量的细菌DNA。因此，短暂暴露于STC足以均匀地将内源性细菌分配在整个样本中。

本实例证明STC可在痰收集地点大致与样本混合以在收集时产生液化的样品。然而，在处理(例如，抗酸染色法)或培养之前，STC还可以在实验室中被添加到样本以在测试时提供液化的样品。

本文的结果进一步证明STC组合物和本文所述的方法不损害测试的完整性，同时仍然确保在现场实施所必需的速度和准确度。这种简单、快速、廉价的痰样品处理方法可以使更多分枝杆菌(当存在时)可用/可接近，用于资源富有和贫乏设置中的各种检测方法，防止疾病的进一步传播。

实例3：在使用涂片显微镜检查、培养和分子诊断学测定的结核病诊断中样本运输化学的兼容性

在全球，约20亿人感染有潜在高度传染性结核分枝杆菌(“MTB”)。每年几乎900万人发展活动性疾病，且200万人死于疾病。考虑到MTB的传染性质，快速和准确诊断是MTB治疗和疾病控制的重要要素。

四种常见的用于抗结核病疗法的一线药物是异烟肼(INH)、利福平(RIF)、乙胺丁醇(EMB)、和吡嗪酰胺(PZA)。然而，MTB菌株可以变得耐一种或多种药物，使得治愈难以实现。RIF耐药性是最常见于多重耐药(MDR-TB)菌株，并且在此类分离物中具有大于95％的报导频率(莫里斯(Morris)等人，1995)。MDR-TB被定义为由至少耐INH和RIF的细菌菌株引起的结核疾病。对RIF或其他一线药物的耐性通常指示需要充分的药敏试验。

在此实施例中，可以得到人类TB-阳性痰样本的独立的诊断实验室，全印度医学科学研究所(All India Institute of Medical Sciences)(AIIMS，新德里，印度)对当前用于诊断来自痰的结核分枝杆菌的金标准方法与将原始痰样品收集到样品运输化学(STC)的本发明并列地进行比较。用于诊断分枝杆菌感染的测试包括1)涂片显微镜检查、2)MGIT培养、3)Cepheid(基于PCR的结核分枝杆菌检测和利福平(RIF)耐性)、和4)实验室开发的多重PCR(LDMP)测定(戈皮纳特(Gopinath)和辛格(Singh)，2009)。

与Cepheid GeneXpert***一起使用的Xpert MTB/RIF测定是半定量的巢式实时PCR体外诊断测试，用于检测1)从抗酸杆菌(AFB)涂片阳性或阴性的诱导或咳出痰中制备的痰样品或浓缩沉积物中的结核分枝杆菌复合DNA；和2)来自处于利福平耐药风险的患者的样品中rpoB基因的利福平耐药性相关突变。

实验方法

原始痰样本的处理和四种诊断测试

从确认的TB或活动性感染MTB的高度可能性的六位患者收集原始痰样品。在通过培养、AFB涂片和两种分子诊断测定进行评估之前，样本(≥4mL)通过移液管手动分成2个部分(每个2mL)，并且使用相等体积的新鲜制备的4％NaOH/0.5％NALC(金标准)或STC(BD2缓冲液，由2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸构成，pH 10.5)进行处理。

在添加NaOH/NALC或者STC之后，每个部分如下处理：

1.涡旋混合物10-15秒。

2.允许混合物在室温下静置15分钟；对于高度粘性的样品静置20-25分钟。

3.用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)将管装满至50mL刻度，然后，在3,000-3,500RCF下离心15分钟之前，倒置几次以充分混合。

4.将上清小心倒出，并将沉淀再重悬于1.25mL无菌磷酸盐缓冲液，将其等分如下：

a.等分试样1：300μL

i.添加300μL无菌磷酸盐缓冲液(600μL总体积)。

ii.抗酸杆菌(AFB)涂片检查(100μL)

1.根据建立的实验室方案进行涂片。在痰去污之前进行涂片(直接涂片)和在用NaOH/NALC或STC去污之后进行涂片(DC涂片)。涂片得分：1+表示低阳性样品，2+表示中阳性样品，3+表示高阳性样品。

iii.BACTEC ^TM MGIT-960培养(500μL)

1.在生物安全柜类型2中，在无菌条件下接种到BACTEC^TM MGIT管。

2.在BACTEC^TM MGIT-960***中加载接种的MGIT-960管，以荧光单位持续监测生长达42天，并且在达到截止增长后管闪现阳性。没有报道MGIT培养的状态。

b.等分试样2：250μL

i.添加250μL无菌磷酸盐缓冲液(500μL总体积)。

ii.实验室开发的多重PCR(LDMP)测定

1.遵循AIIMS方案纯化DNA用于通过LDMP测定的分析(戈皮纳特(Gopinath)和辛格(Singh)，2009)。

2.简言之，用溶菌酶裂解细胞壁，接着是蛋白酶K消化和十二烷基硫酸钠处理蛋白质。

3.NaCl和十六烷基三甲基溴化铵用于沉淀蛋白质和大分子。

4.在用氯仿和异戊醇萃取后从水相中回收核酸。

5.用异丙醇在-20℃下沉淀DNA过夜。

6.用乙醇洗涤沉淀并用50μL TE缓冲液重构；10μL用于多重PCR。

7.在多重PCR(戈皮纳特(Gopinath)和辛格(Singh)，2009)中，使用了三个引物组，包括分枝杆菌属特异性引物(hsp65)(Telenti等人，1993)、鸟分枝杆菌(M.Avium)复合物(MAC)特异性引物(帕克(Park)等人，2000)和靶向cfp 10或esat的新型结核分枝杆菌(MTB)复合物特异性引物组(戈皮纳特和辛格，2009)。

c.等分试样3：300μL

i.添加300μL无菌磷酸盐缓冲液(600μL总体积)。

ii.Cepheid Xpert MTB/RIF测定

1.添加1.8mL Cepheid SR缓冲液(1:3比例)。

2.根据CepheidMTB/RIF测定对痰沉淀物进行测试(方案H.1)。

3.GeneXpert实时PCR给出了2个结果：1)结核分枝杆菌阳性/阴性，和2)利福平(RIF)抗生素敏感性或耐药性(Sens/Res)(表4)。

d.等分试样4：250μL

i.将250μL样品转移到2mL离心管中。

ii.添加250μL STC(500μL总体积)。

iii.用于STC处理的样品的DNA提取方案：

1.添加(偏)高碘酸钠至30mM的终浓度；涡旋混合。

2.在70℃下温育20分钟；冷却样品至室温。

3.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM终浓度；涡旋混合。

4.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM终浓度；涡旋混合。

5.在冰上温育10分钟。

6.以13000rpm离心5分钟。

7.将上清转移到干净的标记的管。丢弃沉淀。

8.添加2体积的室温95％乙醇。

9.反转20次混合。

10.在室温下温育样品15分钟。

11.以15,000rpm离心2分钟以沉淀DNA。

12.轻轻取出并丢弃上清，小心不要打乱沉淀。

13.将沉淀溶于100μL TE。

14.短暂地涡旋并且在室温下静置至少30分钟。

15.在室温或-20℃下存储纯化的DNA。

结果与结论

痰标本短暂暴露于STC成功地液化和去污来自所有6位测试患者(表4)的样本，其水平大致相当于使用NaOH/NALC处理获得的水平。在用NaOH/NALC或STC去污之后，随后接种的培养物没有显示污染的迹象，表明STC在杀死临床样本中的背景微生物群方面同样有效。

涂片分析产生出相同的诊断结果(1+至3+)，与去污方法无关(表4)，表明STC不改变分枝杆菌的抗酸染色特性。因此，使用直接收集到STC中的痰样本，可以容易地应用通过显微镜检查来检测分枝杆菌的标准实验室操作。

在用NaOH/NALC或STC液化和去污痰液之后，从所有6位患者样品中培养分枝杆菌。STC不会不利地影响培养中的分枝杆菌的生存力，并且获得的结果比得上使用常规NaOH/NALC处理获得的结果(表4)。

