CN101175853A - 用于保存来自体液的核酸的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从体液，如唾液的样品中提取核酸的含水组合物，所述含水组合物包含变性剂、螯合剂、缓冲剂和蛋白酶，使得所提取的核酸在室温稳定至少14天，并可直接用于扩增反应中而无需其它处理。具体地，所述组合物包含SDS、环己二胺四乙酸、Tris－HCl和蛋白酶K。还提供了包括所述组合物的直接从体液扩增DNA的方法和试剂盒。

Description

用于保存来自体液的核酸的组合物和方法
本发明的领域一般地涉及从体液，如唾液中分离并保存核酸用于核苷酸序列检测的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及将核酸用于核酸扩增反应之前不需要提取核酸的分离步骤的组合物和方法。
背景技术
有关核酸扩增的基于分子的技术日益用于法医学(forensics)、法律的实施(law enforcement)、军事(military)、人类医药(human medicine)、兽医(veterinary medicine)以及研究中。在法庭、军事以及大规模灾难的处境下，例如，目前通常从被认为是意外事故或谋杀的未经确认的死者亲属的健在者提取DNA样品以帮助确认死者。军队人员或预计会遭遇其生命处于危险的危险处境中的其它个人可能希望在将他们自身暴露于危险之前先保存DNA样品。在法律实施方面，如今加拿大和美国都要求被宣判的重罪犯(felons)提供DNA样品。预计基于DNA的检验的使用在医药方面增加，例如，在检测囊性纤维化(cystic fibrosis)、细胞色素P450同种型(cytochromeP450 isotypes)、影响对传染病和自身免疫疾病易感性的多态性、HLA分型(HLA typing)、亲子关系问题(paternity issues)等方面(to name but a few)。在临床研究中，实例可为筛选群体的结肠癌素因性基因(coloncancer-predisposing genes)或筛选乳腺癌死者家族成员的乳腺癌素因性基因(breast cancer predisposing genes)。扩增DNA的一种技术是聚合酶链式反应(the polymerase chain reaction(PCR))。
PCR为快速、廉价且相对简单的从多种来源材料(source materials)扩增DNA分子拷贝的手段。但是，PCR的局限是DNA来源材料通常含有多种抑制剂，例如色素、蛋白、糖类和/或干扰扩增反应的其它杂质。例如，已知多种DNA聚合酶，包括Taq DNA聚合酶(源自水生栖热菌(Thermusaquaticus))的典型的热稳定DNA聚合酶)在PCR混合物中受到痕量源自体液的杂质抑制。为了克服在DNA来源材料中的抑制剂的问题，通常需要在扩增之前从来源材料纯化DNA。然而纯化方法常常涉及费时且昂贵的多个步骤。
可从几乎每一类型的人体细胞中以及从多种含有细胞的体液中提取DNA。如本文所用的，术语“体液”可指天然存在的来自动物的液体，例如唾液(saliva)、痰(sputum)、血清(serum)、血浆(plasma)、血液(blood)、尿液(urine)、粘液(mucus)、胃液(gastric juices)、胰液(pancreatic juices)、***(semen)、哺乳期或者月经期产物(products of lactation or menstruation)、泪液(tears)或淋巴(lymph)。用于提取DNA的体液的通常来源是静脉血液中的白细胞。但是，使用血液作为DNA的来源有许多缺点。采集血液不是无关重要的步骤。采集静脉血液需要经过训练的人员。而且它是入侵性的步骤，经常给供者(donor)带来一定程度的不适和疼痛。需要预防措施将血液采集者对于血源性病原体(bolld-borne pathogen)的暴露降至最低。一旦采集完，血液样品或者必须冷冻或者必须迅速转移至实验室用于提取DNA。获得血液的较简单方法是刺破手指并将其印迹在一片滤纸上之后采集几滴。需要经过较少训练的人员。一旦干燥后，DAN相当稳定。回收的DNA的量很少但对于许多法庭的用途而言已足够。但是手指刺破仍然是侵入性的步骤并且源自红细胞中血红蛋白(haemoglobin)的血红素(haeme)能抑制某些类型的DNA分析。
用刷子(口腔棉试(buccal swab))擦拭(swabbing)颊内部是另一种获得含有DNA的细胞的方法。这种方法的侵入性比采血少得多并且与采集血液中要求的人员相比允许经过较少训练的人员采集。一旦采集后，可用DNA可回收的时间相对短。口腔内的微生物可降解DNA。但是通过干燥棉试或者通过把其擦拭到滤纸上并干燥，可延长此时间。
唾液大体上由主要的唾液腺(腮腺(parotid)、下颚下腺(submaxillary)以及舌下腺(sublingual glands))分泌的相当透明、无色的液体。它的作用是润滑和清洁口腔以及开始消化过程。腮腺主要分泌浆液样(serous)(watery(水样的))唾液，而其它的腺体则分泌浆液样和粘液样(mucinous)(粘性的(sticky))唾液的混合物。唾液的组分包括粘蛋白(mucin)和消化酶。
