DE60018431T2

DE60018431T2 - Verfahren zum Einfangen luftgebundener Mikroorganismen mittels wasserlöslicher Polymere

Info

Publication number: DE60018431T2
Application number: DE60018431T
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Drocourt; Les Tongham Dodd; Andrew I. 25 The Stand Cooper; Philippe Cornet
Original assignee: Chemunex SA
Current assignee: Chemunex SA
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2020-11-25
Also published as: ES2238979T3; DE60121206D1; CA2429652A1; ATE290066T1; US20040043453A1; EP1209223B1; ES2266287T3; WO2002042410A3; DE60018431D1; JP2004514430A; EP1335970B1; DE60121206T2; ATE331781T1; US7384762B2; EP1209223A1; WO2002042410A2; JP4371195B2; EP1335970A2; AU2002234577A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfangen und Einschließen von Mikroorganismen in der Luft mittels wasserlöslicher Polymere. Insbesondere können die wasserlöslichen Polymere als Träger zum Erhalten von lebensfähigen und nicht lebensfähigen Mikroorganismen für die weitere Analyse verwendet werden. Ein schnelles und sensibles Verfahren zum Erstellen der Zahl von in der Luft vorhandenen Mikroorganismen für eine Sterilitätsprüfung wird auch offenbart.
Hintergrund der Erfindung
Polymere bestehen aus Ketten von chemischen Grundeinheiten, die natürlich oder auf Grund ihrer chemischen Zusammensetzung auftreten. Sie können so angepasst sein, dass sie durch die Kontrolle über den chemischen Aufbau und das Gewicht synthetische Polymere bilden.
Synthetische Polymere ergeben durch cherrische Reaktion von Monomeren lange Polymerketten. Die beiden Hauptvariablen, die die physikalischen Eigenschaften von synthetischen Polymeren beeinflussen, sind die chemische Beschaffenheit der Monomer-Grundeinheiten und das Molekulargewicht des Polymers, die genau gesteuert werden können. Es ist daher bekannt, dass Polymere mit höheren Molekulargewichten eine größere mechanische Festigkeit aufweisen, in Lösung aber viel viskoser sind.
Durch ein Verändern des Verhältnisses von chemischen Gruppen im Polymer kann man die physikalischen Eigenschaften des Polymers an bestimmte Anwendungen anpassen. Zum Beispiel kann die mechanische Festigkeit und Löslichkeit der Polymere auf diese Weise angepasst werden.
Durch Mischen von unterschiedlichen Polymerarten können Charakteristika des fertigen Copolymers optimierte Eigenschaften zeigen. Durch die Konstruktion und Synthese von bestimmten Polymeren können Materialien mit genau den Eigenschaften, die für eine bestimmte Funktion benötigt werden, erzeugt werden. Zum Beispiel kann die Oberfläche einer Polymerplatte (90 mm) durch eine bestimmte Behandlung von 1 m² auf 1.500 m² erhöht werden. Dieses einfache Verfahren steigert die physikalischen und biologischen Charakteristika des Polymers zu einem wirksameren Mechanismus für die Wiedergewinnung von ökologischen Organismen.
Wasserlösliche Polymere sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden von Prokop u.a. in „Water Soluble Polymers for Immunoisolation I: Complex Coacervation and Cytotoxicity" in Advances in Polymer Science, 136, Seite 53–73 (1998) beschrieben. Diese Polymere weisen eine Vielzahl von Verwendungen auf, wie beispielsweise als künstliche Herzen, Immunisolationsbarrieren, zur Schmerzkontrolle bei Krebspatienten im Endstadium und bei der Verkapselung von Langerhans-Inseln.
Neben den medizinischen Verwendungen wird polymeres Material auch in Laboratorien für viel Zubehör, wie beispielsweise Reagenzgläser, Probebehälter, Pipettenspitzen, Wegwerfpipetten und dergleichen, benutzt.
Zum Beispiel wurden als fester Träger verschiedene Polymere bei einem Verfahren zum Nachweisen von DNA in einer Zelle verwendet, während die Morphologie des Kerns bewahrt wurde, wie im US-Patent 5 501 954 beschrieben. Bei diesem Verfahren wurde die DNA auf ein Polymermembranfilter gelegt, mit einer fluoreszenzmarkierten Probe inkubiert und mittels einer markierten Sonde nachgewiesen. Die verwendeten Polymermembranen bestanden aus Polycarbonat, Polyvinylidenfluorid, Polysulfon, Nylon, Celluloseestern, Nitrocellulose und Teflon^® (PTFE). Die in diesem Patent beschriebenen Polymermembranen sind wasserlösliche Polymere, da eine der Anforderungen für dieses Verfahren darin besteht, dass die Polymermembranen das Zellmaterial durch eine Reihe von Behandlungen und Waschungen zurückhalten und trotzdem intakt bleiben müssen.
Die EP 546 032 beschreibt ein Verfahren zur Immobilisierung von Molekülen, Polymeren oder Mikroorganismen durch Mischen mit einer wässrigen Lösungsdispersion eines Polymers und Anwenden des Gemischs auf einen zusammenhängenden Film. Die gebildeten Membranen sind in Wasser unlöslich und können trocken gelagert werden.
Das US-Patent 5 855 652 offenbart eine Vorrichtung zum schnellen Sammeln von Aerosolen mit festen Partikeln und Mikroorganismen aus großen Luftvolumina. Dieses US-Patent offenbart nicht die Verwendung von wasserlöslichen Polymeren zum Sammeln von Mikroorganismen aus Luftproben.
„Monitoring Airborne Microorganisms during Food and Beverage Processing" in der technischen Zusammenfassung von Millipore Corporation, "New Brunswick Slit-to Agar Biological Air Sampler" auf der Online-Webseite von New Brunswick Scientific Corporation und die GB 1 441 576 beschreiben die Verwendung von Agar in bestimmten Einrichtungen, um Proben von Mikroorganismen aus der Luft zu nehmen. Diese Literaturhinweise beschreiben nicht die Verwendung von wasserlöslichen Polymeren mit einem Wasser-Gleichgewichtsgehalt von 1 % bis 50 %.
Die EP-A-0 845 480 offenbart Polyvinylpyrrolidonhydrogele, die vernetzt und daher wasserfest sind.
Die Analyse von Mikroorganismen ist für viele unterschiedliche Bereiche, zum Beispiel für Nahrungsherstellung, das Trinkwasser, pharmazeutische Anwendungen bei der Arzneistoffherstellung, für die kosmetische Analyse, in der Elektronikindustrie und für die Analyse von medizinischen Anwendungen, wichtig.
Proben zum Testen von verschiedenen Mikroorganismen werden im Allgemeinen zum Beispiel mit Wattetupfern gesammelt und zur Analyse an ein Laboratorium geschickt. Das Analyseverfahren erfordert, dass die Proben zuerst gezüchtet werden.
Alternativ sind schnelle Verfahren zur Analyse von Mikroorganismen unter Verwendung von Biosensoren auch auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel offenbart die WO 9931486 Biosensoren mit einem Polymerfilm, der mit einem Metall beschichtet ist, und einer gestalteten, auf das beschichtete Metall aufgedruckten Rezeptorschicht, auf der sich ein aufnahmefähiges Material befindet, das den Analyten spezifisch bindet. Der Umfang an Mikroorganismen, die an den Biosensor angeheftet wurden, wurde über ein Beugungsbild nach Bestrahlung mit einem Laser gemessen.