对于NaOH/NALC和STC处理的患者样品，分子诊断测试结果也是等效的。使用Cepheid***的巢式(nested)实时PCR分析表明，所有6位患者对结核分枝杆菌呈阳性，对利福平敏感(表4)。AIIMS实验室开发的多重PCR分析证实，6位患者事实上在属和种水平上对结核分枝杆菌呈阳性，以及对鸟分枝杆菌复合物呈阴性(表4)。STC处理的痰样品也与AIIMS建立的TB测试算法兼容，该AIIMS建立的TB测试算法是使用标准氯仿/异戊醇纯化方法从样本中回收核酸的LDMP测定。

本实例表明，用STC液化和去污的原始痰样本可以成功地用于标准诊断方法中用于检测和表征分枝杆菌感染，使用全套的当前方法，包括培养、抗酸杆菌(AFB)的显微镜鉴定和分子诊断测试。这些STC处理的样品还可以在用于病因学分枝杆菌种的基于PCR的测试中使用，以便给予适当的治疗和为了更好的患者管理。

表4.对结核分枝杆菌的培养、AFB涂片和分子诊断测定结果

实例4：痰微生物组在样品运输化学中是稳定的

在本实施例中，样品运输化学(STC)组合物与原始、合并的痰(无TB)混合，以评估痰的液化和去污以及在室温下延长储存的內源微生物组的稳定性。在标准痰去污/液化程序中作为对氢氧化钠的工业标准使用的控制，痰在用氢氧化钠短暂处理之后也长期储存。

实验方法

痰样本的处理

将三个TB-阴性的痰样本(由FIND结核病样本库惠赠)合并，并且均匀地分成三个1mL等分试样。将等体积的BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH10.5)、BD3缓冲液(4％SDS、50mM CDTA、250mM LiCl、140mM LiOH，pH 6.8)和氢氧化钠(NaOH，3.5％)添加到三个痰液等分试样并混合。在室温下15分钟内，将所有三种混合物同样地液化，其中液化通过黏度降低、容易地用移液管吸取样品的能力和致密团块的完全丧失来定性地确定。

NaOH处理的等分试样通过离心(3,000rpm，15分钟)沉淀，丢弃上清，并且将沉淀再溶于PBS且储存在4℃下长达28天。在生物安全柜中，将BD2和BD3处理的痰样品保持在室温(15℃-25℃)长达28天。

DNA纯化

1.在处理(上文)后第0、1、7、21和28天，将来自每一个混合物的200μL等分试样合并用于纯化DNA。

2.将81mg蛋白酶K添加到每个等分试样并在50℃下温育过夜。

3.将这些等分试样中的每一个分成两个100μL等分试样，一个用于包括(偏)高碘酸钠(NPI)的提取和另一个没有NPI。

4.向+NPI等分试样添加NPI至15mM的终浓度，在70℃下温育20分钟，并且在室温下冷却。

5.向所有样品添加1M Tris pH 7.1至100mM的终浓度；在室温下温育5分钟。

6.向所有样品添加3M醋酸钾至150mM的终浓度。

7.在冰上温育10分钟。

8.在13,200rpm下离心5分钟；将上清转移至新鲜的管并弃去沉淀。

9.添加2体积的室温95％乙醇至上清。

10.在室温下温育15分钟。

11.在13,200rpm下离心2分钟；丢弃上清。

12.将DNA沉淀重悬于50μL TE缓冲液(pH 7.1)。

变性梯度凝胶电泳

为了精确地和可再现地评估本发明组合物中的痰微生物组的稳定性，利用了相对新的称为变性梯度凝胶电泳(DGGE)的方法。该方法基于如下思想：如果采用细菌16S rRNA基因的可变区(在这种情况下为V3区)并使用PCR和侧翼保守区上的引物扩增它，那么扩增子将具有细菌种独特的熔点(甚至单个核苷酸差异将影响熔化，从而给出不同的曲线(profile，特征))。

当将此方法应用于含有多个细菌种的样品时，使用保守引物的扩增将产生扩增子阵列，所有这些都具有大致相同的长度，但在非保守区域具有不同的核苷酸组成。接下来，这些扩增子在含有变性溶液(尿素和甲酰胺)梯度的凝胶上运行。扩增子将在凝胶的不同阶段上变性，取决于它们的核苷酸组成，从而给出样品中存在的所有种类的分辨率。

为了使DNA扩增子不变性成单链形式，将约30核苷酸的CG夹添加到正向引物，一旦可变区段已变性，该CG夹将阻碍扩增子在凝胶上迁移。通常，凝胶上40％-60％变性梯度提供条良好的带分辨率，同时捕获大多数痰种类。凝胶在恒定的55℃下运行以促进扩增子的变性，并且在整个运行过程中保持凝胶在相同的温度。

根据下述方法进行PCR-DGGE。

DGGE的PCR扩增(使用在正向引物上具有5’夹的16S引物)

a.将2μL的10ng/μL纯化的DNA添加到12-条PCR管中。

b.制备预混物(Master Mix)(98μL/反应)：76.7μL水、10μL10×PCR缓冲液、4μL50mM MgCl₂、2.5μL 10mM dNTPs、2μL 10pmol反向引物(PPUN518R，5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')、2μL 10pmol正向引物(PRBA338F，5'-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')、和0.8μL 5U/μLTaq。

c.将98μL预混物添加至每个管中。

d.PCR在常规PCR机上进行：1个循环，在92℃2分钟；28个循环，在92℃60秒，在55℃30秒，在72℃60秒；接着1个循环，在72℃下6分钟。

PCR扩增子的DGGE

a.制备储备液用于在40％和60％变性溶液中的8％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶：

b.根据DCode***(伯乐公司(Bio-Rad))的说明书组装玻璃板和间隔。

c.为了使用40％和60％变性溶液制备和倾注具有平行梯度的8％丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶，使用以下程序：

●将20mL的40％和60％变性溶液分别测量到标记为“低密度”和“高密度”的2个单独的烧杯中。

●向每种溶液中加入200μL的10％过硫酸铵(APS)。

●向每种溶液中加入20μL TEMED。

●通过漩涡将溶液充分混合。

●将每种溶液填充进单独的20mL注射器中。

●将注射器附接到指明“低密度”或“高密度”的凝胶加载设备用于顶部填充。

●注：对于具有1.0mm间隔的16×16cm凝胶，体积调节设置为18.5mL。

●Y型管子被附接到每个注射器上，针头被附接到管子的另一端。

●将针头放置在玻璃板之间。

●通过旋转轮缓慢且一致地倾注凝胶使得梯度有时间均匀。

●允许凝胶聚合几个小时。

d.凝胶运行***统用1×TAE缓冲液预热至55℃。

e.将8μL的Fermentas 6×加载染料添加至42μL的PCR产物。

f.在开启再循环泵之前，使凝胶在200V下运行5分钟以便使样品从孔出来并进入凝胶。

g.在再循环泵开启的状态，使凝胶在70V下运行14小时。

h.使凝胶在1×荧光金染料(Sybr Gold)中染色30分钟(250mL1×TAE+25μL 10,000×Sybr Gold)。

i.使凝胶在1×TAE中脱色5分钟。

j.在UV光下拍照。

使用通用引物进行16S rRNA基因PCR(V3区域)，接着是使用DCode通用突变检测***(伯乐公司(Bio-Rad))的DGGE。

结果与结论

类似于标准NaOH处理，在室温下快速液化与本发明STC组合物(BD2和BD3缓冲液)混合的痰。通过目视检查和处理，混合物的黏度降低，容易用移液管吸取，并且没有留下致密团块。然而，与限制在短暂的15-20分钟以避免杀死分枝杆菌的NaOH处理不同，可以将痰在室温下收集并储存在STC组合物中数天和数周而不负面影响培养分枝杆菌的能力(参见实例1和5)。

在第0天，细菌16S rRNA基因的DGGE分析代表了存在于在收集地点合并的痰样品中的微生物组或不同的细菌群体(图1-3)。在28天的历程中，由BD2(图1)/BD3(图2)处理或NaOH(图3)处理的痰产生的带型保持基本上稳定，表明这些混合物在分别室温和4℃下是抑制细菌的。对于BD2/BD3处理的痰，无论纯化方法(+/-NPI)如何，随时间没有新的条带出现，并且条带强度保持恒定。