粘蛋白是高分子量的糖基化的蛋白，其形成了上皮细胞的表面上保护性生物膜的主要部分，其中它们能提供对于颗粒物质的凭障以及与微生物结合。这些糖蛋白非常有助于唾液的粘性。
很久就已知细胞DNA存在于唾液中并且这种DNA适于法庭应用。使用可在犯罪现场或从邮票的背面回收的唾液中的少量DNA，法庭用途通常限于受害人或者嫌疑犯的鉴定。为此，van Schie等(van Schie et al.，(1997)J.lmmunol.Methods.208：91-101)已研究了唾液可以是基因组DNA的可靠来源和静脉血液样品的竞争者的观念。van Schie等使用新采集的或者冰冻的唾液样品并通过相当复杂的提取步骤纯化DNA。基于在260nm的光吸收来评估回收的DNA的量，已知该方法为不可靠的方法因为其它普通的生物大分子如RNA具有基本上相同的紫外光吸收光谱。不过，这些作者指出通过某些等位基因多态性凝胶电泳分析和聚合酶链式反应分析，确实存在优质基因组DNA(quality genomic DNA)。Terasaki等(Terasaki et al.(1998)HumImmunol.59：597-598)报道了有关唾液适宜作为用于通过聚合酶链式反应分析进行HLA分型的DNA来源的相似结果。尽管报道了回收的DNA的量，但未报道用来测量DNA的方法。这些作者提供了3个实施例，在这些实施例中，在滤纸上干燥的唾液产生了适于分析的DNA。
提供唾液样品而不是血液样品作为DNA的来源有很多明显的优势。因为不适、疼痛或有关放血或针刺(phlebotomy or pin-pricks)的忧惧，供给者一般愿意捐献唾液而不是血液。唾液还具有不需要专门的人员的优势，因而减少了进行大量样品采集的费用。然而，对技术人员来说显然的是，尽管唾液是优选的DNA来源，但其它的体液包括血液也可以使用。
最近，已经发现可将唾液直接用于实时PCR(real time PCR)而无需任何DNA纯化步骤。French等(French et al.(2002)Molecular And Cellular Probes.16：319-326)用水按1∶1稀释了新鲜完整的唾液并立即或者在4℃(2-3天)或-20℃保存后将这种混合物用于以LightCycler装置(Roche Diagnostics)进行的实时PCR。PCR的反应体积通常为20μl，含有2μl的唾液(在水中稀释至50％)。发现可用于PCR的DNA的计算浓度在0.1ng/μl和3.5ng/μl之间，在来自不同个体和在不同日期的样品间变化。作者认为天然的唾液(crudesaliva)中可用于扩增的DNA的量可能不是存在于唾液样品中所有的DNA，在该样品中总DNA的数量可能仍然存在于口腔细胞内或者被降解而不能实现靶标扩增(target amplification)。用保存于4℃(2-3天)或-20℃的唾液样品并未在功效试验中观察到明显的减少。
随着在法医学、法律实施、军事、人类医药、兽医以及研究中日益增加的使用基于DNA的分析，需要使体液如唾液成为个体中DNA的标准而可靠的来源(而取代目前的标准-血液)的组合物和方法。理想地，能够使用此类组合物和方法检测DNA而不需要从唾液中提取和纯化DNA的分离步骤。此外，期望能在环境温度下将体液保存几天。这在当需要运送唾液样品和/或者冷藏源(source of refrigeration)不可用时是特别有利的。另外，如果唾液样品中基因组DNA的浓度足够高以用于传统的PCR以及实时PCR而不需要其它步骤，这是令人满意的。传统的PCR通常要求DNA模板的量＞10ng。根据Roche Molecular Biochemicals PCR Application Manual(2ndedition，1999，Roche Diagnostics)，用低量模板(＜10ng人基因组DNA)的传统的PCR要求特殊的反应变化，如在循环数、重新设计引物、使用“Hot Start”等方面的改变。相比之下，实时PCR比传统的PCR灵敏得多。例如，对于检测30pg的对照人基因组DNA(LightCycler Control Kit DNA manual，version 3，2003)，LightCycler实时PCR装置(Roche Diagnostics)具有100％的灵敏度。
出于使申请人相信的这些已知信息与本发明可能相关的目的，提供了此背景信息。不意味着必须承认也不应该解释为任何上述信息构成了针对本发明的现有技术。
发明概述
本发明的目的是提供保存来自体液如唾液中的DNA的组合物和方法，其允许在核酸扩增反应中直接使用DNA样品。
依据本发明的一个方面，提供了用于从体液样品中提取核酸的含水组合物(aqueous composition)以使所述样品中的所述核酸在室温保持稳定至少14天，其中当将所述组合物以扩增反应混合物总体积的至少2％的量加入所述的扩增反应混合物中时，所述组合物不抑制核酸扩增。
依据本发明的另一个方面，提供了直接从体液中扩增DNA的方法，其包括：(a)将体液样品与等体积的根据本发明的含水组合物混合；(b)用一部分步骤(a)中形成的混合物进行PCR扩增。
依据本发明的另一个方面，提供了用于从体液扩增DNA的试剂盒，包含：(a)依据本发明的含水组合物；以及(b)其使用说明书。
附图说明
