JP2017516477A - 頑丈な微生物の生存能力を安定化および維持するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本出願は、試料収集から下流の分析まで、頑丈な微生物の生存能力を安定化し、維持するための組成物および方法を提供する。特に、マイコバクテリア、炭疽菌、またはクロストリジウム・ディフィシレなどの生存可能で頑丈な細菌を保存する方法であって、該方法は、生物試料を安定化組成物と接触させることを含み、安定化組成物はキレート化剤、変性剤、塩を含み、約６〜約１１のｐＨを有する。【選択図】なし

Description

本出願は、試料収集および貯蔵の分野に関する。より具体的には、本出願は試料収集から分析までの期間、頑丈な微生物の生存能力を維持するための組成物および方法に関する。

結核（ＴＢ）は、大きな世界的健康問題として残されたままである。新しい感染と死亡の大部分は、発展途上国で発生している。世界保健機関（ＷＨＯ）は、２０１２年だけで８６０万人がＴＢを発症しており、この疾患で１３０万人が死亡し、この内に３２万人のＨＩＶ陽性患者が含まれていると推定した（Ｇｌｏｂａｌ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｒｅｐｏｒｔ ２０１３，ＷＨＯ）。ＴＢ死亡の数は、これらのほとんどが予防可能であることを考えると受け入れ難いほど大きい。ＷＨＯは、世界の人口の約１／３、すなわち、２０億人が結核に感染し、従って、活動性疾患を発症する危険性があると推測している。驚くべきことに、ＷＨＯは、２００１年には３６０万スメア陽性ＴＢ症例の１／３のみが報告されたと推定した（ＷＨＯ．２００１．Ｇｌｏｂａｌ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌ．ＷＨＯ／ＣＤＳ／ＴＢ／２００１ ２８７：１８−１９）。ＴＢの早期診断の問題は、この疾患の広がりの抑制に対する主要な障害の１つであり続けている。都合の悪いことに、世界中の活動性ＴＢである約３千万人の特定に関連する数多くの問題が存在する。

収集の時間から輸送、貯蔵、処理に至るまでの生物検体の正しい取り扱いは、タイミング的に、また臨床的に意味のある微生物学の試験結果を得るために非常に重要である（Ｗｉｌｓｏｎ，１９９６）。微生物学的試験に供される全ての臨床検体に共通の問題には、正確な特定のみでなく、病原性微生物の回収の最大化および非病原体による汚染を最小化する収集技術も含まれる。喀痰、糞便および尿などの検体に関しては、インビボで存在する微生物の相対的比率が保存される必要があり、そうでなければ、培養結果の判断を誤る可能性がある。検体が適切に取り扱われる場合は、培養結果の解釈はより容易になり、患者ケアが改善され、コストが低減される可能性がある。

最近、従来の進め方を変更して、無用の労力を排除し、検査室の効率を高め、微生物学的試験をより費用対効果が大きいものにするように、検体の取り扱いに対するガイドラインが重要視されるようになってきた。感染症の診断のための迅速で正確な手順を開発して、症例探索を改善し、診断および処置の開始の時間を短縮し、疾病監視を改善し、診断経路から外れる患者をより少なくすることは、長期にわたる医科学の目標となっている。腸感染症の検査室診断は、特に難しい。課題には、潜在的病原体の数、これらの生物の生物学的多様性、新しい病原体の出現、一部の病原体の体外への間欠的排出、同じ患者から提出された複数の検体、ほとんどの臨床設定（特に外来患者および遠隔にある状況）での新しい検体試験の非実現性、および培養と分子診断試験のための検体の検査室への輸送コストが含まれる。