来自BD2和BD3处理的痰的细菌16S rRNA基因条带的数目非常相似，表明STC组合物的两个实例在改时间段期间以相似的程度保存细菌或细菌DNA(图1和2)。有趣的是，由NaOH处理的痰(图3)产生的DGGE带型与BD2/BD3处理的痰不同。由NaOH处理的痰产生的16SrRNA基因条带较少，表明细菌种类的多样性降低。另外，在NaOH处理后使用NPI的DNA纯化，注意到有条带强度的微小差异。看来DNA在与NaOH处理和随后在PBS中储存的变性条件下降解，或者DNA纯化的条件不是理想的。

实例5：从用STC处理长达一周的痰中回收活的结核分枝杆菌

●已经发现痰运输化学(STC)组合物成功地液化痰，去污背景菌群和稳定样本中的总核酸，而不杀死存在于样本中的分枝杆菌。本发明的STC组合物和方法的这些有益特性为测试实验室提供了灵活性。用STC组合物处理的样本可以在偏远地区收集，在环境条件下廉价地运输到实验室，并且仍然可以通过目前接受的用于原始痰分析(包括培养、涂片显微镜检查和分子诊断测定)的方法成功且准确地进行评估。此实施例提供了分枝杆菌在室温下在STC组合物中保持有活力的时间窗口的证明。

实验方法

来自囊性纤维化患者的痰的处理

来自囊性纤维化(CF)患者的原始临床痰样品(由加拿大安大略省渥太华医院的德雅尔丹博士(Dr.M Desjardins,The Ottawa Hospital,Ontario,Canada)友情提供)在4℃保持长达1周。将3.3×10⁶个菌落形成单位(cfu)的毒性结核分枝杆菌的临床菌株(分离自确认的TB阳性患者)掺入痰(每个3mL)中。将掺过的痰与等体积的BD2缓冲液混合，颠倒5-10次，并在室温下在生物安全柜中放置长达7天。在室温下24小时和7天后，将样品涡旋10秒，并以3,000×g离心15分钟以沉淀细菌小球。倒出上清，将小球重悬于无菌水中。将等分试样接种到多个MGIT培养管(具有PANTA/生长补充物)中，并在35℃下生长长达23天。

结果与结论

在接种到MGIT管中之前在BD2缓冲液中保持24小时的掺有TB的痰在7天内显示阳性TB生长，并且没有这些培养物被背景菌群污染的证据。在接种到MGIT管中之前在BD2缓冲液中保持7天的掺有TB的痰在21-23天内显示阳性TB生长，并且没有被背景菌群污染的证据。结果表明，用BD2缓冲液处理临床痰样品在消除背景菌群生长方面高度有效，同时在STC处理的样品储存长达一周后保持毒性结核分枝杆菌的生存力。暴露于BD2缓冲液一周的样品的阳性培养结果的时间增加表明，通过在STC组合物中在室温下更长时期的储存，一些分枝杆菌被杀死和/或生长受到抑制。然而，甚至在长期储存后，样品确实保留了足够的有活力的分枝杆菌以提供阳性培养试验。

实例6：与标准治疗方法(care method)相比，样品运输化学方法用于结核分枝杆菌的分子检测

CDC建议临床样本同时通过培养、抗酸杆菌(AFB)染色、和核酸扩增方案进行分析(CDC，2009)。培养是最终确定TB阳性的“金标准”，但它是缓慢的并可能需要长达8周。AFB染色是快速的，但具有低敏感性和低特异性，因为它不区分来自结核分枝杆菌复合体(MTBC)的成员与非结核分枝杆菌(NTM)。因此，对控制疾病的传播至关重要的快速鉴定依赖于核酸扩增方案，例如实时PCR(qPCR)和测序。

对结核分枝杆菌感染的患者中抗生素耐药性的的评估对患者管理和控制疾病的传播至关重要。结核分枝杆菌的药物敏感试验(DST)的标准方法可能需要几周到几个月来提供结果。由于多重耐药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现，已经发展出快速的分子办法。rpoB基因内的突变与利福平(RIF)耐药性相关，而inhA基因内的突变与异烟肼耐药性相关。哈尔斯(Halse)等人(2010)开发了两步分子方法，该方法直接用对MTBC阳性的临床样本通过实时PCR利用抗生素抗性基因焦磷酸测序分析。

在此实施例中，独立的公共健康诊断实验室，沃兹沃思中心分枝杆菌实验室(Wadsworth Center Mycobacteriology Laboratory)从事对由两种不同方法处理的TB阳性痰样品(由创新诊断基金会(FIND)结核病样本库惠赠)的临床评估并列地进行比较。具体地，1)“治疗标准”方法，包括氢氧化钠处理，接着是珠粒打浆，和2)本发明的方法，在CLIA/CLEP批准的rtPCR试验(靶向RD4结核分枝杆菌复合物(MTBC)差异区域(RD))(哈尔斯(Halse)等人，2011)和抗生素抗性基因焦磷酸测序试验(哈尔斯等人，2010)的敏感性方面进行了比较。在本发明的方法中，在DNA分离和试验检测之前，TB阳性痰样品用STC组合物进行处理以促进样本中细胞的液化和化学溶解。

与STC组合物的使用相反，“治疗标准(Standard of Care)”方法包括珠粒打浆、机械方法以破开痰样品中的细菌。虽然机械珠粒打浆可以有效地破开生物体，但是它在实验室环境的确产生危险的气溶胶。因此，非常希望开发一种有效的、非机械的、化学的方法以安全地从结核分枝杆菌释放DNA，而不会对诊断测试的临床敏感性产生负面影响。

实验方法

结核分枝杆菌阳性痰样品的生存力的确认

对于本实施例，来自确认的TB阳性患者的原始痰样本由创新诊断基金会(FIND)结核病样本库惠赠。一式两份的0.5mL的等分试样从30位患者样品提供并且冷冻储存。使用培养和涂片分析，FIND将这些样品如下分类(表5)。

表5.来自FIND的TB-阳性痰样本的分类

等分试样被冷冻运到沃兹沃斯中心分枝杆菌学实验室(Wadsworth CenterMycobacteriology Laboratory)(纽约州***门，奥尔巴尼，纽约州，美国)用于进一步分析，该实验室是CLIA/CLEP批准的临床实验室。痰处理、DNA提取、rtPCR测定以及焦磷酸测序由沃兹沃思中心分枝杆菌实验室进行。在到达沃兹沃思时，来自30位供体的一式两份的等分试样在冰上解冻；在DNA的分离之前，一组等分试样使用“治疗标准(Standard of Care)”方法(合作者)处理并且第二组用STC组合物处理。

使用“治疗标准”方法(合作者)处理TB阳性痰

1.添加0.5mL 3.5％NaOH以液化每个0.5mL痰等分试样(n＝30)；将等分试样涡旋以混合NaOH。

2.将混合物在室温下温育15分钟。

3.用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)将混合物的体积升至10mL。

4.将混合物在5,000rpm离心20分钟以沉淀细菌并且弃去上清。

5.在0.5mL无菌PBS中重悬沉淀。

6.300μL重悬的细菌被留存用于涂片和培养测试以确认分枝杆菌的生存力(参见表7)。

7.为了溶解细菌，将200mg的105-150微米的玻璃珠加入到剩余的200μL重悬的细菌，接着使用微型珠粒打浆机(BioSpec产品公司)进行两个1分钟循环的珠粒打浆并在冰上放置1分钟。

使用样品运输化学(STC)方法处理TB阳性痰

1.将0.5mL BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)添加到每个0.5mL痰等分试样(n＝30)；然后涡旋混合。

2.添加蛋白酶K(400μg)，并在50℃水浴中温育混合物2小时。

3.将400μL混合物转移至新鲜管并且将3M醋酸钾(pH 5.5)添加至150mM的终浓度。

4.将混合物在冰上温育10分钟，然后在13,000rpm下离心5分钟。

5.将上清转移到干净的、标记的管并且丢弃沉淀。

6.将2体积的室温95％乙醇添加到收集的上清，并且将管倒置20次混合。

7.将样品在室温下温育15分钟以沉淀DNA，然后在15,000rpm下离心2分钟以沉淀DNA。

8.轻轻取出上清，小心不要打乱沉淀。

9.将沉淀溶于200μL TE中，短暂地涡旋以充分重悬DNA并且允许在室温下静置至少30分钟。

对结核分枝杆菌进行实时PCR和抗生素抗性进行焦磷酸测序

使用CLIA/CLEP批准的实时PCR试验，来自每个纯化痰样品的5μL‘纯的’DNA和5μL稀释的(1:10)DNA的重复反应在ABI 7500实时PCR仪上扩增，该实时PCR试验靶向RD4结核分枝杆菌复合体(MTBC)差异区域(RD)(哈尔斯(Halse)等人，2011)。小于37的阈值循环(C_t)值报道为阳性，并且值大于37的样本被重测；如果结果是相同的，结果被报告为阴性，并且如果它们不同，它们被报告为不确定的。