Eine andere Art von Biosensor ist in der WO 982747 offenbart, umfassend einen mit einem Metall beschichteten Polymerfilm und eine sich selbst zusammenfügende Monoschicht mit einem darauf befindlichen aufnahmefähigen Material, das für einen Analyten spezifisch ist und auf den Film aufgedruckt ist. Die sich selbst zusammenfügende Monoschicht wird so zu einer Struktur gedruckt, dass, wenn der Biosensor den Analyten bindet, der Biosensor ausgesendetes Licht beugt, um ein Muster auszubilden.
Es ist zu erkennen, dass, obwohl Biosensoren verschiedene Mikroorganismen in der Umgebung nachweisen können, die Messung eines Beugungsmusters oft unrichtig oder ungenau ist und es ihm an Empfindlichkeit mangelt.
Darüber hinaus sind in vielen Bereichen der Mikrobiologie nicht die Gesamtzahlen sondern die Bestimmung der Zahl von aktiven Mikroorganismen von großer Wichtigkeit. Leider wird weithin beobachtet, dass herkömmliche Kulturverfahren die Fraktion von richtigen lebensfähigen Mikroorganismen unterschätzen und dass die Gesamtzahlen, die alle Mikroorganismuspartikel zeigen, diese Fraktion überschätzen.
Zusätzlich zu den Problemen, die mit dem Erhalt einer genauen Zahl von in einer Probe vorliegenden Mikroorganismen verbunden sind, ist auch bekannt, dass Kulturverfahren auf einem Kulturmedium zeitaufwändig sind und im Allgemeinen zwischen etwa 18 Stunden und 20 Tagen erfordern, um ein Ergebnis zu erhalten. Die Verwendung von herkömmlichem Kulturmedium ist nicht spezifisch und natürlich, daher also veränderlich und nicht gesteuert.
Ein Verfahren, das das Erfordernis des Züchtens von Mikroorganismen nach deren Probenahme überwindet, ist in der EP 0 816 513 A1 beschrieben. Diese Literatur offenbart die Verwendung einer druckempfindlichen Klebefolie zum Sammeln von Mikroorganismen auf Oberflächen, die die Mikroorganismen enthalten können. Die Klebefolie besteht aus einem Laminat aus einer Klebeschicht, die hauptsächlich aus einem wasserlöslichen Polymer besteht, und einer wasserdurchlässigen Membran, die den Durchtritt von Mikroorganismen nicht gestattet. Daher verlangt die EP 0 816 513 A1 , dass mindestens zwei Schichten der Klebefolie miteinander verbunden werden müssen, wobei eine Schicht dahingehend wirkt, dass sie die Mikroorganismen in einem Verfahren nach der Probenahme fängt.
Darüber hinaus erfordert die Probenahme des Mikroorganismus mit der druckempfindlichen Klebefolie, dass die Klebeschicht so in Kontakt mit der Oberfläche eines Testobjekts gebracht wird, dass eine Anhäufung von Mikroorganismen auf der Folie erreicht wird. Sogar eine visuelle Beobachtung von Mikroorganismen wird mittels eines chromagenen Mittels erzielt, das in der Klebeschicht oder im Wasser vorhanden ist, wobei das Verfahren nicht sehr empfindlich sein kann.
Die EP 0 816 513 A1 offenbart nicht, dass ihre Einrichtung zur Probenahme, die mindestens zwei laminierte Schichten erfordert, und/oder ihr Verfahren zum Nachweisen von Mikroorganismen für den Sterilitätstest von Luftproben, bei dem eine sehr hohe Empfindlichkeit für den Nachweis erforderlich ist, verwendet werden kann, und legt dies auch nicht nahe.
Es ist auf dem Fachgebiet weithin bekannt, dass das spezifische Überwachen und die Kontrolle von aseptischen Umgebungen für die Verarbeitung von Arzneistoffen, Dosisformen und in manchen Fällen medizinischen Einrichtungen erforderlich ist. Ein großer Teil von sterilen Produkten wird mittels aseptischer Verarbeitung hergestellt, da dieses Verfahren auf dem Ausschluss von Mikroorganismen aus dem Prozessstrom und der Verhinderung, dass Mikroorganismen während des Füllens in Behälter eindringen, beruht. Ein aseptisches Verarbeiten wird generell in Reinräumen durchgeführt, und die Umgebung wird immer sorgfältig überwacht.
Neben der Verwendung von aseptischen Bedingungen in der pharmazeutischen Industrie verwendet und überwacht auch die Elektronikindustrie Reinräume für die Herstellung von elektronischen Bauteilen, Computerchips, Computer-Bauteilen und dergleichen.
Der Unterschied bei der Überwachung der Umgebung zwischen diesen beiden Industrien besteht darin, dass bei der Elektronikindustrie nicht lebensfähige Mikroorganismen oder Teilchen allgemein gemessen werden und dass weniger Wert auf die Zahl der lebensfähigen Teilchen oder Mikroorganismen gelegt wird. Im Gegensatz dazu besteht bei der pharmazeutischen Industrie eine viel größere Sorge im Hinblick auf den Punkt von lebensfähigen Mikroorganismen.
Ein Verfahren einer Überwachung bei aseptischen Bedingungen besteht darin, die Gesamtpartikelzahl zu ermitteln. Dieses Verfahren liefert keine Informationen über den mikrobiologischen Gehalt der Umgebung. Die Haupteinschränkung von Teilchenzählern ist, dass sie nur Partikel von 0,5 μm oder größer messen. Wenn in der Luft schwebende Partikel nicht frei schwebend oder Einzelzellen sind, verbinden sie sich häufig mit Partikeln von 10 μm bis 20 μm, und deshalb wird von einer Prüfung nur auf Teilchenzahlen ohne Mikrobenzahlen abgeraten.
Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass Reinräume bestimmten Normen zu entsprechen haben. Tatsächlich sind Bedingungen für Luftwechsel pro Stunde und Geschwindigkeiten üblich, obwohl sie von US-Bundesnormen nicht umfasst sind. Daher sind zum Beispiel Räume der Klasse 100.000 in aseptischen Verarbeitungsumgebungen so konstruiert, dass sie ein Minimum von 20 Luftwechsel pro Stunde vorsehen, während Reinräume der Klasse 100 mehr als 100 Luftwechsel pro Stunde vorsehen. Durch Verdünnen und Entfernen von verunreinigenden Substanzen werden große Luftvolumen wahrscheinlich die Luftkontamination bei der aseptischen Herstellung reduzieren.
Es gibt bestimmte Richtlinien für die Reinheit der Luft, die für die unterschiedlichen Klassen eines Reinraums zu erfüllen sind. Daher müssen zum Beispiel für die Klasse 100 die laufenden Mittelwerte von allen Datenpunkten < 1 koloniebildende Einheit (cfu) pro Kubikmeter Luft sein und mindestens 85 % von allen genommenen Proben muss Null sein. Für Reinräume der Klasse 10.000 müssen mindestens 65 % von allen genommenen Proben Null sein und für die Klasse 100.000 müssen mindestens 50 % der Proben Null sein. Daher sind diese Werte sehr kritisch, um eine sichere Überwachung der Umgebung zu bieten.