图1显示PCR产物电泳后用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，并显示来自唾液的DNA的直接扩增，所述唾液与含水组合物混合并在室温存放了1天、14天或365天。在PCR之前，将样品在60℃温育1小时。琼脂糖凝胶中泳道的内容物如下：
泳道#    描述
1        100-bp标记
2        1天
3        14天
4        365天
5        100-bp标记
图2显示PCR产物电泳后用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，并显示来自唾液的DNA的直接扩增，所述唾液与等体积的显示于下表的含水组合物混合然后在室温存放1天、7天、14天、21天或365天。琼脂糖凝胶中泳道的内容物如下：
泳道#    描述
1        100-bp标记
2        水
3        100mM氢氧化钠
4        100mM氢氧化钾
5        200mM碳酸钠
6        100-bp标记
图3表示PCR产物电泳后用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，并显示分级的(graded)NaOH的浓度对于含有纯化的人DNA的PCR扩增反应的影响。琼脂糖凝胶中泳道的内容物如下：
泳道#    NaOH的终浓度(mM)
1        100-bp标记
2        0
3        1
4        2
5        4
6        6
7        8
8        10
9        12
10       14
11       100-bp标记
图4表示PCR产物电泳后用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，并显示NaOH/唾液混合物的逐渐增加的体积对于50μL PCR扩增反应的影响。琼脂糖凝胶中泳道的内容物如下：
泳道#    NaOH加唾液的体积(μL)
1        100-bp标记
2        0
3        1
4        2
5        3
6        4
7        5
8        6
9        7
10       8
11       9
12       10
13       12
14       14
15       16
16       18
17       20
18       100-bp标记
图5表示PCR产物电泳后用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，并显示与其它的组合物相比OrageneTM对于PCR扩增反应的抑制作用。琼脂糖凝胶中泳道的内容物如下：
泳道#    描述
1        100-bp标记
2        水
3        100mM氢氧化钠
4        100mM氢氧化钾
5    200mM碳酸钠
6    Oragene溶液
7    100-bp标记
发明详述
如下文将要详细描述的，本发明涉及从体液如唾液中提取并保存DNA的含水组合物和方法，其中所得组合物中的DNA在室温保持稳定至少14天。本发明的组合物允许释放自唾液或其它体液的DNA直接用于核酸扩增反应而无需任何其它的处理步骤。
如本文所用的，术语“约”指化学品的指定值的+/-10％或其显然的等同量。
如本文所用的，术语“体液”指来自动物的天然存在的液体，如唾液、痰、血清、血浆、血液、尿液、粘液、胃液、胰液、***、哺乳期或月经产物、泪液或淋巴。
如本文所用的，术语“粘蛋白”指增加介质(medium)粘性的任何粘蛋白(mucoprotein)，所述介质围绕着分泌所述蛋白的细胞。
如本文所用的，术语“类粘蛋白(mucoid)”指含有粘蛋白的任何体液。
如本文所用的，术语“核酸”指核苷酸链，包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，通常天然地存在于染色体(chromosomes)、染色质(chromatin)、线粒体(mitochondria)、细胞质(cytoplasm)、核糖体(ribosomes)、细菌(bacteria)、真菌(fungi)和/或病毒(viruses)中。
如本文所用的，术语“DNA聚合酶”指经由引物结合以及随后的核苷酸并入而催化脱氧核糖核酸合成的酶。适宜的聚合酶包括但不限于获得自大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶I、获得自大肠杆菌的DNA聚合酶的克列诺片段(Klenow fragment)、T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T.litoralisDNA聚合酶、Tth DNA聚合酶以及Pfu DNA聚合酶。
如本文所用的，术语“引物”指在DNA模板、用于聚合的试剂等存在时充当合成开始的起点的寡核苷酸。尽管引物优选为单链的，但也可使用双链引物。当使用双链引物时，在用于扩增反应前期望将其转变为它们的单链形式。用熟知的方法可以合成引物或者可将其从生物体分离。