对于利福平耐药性用先前公布的焦磷酸测序法(rpoB)(哈尔斯(Halse)等人，2010)和对于异烟肼耐药性用另外的靶标(inhA)来进行抗生素耐药性分析。从两种方法获得的DNA被用于单独的PCR反应以扩增rpoB和inhA基因的特异性区域。在这些区域中的突变指示对利福平和/或异烟肼抗生素的可能的耐药性。

结果与讨论

现在，治疗标准方法涉及用氢氧化钠液化痰，接着是使用机械珠粒打浆从细菌分离DNA。在本实施例中所采用的化学方法完全不同，因为BD2缓冲液(STC组合物)的功能是在一个步骤中液化痰和溶解较不顽强的细菌。重要的是，如果本发明的组合物和方法在引导对结核分枝杆菌特异的DNA和抗生素抗性标记的后续检测方面与标准治疗方法相比不是更加有效，那么本发明的组合物和方法显示为与治疗标准方法一样有效。

相比于传统的方法(表6和图4中的“合作者”)，本发明的“STC”方法通过实时PCR在先前由培养和涂片显微镜检查归类为‘低’和‘中’TB阳性的一式两份痰样品中导致结核分枝杆菌特异性检测的敏感性增加。在此实施例中，直到使用“治疗标准”方法提取的DNA被稀释10倍才可以检测到在‘中’和‘高’TB阳性痰样品中的结核分枝杆菌(表6和图4)；然而利用“STC”方法分离DNA后‘低’TB负荷痰样品的87％被检测为阳性(表2)。在使用治疗标准方法分离DNA之后，仅25％的‘低’TB负荷痰液样品通过实时PCR被检测为阳性(表6)。

表4阐明了相比治疗标准方法(合作者，1:10)，使用STC方法处理的所有TB阳性痰样品中结核分枝杆菌的显著改善的检测极限(通过rtPCR的较低的C_t值)。例如，‘低’TB阳性痰的C_t值的范围对于“STC”方法为31.4-45.0，相比之下对于“合作者”方法为38.5-45.0；‘中‘TB阳性痰的C_t值的范围对于“STC”方法为20.9-32.3，相比之下对于“合作者”方法为26.8-45.0；‘高’TB阳性痰的C_t值的范围对于“STC”方法为19.8-28.3，相比之下对于“合作者”方法为27.2-39.3。当使用STC来处理痰和使用本发明方法提取的DNA时，对于所有TB负荷水平，C_t值始终较低。此较低的检测极限，帮助确保对来自患者痰样品的结核分枝杆菌的精确诊断。

类似地，本发明的组合物和方法是与工业标准测试兼容来预测在结核分枝杆菌阳性样本中的抗生素抗性。对于测试的6个临床的TB阳性痰样本，用治疗标准方法和STC方法获得的焦磷酸测序法结果是100％一致的。重要的是，从这6个患者痰样本中，本发明的STC方法，但不是治疗标准方法，检测到2名患者(FIND 01 01 2072和FIND 01 01 2137)具有抗生素抗性标记(inhA和ropB基因)(表7)。甚至金标准培养测试在52天后没能显示这2位患者的样品中的分枝杆菌的生长。

在测试时分枝杆菌DNA的回收增加的影响最好使用焦磷酸测序数据突出显示。用STC组合物处理的样本具有足够数量可用DNA以在测试的第0天对抗生素抗性标记进行测试。相比之下，治疗标准方法在焦磷酸测序前需要平均14天用于MGIT培养来变成阳性，该方法可以在第0天被PCR测试为阴性样本上重复。患者的抗生素概况对病例管理至关重要，并且使用适当的抗生素治疗的较早干预将减少传播率和增加患者恢复的几率。因此，本发明对通过实时PCR的MTBC的快速的当天的鉴定有价值，并且足够灵敏以检测用于结核分枝杆菌的抗生素抗性标记，无需等待通过培养来检测分枝杆菌。

表6.使用2种不同方法提取DNA后通过实时PCR被检测为TB阳性的痰样品的百分比

*2个数据点从低TB样品中排除-任何提取方法或培养后未检测TB

表7.在结核分枝杆菌中对两种抗生素抗性标记的焦磷酸测序结果。

实例7：样品运输化学在使用Cepheid MTB/RIF测定的结核病诊断中的兼容性

目前，在痰样本中结核分枝杆菌的领先分子诊断测试是Cepheid GeneXpert MTB/RIF测定，它是一种结核分枝杆菌复合物DNA和利福平抗性的巢式基于实时PCR的检测。在此实施例中，与来自相同患者的未处理痰相比，评价了STC组合物处理的痰与CepheidGeneXpert MTB/RIF测定的兼容性。来自25位患者的一式两份的TB阳性痰样品由创新诊断基金会(FIND)的结核病样本库惠赠。独立的诊断实验室，国家犹太健康中心(NationalJewish Health，NJH)从事确定在Cepheid GeneXpert测定中，与未处理痰相比，STC组合物处理的痰的诊断功效。

实验方法

用于GeneXpert MTB/RIF测定的原始痰样本的制备

本实施例使用来自25位结核病阳性患者的原始冷冻痰(由FIND捐赠)的一式两份的0.5-1.0mL等分试样。FIND使用培养和涂片显微镜检查来对这些样品进行确认和分类如下(参见表8)：

表8.来自FIND的TB-阳性痰样本的分类

将等分试样冷冻运送至国家犹太健康中心(丹佛，科罗拉多州，美国)用于在Cepheid***上处理和测试TB。到达NJH分枝杆菌实验室后，将来自25位供体的一式两份的等分试样在冰上解冻。一组等分试样用2体积的Cepheid样品试剂(SR)缓冲液处理，第二组用等体积的STC组合物(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)处理以液化样本。

加入Cepheid SR缓冲液后，对每个等分试样进行如下处理：

a.将混合物涡旋10-15秒，并使其在室温下静置5分钟。

b.将混合物涡旋另外10-15秒，并使其在室温下静置10分钟

c.将每个样品加载到Cepheid GeneXpert MTB/RIF筒中

d.根据CepheidMTB/RIF测定(方案H.2)进行测试。

在添加STC之后，对每个等分试样进行如下处理：

a.将混合物涡旋10-15秒，并使其在室温下静置15分钟。

b.将混合物充分涡旋混合，然后在3000×g离心20分钟。

c.小心地倒出上清。

d.将沉淀重悬于1mL Xpert MTB/RIF SR缓冲液中并涡旋至少10秒。

e.将混合物在室温下温育10分钟并涡旋至少10秒。

f.将样品在室温下温育另外的5分钟。

g.将每个1mL样品直接加载到Cepheid GeneXpert MTB/RIF筒中。

h.根据CepheidMTB/RIF测定(方案H.2)进行测试。

GeneXpert实时PCR提供了2个结果：1)结核分枝杆菌阳性/阴性，和2)利福平(RIF)抗生素敏感性或耐药性(Sens/Res)(表9)。

表9.Cepheid GeneXpert MTB/RIF测定结果

^a一个样品是通过两种方法没有检测到MTB；从计算中排除。

^b一个样品由于“运行后分析错误”而失败；从计算中排除。

^c等分试样中的生物变化可能起作用；可以进行另外的工作以解决差异。

^d如果呼叫不正确，则为88％；如果呼叫正确，则为100％；可以进行另外的工作以解决差异。

结果与结论

从STC组合物处理的痰提取的沉淀物与CepheidMTB/RIF测定***完全兼容。与相同患者的未处理痰相比，分类为涂片阳性/培养阳性(高和中)和用STC处理的样本对于通过Cepheid分子测定的结核分枝杆菌和RIF抗性是100％一致的(表9)。