Es gibt viele auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, um eine Probe von lebensfähigen, in der Luft schwebenden Mikroorganismen zu nehmen, wie beispielsweise den Schlitz-Agar-Probenehmer (slit-to-agar-sampler), den Siebimpaktor, den Zentrifugenprobenehmer, den Oberflächenluftsystem-Probenehmer und den Gelatinefilter-Probenehmer. Alle diese Probenehmer erfordern eine Pumpe, einen Motor oder ein Vakuum, das entweder Luft durch die Probenehmereinheit zieht oder drückt. Die Verwendung von diesen „aktiven" Probenahmeeinrichtungen kann unbequem sein, wenn es eine Raumbegrenzung in dem Reinraum gibt, da diese benötigten Raum einnehmen können. Darüber hinaus können diese Einrichtungen auch eine Gefahr für sichere aseptische Gegebenheiten darstellen, da sie den direktionalen Luftstrom auf Grund der Größe und der Lage des Geräts oder der Art, auf der die Anlage Luft in die Medien oder das Filter zur Probenahme drückt, unterbrechen können.
Eine andere Art von „nicht aktiven" Probenahmegeräten sind Absetzplatten. Absetzplatten sind eine leichte und kostengünstige Art, um die Luftumgebung über lange Zeiträume qualitativ zu bewerten. Absetzplatten bestehen aus Agar, die in Petrischalen angeordnet werden und in kritischen Bereichen nützlich sind, wo die Verwendung eines aktiven Probenahmegeräts hinderlich ist. Tatsächlich können Absetzplatten, wenn sie für Zeiträume von vier bis fünf Stunden ausgesetzt werden, eine Nachweisgrenze vorsehen, die ähnlich den bei aktiven Probenahmegeräten eingehaltenen sind.
Allerdings wird bei vielen dieser Verfahren Agar als Medium verwendet, um die Mikroorganismen zu fangen, und es ist bekannt, dass ein Mangel an Agar sowie eine Produktschwankung zu einer Suche nach einem geeigneten Ersatz für Agar geführt haben.
Weiterhin ist es auf dem Fachgebiet weithin bekannt, dass die Überwachung von Mikroorganismen unter aseptischen Bedingungen bis jetzt nicht perfektioniert ist. Variationen bei der Probenahmesensibilität und den Nachweisgrenzen können nicht nur den inhärenten Charakteristika des Probenahmeverfahrens selbst zugeschrieben werden, sondern auch der Veränderlichkeit der Medien, den Inkubationstemperaturen, der Probenahmehandhabung und einer zufälligen Kontamination der Proben.
Darüber hinaus wird die mikrobielle Bewertung von Reinräumen unter Verwendung von Verfahren durchgeführt, die nicht zu einer quantitativen Bewertung führen. Vielmehr können die verwendeten Verfahren bestenfalls als semiquantitativ definiert werden. Tatsächlich sind viele Verfahren nur zum Messen des Vorhandenseins von atypisch hohen Niveaus an mikrobieller Kontamination geeignet und ihre Genauigkeit und Präzision ist sehr schlecht.
Es gibt daher auf dem Fachgebiet der Umgebungsanalysen von Mikroorganismen einen Bedarf, nicht nur ein schnelles Analyseverfahren für Luftproben zur Verfügung zu stellen, sondern auch ein Mittel, um diese Analyse mit größerer Genauigkeit, insbesondere auf dem Gebiet der Sterilitätsprüfung, zu erzielen.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Probleme, die mit dem Stand der Technik verbunden sind, zu überwinden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, wasserlösliche Polymere zu verwenden, um Mikroorganismen in der Luft einzufangen und einzuschließen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein empfindliches Mittel für die Sterilitätsanalyse von Luftproben zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Polymer zur Verfügung zu stellen, das ausreichende mechanische Festigkeit besitzt, so dass es transportiert werden kann, in Wasser oder anderen physiologischen Verdünnungsmitteln löslich ist, bis zu einem bestimmten Grad Wasser zurückhält, während lebende Mikroorganismen in einem lebensfähigen Zustand gehalten werden, und Mikroorganismen aus der Luft einfangen kann.
Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum schnellen Nachweisen von Mikroorganismen in einer unbekannten Luftprobe zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweisen von Mikroorganismen in einer unbekannten Luftprobe zur Verfügung zu stellen, die nicht erfordert, dass der Mikroorganismus einem weiteren Züchten unterliegt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem das veränderliche und unkontrollierte System des Verwendens von Kulturmedium vermieden wird.
Diese und weitere Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung, wie die Zusammenfassung der Erfindung, die Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und die Ansprüche, erzielt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfangen und Einschließen von Mikroorganismen in der Luft für die Analyse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Gießen eines wasserlöslichen Polymers; und
(b) Aussetzen des wasserlöslichen Polymers einem Mikroorganismus, der in der Luft vorhanden ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und Herunterzählen der Mikroorganismenzahl in der Luft bis Eins in einer aseptischen Umgebung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einfangen und Einschließen der in der Luft vorhandenen Mikroorganismen mit einem wasserlöslichen Polymer;
(b) Lösen des wasserlöslichen Polymers in einem Verdünnungsmittel zur Bildung einer Lösung;
(c) Trennen der Mikroorganismen von der Lösung; und
(d) Nachweisen der Mikroorganismen durch Fluoreszenz unter Verwendung eines Scan RDI^® Messgeräts oder eines D-count^® Messgeräts.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Kurve, die die Veränderung der Filtrationszeit mit der Konzentration des Polymers Poly(vinylalkohol) (PVA) (K30) mittels einer Porenmembran (porosity membrane) (CB04) von 0,4 μm veranschaulicht.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
Wie hier verwendet umfasst der Begriff „Mikroorganismus" Algen, Bakterien, Pilze (Hefe, Schimmel und Schimmelsporen) (einschließlich Flechten), Rickettsien, Protozoen, Pollen, Parasiten, Milben, Viren und subvirale Erreger.
Wie hier verwendet umfasst der Begriff „Bakterien" Sporen bildende Bakterien und beinhaltet Escherichia coli, Brucella, Shigella, Clostridia, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Treponema, Leptospira, Borrelia, Vibrio fetus, Spirillum minus, Staphylococci, Streptococci, Gonococci, Salmonella, Meningococci und dergleichen sowie Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Mycobacterium phlei, Shigella sonnei, Zymomonas sp, Edwardsiella ictaluri und dergleichen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „wasserlösliche Polymere", dass die Polymer in Wasser und/oder physiologischen Verdünnungsmitteln löslich sind, eine ausreichende mechanische Festigkeit besitzen, so dass das Polymer transportiert werden kann, bis zu einem gewissen Grad Wasser zurückhalten und an Mikroorganismen anhaften.
Unter „lebensfähigen Mikroorganismen" versteht man, dass die Mikroorganismen in der Lage sind, unter geeigneten Bedingungen zu leben.
Unter „geeigneten Bedingungen" versteht man, dass die Mikroorganismen nicht dehydratisiert und nicht belastet werden.
Unter „einfangen" versteht man, dass die Mikroorganismen durch die wasserlöslichen Polymere aus der Umgebung maskiert werden.
Unter „Einschließen" versteht man, dass die Mikroorganismen an den wasserlöslichen Polymeren anhaften oder in sonstiger Weise davon eingefangen werden.
Unter „die Umgebung" versteht man das Milieu, sei es Luft, physische Objekte, Oberflächen und dergleichen.