吐き出された喀痰は、最も高頻度のＴＢ原因物質である結核菌（ＭＴＢ）を検出するために最も一般的に収集される細菌培養用の呼吸器検体である。気道検体は「汚染性」微生物を含むと思われるので、検体は、非病原体の異常増殖を防止するために、素早く収集し、検査室に輸送する必要がある。従来は、収集と培養接種との間の遅延は、７日間を超えてはならず、検体は処理できるようなるまで冷凍保存する必要がある。迅速な輸送、処理および冷凍保存は、マイコバクテリアの死滅、検体中の正常な急速増殖細菌叢の異常増殖を防ぐのに役立つ。こうしなければ、病原体の回収と検出を複雑化する。喀痰が３日より長期間室温で貯蔵されると、異常増殖または腐敗した検体の処理は、もし可能だとしても、追加の人件費および培養感受性の低下を伴う（Ｐａｒｍａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。検体が、適切な条件下で最大限の注意をもって収集され、迅速に検査室に輸送されない場合には、培養の利点が完全に実現されることはないであろう。

最適な結果を得るためには、適切な喀痰収集が重要である。理想的には、新しい患者から３つの検体（それぞれ２〜１０ｍＬ）を数日間続けて早朝収集し、別々に処理する必要がある。ＷＨＯは、２つの早朝検体および患者が医院を訪れた際の３つ目のその場の検体を推奨している。品質保証プログラムが実施されている場合に限り、高い作業負荷および限られた人的資源の場所における、ＴＢ症例を選別するために検査する検体の数の３つから２つへの低減は既に認められている。

スメア顕微鏡および培養の前に、検査室で受け取られるとすぐに、これらの高粘液性検体を液化し、「汚染除去する」必要がある。疾病予防管理センター（ＣＤＣ）により推奨された標準的な手順は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）−水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）手順である（ＰＴ Ｋｅｎｔ ａｎｄ ＧＰ Ｋｕｂｉｃａ；Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌ ＩＩＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣＤＣ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ，１９８５）。ＮＡＬＣは粘液性検体を液化し、同時に、ＮａＯＨは汚染／バックグラウンド細菌に対し殺菌力を有し、液化を助ける。ＮａＯＨはマイコバクテリアも死滅させるが、その程度は遥かに低い。「スメア陽性」の症例は、少なくとも２つの初期喀痰スメア検査（直接スメア顕微鏡）で抗酸性桿菌に対し陽性（ＡＦＢ＋）である患者に対して確定される。

活動性結核の確定診断は、患者の分泌物、体液または組織からの原因細菌の回収とその後の特定に基づく。現在の培養方法は完了までに長期間（４２日間まで）が必要であるので、患者の初期管理は、提出された臨床検体の顕微鏡検査の結果に基づくことが多い。特に、臨床喀痰検体から作製されたスメア中の抗酸性桿菌（ＡＦＢ）の存在の実証は、マイコバクテリア症の予備的診断を提供するが、一方、培養によるマイコバクテリアの単離は、結核菌以外のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ桿菌）または非結核マイコバクテリア（ＮＭＴ）による結核または類似の疾患の確定診断を与える。スメア顕微鏡は現在最も広く使用されている選別ツールであるが、この手順の的中度に関してはかなりの論争がある。顕微鏡は培養陽性の症例の２／３を見逃す場合があると推測されている（Ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。その結果、マイコバクテリア症の診断において、培養技術が未だ重要な役割を果たしている。