对于涂片阴性/培养阳性(低)样本，在通过实时PCR检测结核分枝杆菌中STC组合物处理和未处理的痰样品之间存在88％的一致性(表9)。特别地，用STC处理的一个供体样品对结核分枝杆菌得到阴性结果。来自相同患者的不同等分试样之间的生物学变化可能在这种情况下起作用，使得MTB在这个“低”样本中不可检测。

当评估RIF抗性时，涂片阴性/培养阳性(低)样本有一个差异呼叫。使用STC组合物处理的痰将两个供体鉴定为RIF抗性；而当使用Cepheid Sr缓冲液法(方案H.2)处理未处理的痰时，1个供体被鉴定为抗性。当在分析前用STC组合物预处理痰时，这种差异可以通过测定的灵敏度的增加来解释。

实例8：炭疽杆菌的孢子存活于样品运输化学

炭疽热是一种急性的、通常致命的、由棒状革兰氏阳性好氧性细菌炭疽杆菌引起的疾病，该炭疽杆菌通常以内生孢子形式安置在土壤中。像艰难梭菌，炭疽杆菌可以形成休眠的内生孢子，其非常难以根除，在恶劣的条件下存活几十年甚至几个世纪。炭疽不直接从一个感染的动物或人传播到另一个，它通过孢子传播。当孢子被吸入、摄入、或接触到宿主的皮肤损伤时，它们可能成为再活化的并迅速繁殖。炭疽孢子的顽强性以及它们在体外易于生产，使得它们非常适合于用作(以粉末和气溶胶形式)生物武器。

虽然先前的实例显示结核分枝杆菌在本发明的组合物中保持存活，但本实施例证明其它顽强的微生物(如炭疽杆菌孢子)在用STC组合物处理后保持存活。

实验方法

工作在美国生物防护实验室(Biodefense Laboratory)沃兹沃思中心(WadsworthCenter)纽约州***(New York State Department of Health)进行。

炭疽杆菌孢子的制备

炭疽杆菌斯特恩(Sterne)菌株的冷冻储备培养物在具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上培养，并在35℃、5％CO₂下温育24小时。初始温育后，将这些培养物转移到多个(最少10个)杆菌孢子形成琼脂板(Bacillus Sporulation Agar plates)，并在35℃、CO2下厌氧温育长达2周。

每3至4天进行孔雀绿孢子染色以监测体外炭疽杆菌的孢子形成。当制备的孔雀绿染色显示几乎完成生物体的形成孢子时，将孢子收获至5.0mL的PBS(pH 7.4)中，并在室温下保存直到使用。

孢子浓度的确定

将炭疽杆菌孢子悬浮液在PBS中稀释至10^-3。将这个最终稀释液的等分试样(10μL)装入2室的血细胞计数器载玻片的每个清洁的孔中。在40×放大无油下观察血细胞计数器室来进行孢子计数。在血细胞计数器的光场网格上孢子可视化为圆形或椭圆形的黑细胞。

孢子的处理

1.以要求的浓度制备700μL的孢子储备悬浮液。

2.将每个样品分成2×350μL体积；一个350μL等分试样用作未处理或“对照”：

a.取出50μL等分试样以通过涂板于具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上确认孢子是有活力的(参见下文)。

4.将第二个350μL的等分试样用于STC方法：

a.将350μL BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)添加至350μL炭疽杆菌的孢子储备悬浮液；并且涡旋混合。

c.将混合物在室温下温育15分钟，然后取出100μL用于培养(“STC”)并涂板到具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上(参见下文)。

培养孢子以确定生存力

将炭疽杆菌等分试样直接涂板于具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上，并在35℃、5％CO₂下温育。24小时后，记录菌落形成单位(CFU)。

结果与讨论

此实施例表明用STC处理不杀死炭疽杆菌孢子(图5)。未处理的和STC处理的孢子两者在有利的培养条件下24小时后产生相等数量的营养细菌。

实例9：分枝杆菌在环境温度下在样品运输化学中存活一周

环境温度在区域与区域之间可以广泛地改变，一整天都在波动。在收集和运输到实验室期间，除非采取措施，生物样品是暴露于这个宽温度范围的温度的。在发展中国家，由于高成本以及缺乏的基础设施，样品在环境温度下被运输到实验室，损害了样品的质量和测试结果的有效性。

在实例1中，掺入到痰中的减毒结核分枝杆菌H37Ra(aMTB)在室温(20℃-25℃)和4℃下本发明的组合物STC中保持有活力长达30天。在本实施例中，在不存在的黏液状痰下，aMTB直接与STC或PBS接触并且暴露于从4℃至40℃的温度范围持续1、2、3、4和7天。暴露于STC长达7天之后，培养分枝杆菌以评估生存力；监测了阳性培养结果的时间。作为对照，这个实验用大肠杆菌(相比分枝杆菌较不顽强的微生物)进行重复。

实验方法

用STC或PBS对减毒结核分枝杆菌和大肠杆菌进行处理

A.在多个50mL无菌管中，将aMTB(2×10⁶CFU/mL)和大肠杆菌(2×10⁶CFU/mL)掺入10mL的STC(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

B.将每个管保持在适当的温度(4℃、室温(20℃-25℃)、或40℃)持续指定的时间(1、2、3、4、或7天)。

C.从每个管取出3mL的在STC或PBS中的掺入微生物。

D.以3500rcf离心20分钟以沉淀完整的细菌。

E.丢弃上清，并在0.5mL无菌PBS中重悬沉淀。

F.接种100μL重悬的细菌至5×5mL补充的M7H9肉汤中。

G.在37℃下温育并每天检查生长。

H.培养对照：

a.将来自储备液的aMTB(10⁶CFU/mL)接种到5mL M7H9肉汤中，每天对测试样品进行培养。

b.将来自储备液的大肠杆菌(10⁶CFU/mL)接种到5mL M7H9肉汤中，每天对测试样品进行培养。

c.在37℃下用测试样品来接种对照培养物。

I.对于所有样品记录直到阳性的天数

J.对于aMTB，继续温育直到达到0.5麦克法兰标准浊度(McFarland Standardturbidity)。

K.对于大肠杆菌，继续温育直到达到1.0麦克法兰标准浊度。

从4℃和40℃下在STC或PBS中处理30天的aMTB中提取DNA

A.转移200μL的aMT(在4℃和40℃下用PBS处理30天)至新鲜管，并且与200μL的BD2缓冲液混合。

B.转移200μL的aMTB(在4℃和40℃下用STC处理30天)至新鲜管用于DNA提取。

C.向每只管添加(偏)高碘酸钠至30mM的终浓度，并涡旋混合。

D.将混合物在70℃水浴中温育20分钟。

E.将样品在室温冷却2分钟。

F.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

G.将混合物在室温下温育10分钟。

H.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM的终浓度，涡旋混合。

I.将混合物在冰上温育10分钟，然后在13,000rpm下离心5分钟。

J.将上清转移到干净的、标记的管并且丢弃沉淀。

K.将两体积的室温95％乙醇添加到管中的上清，并且将管倒置20次混合。

L.将混合物在室温下温育10分钟以沉淀DNA，然后在15,000rpm下离心2分钟以沉淀DNA。

M.轻轻取出并丢弃上清，小心不要打乱沉淀。

在200μL TE中溶解沉淀。

rtPCR条件

从在4℃和40℃下用STC或PBS处理30天的aMTB中分离的DNA进行对分枝杆菌特异的qPCR，即，RD4 Taqman实时PCR测定(与实例1相同的方案)。

结果与讨论

aMTB在本发明的组合物STC中在典型的运输条件的宽范围温度(4℃-40℃)下存活7天。阳性aMTB培养在35℃下在标准的42天温育期间显示0.5麦克法兰浊度生长(表10)。与aMTB暴露于PBS相比，暴露于STC的aMTB当保持在4℃、室温和40℃长达7天时丧失一些生存力，如通过实现0.5麦克法兰浊度生长的更长时间周期所示(表10)。有趣的是，PBS中的aMTB当在40℃保持甚至1天时也显示出一些生存力的损失，表明温度对aMTB生存力具有显著的影响。

相比之下，在STC中，在测试的所有温度下第1天大肠杆菌就完全丧失生存力(表11)。在PBS中，在4℃、室温和40℃下长达7天，大肠杆菌的生存力没有损失。因此，在4℃-40℃的范围，STC将保持aMTB有活力至少7天，同时，在接触时消除细菌诸如大肠杆菌，从而减少生物样品的背景菌群。