Wie hier verwendet, werden die Begriffe „ScanRDI^®" und „ChemScanRDI^®" austauschbar verwendet und betreffen das gleiche Gerät. Es ist auf dem Fachgebiet weithin bekannt, dass in den USA das Gerät als „ScanRDI^®" bezeichnet wird, während in Europa darauf als „ChemScanRDI^®" Bezug genommen wird.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Einfangen und Einschließen von Mikroorganismen, die in der Luft vorhanden sind, mittels eines wasserlöslichen Polymers. Vorzugsweise beinhaltet die vorliegende Erfindung die Umgebungsanalyse von Mikroorganismen, die beispielsweise in einem Reinraum vorhanden sind, in dem aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten sind. Nachdem die Mikroorganismen eingefangen und eingeschlossen sind, können sie für die weitere Analyse weiter zu einem Laboratorium transportiert werden.
Die Mikroorganismen, die eingefangen und eingeschlossen sind, können lebensfähige Mikroorganismen, nicht lebensfähige Mikroorganismen und Gemische davon sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden lebensfähige Mikroorganismen in der Luft mittels wasserlöslicher Polymere eingefangen und eingeschlossen. Die lebensfähigen Mikroorganismen werden dann transportiert und einer Analyse unterworfen.
Nach dem Sammeln der Mikroorganismen auf dem wasserlöslichen Polymer werden diese mittels eines Scan RDI^® oder eines D-Count^® Messgeräts analysiert. Die Verwendung dieser besonderen Messgeräte liefert eine Zählung der Mikroorganismen innerhalb von ungefähr 90 Minuten ab Erhalt der Probe und es kann das Vorhandensein bis runter auf einen in der Luft vorhandenen Mikroorganismus mit dem ScanRDI^® Messgerät gemessen werden. Die Empfindlichkeit dieser Analyseart ist äußerst wichtig für die Überwachung von Mikroorganismen, die bei aseptischer Verarbeitung, wie beispielsweise in Reinräumen, vorhanden sein können. Weiterhin gibt es keinen Bedarf, die Mikroorganismen vor der Analyse zu züchten, wodurch Zeit und Kosten gespart werden.
Die wasserlöslichen Polymere, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sollten an die Umgebungsanalyse anpassbars ein und sollten mit eindeutigen und reproduzierbaren physikalischen Eigenschaften hergestellt sein. Weiterhin sollten die in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserlöslichen Polymere leicht in Wasser und/oder einem physiologischen Verdünnungsmittel löslich sein, eine vernünftige mechanische Festigkeit aufweisen, so dass sie ohne Bruch transportiert werden können, bis zu einem gewissen Grad Wasser zurückhalten, damit die gefangenen und eingeschlossenen Mikroorganismen bei der Analyse lebensfähig sind, und an Mikroorganismen in der Luft anhaften.
Es ist bevorzugt, dass die wasserlöslichen Polymere eine große Oberflächenmorphologie zum Einfangen von ausreichend Mikroorganismen aufweisen, nicht toxisch sind, gute Filmbildungseigenschaften oder Formeigenschaften, Verarbeitbarkeit aufweisen, nach dem Lösen filtrierbar, nicht bakterizid und falls es wünschenswert ist, vorzugsweise sterilisierbar sind.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserlöslichen Polymere können natürlich oder synthetisch sein. Wenn natürliche Polymere verwendet werden, können sie modifiziert werden, um die spezifischen, oben angegebenen Charakteristika beispielsweise durch Polymerpfropfen oder Oxidation zu erreichen. Es ist bevorzugt, dass gefügemäßig gut definierte wasserlösliche Polymere in dem Verfahren zum Einfangen und Einschließen der Mikroorganismen verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polymere können wasserlösliche Homopolymere, wasserlösliche Copolymere, Mischungen von mehr als einem Homopolymer/Copolymer, poröse Polymere und dergleichen sein. Diese Polymere können so konzipiert und synthetisiert werden, dass die spezifischen, oben beschriebenen Eigenschaften erhalten werden.
Insbesondere sind die wasserlöslichen Polymere der vorliegenden Erfindung durch ihre mechanische Festigkeit charakterisiert, d.h. sie können ohne Bruch transportiert werden und haben daher ein besonderes Molekulargewicht, das im Bereich von 500 bis 500.000 g/mol, vorzugsweise 2.000 bis 250.000 g/mol, besonders bevorzugt 1.000 bis 100.000 g/mol, liegt.
Außerdem müssen die wasserlöslichen Polymere in Wasser und/oder anderen physiologischen Verdünnungsmitteln löslich sein, wobei dieses Charakteristikum von dem Molekulargewicht und, falls zutreffend, dem Hydrolysegrad abhängt. Die besonderen Molekulargewichte, die von diesen Löslichkeitskriterien umfasst sind, sind oben ausgeführt. Was den Hydrolysegrad, falls zutreffend, anbetrifft, haben die wasserlöslichen Polymere der vorliegenden Erfindung einen Hydrolysegrad von 70 bis 90 %, vorzugsweise von 75 % bis 90 % und besonders bevorzugt von 80 bis 89 %.
Darüber hinaus müssen die wasserlöslichen Polymere der vorliegenden Erfindung Wasser bis zu einem gewissen Grad zurückhalten. Dieses Charakteristikum kann durch den Wasser-Gleichgewichtsgehalt gemessen werden, wenn diese Polymere gegossen und luftgetrocknet werden. Insbesondere sollte der Wasser-Gleichgewichtsgehalt von 1 % bis 50 % Gew./Gew., vorzugsweise 2 % bis 40 Gew./Gew. und besonders bevorzugt 4 % bis 30 % Gew./Gew. betragen.
Aufgrund der obigen Eigenschaften der mechanischen Festigkeit, Hydrophilie und Wasserretention haften die wasserlöslichen Polymere der vorliegenden Erfindung an Mikroorganismen an, wie in den Beispielen veranschaulicht. Daher können in der Luft befindliche Mikroorganismen mit den wasserlöslichen Polymeren, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, leicht eingefangen und eingeschlossen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polymere auch die folgenden Eigenschaften haben:

(1) das Polymerpulver sollte leicht in einem geeigneten Lösungsmittel bei Umgebungstemperatur löslich sein;
(2) sie sollten Filmbildungs- oder Formeigenschaften aufweisen und können als gleichförmiger Film oder in eine Form gegossen werden;
(3) sie sollten gute mechanische Eigenschaften aufweisen und idealerweise leicht aus dem Behälter, in den sie gegossen werden, ohne zu brechen entnommen werden;
(4) die Polymerfilme, Formen, Kugeln oder Mikrokügelchen sollten sich bei Umgebungstemperaturen über eine vernünftige Zeitskala vollständig in Wasser auflösen lassen;
(5) die Polymerfilme, Formen, Kugeln oder Mikrokügelchen sollten sich in Wasser zu klaren, homogenen Lösungen lösen lassen, die durch Membranen filtriert werden können;
(6) kein störender Polymerrest sollte nach der Filtration auf der Membran verbleiben;
(7) das Polymer sollte nicht bakterizid sein;
(8) der Polymerfilm, die Form, Kugeln oder Mikrokügelchen sollten an Mikroorganismen anhaften;
(9) vorzugsweise sollte das Polymer bis 120°C hitzestabil sein, d.h. stabil unter Autoklavbedingungen oder inert gegenüber Bestrahlung;
(10) das Polymer muss Wasser zurückhalten; und
(11) das Polymer sollte nach der Sterilisation nicht chemisch zu einem unlöslichen Gel vernetzt werden.