如本文所用的，术语“唾液”指任何唾液腺的分泌物(secretion)或分泌物的组合，所述唾液腺包括腮腺、下颚下腺以及舌下腺，任选地与来自排列在口中的许多小的唇腺(labial glands)、颊腺(buccal glands)以及腭腺(palatalglands)的分泌物混合。
如本文所用的，术语“痰”指包含于哺乳动物的口腔或鼻腔中或者从哺乳动物的口腔或鼻腔中排出的粘液样物质，包括唾液以及呼吸道包括肺中的排出物(discharges)。
如本文描述唾液样品中的核酸所使用的，术语“稳定的”指该核酸维持PCR扩增成为可检测产物的能力。例如，如果在与本发明的含水组合物混合至少14天后，PCR产物是可获得的，那么就认为唾液样品中的核酸保持稳定至少14天。
如本文所用的，术语“受试者”指动物或人类。理想地，受试者是能产生用于本发明核酸检测目的的唾液的哺乳动物，最理想地，受试者是人。
组合物
本发明的组合物用于从体液中提取核酸并在室温将包含在其中的核酸保持稳定至少14天。在优选的实施方案中，体液是唾液。本发明的组合物还允许在扩增反应中直接使用提取的核酸而无需进一步处理包含核酸的组合物。具体地，当将构成总反应体积的至少2％的部分加入扩增反应时，该组合物的组分处于允许核酸扩增的足够低的浓度。如本文所用的术语“处理”指用于从保存的组合物中分离或纯化核酸的机械或化学步骤。
基于各种标准，例如费用(cost)、可用性(availability)、下游应用(downstream application)和安全(safety)，进行组合物的具体组分的选择。如为本领域熟练的技术人员所容易理解的，组分的浓度足够高以在室温使获得自体液的核酸稳定至少14天，而不干扰含有核酸的组合物的一部分在扩增反应中的直接使用。例如当唾液样品与本发明的组合物1∶1(v/v)混合时，组合物由溶于水中的100mM NaOH组成，将一定量的组合物/体液加入扩增反应中以使其构成总反应体积的2％至20％(即，本发明的组合物构成总体积的2％至20％)，此时没有观察到核酸扩增的抑制。
生物样品中核酸不稳定的主要原因是脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的存在。脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶是分别分解DNA或RNA的酶。在消化道(digestive tract)中它们的主要来源是胰腺的分泌物，尽管较低的量可存在于唾液以及唾液腺和口腔粘膜的细胞内。另外，居留于口腔内或来自最近摄入的食物的微生物可释放脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶。随着时间的推移，预计保存在水中的唾液样品内的核酸将分解或降解成较小的片段。
理想地，组合物提供核酸酶，包括脱氧核糖核酸酶的抑制，和核酸的化学稳定。通过使用变性剂、蛋白酶和/或加热来实现核酸酶抑制。通过使用pH缓冲剂(pH buffrs)维持适当的pH和/或使用螯合剂阻止金属氧化还原循环现象或金属离子与核酸的磷酸骨架(phosphate backbone)的结合现象，可实现唾液样品中核酸的化学稳定。
通过破坏这些酶(蛋白质)的复杂结构的变性剂，可抑制脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的作用。因此，变性剂可包括在本发明的组合物中。适宜的变性剂的非限制性实例是十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate(SDS))。
低特异性的蛋白酶，如蛋白酶K，经常用于消化蛋白质。在本发明的一个实施方案中，在与唾液混合之前、之后或同时，将蛋白酶加入组合物。因为蛋白酶本身是蛋白，可通过变性剂抑制它们的作用。因此，必须在变性剂浓度之间达到平衡，一方面该变性剂抑制脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶并使唾液中其它的蛋白变性，另一方面不显著地抑制蛋白水解酶。
本发明的方法任选地包括加热包含唾液的混合物的步骤。唾液样品的加热(在45-90℃范围)可充当“反”变性剂，特别是当与变性剂组合使用时。即，已发现如果与热变性作用组合，可使用较低浓度的化学变性剂。任选地，为了改进DNA的释放和提高扩增反应的产量，在扩增步骤前，本发明的方法包括加热步骤。可以理解该可选的加热步骤未构成用于分离或纯化样品中核酸的“处理”步骤。
DNA对金属离子具有很强的亲和性，其中的一些，例如普通的过渡金属铁或铜，能催化活性氧种类(reactive oxygen species)的形成。因此，本发明的一个实施方案提供了含有一个或多个螯合剂的组合物，该螯合剂能与金属离子形成复合物(complexs)以阻止它们与DNA结合，除去已经与DNA结合的金属离子，或能足够强地结合金属离子以抑制它们的氧化还原循环，并因此抑制活性氧种类的形成。螯合剂的量或浓度依赖于螯合剂的强度，其需要以经验确定。环己二胺四乙酸(Cyclohexanediamine tetraacetate(CDTA))是通常所用的螯合剂。在具体的实例中，使用20mM的CDTA；然而，技术人员能理解并容易测定可能适当的CDTA的其它浓度。