重要的是，对MTB DNA特异的qPCR(表12)显示在4℃和40℃下aMTB的量在STC中持续30天保持恒定。在这些极端温度下，对于用PBS处理30天的MTB获得相似的值(表12)。因此，此实施例显示aMTB在STC中是稳定的，即，其在宽的温度范围内至少一个月不增殖或降解；确保到达遥远的实验室的样品紧密地代表患者体内的状态。

表10.aMTB在STC中从4℃至40℃的生存力

表11.大肠杆菌在STC中从4℃至40℃的生存力

表12.从STC处理和PBS处理30天后的aMTB中提取的DNA的qPCR。

实例10：缓冲液组合物对结核分枝杆菌的生存力和DNA提取的影响

如实例5中所见，在室温下结核分枝杆菌在STC组合物BD2中保持有活力7天。对于特定的样品类型和用途，STC组合物的基本组分可以变化或“调整(tailored)”。研究螯合剂、洗涤剂、pH和缓冲剂之间的关系对减毒结核分枝杆菌的生存力以及随后的高分子量(HMW)DNA的回收的影响。

在此实施例中，对以下STC组合物进行测试：

表13：在此实施例中测试的组合物

实验方法：

涂板的菌落和DNA提取

从健康个体收集唾液样品并进行如下处理：

1.将0.4mL的唾液或水(用于DNA提取的对照)与0.5mL的上述化学品混合(表13)，并将管温育30分钟以允许液化。

2.向每个样品(每种化学品一管)添加100μL的以PBS洗涤的减毒结核分枝杆菌细胞(菌株h37a；aMTB)的悬浮液。可选地，向在化学品中的唾液添加100μL无菌水以产生未掺过的对照样品。

3.当将样品连续稀释并铺展涂于米德尔布鲁克(Middlebrook)琼脂平板上时，通过涡旋混合样品并在室温下温育30分钟、2天、4天和8天(见下文详述)。在35℃下温育3-4周后，手动计数板上的菌落

4.在步骤3中列出的每个时间点，将每个样品的等分试样进行涡旋珠粒打浆以提取总DNA。简言之，将250μL样品沉淀，在PBS中洗涤，并置于340μL无菌无RNase水中。将30μL连续稀释并涂板在米德尔布鲁克(Middlebrook)板上，同时将300μL添加到带螺旋盖的2mL管中300μL BD1(250mM LiCl、50mM CDTA、4％SDS，pH 6.8)，该带螺旋盖的2mL管中含有250mg科尔(Cole)高折射率二氧化硅珠。然后将BD1样品混合物在Bio Spec珠粒打浆机中处理1分钟。

5.通过在微量离心机中以15,000rpm离心5分钟除去碎片。

6.使用实例1中概述的方法的缩减版本从样品中纯化DNA(使用高碘酸盐方法从掺有aMTB的BD2缓冲液处理的痰中提取DNA；具体地，使用步骤8-13，并且步骤12使用在-20℃下温育1小时)。

7.将样品在微型离心机中以15,000rpm离心3分钟，将沉淀置于50μL不含RNA酶的水中，并将12μL通过在0.8％琼脂糖凝胶上的琼脂糖凝胶电泳进行分析(参见下文图6)。

结果与结论

表14总结了在指定的温育时间后结核分枝杆菌菌落的计数结果。ND的条目表示由于污染的存在而未确定菌落的数目。在所有其他板上，结核分枝杆菌是存在的唯一细菌。条目<10²表示在具有最低稀释的板上没有观察到菌落，其是这个方法的检测极限。

表14：在STC组合物中温育指定的温育时间后，每0.6mL人唾液中有活力的结核分枝杆菌的计数。

STC	30分钟	2天	4天	8天
					BD2	7.0x 10⁵	5.0x 10⁴	1.0x 10³	<10²
变体#1	6.8x 10⁵	5.2x 10⁵	5.0x 10³	<10²
					变体#2	2.0x 10⁵	4.0x 10⁴	<10²	<10²
BD4	1.5x 10⁵	5.0x 10⁴	5.0x 10³	<10²
					水(对照)	1.0x 10⁷	ND	ND	3.0x 10⁵

结果与结论

图6显示(作为实例)对于t＝2天时间点的琼脂糖凝胶结果。在用BD2或指定的化学变体处理唾液样品后回收完整的高分子量(HMW)DNA。含有aMTB的所有样品显示回收的DNA量显著增加，表明aMTB对存在的总核酸的贡献。最上面的DNA梯形条带(箭头)等于约23kB。所有回收的DNA条带都高于这个点，表明存在HMW DNA。

在这个实施例中，研究了对与唾液混合的BD2或相关化学变体中温育后减毒结核分枝杆菌的DNA提取和生存力的影响，以便证明STC组分的不同组合的基本效用。通过琼脂糖凝胶电泳评估了从结核分枝杆菌的DNA提取，并包括对照以区分唾液DNA和分枝杆菌DNA。可以在所有测试组合物中温育后的所有时间点获得来自结核分枝杆菌的完整高分子量(HMW)DNA，随后进行珠粒打浆(图6)。

结核分枝杆菌的生存力通过在BD2或相关化学品中温育后计数平板菌落来确定。结核分枝杆菌对于形成细胞团块是众所周知的，其使得难以精确测定样品中存在的有活力的MTB细胞。另外，在与含有triton X-100的硼酸盐缓冲化学品混合的样品中观察到污染。尽管有这些困难，可以确定这些化学品中结核分枝杆菌的存活的总体趋势。虽然随着时间的推移生存力降低，但是结核分枝杆菌甚至在BD2和相关化学品中温育四天后仍保持生存力(表14)。这与实例5的结果一致，其中毒性结核分枝杆菌在STC组合物中储存长达一周后保持有活力。尽管所有化学品在8天后显著降低生存力，但是在较早时间点对生存力的影响存在一些变化(比较BD2与变体#2)。在所有情况下，含有MTB的唾液样品在测试的所有时间点产生HMW DNA(图6中的时间点t＝2天)。最终，这些数据表明STC组合物的变化对于HMWDNA回收和顽强微生物的生活力表现同样良好。目前，现有技术的分子诊断测试的输入要求之一是优质的HMW DNA。此实施例证明STC组合物能够提供这样的DNA用于随后的分子诊断测试。

实例11：STC组合物有效消除痰中存在的机会病原体

在许多高负担的TB国家，TB阳性样品的安全和有效运输是一个问题。由于在环境温度下的长运输时间导致的腐败，在处理实验室定期丢弃样品。STC组合物意图保留顽强微生物(例如结核分枝杆菌)的生活力，同时消除痰的背景微生物群落，从而在分子和培养TB诊断之前允许痰样品的运输而没有腐败的风险。

铜绿假单胞菌和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)是常常在免疫受损或慢性病患者中引起呼吸道感染的机会病原体。铜绿假单胞菌是形成生物膜的革兰氏阴性细菌，并且是从具有医院(医院获得性)感染的人中最常分离的细菌之一。由于它与囊性纤维化的人的关联，它也经常在痰样品中发现。卡他莫拉菌是革兰氏阴性细菌，它能够同时需氧和厌氧生长。它可以在咳出的痰中存活至少三周，并且甚至在NALC-NaOH处理之后是痰样本的潜在污染物。在这里，对STC组合物处理的铜绿假单胞菌和卡他莫拉菌的存活能力进行了研究。

a)STC组合物对人痰样本中背景微生物的影响

材料与方法：

1.600μL合并的、证实的TB-阴性人痰(来自六位供体，组织溶液，来源53，法国)与700μL PBS、BD2(250mM LiCl、12.5mM CDTA、2％SDS、50mM甘氨酸，pH 10.5)或BD3(250mMLiCl，50mM CDTA，4％SDS，pH 6.8)混合。

2.当从每个样本制备连续稀释时，将样本进行混合并且在室温下温育10分钟、3小时或24小时，以确定有活力的细菌的数量。

3.对于在每个时间点的涂板，100μL等分试样在PBS中洗涤(例外：在PBS中的样品在涂板之前不洗涤)。在PBS中制备连续稀释，并且在温育后t＝0(10分钟、0.17小时)、3小时和24小时，将100μL稀释的等分试样涂板于胰蛋白酶大豆琼脂上。细菌的背景群落在35℃下温育后通过在这些平板上计数CFU来计数(表A)。