喀痰検体および標準的処理方法（ＮＡＬＣ／ＮａＯＨ）の両方の性質により、ＭＴＢの検出が損なわれる（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。第１に、検体、ならびに検体を処理するために使用される溶液は、核酸増幅を抑制する場合がある。ほとんどの検体は、培養法を妨害する多数の腐生性微生物および／または感染性微生物を含み、従って、汚染除去ステップは必須である。しかし、汚染除去は、マイコバクテリアの生存能力を大きく損ない（Ｂｕｒｄｚ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｋｒａｓｎｏｗ ａｎｄ Ｗａｙｎｅ，１９６６）、従って、処理は培養による検出の感度も同様に低下させる。第２に、疾患の固有の性質が少ないコピー数および生物の体外への間欠的のみの排出をもたらす。第３の問題は、マイコバクテリアそれ自体の固有の生理的な性質に関連し、ｉ）凝集、集塊、およびコーディング、ｉｉ）蝋状の細胞壁により引き起こされる表面張力、ｉｉｉ）浮力（０．７９〜１．０７で平均１未満）（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｌｐｅ，１９４８）、ｉｖ）遅い増殖、およびｖ）厚い細胞壁により結核菌の溶解を困難にしているなどのことが含まれる。喀痰の粘液性の性質に加えて、これらの性質が、遠心分離によるマイコバクテリアの収集を複雑化しており、これらの桿菌の非効率的沈殿を引き起こす。必然的に、一部の桿菌は、遠心分離後、上清画分と一緒に流れ出る。検出用の臨床検体調製のためにＣＤＣにより承認された全ての方法は、遠心分離ステップを含む。真の影響は、マイコバクテリアが処理沈殿物中に非常に少ないので、一部の分割採取量は標的桿菌を含まず、また、収集されたわずかの微生物は効率的に溶解されるかまたは汚染細菌と競合するための生存能力を有する必要があるということである。最終的には、ＭＴＢの少ないコピー数のために、多くの検体量が必要となり、このことにより次に濃縮−汚染除去ステップを必要とすることになる。

いくつかのグループが喀痰検体を保存する方法を開発することにより、遠隔地域で試料を収集し、より大きな処理センターに送ることを試みた。Ｈｏｌｚら（２００１）およびＰｏｐｏｖら（２００４）は、試料を処置前に１０日間までうまく凍結することができることを示した。しかし、凍結試料の輸送は高価であり、液体窒素が利用可能でない場合には、遠隔地および地方では実現可能ではない。Ｋｅｌｌｙら（２００３）は、試料を輸送するより費用対効果が大きい方法、すなわち、処理前にホルムアルデヒドによる固定について試験した。しかし、この方法は、試料処理方法における大きな変更を必要とし、処理コストが増え、また、ＭＴＢ生物は、歴史的な「代表的」スタンダード試験である培養に対し、も早生存可能ではない。同様に、Ｄｏｒｍａｎら（２０１０）はアルコール（５０容積％のエチルアルコール）を使用して、誘発喀痰試料を保存したが、この場合も、ＭＴＢは培養に対し、もはや生存可能ではなくなった。

喀痰を液化し、ＭＴＢおよびその他の頑丈な微生物の生存能力を維持し、同時にバックグラウンド細菌叢を死滅させる収集方法および組成物への要求がいまだ残されている。

上記情報は、出願者が考えている既知の情報を本発明に可能な限り関連づけるために提供されている。前述のいずれかの情報が本発明に対する先行技術となることを承認することを必然的に意図するものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。

本出願の目的は、頑丈な微生物の生存能力を安定化および維持するための組成物および方法を提供することである。本出願の一態様では、生物試料中のマイコバクテリア、炭疽菌、クロストリジウム・ディフィシレまたは酵母などの、生存可能で頑丈な細菌を保存する方法が提供され、該方法は生物試料を安定化組成物と接触させることを含み、該安定化組成物はキレート化剤、変性剤、塩を含み、約６〜約１１のｐＨを有する。

本出願の別の態様では、生物試料を液化する方法が提供され、該方法は生物試料を安定化組成物と接触させることを含み、該安定化組成物はキレート化剤、洗剤、塩を含み、約６〜約１１のｐＨを有する。

本出願の別の態様では、生物試料中のマイクロバイオームを安定化する方法が提供され、該方法は生物試料を安定化組成物と接触させることを含み、該安定化組成物はキレート化剤、洗剤、塩を含み、約６〜約１１のｐＨを有する。