认为DNA的化学骨架和嘌呤碱基在稍微碱性的pH中是最稳定的，当处于约7-11的pH范围内并且理想地在约8的pH时，具有通常识别的最佳的稳定性。低于约6的pH时，可发生脱嘌呤作用(即嘌呤碱基从磷酸脱氧核苷骨架的自发丢失)。高于约10的pH时，可发生氨基从胞嘧啶自发丢失，由此将胞嘧啶转变为尿嘧啶。高于约12的pH时，DNA变性，将DNA从双链形成转变为单链形式。相比之下，RNA在5.0至7.0的pH范围内，理想地在6.5至6.8的pH最稳定。因此，在本发明的一个实施方案中，通过包含缓冲剂，理想地为将pH最佳控制在约5至11的范围内的那些缓冲剂，来维持组合物的pH。在pH范围6.5至9.5内适宜的缓冲剂的一个非限制性实例是Tris盐酸(Tris hydrochloride)。
依据本发明的一个实施方案，组合物包含变性剂以及任选地蛋白酶K、螯合剂和pH缓冲剂以将pH维持在7-11的范围内。
依据本发明可选的实施方案，组合物不含有变性剂、蛋白酶K、螯合剂或pH缓冲剂。而是通过维持碱性pH来实现核酸酶的抑制及DNA的提取和保存。
令人惊讶地，已发现体液如唾液与含有碱性剂的含水组合物的混合物能从体液中释放DNA，使得释放的DNA能在PCR反应中起到模板的作用，所述碱性剂例如碱金属氢氧化物(alkali metal hydroxide)、可溶的碱土金属氢氧化物(soluble alkaline earth metal hydroxide)、碱金属氧化物(alkali metaloxide)或有机碱(organic base)。虽然不期望受限于理论，认为通过维持碱性pH，组合物实现蛋白质的变性、核酸酶的抑制以及DNA的提取和保存。在选择适当的碱(base)中，可以理解的是，含有与DNA起反应的或干扰扩增反应中所用的DNA聚合酶的金属的碱，不适用于本发明的组合物中。
依据本发明具体的实施方案，用于从唾液中提取并保存DNA的组合物是50mM至400mM的氢氧化钠(NaOH)溶液。
如上文所述的(noted)，为了直接用于扩增反应，必须确保本发明的组合物中各种组分的浓度为不抑制扩增反应的浓度。测定组分对扩增反应的干扰的方法实例是在扩增反应中包含组合物的分级浓度(gradedconcentration)，以测定可加入反应中而不抑制反应的组合物的最大量。此类方法的另一个实例包括首先将组合物和唾液组合，然后在PCR扩增反应中包括唾液/组合物的混合物的分级体积(graded volumes)，以测定加入反应中而不抑制反应的唾液/组合物的混合物的最大量。
对于PCR或其它扩增反应中可容忍的组分的量，一旦完成测定，此信息用于计算包括于本发明组合物中的量。
方法
依据本发明的另一方面，提供了保存和扩增源自唾液的核酸样品的方法。该方法包括如下步骤：将唾液样品与本发明的组合物混合，随后将所得的含有唾液的混合物的等分试样与扩增反应混合物混合，和扩增含有唾液的混合物的等分试样中的核酸。
为了从受试者采集唾液，在取样前优选冲洗口腔。食物颗粒能引入外来的DNA(foreign DNA)并且通过接吻转移的唾液可为外来的人DNA的来源。用约50ml的温水(tepid water)通过发出有力的嗖嗖声或通过用无牙膏的牙刷洗刷来冲洗口腔。非受激唾液(unstimulated saliva)通常是粘液型的并且以低速率分泌。受激唾液(stimulated saliva)(期望可口的食物、甜或者酸的糖果)是水样(如水的)类型的并以较快的速率分泌。已发现在2ml非受激唾液中比在2ml受激唾液中存在更多的DNA。冲洗口腔并等待约2-3分钟以使口腔(mouth)清除水后，供者可将一定体积(例如，约1ml)“未受激”的唾液吐至接受管(receiving tube)。如果证明这是困难的，可用一些蔗糖颗粒或不干扰DNA稳定性或后续扩增的任何其它的此类唾液刺激物方便地刺激唾液流(saliva flow)。
本发明的方法任选地包括加热含有唾液的混合物的步骤。加热唾液样品(在45至90℃的范围内)可充当“反”变性剂，特别是当将其与变性剂组合使用时。也就是说，已发现如果与热的物理变性作用组合，可使用较低浓度的化学变性剂。因此，为了改善DNA的释放和提高扩增反应的产量，在扩增步骤之前，本发明的方法包括任选的加热步骤。
通过以试剂盒的形式提供用于此类方法的组合物，可便利地实施本发明的方法。这样的试剂盒优选含有适当的溶液、酶、盐或洗涤剂(或其等同物)。可提供至少一种正向标准(positive standard)并且可包括在靶基因或DNA的检测中有用的核酸(DNA或RNA)模板，或者引物。
任选地试剂盒包括容器(container)，如描述于国际PCT申请号WO03/104251的容器，该容器含有本发明的组合物并且其适宜唾液采集。
为了获得本文所述的本发明的较好理解，列出下列实施例。可以理解这些实施例仅用于示例性目的。因此，它们不应以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：从能遵循说明书的受试者中获得唾液样品的规程
在最近进食前，指示受试者等待30-60分钟。如果可能，受试者在不用牙膏的情况下刷牙。受试者用50ml的凉水或温水漱他的/她的口。要求受试者等待2分钟以便使口腔清除水，然后将唾液吐至专门的收集管中，直到唾液的量达到1ml的标记。最近进食和漱口后等待是理想的，但并非是必须的。唾液采集可花费几分钟。如果受试者发现他/她不能给出足够的唾液，给他/她一些蔗糖颗粒咀嚼，并告知如果将一些糖吐至收集管中不必担心。