结果：

表15：在STC组合物中温育指定的温育时间后对每0.6mL人类痰中有活力的背景细菌的计数。

*条目<10表示在具有最低稀释(101)的平板上没有观察到菌落，该最低稀释是这个方法的检测极限。

b)STC组合物对铜绿假单胞菌和卡他莫拉菌的影响

材料：

●过夜培养卡他莫拉菌ATCC 25238和铜绿假单胞菌ATCC 10145

●过滤器消毒的STC组合物：BD2(250mM LiCl、12.5mM CDTA、2％SDS、50mM甘氨酸，pH 10.5)；BD3(250mM LiCl、50mM CDTA、4％SDS，pH 6.8)；BD4(250mM LiCl、12.5mM CDTA、2％SDS、50mM硼酸盐，pH 9.3)

●无菌水、无菌杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)、脑心浸液(BHI)肉汤和琼脂

●用于微生物学的转台

实验方法：

通过涂板确定生存力

1.卡他莫拉菌在来自4℃储存的板的BHI肉汤中生长。板的铜绿假单胞菌在来自4℃储存的TSB中生长。

2.在37℃过夜生长后，将细菌收获、洗涤，并且以大约100个细胞/100μL PBS温育在1mL的STC组合物(与水1:1)或PBS中。

3.在15分钟、1小时和24小时后取出300μL等分试样。

4.在每个时间点，在DPB(铜绿假单胞菌)或BHI肉汤(卡他莫拉菌)中洗涤沉淀，并在PBS(铜绿假单胞菌)或BHI肉汤(卡他莫拉菌)中进行连续稀释。

5.将稀释液涂板在TSA(铜绿假单胞菌)或BHI琼脂(卡他莫拉菌)上，将平板在35℃温育过夜；通过手动计数来计数平板上的菌落(表16)。

通过肉汤生长确定生存力

1.卡他莫拉菌在来自4℃储存的板的BHI肉汤中生长。铜绿假单胞菌在来自4℃储存的板的TSB中生长。

2.在37℃过夜生长后，将细菌收获、洗涤，并且将大约100个细胞温育在1mL的化学品(与水1:1)或PBS中。通过连续稀释和在琼脂平板上计数来确定初始接种物。

3.在15分钟和2小时后取出300μL等分试样。

4.在每个时间点，将完整的细菌沉淀并在TSB或BHI肉汤中洗涤。

5.然后将等分试样用于接种2mL TSB(铜绿假单胞菌)或BHI肉汤(卡他莫拉菌)

6.将肉汤在37℃下振荡(180rpm)温育过夜，并记录任何生长(表17)。

结果：

表16：在STC组合物中温育指定的温育时间后对铜绿假单胞菌(TSA板)和卡他莫拉菌(BHI板)的计数

表17：在STC组合物中温育指定的温育时间后铜绿假单胞菌(TSB肉汤)和卡他莫拉菌(BHI肉汤)的生长

结论

尽管本发明的组合物长时间保存顽强微生物(例如结核分枝杆菌)的生存力(实例5和10)，但是至关重要的是尽快消除由其它更快速生长的微生物的生长引起的污染。在这里，我们发现STC组合物在温育15分钟至24小时之间有效消除铜绿假单胞菌和卡他莫拉菌的平板生长(表16)。在组合物之间存在变化，其中BD2和BD4比BD3更有效地对抗铜绿假单胞菌(表16和17)。

由于平板计数实验的检测极限为100个细胞，因此有可能一些用STC组合物处理的存活细菌可能导致分枝杆菌肉汤培养的污染。为了解决这个问题，还通过肉汤培养研究了在STC组合物中温育后的生存力。在这里，任何存活的细菌应当多样地导致在肉汤中容易观察到的生长。与涂板结果一致，只有用PBS处理的细胞接种的培养物或用BD3处理的铜绿假单胞菌在过夜温育后导致细菌生长(表17)。这个实施例证明了STC组合物可以快速并有效地消除较不顽强的微生物，其是生物样品(如痰)中的潜在污染源，使得本发明的组合物成为TB样品的理想运输溶液。

实例12：STC组合物有效地快速消除革兰氏阴性和***种类以及酵母种类

顽强的微生物(例如结核分枝杆菌)可以在许多环境中与许多其他细菌种以及其他微生物(例如酵母)中发现。此实施例证明了STC组合物在快速消除各种微生物的生存力方面的广泛适用性。选择了若干细菌种类是因为它们存在于诸如土壤(苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))，人皮肤(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))和哺乳动物胃肠道(小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、白色念珠菌(Candida albicans))的一系列环境中。

材料：

●过夜培养物

●过滤器消毒的BD2(250mM LiCl、12.5mM CDTA、2％SDS、50mM甘氨酸，pH 10.5)；BD3(250mM LiCl、50mM CDTA、4％SDS，pH 6.8)和BD4(250mM LiCl、12.5mM CDTA、2％SDS、50mM硼酸盐，pH 9.3)

●无菌水、无菌杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)、脑心浸液(BHI)肉汤和琼脂、补充有0.1％半胱氨酸的TSB和TSA(分别为TSBC和TSAC)、用于酵母的YEPD平板和肉汤。

●用于微生物学的转台

实验方法：

1.将细菌和酵母生长在推荐的生长培养基中和在推荐的温度下(参见步骤#5，下文详述)。

2.过夜生长后将细胞收获、洗涤，并且将在100μL PBS中的109个细胞温育在1mL的STC化学品(与水1:1)或PBS中。

3.在15分钟、1小时和24小时后取出300μL等分试样。

4.在每个时间点，将等分试样洗涤并且在培养基中连续稀释。

5.将稀释液涂板在YEPD(白色念珠菌)、TSAC(蜃楼弗朗西斯氏菌(F.philomiragia))、BHI琼脂(小肠结肠炎耶尔森菌、或TSA(其他所有)上，并且将平板在30℃(小肠结肠炎耶尔森菌、白色念珠菌)、或35℃(其他所有)下温育过夜，并且通过计数来计数平板上的菌落(表18)。

结果：

表18：在STC组合物中温育指定的温育时间后对指定的微生物的计数

结论

研究了在STC组合物中温育革兰氏阳性(苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性(小肠结肠炎耶尔森菌、蜃楼弗朗西斯氏菌、肺炎克雷佰菌)细菌和酵母(白色念珠菌)的影响。BD3对测试的细菌物种的影响显著的不同；***和白色念珠菌在15分钟内完全丧失活力，革兰氏阴性细菌甚至在温育24小时之后有相对大量的细菌存活。对于所有测试的种——包括酵母，组合物BD2引起有活力的细菌的快速减少(在15分钟内)。在环境温度条件下的延长的样本运输的背景下，样本的这种快速“去污”特别令人满意。更具体地说，如果宽范围的快速生长的背景细菌可以被快速且有效地消除，那么TB阳性痰液样品将不太可能由于腐败而被丢弃。这个实施例证明了STC组合物在消除具有不同物理特性和来源于不同的环境的宽范围的微生物的生存力方面是有效的。

实例13：可以从储存在STC组合物中并且冷冻于-80℃1周的人痰样品中提取来自结核分枝杆菌的DNA

虽然在许多发展中国家冷冻样品作为保存方法的成本过分昂贵，但是它是经常用于更富裕国家的方法。不仅提供环境温度稳定的重要益处，而且还能够整合到含有冷冻步骤的分子诊断工作流中的组合物具有明显的优点。此实施例评估了冷冻对提取适合于下游使用的DNA的能力的影响。

材料

●在PBS中的1.5×10⁹CFU/mL减毒结核分枝杆菌(菌株h37a；aMTB)(储存于4℃)。

●2-3mL来自组织溶液的痰样品(储存于-80℃)。

●过滤器消毒的BD2(50mM甘氨酸、250mM LiCl、50mM CDTA、2％SDS；pH 10.5)