Beispiele für die Polymere, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können poröse oder wasserlösliche synthetische Polymere sein. Poröse Polymere können zum Beispiel mittels des Verfahrens von Yang und Zhang, Journal of Membrane Science, 114, Seite 149–155 (1996) hergestellt werden. Wasserlösliche synthetische Polymere umfassen Polyethylenoxid (PEO), Polyethylenglycol (PEG), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(acrylsäure) (PAA), Poly(acrylsäure)-natriumsalz (PAMPSA), Poly(natriumstyrolsulfonat (PSSS), Polyacrylamid, Agarose, Poly(hydroxyethylmethacrylat (PHEMA), Poly(hydroxyethylacrylat (PHEA) und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es können auch zwei Copolymere oder Mischungen von mehr als einem Homopolymer/Copolymer verwendet werden. Das Polymer kann auch maßgeschneidert oder modifiziert werden, um die verschiedenen Eigenschaften des Polymers wie gewünscht zu ändern: d.h. zum Beispiel um dessen mechanische Festigkeit, Wasserlöslichkeitscharakteristika, Mikroorganismusretentionsnatur, Wasserretentionsnatur und Kombinationen davon zu steigern oder reduzieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, als wasserlösliches Polymer von 1.000 bis 250.000 g/mol, bevorzugt von 5.000 bis 100.000 g/mol, besonders bevorzugt von 7.500 g/mol bis 25.000 g/mol Poly(vinylalkohol) (PVA); 5.000 bis 500.000 g/mol, bevorzugt 10.000 bis 100.000 g/mol und besonders bevorzugt 20.000 bis 75.000 g/mol Poly(vinylpyrrolidon) (PVP); 500 bis 100.000 g/mol, bevorzugt 1.000 bis 50.000 g/mol, besonders bevorzugt 2.000 bis 10.000 g/mol Polyethylenoxid (PEO); 2.000 bis 250.000 g/mol, bevorzugt 5.000 bis 100.000 g/mol, besonders bevorzugt 10.000 bis 50.000 g/mol Poly(acrylsäure) (PAA); 1.000 bis 250.000 g/mol, bevorzugt 2.000 bis 100.000 g/mol, besonders bevorzugt 5.000 bis 50.000 g/mol Poly(acrylsäure)-natriumsalz (PAMPSA) und 500 bis 500.000 g/mol, bevorzugt 1.000 bis 50.000 g/mol, besonders bevorzugt 1.500 bis 10.000 g/mol Polyacrylamid, zu verwenden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, Poly(vinylalkohol) (PVA) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht im Bereich von 10.000 bis 100.000 g/mol und einen Hydrolysegrad im Bereich von 80 % bis 90 % zu verwenden.
Die Polymere können in Form von Filmen, Tupfern, Platten, Fasern, Scheiben, Kontaktplatten, Mikrokügelchen, Perlen und dergleichen gestaltet werden. Die Polymerform ist nicht wichtig und kann an die Umgebung angepasst werden, in der die Luftprobenahme erforderlich ist. Alle diese Formen sind unter Verwendung von porösen und nicht porösen Polymeren anpassbar.
Wenn die wasserlöslichen Polymere in Form eines flachen Objekts, wie beispielsweise eines Films, einer Platte oder Scheibe, gestaltet werden, kann die Polymerdicke im Bereich zwischen 50 μm und 5 mm variieren. Bevorzugt liegt die Dicke im Bereich von 50 μm bis 1 mm.
Wenn Mikrokügelchen oder Perlen gewünscht sind, können Extrusions- oder Emulsions/Suspensionsverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden. Zum Beispiel können Mikrokügelchen durch das Verfahren von Thanoo u.a., J. Pharm. Pharmacol. 45, 16 (1993) verwendet werden.
Die Größe der Mikrokügelchen kann je nach der Menge an Mikroorganismen, die eingefangen und eingeschlossen werden müssen, variieren. Die Größe kann im Bereich von 50 nm bis 3 mm, bevorzugt von 1 μm bis 1 mm, besonders bevorzugt von 250 μm bis 500 μm, liegen.
Die wasserlöslichen Polymere können von einer Lösung gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gegossen werden. Zum Beispiel kann das Polymerpulver in einem Verdünnungsmittel gelöst und, falls gewünscht, sterilisiert werden.
Das Verdünnungsmittel, das im Allgemeinen verwendet wird, um das wasserlösliche Polymer zu lösen, ist generell bakterienfreies Wasser. Allerdings können auch phosphatgepufferte Kochsalzlösung, destilliertes Wasser, deionisiertes Wasser, WFI-Wasser, steriles Wasser und Gemische davon verwendet werden. Falls nötig kann der pH-Wert der Polymerlösung mittels verdünnter Essigsäure oder Natriumhydroxid auf den gewünschten pH-Wert, wie beispielsweise einem neutralen pH-Wert, verdünnt werden.
Wenn eine Sterilisation erwünscht ist, kann jedes Sterilisationsverfahren verwendet werden, solange die wasserlöslichen Polymere ihre Wasserlöslichkeit, mechanische Festigkeit erhalten, nicht dehydratisiert werden und ihre Einfang- und Einschließfähigkeiten behalten, so dass die Mikroorganismen in dem wasserlöslichen Biopolymer überleben. Insbesondere können die Polymere mit einem Autoklav (121 °C für 15 Minuten), mit Gammabestrahlung (bei einer Dosis von 10 K Gray bis 30 K Gray, vorzugsweise 20 K Gray) oder mit einer Ethylenoxidbehandlung sterilisiert werden.
Die wasserlösliche Polymerlösung kann durch eine Polyestermembran filtriert werden, um die wasserlösliche Polymerlösung zu reinigen. Im Allgemeinen wird eine Membran von 0,3 μm bis 0,6 μm, vorzugsweise 0,4 μm bis 0,5 μm, besonders bevorzugt von 0,45 μm verwendet.
Nach der Sterilisation wird dann das verdünnte wasserlösliche Polymer zu einer geeigneten Form, wie oben beschrieben, ausgebildet und gegossen, indem die Lösung bei Umgebungstemperatur oder in einem laminaren Dunstabzug verdampfen gelassen wird.
Im Allgemeinen liegen die wasserlöslichen Polymerkonzentrationen während des Gießens im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 Gew.-% bis 12 Gew.-%, besonders bevorzugt von 5 Gew.-% bis 10 Gew.-%. Wenn zwei Copolymere oder Mischungen aus mehr als einem Homopolymer/Copolymer verwendet werden, wird die gleiche Endkonzentration benutzt. Zum Beispiel kann ein Copolymergemisch aus 1 Gew.-% Poly(vinylalkohol) und 4 Gew.-% Poly(vinylpyrrolidon) verwendet werden.
In einem typischen Verfahren kann ein Aliquot des wasserlöslichen Polymers gegossen werden. Zum Beispiel können 5 ml einer 10 %igen Polymerlösung auf eine Petrischale gegeben werden, und das Wasser wird bei Raumtemperatur in einem Laminarströmungsabzug verdampfen gelassen, um das wasserlösliche Polymer zu gießen.
Das wasserlösliche Polymer sollte vorzugsweise unter reinen und staubfreien Bedingungen hergestellt und gegossen werden.