出于比较两个组合物的目的，当从供者采集两个或更多个样品时，要求供者交替在两个或更多个收集管之间给出小量唾液，直到将每一个收集管装至1ml的标记。这是必须的，因为唾液的组分在吐的过程中能改变。
当采集了所需量的唾液后，将其与1ml的含水组合物混合。将含水组合物引入的精确方式依赖于容器设计。一旦将含水组合物引入，就将容器牢固地加盖。可将含有DNA的样品在室温维持至少14天。在任何时间最多至14天，可将一部分水溶液中的含有DNA的样品用作直接加入PCR反应中的DNA模板。
实施例2：唾液中DNA的稳定性和具有加热步骤的源自唾液的DNA 的PCR扩增
方法
用描述于实施例1中的规程，从单个供者采集唾液，并将个体的唾液样品与溶液1∶1混合，该溶液由20mM CDTA、400mM NaOAc(醋酸钠)、200mM Tris-HCl、0.05％SDS(十二烷基硫酸钠)；pH调至8.0组成。然后将20μL蛋白酶K(1mg/mL的浓度)加入这种混合物(10μg/mL终浓度)。将样品涡旋(vortex)，然后将其在室温(大约24℃)静置。在第1天、第14天和第365天，在60℃温育1小时后，将2μl唾液/溶液样品直接加入标准的50μlPCR反应中。
PCR条件
在Eppendorf MastercyclerTM梯度PCR仪中进行PCR反应。总反应体积为50μL。每个反应含有Invitrogen PCR Mastermix加Tris-HCl(pH8.0，10mM终浓度)、MgCl2(2mM终浓度)、4种dNTPs的每种(400μM终浓度)、用于胸苷酸合成酶基因560bp片段的10pmoles每种PCR引物(正向：5’-ATGCTTAGTAGGCAATTCTG-3’，反向：5’-TTTGGTTGTCAGCAGAGG-3’)以及2个单位的Taq DNA聚合酶。
热循环条件由以下组成：94℃ 1分钟的1个循环；94℃ 30秒、55℃ 60秒、72℃ 120秒的30个循环；72℃ 4分钟的1个循环。
琼脂糖凝胶电泳
将来自每个PCR反应的8μl加样于1％琼脂糖凝胶上。将100-bp阶梯(ladder)用作标记。电泳后，用溴化乙锭(1μg/ml，15分钟)将琼脂糖凝胶染色，并在300nm透照(transillumination)下，使用UVP Digi Doc-itTM System拍照。
总结
如图1所示，当将来自唾液的DNA与组合物1∶1混合并在室温保存1、14和365天时，来自唾液的DNA是稳定的。
实施例3：唾液中DNA的稳定性和源自唾液的DNA的PCR扩增
方法
用实施例1中描述的规程从单个供者采集唾液，并且个体的唾液样品与下列各溶液1∶1混合：
-水
-100mM NaOH(氢氧化钠)
-100mM KOH(氢氧化钾)
-200mM Na2CO3(碳酸钠)
将样品涡旋并将其在室温(大约24℃)静置。在第1天、第7天、第14天、第21天和第365天，将2μl的唾液/溶液样品直接加入标准的50μl PCR反应。
PCR条件
PCR反应条件与实施例2中的相同。热循环条件与实施例2中的相同。
琼脂糖凝胶电泳
如实施例2所述，进行琼脂糖凝胶电泳。
总结
如图2所示，当将来自唾液的DNA与100mM NaOH、100mM KOH以及200mM Na2CO3 1∶1混合并在室温保存1、7、14、21和365天时，来自唾液的DNA是稳定的并且可用于PCR。
实施例4：在PCR反应中非抑制性的氢氧化钠浓度的测定
方法
设置一系列9个PCR反应管，每管具有不同终浓度的NaOH。如图3所示，NaOH终浓度的变化范围为0至14mM。这相当于50至400mM的起始浓度(即1ml的400mM NaOH加1ml的唾液；然后将2μl的这种混合物用于50μl的PCR反应中)。为了分离NaOH的效果，不将唾液加入反应管中。
PCR条件
除了NaOH外，每个反应含有KCl(50mM终浓度)、Tris-HCl(30mM终浓度，pH8.4)、MgCl2(2mM终浓度)、4种dNTPs每种(400μN终浓度)、胸苷酸合成酶基因560bp片段的10pmoles每个PCR引物(正向：5’-ATGCTTAGTAGGCAATTCTG-3’，反向：5’-TTTGGTTGTCAGCAGAGG-3’)和2个单位的Taq DNA聚合酶。加入50ng纯化的对照人DNA(来自唾液，用OrageneTM采集和纯化)作为模板。在Eppendorf MastercyclerTM梯度PCR仪中进行PCR反应。总反应体积为50μl。热循环条件与实施例2中的相同。
琼脂糖凝胶电泳
如实施例2所述，进行琼脂糖凝胶分析。
总结
如图3所示，8mM NaOH是NaOH的最高终浓度，其可用于50μl常规的PCR反应中，而不强烈地抑制反应。这相当于用在PCR之前用唾液样品1∶1稀释的400mM NaOH的起始浓度。
实施例5：在PCR反应中非抑制性的NaOH/唾液混合物体积的测定
方法
从单个供者采集1ml唾液并将其与等体积的100mM氢氧化钠溶液混合。将样品涡旋并保存在室温。在室温保存7天后，移出等分试样并将其加入标准的50μl PCR反应。等分试样体积的变化范围为1至20μl。
PCR条件