●(偏)高碘酸钠(NPI)。

●M7H9液体培养基(从具有OADC富集和40mM丙酮酸钠的2714米德尔布鲁克7H9肉汤制备而来)。

实验方法

1.在提取和培养之前，将痰进行如下掺加并且在cryological小瓶中在-80℃冷冻1周：

¹来自5麦克法兰悬浮液

²在痰/STC混合物中的最终浓度

2.在处理的当天，将样品进行解冻且在1.5mL带螺旋盖的管中制作200μL等分试样。

3.它们在3,500g旋转20分钟，丢弃上清并将沉淀放置在100μL PBS中。

4.使用实施例1中概述的方法的缩减版本从样品中纯化DNA(使用高碘酸盐方法从掺有aMTB的BD2缓冲液处理的痰中提取DNA；具体地，使用步骤8-14)。

5.如在实施例1中所述，从掺有aMTB的痰中分离的DNA被用于分枝杆菌特异的RD4Taqman实时PCR测定(参见rtPCR条件)。

结果

表19：从使用与STC组合物BD2混合的掺有aMTB的人类痰样品中分离的DNA的RD4PCR获得的C_t值。

结论

从表19中可以看出，在掺有aMTB的冷冻和非冷冻痰样品中，从RD4 PCR获得的C_t值非常相似。这与霍尔兹(Holz)等人(2001)描述的结果一致，其中冷冻(-20℃)不影响痰形态学或细胞计数。因此，STC组合物不仅理想地适用于其中制冷昂贵或不可接近的地区，而且还适用于其中冷冻储存是常规的实验室工作流程。此实施例证明了STC组合物的广泛应用。当含有顽强微生物(如结核分枝杆菌)的样品与STC组合物混合时，微生物在各种储存条件下是稳定的，并且它们可在收集后数天回收。然后，可以回收DNA以进一步用于分子诊断测定。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请表示本发明所属的技术领域的技术人员的水平，并且以与如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地说明通过引用并入本文相同的程度通过引用结合在此。

如此描述了本发明，但显而易见的是相同可以以许多方式变化。这些变化不被视为违背本发明的精神和范围，并且所有这样的修改，如将对本领域技术人员而言是显而易见的，旨在被包括在以下权利要求的范围之内。

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美国疾病控制与预防中心(CDC，2009)，在结核病的诊断中使用的核酸扩增试验的更新指南(Updated guidelines for the use of nucleic acid amplification testsin the diagnosis of tuberculosis)，MMWR发病率和死亡率周报(Morb Mortal WklyRep)58:7-10。

哈尔斯·TA(Halse TA)、爱德华兹·J(Edwards J)、坎宁安·PL(CunninghamPL)、沃尔夫冈·WJ(Wolfgang WJ)、大仲马·NB(Dumas NB)、Escuyer VE、马瑟·KA(MusserKA)(2010)结合的实时PCR和rpoB基因的焦磷酸测序法用于直接在临床标本中快速鉴定结核分枝杆菌和确定利福平耐药性(Combined real-time PCR and rpoB genepyrosequencing for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis anddetermination of rifampin resistance directly in clinical specimens)，临床微生物学杂志(J Clin Microbiol)48(4):1182-1188。

Claims

1.用于保存生物样品中有活力的顽强细菌的方法，包括使所述生物样品与稳定组合物接触，其中所述稳定组合物包含螯合剂、变性剂、盐，并且具有约6至约11之间的pH。

2.权利要求1所述的方法，其中所述顽强细菌是分枝杆菌(Mycobacteria)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、或艰难梭菌(Clostridium difficile)。

3.权利要求2所述的方法，其中所述分枝杆菌是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)，并且其中该炭疽杆菌作为孢子是稳定的。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品是黏液状体液，例如痰或唾液。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述螯合剂是乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或其任意组合。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述变性剂是阴离子洗涤剂(如，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂、月桂酰硫酸钠(SLS))、阳离子洗涤剂(如，例如，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))或非离子洗涤剂(如，例如，吐温(Tween)-20、曲拉通(Triton)X-100、或布里杰(Brij)-58)。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物包括：(i)2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，并且具有pH 10.5；或(ii)4％SDS、50mM CDTA、250mM LiCl、140mMLiOH，并且具有pH 6.8。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所有或部分的顽强细菌在室温、环境温度或在约4℃至约40℃范围内的温度下储存1天或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、或7天或1个月或更长后保持稳定。

9.用于液化生物样品的方法，包括使所述生物样品与稳定组合物接触，其中所述稳定组合物包含螯合剂、洗涤剂、盐，并且具有6至11之间的pH。

10.权利要求9所述的方法，其中所述生物样品是黏液状体液，例如痰或唾液。

11.权利要求9或10所述的方法，其中所述螯合剂是乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或其任意组合。

12.权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述变性剂是阴离子洗涤剂(如，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂、月桂酰硫酸钠(SLS))、阳离子洗涤剂(如，例如，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))或非离子洗涤剂(例如，吐温-20、曲拉通X-100、或布里杰-58)。

13.权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述组合物包括：(i)2％SDS、12.5mMCDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，并且具有pH 10.5；或(ii)4％SDS、50mM CDTA、250mM LiCl、140mM LiOH，并且具有pH 6.8。

14.权利要求9-13中任一项所述的方法，其中所述稳定组合物保存生物样品中处于有活力状态的顽强细菌，并且减少或消除所述样品中的其它微生物生长。

15.用于稳定生物样品中的微生物组的方法，包括使所述生物样品与稳定组合物接触，其中所述稳定组合物包含螯合剂、洗涤剂、盐，并且具有6至11之间的pH。

16.权利要求15所述的方法，其中所述生物样品是黏液状生物液体，例如痰或唾液。

17.权利要求15或16所述的方法，其中所述螯合剂是乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或其任意组合。

18.权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述变性剂是阴离子洗涤剂(如，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂、月桂酰硫酸钠(SLS))、阳离子洗涤剂(例如，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))或非离子洗涤剂(例如，吐温-20、曲拉通X-100、或布里杰-58)。

19.权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述组合物包括：(i)2％SDS、12.5mMCDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，并且具有pH 10.5；或(ii)4％SDS、50mM CDTA、250mM LiCl、140mM LiOH，并且具有pH 6.8。

20.权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述稳定组合物保存生物样品中处于有活力状态的顽强细菌，并且减少或消除所述样品中的其它微生物生长。

21.用于表征生物样品中的细菌核酸的方法，包括：

使所述生物样品与稳定组合物接触，其中所述稳定组合物包含螯合剂、洗涤剂、盐，并且具有6至11之间的pH；以及

扩增所述样品中的核酸，其中如果扩增步骤立即发生在收集之后或稍后，则扩增的核酸的水平保持基本上不变。

22.权利要求21所述的方法，其中所述生物样品是黏液状生物液体，例如痰或唾液。

23.权利要求21或22所述的方法，其中所述螯合剂是乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或其任意组合。

24.权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述变性剂是阴离子洗涤剂(如，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂、月桂酰硫酸钠(SLS))、阳离子洗涤剂(如，例如，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，尽管当与DNA一起起作用时这种洗涤剂不理想)或非离子洗涤剂(如，例如，吐温-20、曲拉通X-100、或布里杰-58)。

25.权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述组合物包括：(i)2％SDS、12.5mMCDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，并且具有pH 10.5；或(ii)4％SDS、50mM CDTA、250mM LiCl、140mM LiOH，并且具有pH 6.8。

26.组合物，包括：

螯合剂；

洗涤剂；以及

有活力的顽强微生物。

27.权利要求26所述的组合物，其中所述螯合剂是乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或其任意组合。

28.权利要求26或27所述的组合物，其中所述变性剂是阴离子洗涤剂(如，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂、月桂酰硫酸钠(SLS))、阳离子洗涤剂(如，例如，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))或非离子洗涤剂(如，例如，吐温-20、曲拉通X-100、或布里杰-58)。

29.权利要求26-28中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括：(i)2％SDS、12.5mMCDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，并且具有pH 10.5；或(ii)4％SDS、50mM CDTA、250mM LiCl、140mM LiOH，并且具有pH 6.8。

30.权利要求26-29中任一项所述的组合物，其中所述顽强微生物是分枝杆菌、炭疽杆菌、或艰难梭菌。

31.权利要求30所述的组合物，其中所述分枝杆菌是结核分枝杆菌，并且其中所述炭疽杆菌处于孢子的的形式。