„Im Allgemeinen" werden zur Luftüberwachung die wasserlöslichen Polymere in Petrischalen mit einer Größe von 90 mm bis 150 mm Durchmesser, bevorzugt von 50 mm bis 130 mm Durchmesser, gegossen. Generell wird eine größere Polymermenge zur Luftüberwachung benötigt als bei anderen Umgebungsanwendungen, wie beispielsweise der Überwachung von Mikroorganismen auf Oberflächen.
Nach dem Gießen der Polymere wird das wasserlösliche Polymer der Luft ausgesetzt, wobei die Mikroorganismen gefangen und eingeschlossen werden. Die Probe wird vorzugsweise unter sterilen Bedingungen mit auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gesammelt.
Zum Beispiel kann, wenn die Mikroorganismusmenge in einer bestimmten Umgebung oder einem bestimmten Raum gemessen werden soll, das gegossene wasserlösliche Polymer für 1 bis 10 Stunden, vorzugsweise 1,5 bis 8 Stunden, besonders bevorzugt 2 bis 4 Stunden, in der Umgebung oder dem Raum stehen gelassen werden. Das wasserlösliche Polymer wirkt als Falle und schließt die Mikroorganismen in dem Polymer ein.
Alternativ kann das wasserlösliche Polymer an einen geeigneten Rahmen angebracht und vor einen Lüftungskanal gehangen werden.
Nachdem die unbekannte Probe auf dem wasserlöslichen Polymer angeordnet oder gefangen und eingeschlossen ist, wird das wasserlösliche Polymer mit der unbekannten Probe dann erneut in einem Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Pepton, und 0,1 % Tween 80^® oder WFI-Wasser, bakterienfreiem Wasser, sterilem Wasser, phosphatgepufferter Kochsalzlösung und dergleichen, gewaschen.
Die gefangenen Mikroorganismen können durch Zentrifugation oder durch Filtration wieder aufbereitet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Filtrationsschritt durchgeführt. Die resuspendierte Polymerlösung kann durch Membranen von 0,1 μm bis 5 μm, vorzugsweise 0,2 μm bis 4,5 μm, besonders bevorzugt von 0,4 μm, filtriert werden.
Der Gehalt an der Mikroorganismenzahl der resuspendierten Polymerlösung wird mittels des D-Count^® Messgeräts (Chemunex) oder mittels eines Scan RDI^®-Messgerätes (Chemunex), das im US-Patent 5 663 057 beschrieben ist, welches hier durch Bezugnahme aufgenommen wird, bestimmt. Mit diesen beiden Messgeräten kann die Zahl der Mikroorganismen, die in der Probe vorhanden sind, innerhalb von 90 Minuten analysiert werden und erfordert nicht, dass die Mikroorganismen vor der Analyse gezüchtet werden. Beide Messgeräte sind Cytometer, die in der Analyse Laserstrahlen verwenden.
In dieser bevorzugten Ausführungsform kann die resuspendierte Polymerlösung, die die Mikroorganismen enthält, mit dem Scan RDI^® analysiert werden. Die Probe wird dann durch eine 0,4 μm Porenmembran filtriert.
Die Mikroorganismen, die an der Oberfläche zurückgehalten werden, werden dadurch markiert, dass die Markierungslösung in den Proben für das D-Count^® Messgerät oder für das Scan RDI^® Messgerät direkt zugesetzt wird. Die Mikroorganismen, die an der Oberfläche der Filtrationsmembran nach dem Probenfiltern zurückgehalten werden, werden mittels eines Fluoreszenzmarkers oder einer Fluoreszenz erzeugenden Chemikalie markiert.
Fluoreszenzmarkierungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Fluoreszenzfarbstoffe auf der Basis von Fluoresceinderivaten, wie beispielsweise ChemChrome V, aber auch andere Arten von Fluoreszenzmarkern, wie beispielsweise Kaskadenblau, Lucifer Yellow^®, Oregon Green^®, Acridin Orange und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Bei dieser bevorzugten Ausführungsform wird ChemChrome V verwendet, indem die Membran, die die Mikroorganismen zurückhält, in Kontakt mit der ChemChrome-V-Lösung gehalten wird, die auf die folgende Weise hergestellt wurde:
100 μl ChemChrome V wurde zu 10 ml filtriertem (0,22 μm) ChemSol Markierungspuffer gegeben. Die Lösungen wurden vollständig vermischt.
Nach der Inkubation der Membran mit dem Fluoreszenzfarbstoff gemäß den in der WO 98/55861 beschriebenen Protokollen wurden die Membranen dann mit dem Scan RDI^® Messgerät analysiert. Nach der Analyse korreliert die Menge an Fluoreszenzvorgängen, die durch die Messgeräte nachgewiesen wurden, mit der Zahl der Mikroorganismen in der Probe.
Um die vorliegende Erfindung und deren Vorteile weiter zu erläutern, werden die folgenden spezifischen Beispiele genannt, wobei davon ausgegangen wird, dass diese nur veranschaulichend und in keiner Weise einschränkend sein sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Herstellung von Polymeren
Herstellung von Filmen aus Poly(vinylalkohol) (PVA)
5 g des Poly(vinylalkohols) (CAS Nr. 9002-89-5) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10.000 g/mol und einen Hydrolysegrad von 80 % wurde unter Rühren bei Raumtemperatur in Wasser (100 cm³) gelöst. Nach dem vollständigen Lösen wurde die Lösung autoklaviert. 20 ml der Lösung wurden einer sterilen Petrischale aus Kunststoff zugegeben. Der Film wurde dann an der Luft gegossen, indem das Wasser bei Umgebungstemperatur in einem Laminarströmungs-Dunstabzug verdampfen gelassen wurde. Die Zeit bis zum Erfolgen des Filmgießens betrug etwa 10 Stunden je nach den Laminarluftströmungsbedingungen. Der Wasser-Gleichgewichtsgehalt in den Filmen, wie er in dem oben aufgeführten Verfahren gemessen wurde, lag bei etwa 6 Gew.-%.
Herstellung von Filmen aus Poly(vinylpyrrolidon) (PVP)
5 g Poly(vinylpyrrolidon) (CAS Nr. 9003–3908) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 44.000 g/mol wurde in Wasser (100 cm³) unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Nach dem vollständigen Lösen wurde diese Lösung dann durch ein 0,45 μm Filter filtriert. Eine 1 %ige Lösung wurde zu einer sterilen Petrischale aus Kunststoff gegeben. Der Film wurde dann an der Luft gegossen, indem das Wasser bei Raumtemperatur in einem Laminarströmungs-Dunstabzug verdampfen gelassen wurde. Die Zeit bis zum Erfolgen des Filmgießens betrug etwa 16 Stunden.
Beispiel 2 – Wassergehalt und physikalische Eigenschaften der Polymere
Die Filme wurden aus wässrigen Lösungen in einem Konzentrationsbereich von 5 bis 10 %, d.h. 5 t bis 10 g Polymer in 100 ml Wasser, gegossen. 5 ml einer 10%igen Polymerlösung wurde zu einer kleinen Petrischale gegeben und das Wasser wurde bei Raumtemperatur und Umgebungsdrücken verdampfen gelassen. Die Filme wurden intakt von den Petrischalen genommen und die mechanischen Eigenschaften der Filme wurden durch Messen der Zeit, die für das Lösen des wasserlöslichen Polymers verstrich, sowie der Filtrationszeit bewertet.