PCR条件与实施例2中的相同。将总反应体积保持恒定在50μl。热循环条件与实施例2中的相同。
琼脂糖凝胶电泳
如实施例2所述，进行琼脂糖凝胶分析。
总结
如图4所示，可将多至10μL的NaOH/唾液混合物加入50μl的常规PCR反应而不抑制反应。
实施例6：OrageneTM对PCR反应的抑制
OrageneTM(DNA Genotek Inc.)为唾液采集装置(collection device)，其含有在室温稳定唾液中的DNA的水溶液。
方法
将100mM氢氧化钠、100mM氢氧化钾、200mM碳酸钠或者OrageneTMDNA-保存溶液用蒸馏水1∶1稀释，并且将2μl每种稀释的组合物加入标准的PCR反应。
PCR条件
PCR条件与实施例2中的相同。热循环条件与实施例2中的相同。将50ng纯化的DNA加入各个反应中作为模板。
琼脂糖凝胶电泳
如实施例2所述，进行琼脂糖凝胶分析。
总结
如图5所示，OrageneTM DNA保存溶液对PCR是抑制性的。相比之下，此实施例证明可将氢氧化钠、氢氧化钾以及碳酸钠组合物直接加入PCR反应中而不抑制反应。
实施例7：对从唾液中提取DNA的改进
French等(French et al.(2002)Molectular and Cellular Probes.16：319-326)用水1∶1稀释了新鲜完整的唾液并将这种混合物用于定量实时PCR。稀释的唾液样品立即使用或者在4℃(2至3天)或-20℃保存。发现可用于实时PCR的样品中DNA的计算浓度在0.1ng/μl和3.5ng/μl之间，在得自不同个体的样品间变化。
表I、II以及III中的实例显示本发明的组合物从唾液中比从唾液和水的混合物中产生明显更多可用的DNA。
方法
从单个供给者采集1ml唾液并与1ml100mM氢氧化钠、100mM氢氧化钾、200mM碳酸钠或者蒸馏水混合。将混合物保存在室温。在第1天(表I)、第14天(表II)和第365天(表III)，按下文所述将1μl每种混合物直接加入实时PCR反应中。
另外，采集1ml来自同一个供者的唾液并与20mM CDTA；400mMNaOAc(醋酸钠)；200mM Tris-HCl、0.05％SDS；pH调至8.0的溶液混合。唾液采集后且保存前(storate)，将20μl蛋白酶K(1mg/ml的浓度)加入混合物中(10μg/mL终浓度)。将样品保存在室温。在第1天、第14天和第365天，在60℃温育1小时后，如下文所述，将1μl这种混合物直接加入实时PCR反应中。
实时PCR条件
在Rotor-GeneTM 3000实时热循环仪(Corbett Research)中进行实时PCR反应。总反应体积是25μl。
每个反应含有KCl(50mM终浓度)、Tris HCl(20mM，pH8.4)、MgCl2(3mM)、4种dNTPs每种(400μM)；5pmoles每个引物以产生人胸苷酸合成酶基因的143bp片段(正向引物：5’-GCCCTCTGCCAGTTCTA-3’，反向引物5’-TTCAGGCCCGTGATGT-3’)、2个单位的Taq DNA聚合酶、SYBR Green I染料(分子探针)，1∶25,000终浓度。
热循环条件为：96℃ 5分钟的1个循环；95℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃30秒的40个循环。解链曲线分析条件由以下组成：72-97℃；72℃ 45秒，接着每摄氏度5秒至97℃。
用已知浓度的纯化DNA构建标准曲线。
结果
参考标准曲线，用Rotor GeneTM 3000软件自动计算输入样品的DNA浓度。
表1-第1天的实时PCR结果
组合物 实时PCR的阈值交叉点(Ct) 基于Ct值计算的输入样品的DNA浓度(ng/μl)
对照DNA，30ng/μL  21.06  26.80
对照DNA，15ng/μL  22.14  14.43
对照DNA，7.5ng/μL  23.21  7.84
对照DNA，3.75ng/μL  24.06  4.84
对照DNA，1.90ng/μL  25.83  1.76
组合物 实时PCR的阈值交叉点(Ct) 基于Ct值计算的输入样品的DNA浓度(ng/μl)
对照DNA，1.00ng/μL 26.67  1.09
对照DNA，0.50ng/μL 28.31  0.43
无模板  0
水+唾液 34.6  0.01
CDTA/SDS/NaOAC/Tris+唾液 23.33  7.32
100mM氢氧化钠+唾液 23.54  6.51
100mM氢氧化钾+唾液 24.96  2.89
200mM碳酸钠+唾液 25.19  2.54
表II-第14天的实时PCR结果
组合物 实时PCR的阈值交叉点(Ct) 基于Ct值计算的输入样品的DNA浓度(ng/μl)
 对照DNA，30ng/μL  20.56  25.88
 对照DNA，15ng/μL  21.2  17.71
 对照DNA，7.5ng/μL  22.44  8.50
 对照DNA，3.75ng/μL  23.97  3.45
 对照DNA，1.90ng/μL  25.07  1.80
 对照DNA，1.00ng/μL  26.19  0.92
 对照DNA，0.50ng/μL  27.11  0.54
 无模板  0
 水+唾液 31.81  0.03
 CDTA/SDS/NaOAC/Tris+唾液 23.62  4.23
 100mM氢氧化钠+唾液 23.01  6.06
 100mM氢氧化钾+唾液 24.12  3.15
 200mM碳酸钠+唾液 24.02  3.35
表III-第365天的实时PCR结果
组合物 实时PCR的阈值交叉点(Ct) 基于Ct值计算的输入样品的DNA浓度(ng/μl)
对照DNA，30ng/μL  21.21  27.91
对照DNA，15ng/μL  22.11  16.32
对照DNA，7.5ng/μL  23.43  7.44
对照DNA，3.75ng/μL  24.68  3.52
对照DNA，1.9ng/μL  25.5  2.15
对照DNA，1.0ng/μL  26.81  0.99
对照DNA，0.5ng/μL  28.04  0.47
无模板  33.99  0.01
水+唾液  0
CDTA/SDS/NaOAc/Tris+唾液  23.51  7.07
100mM氢氧化钠+唾液  26.06  1.54
100mM氢氧化钾+唾液  26.48  1.20
200mM碳酸钠+唾液  25.35  2.35
总结
此研究的目的是证明，与单独使用水保存DNA相比，用于保存DNA的本发明组合物的改进的性能。可以理解，本研究中所用的实时PCR技术仅仅是半定量的，并且，由于此技术中固有的错误程度，计算的DNA的浓度值可不是实际的DNA浓度。然而，如本领域熟练的技术人员所容易理解的，这种方法在试验的样品之间的确提供了准确的比较。
如表I、II以及III所示，当将唾液在水中保存1、14或365天时，存在通过实时PCR可检测的可以忽略的DNA。相反，在本发明的各种组合物中DNA的浓度范围在第1天为2.54至7.32ng/μL(表I)、在第14天为3.15至6.06ng/μL(表II)以及在第365天为1.20至7.07ng/μL(表III)。
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请表示本发明所属技术领域的技术人员的技术水平，并且通过引用并入本文，其程度如同具体而单独地显示每个单独的出版物、专利或专利申请以通过引用并入。
虽然如此描述了本发明，但显然可以多种方式改变本发明。并不认为这些改变偏离了本发明的精神和范围，并且，如对本领域技术人员所显而易见的，所有这些修饰意欲包括在如下的权利要求的范围中。

Claims (21)

1.用于从体液样品中提取核酸的含水组合物，使得所述样品中的所述核酸与所述含水组合物混合后在室温保持稳定至少14天，其中当将所述组合物以扩增反应混合物总体积的至少2％的量加入至所述扩增反应混合物时，所述组合物不抑制核酸扩增。
2.根据权利要求1的含水组合物，其中所述体液是唾液。
3.根据权利要求1或2的含水组合物，其含有：
(a)变性剂；
(b)螯合剂；
(c)缓冲剂；和
(d)蛋白酶。
4.根据权利要求3的含水组合物，其中所述变性剂是SDS，所述螯合剂是CDTA，所述缓冲剂是TrisHCl，以及所述蛋白酶是蛋白酶K。
5.根据权利要求4的含水组合物，其含有0.05％SDS、20mM CTDA、200mM TrisHCl pH8.0、400mM NaOAc和10μg/ml蛋白酶K。
6.根据权利要求1或2的含水组合物，其含有碱性剂。
7.根据权利要求6的含水组合物，其中所述碱性剂是碱金属氢氧化物、可溶的碱土金属氢氧化物、碱金属氧化物或有机碱。
8.根据权利要求7的含水组合物，其中所述碱性剂选自下组：氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钠。
9.根据权利要求8的含水组合物，其中所述碱性剂是以50mM-400mM的浓度存在的氢氧化钠。
10.根据权利要求9的含水组合物，其中所述浓度是约100mM。
11.根据权利要求8的含水组合物，其中所述碱性剂是以约100mM的浓度存在的氢氧化钾。
12.根据权利要求8的含水组合物，其中所述碱性剂是以约200mM的浓度存在的碳酸钠。
13.根据权利要求9的含水组合物，其中当将所述组合物以扩增反应混合物总体积2％-10％的量加入至所述核酸扩增混合物时，所述组合物不抑制核酸扩增。
14.根据权利要求2-13任一项的含水组合物，其中所述核酸在室温保持稳定至少365天。
15.直接从体液扩增DNA的方法，其包括：
a)将体液样品与等体积的根据权利要求1的含水组合物混合；
b)将一部分步骤(a)中形成的混合物进行PCR扩增。
16.根据权利要求15的方法，其中所述体液是唾液。
17.根据权利要求15的方法，其中所述步骤(a)中形成的混合物在室温稳定至少14天。
18.根据权利要求15的方法，其中所述步骤(a)中形成的混合物在室温稳定至少365天。
19.权利要求15-18任一项的方法，另外包括在步骤(b)之前将所述混合物在约45℃至80℃的温度加热约15至60分钟的步骤。
20.用于从体液中扩增DNA的试剂盒，其含有：
a)根据权利要求1的含水组合物；和
b)其使用说明书。
21.根据权利要求16的试剂盒，其中所述体液是唾液。
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