So wurden die Filme in reinem Wasser (50 ml bei 20°C) erneut gelöst und die Zeit für das Lösen wurde vermerkt.
Es wurden Filtrationstests an allen wasserlöslichen Polymeren (Lösungen von 50 ml) in drei unterschiedlichen Konzentrationen von 1, 2 und 5 % bei Standardbedingungen (400 mbar) mittels zwei unterschiedlicher Filtrationsmembranen mit einer Porengröße von 0,2 μm bzw. 0,4 μm durchgeführt.
Der Wasser-Gleichgewichtsgehalt wurde für einige der gegossenen Filme erstellt, da dies als wichtig für die Bestimmung der Wasserretention angesehen wurde. Die Filme wurden an der Luft mit dem üblichen Verfahren gegossen, indem sie mit Wasser verdünnt und einem laminaren Dunstabzug zum Trocknen unterworfen und dann stehen gelassen wurden, bis die Proben ein konstantes Gewicht erreicht hatten. Die Proben wurden dann in einem Vakuumofen bei 100°C getrocknet, wieder bis die Proben ein konstantes Gewicht erreicht hatten. Aus diesen Messungen kann ein Wasser-Gleichgewichtsgehalt aus dem Unterschied in der Masse zwischen den beiden konstanten Gewichten errechnet werden, der gleich der Masse für Wasser ist, d.h. Massen-Trockengewicht.
Beispiel 3 – Cytotoxizitätsstudien
Die obigen Polymerlösungen, nämlich PVA oder PVP, wurden in 50 ml vorfiltriertes Pepton (1 g/Liter) und 0,1 % Tween 80^®, resuspendiert. Etwa 10 bis 10³ der folgenden Mikroorganismen wurden zu der resuspendierten Polymerlösung in getrennten Röhren gegeben:
E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, B. subtilis, C. albicans und A. niger.
10 ml von jedem Polymer/Mikroorganismus wurde dann mittels des Scan RDI^® unter Verwendung der Protokolle von „TCV" und „Fungi" analysiert, die von Chemunex entwickelt wurden und mit dem Scan RDI^® vertrieben werden.
Insbesondere sind diese Protokolle generell unten angeführt, aber den Fachmann wird freuen, dass eine ausführlichere Version, die er nachvollziehen kann, in der WO 98/55861 angegeben ist, die hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Alle nachfolgend erwähnten Reagenzien sind durch Chemunex SA öffentlich zugänglich, deren Hauptfirmensitz in Maisons-Alfort, Frankreich liegt.
Zum Nachweis von Bakterien, bakteriellen Sporen und Hefe
CSE/2 Kontrastfärbung
Mit einer mit einer Nadel ausgestatteten Spritze (20 ml) wurde der CSE/2-Flaschendeckel durchstochen und CSE/2 (1 ml pro Probe) wurde angesaugt. Ein 0,2 μm Autotop-Anlagefilter wurde der Spritze angepasst und 1 ml dieser Kontrastfärbung wurde in den Filtertrichter gegeben. Der Vakuumhahn wurde geöffnet und das CSE/2 wurde durch das Filter strömen gelassen. Nach dem Vollenden (keine Flüssigkeit blieb an der Membranoberfläche, aber die Membran sollte feucht bleiben), wurde der Vakuumhahn geschlossen. Das Vakuum wurde dann freigegeben.
Vormarkieren von Proben
Der Probenträger wurde hergestellt, indem die Markierpadträger in Stellung gebracht wurden. Ein Markierpad wurde aus der Packung entnommen und 600 μl ChemSol A4 (Aktivierungsmedium) wurde dann auf das Markierpad gegeben.
Die Probemembran wurde auf das Markierpad übertragen, indem sichergestellt wurde, dass dieselbe Seite der Membran wie mit dem Filter in Kontakt mit dem Markierpad war.
Das Markierpad und die Membranen wurden bei 37°C ± 3°C 60 Minuten ± 5 Minuten lang inkubiert.
Markieren der Proben
Nach der Vormarkierungsstufe wurde die Chemfilter-Membran auf ein neues Markierpad, das zuvor mit 600 μl Markierungslösung getränkt worden war, übertragen und 30 Minuten lang bei 30°C gemäß den in der WO 98/55861 beschriebenen Protokollen inkubiert.
ScanRDI^®-Analyse
Nach dem Markierungsschritt wurde die markierte Chemfilter-Membran in das Scan RDI^® Gerät gegeben. Die Analyse wurde in den vier Minuten nach der Einführung der Membran in die Maschine durchgeführt.
Die markierte Chemfilter-Membran von dem Markierpad wurde auf das Trägerpad übertragen. Der in einer Petrischale geschützte Membranhalter wurde auf das ChemScan Gerät übertragen. Die Abtastung wurde mit der Software eingeleitet. Die Analyse wurde in den vier Minuten nach der Bereitstellung des Membranhalters durchgeführt.
Das Pilzprotokoll ist nachfolgend angegeben:
Pilz – zum Nachweis von Hefe und Schimmel
CSE/5 Kontrastfärbung
Mit einer mit einer Nadel ausgestatteten Spritze (20 ml) wurde der CSE/5-Flaschendeckel durchstochen und CSE/5 (1 ml pro Probe) wurde angesaugt. Ein 0,2 μm Autotop-Anlagenfilter wurde der Spritze angepasst und 1 ml wurde in den Filtertrichter gegeben.
Der Vakuumhahn wurde geöffnet und das CSE/5 wurde durch das Filter fließen gelassen. Nach dem Vollenden (keine Flüssigkeit verblieb an der Membranoberfläche, aber die Membran sollte feucht bleiben) wurde der Vakuumhahn geschlossen. Das Vakuum wurde dann freigegeben.
Vormarkieren von Proben
Ein Markierpad wurde aus der Packung genommen und 600 μl ChemSol A6 (Aktivierungsmedium) wurde dann auf das Markierpad gegeben. Die Probenmembran wurde auf das Markierpad übertragen, indem sichergestellt wurde, dass dieselbe Seite der Membran wie bei dem Filter in Kontakt mit dem Markierpad war.
Das Markierpad und die Membranen wurden bei 30°C ± 3°C für 3 Stunden ± 5 Minuten inkubiert.
Markieren von Proben
Nach der Vormarkierungsstufe wurde die Chemfilter-Membran auf ein neues Markierpad, das zuvor mit 600 μl Markierungslösung getränkt wurde, übertragen und 1 h lang bei 37°C ± 3°C gemäß den in der WO 98/55861 beschriebenen Protokollen inkubiert.
Ein neues Markierpad wurde für die Markierungsstufe hergerichtet. Das Markierpad wurde auf einen Markierpadträger auf dem ChemPrep S gelegt. 600 μl Markierungslösung wurde auf das Markierpad gegeben.
Die Chemfilter-Membran wurde auf das neue Markierpad übertragen.
Das Markierpad und die Membran wurden dann in den Probenträger auf das ChemPrep S. übertragen und bei 37°C ± 3°C mindestens 1 h lang inkubiert, um die Inkubation zu vervollständigen.
Scan RDI^®-Analyse
Nach dem Markierungsschritt wurde die markierte Chemiflter-Membran in das Scan RDI^® Gerät eingeführt. Die Analyse wurde in den vier Minuten nach der Einführung der Membran in die Maschine durchgeführt.
Die Kontrollen mit den Mikroorganismen allein, die keinen Kontakt mit dem Polymer hatten, wurden auch wie oben beschrieben analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
In der obigen Tabelle 1 ist die prozentuale Wiedergewinnung das Verhältnis zwischen den Scan RDI^®-Ergebnissen und den Plattenzählungen.
Beispiel 4 – zusätzliche Cytotoxizitätsstudien
Die Herstellung der Polymere wurde in Beispiel 2 durchgeführt. Es wurde dasselbe Verfahren wie im Beispiel 3 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Mikroorganismen mit den Polymeren 15 Minuten lang vor der Analyse kontaktiert wurden. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der Tabelle 2 angeführt.
Tabelle 2
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, war die Wiedergewinnung größer als 100 und ist der Kontrolle sehr ähnlich.
Beispiel 5 – Messung von Mikroorganismen in der Luft
Bei diesem Experiment wurde die Zahl der Mikroorganismen in der Luft gemessen. Das Polymer PVA wurde wie im Beispiel 2 hergestellt und in den Laboratorien jeweils 30 Minuten und 3 h 30 min vor der Analyse stehen gelassen. Die Analyse wurde wie im Beispiel 3 durchgeführt. Die Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments.
Tabelle 3
Beispiel 6 – Testen von zusätzlichen Polymeren
Polyethylenoxid (PEO), Polyethylenglycol (PEG), Poly(acrylsäure) (PAA), Poly(acrylsäure-natriumsalz) (PAMPSA), Poly(natriumstyrolsulfonat) (PSS) und Polyacrylamid werden gemäß Beispiel 2 hergestellt und nach dem Verfahren in Beispiel 1 gegossen. Zytotoxizitätsstudien werden wie im Beispiel 3 und 4 durchgeführt. Die Zahl der Mikroorganismen wird gemäß Beispiel 5 analysiert. Ähnliche Ergebnisse werden mit diesen besonderen Polymeren erhalten.
Beispiel 7 – Mikroorganismen, gemessen in einem Reinraum
Bei diesem Experiment wird die Zahl der Mikroorganismen in der Luft in einem Reinraum der Klasse 100 gemessen. Die Polymeren wurden wie im Beispiel 2 hergestellt und in eine Petrischale von 90 mm Durchmesser gegossen. Das gegossene wasserlösliche Polymer wird dann bei Betriebsbedingungen zum Luftkanal gestellt und 4 Stunden vor der Analyse stehen gelassen. Die Analyse wurde wie im Beispiel 3 durchgeführt.
Da in diesem Beispiel keine Mikroorganismen vorhanden sind, wird bestätigt, dass der Reinraum die Luftreinheitsnormen in dieser besonderen kontrollierten Umgebung erfüllt.
Beispiel 8 – Nachweis der Gesamtpopulation von Mikroorganismen mit Orange Acridin: Zählen von lebensfähigen und toten Zellen mit dem Scan RDI^®.
Die obigen Polymerlösungen, nämlich PVA oder PVP, wurden wie im Beispiel 2 hergestellt und in eine Petrischale von 90 mm Durchmesser gegossen.
Etwa 10 bis 10³ Mikroorganismen eines Mix (50×50) aus lebensfähigen und getöteten Mikroorganismen werden auf die Oberfläche des gegossenen wasserlöslichen Polymers gelegt.
Dann werden die Polymerfilme aus den Platten entfernt und erneut in reinem Wasser gelöst, wie im Beispiel 2 beschrieben.
Die Polymerlösungen mit den Mikroorganismen werden durch die 0,4 μm Chemfilter-Membranen filtriert, bevor letztere weiter mit den folgenden Markierungsprotokollen verarbeitet werden:
Die Zahl der lebensfähigen Mikroorganismen wird mit dem Lebensfähigkeitsmarker (ChemChrome) und dem Scan RDI^® Messgerät gemäß dem TVC-Protokoll, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, definiert;
Die Gesamtzellpopulation (lebend und tot) von Mikroorganismen wird mit dem folgenden Protokoll bestimmt: 0,8 ml Orange Acridin-Lösung wurde auf die Oberfläche der Chemfilter-Membranen aufgebracht und zwei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zahl der markierten Zellen wird dann nach einer manuellen Beobachtung der Membranen mit einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop erhalten.
Die Ergebnisse zeigen einen perfekten Zusammenhang zwischen der Zahl von lebensfähigen Zellen, bestimmt durch das Scan RDI^® Messgerät, der erwarteten Zahl von toten Zellen und dem Wert der gesamten Population, der experimentell bestimmt wurde.

Claims

Verfahren zum Einfangen und Einschließen von Mikroorganismen für eine spätere Analyse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Gießen eines wasserlöslichen Polymers, wobei das wasserlösliche Polymer einen Wasser-Gleichgewichtsgehalt zwischen 1 % und 50 aufweist; und (b) Unterwerfen des wasserlöslichen Polymers einem Mikroorganismus, der in der Luft vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das wasserlösliche Polymer ausreichende mechanische Festigkeit für den Transport hat, in Wasser oder einem anderen physiologischen Verdünnungsmittel löslich ist, Wasser zurückhält und an Mikroorganismen anhaftet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das wasserlösliche Polymer ein Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 500.000 g/mol aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das wasserlösliche Polymer ein Molekulargewicht im Bereich von 2.000 bis 250.000 g/mol hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das wasserlösliche Polymer ein Molekulargewicht im Bereich von 1.000 bis 100.000 g/mol hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das wasserlösliche Polymer einen Hydrolysegrad zwischen 70% und 90 % hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das wasserlösliche Polymer einen Hydrolysegrad zwischen 75 % und 90 % hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das wasserlösliche Polymer einen Hydrolysegrad zwischen 80 % und 89 % hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das wasserlösliche Polymer einen Wasser-Gleichgewichtsgehalt zwischen 2 % und 40 % hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das wasserlösliche Polymer einen Wasser-Gleichgewichtsgehalt zwischen 4 % und 30 % hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das wasserlösliche Polymer aus der Gruppe Polyethylenoxid, Polyethylenglycol, Poly(vinylpyrrolidon), Poly(vinylalkohol), Poly(acrylsäure), Poly(acrylsäure)-Natriumsalz, Poly(styrolsulfonat), Polyacrylamid und Gemischen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das wasserlösliche Polymer Poly(vinylalkohol) oder Poly(vinylpyrrolidon) ist.
Verfahren zum Feststellen von Mikroorganismen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Einfangen und Einschließen der Mikroorganismen mit einem wasserlöslichen Polymer, wobei das wasserlösliche Polymer einen Wasser-Gleichgewichtsgehalt zwischen 1 % und 50 % hat; (b) Lösen des wasserlöslichen Polymers in einem Verdünnungsmittel, um eine Lösung zu bilden; (c) Trennen der Mikroorganismen von der Lösung; und (d) Nachweisen der Mikroorganismen durch Fluoreszenz unter Verwendung eines Scan RDI^® Messgeräts oder eines D-count^® Messgeräts.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Mikroorganismen im Schritt (c) mittels Filtration oder Zentrifugation getrennt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, wobei das Verdünnungsmittel im Schritt (b) aus der Gruppe bakterienfreies Wasser, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, destilliertes Wasser, deionisiertes Wasser, steriles Wasser und Gemischen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei bis zu ein einzelnes Mikroorganismus nachgewiesen werden kann.