本出願の別の態様では、生物試料中の細菌核酸のキャラクタリゼーション方法が提供され、該方法は、
生物試料を安定化組成物と接触させること、および試料中の核酸を増幅することを含み、
該安定化組成物はキレート化剤、洗剤、塩を含み、約６〜約１１のｐＨを有し、該増幅ステップを行うのが収集の直後であっても、またはさらに後であっても、増幅された核酸のレベルが実質的に不変のままである。

本出願の別の態様では、キレート化剤、洗剤、および生存可能な頑丈な微生物を含む組成物が提供される。

本発明をよりよく理解するために、その他の態様およびさらなる特徴に加えて、併せて添付図面を使用して以下の説明を行う。

ＢＤ２緩衝液中、室温で貯蔵した喀痰の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）分析のゲルの写真である。 ＢＤ３緩衝液中、室温で貯蔵した喀痰のＤＧＧＥ分析のゲルの写真である。 ＮａＯＨ処理後、４℃で貯蔵した喀痰のＤＧＧＥ分析のゲルの写真である。 低、中および高ＴＢ負荷喀痰試料のリアルタイムＰＣＲ分析の結果を示すグラフである。 Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＳＴＣ）で処理後の炭疽菌芽胞の生存能力を示すグラフである。 ｔ＝２日の時点のヒト唾液由来の結核菌の存在を分析したゲルの結果の写真である。

特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。

本明細書および請求項で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数形の指示対象を包含する。

本発明で使用する場合、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、後に続くリストが非包括的であり、任意のその他の追加の適切な項目、例えば、必要に応じて１つまたは複数のさらなる特徴（単一または複数）、構成要素（単一または複数）および／または成分（単一または複数）を含んでも、または含まなくてもよいことを意味すると理解される。

本明細書で使用される場合「試料」という用語は、任意選択で、注目している核酸、タンパク質またはその他の生体分子である対象物質を含む可能性のある任意の検体を意味すると理解される。「試料」という用語は、水溶液などの溶液、細胞、組織、生検材料、粉末、固体、または１種または複数種のこれらの集団を包含することができる。試料は生物試料、例えば、唾液、喀痰、口腔スワブ試料、血清、血漿、血液、軟膜、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブまたは擦過物、尿、粘液、糞便、直腸スワブ、病変スワブ、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、消化管液、***／***、尿道スワブおよび分泌物、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄試料および吸引液、胸水および浸出液、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液または吸引液、腹膜浸出液、細胞培養液および細胞懸濁液、結合組織、上皮、上皮スワブおよびスメア、粘膜、筋組織、胎盤組織、生検材料、滲出液、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、土壌試料、環境試料、下水、廃水、食糧、食肉加工設備スワブ、などであってよい。

本明細書で使用される場合、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、任意の顕微鏡的生物および芽胞を意味すると理解され、これらには、すべての原核生物、すなわち、真正細菌および始原細菌、および種々の形態の真核生物が挙げられ、原虫類、真菌（例えば、酵母）、藻類、および輪虫類およびプラナリアなどの動物が含まれる。

本明細書で使用される場合、「頑丈な微生物」という用語は、通常、標準的核抽出技術に抵抗性である、例えば、マイコバクテリウム属の１つまたは複数の種、結核菌群の１つまたは複数の種、結核菌のＭＤＲ株、クロストリジウム属の１つまたは複数の種、炭疽菌などのバチルス属の１つまたは複数の種、および頑丈な細胞壁を有するその他の微生物などの微生物および芽胞を意味する。

本明細書で使用される場合、「Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ組成物」および「ＳＴＣ組成物」という用語は、生物試料中に存在しても存在していなくてもよい頑丈な微生物の生存能力を維持するために、生物試料を処理および／または貯蔵するために使用される組成物を意味する。

本出願は生物試料中の頑丈な微生物を安定化するための組成物および方法を提供する。本組成物および方法はまた、粘稠な生物試料を液化するために、および／または環境温度で貯蔵中の生物試料中のバックグラウンド細菌フローラの増殖をなくするかまたは最少化するために、有用である。

Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
本安定化組成物は、貯蔵試料中のマイコバクテリアなどの頑丈な微生物の安定化にうまく機能し、それにより、下流の臨床試験に対し頑丈な微生物が生き残ることが明らかになったＳａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（「ＳＴＣ」）混合物を含む。特に、ＳＴＣ組成物中に貯蔵された頑丈な微生物は、室温における貯蔵後であっても、標準的培養条件下での培養で生存可能である。頑丈な微生物は、ＳＴＣ組成物中で１日以上の、５日間以上の、１週間以上の室温における貯蔵の後での培養に対して生き残ることが明らかになった。一実施形態では、ＳＴＣ組成物は、生物試料中の生存可能な頑丈な微生物の室温で約１週間の貯蔵に有用である。この情況では、頑丈な細菌は、標準的培養条件下で頑丈な細菌のコロニー形成単位の形成により判定して、細菌培養に対して生存可能なままである場合、「安定化されている」と理解される。

本出願のＳＴＣ組成物は、キレート化剤、変性剤および塩を含み、約６〜約１１のｐＨを有する水性組成物である。あるいは、本出願のＳＴＣ組成物は、最終混合物のｐＨが約６〜約１１となるように、水、水溶液、または試料で再構成することができる、キレート化剤、変性剤、塩および、任意選択で緩衝剤を含む。

キレート化剤は、特定の金属イオンと安定な錯体を形成してそれらのイオンを封鎖し、それにより、それらのイオンがその他の成分と正常に反応できないようにする任意の化学薬品である。キレート化剤は、例えば、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。別の実施形態では、キレート化剤はＣＤＴＡである。

変性剤は、タンパク質にそれらの元々の二次および／または三次構造を失わせることができる任意の化学薬品である。変性剤は、例えば、アニオン洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウレス硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ））、カチオン洗剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、これは特定の実施形態で使用することができる）または非イオン洗剤（例えば、ツイーン、トリトンＸ、またはブリージなど）であってよい。一実施形態では、変性剤はＳＤＳである。

一実施形態では、ＳＴＣ組成物は、２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシンを含み、ｐＨ１０．５である。代替的実施形態では、ＳＴＣ緩衝液は、４％ＳＤＳ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１４０ｍＭのＬｉＯＨを含み、ｐＨ６．８である。

ＳＴＣ組成物は、さらに塩を含み、これは無機塩であるのが好ましい。一例では、塩はＬｉＣｌである。別の例では、塩は、例えば、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。さらに別の例では、塩は、例えば、ホウ酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、フッ化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。

ＳＴＣ組成物は中性のまたは塩基性ｐＨである。特定の実施形態では、ｐＨは６〜１１の範囲であり、例えば、ＳＴＣ組成物のｐＨは約６．８、または約１０．５であってよい。ｐＨを維持するために、組成物は、グリシンなどの緩衝剤をさらに含むことができる。あるいは、組成物は、ＬｉＯＨなどの酸または塩基を使って適切なｐＨに調節される。

一実施形態では、ＳＴＣ組成物は、２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシンを含み、ｐＨ１０．５である。代替的実施形態では、ＳＴＣ緩衝液は、４％ＳＤＳ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１４０ｍＭのＬｉＯＨを含み、ｐＨ６．８である。

本出願は、上記で定義のＳＴＣ組成物の成分および生物試料などの試料由来の生存可能で頑丈な細菌を含む組成物をさらに提供する。特定の実施形態では、頑丈な細菌は、芽胞の形であってもよい結核菌、炭疽菌などのマイコバクテリア、またはクロストリジウム・ディフィシレである。

輸送および貯蔵方法
本出願は、生物試料などの試料の貯蔵方法をさらに提供する。該方法は、下流の臨床診断検査での使用に適する形態で安定化されるように生物試料を貯蔵する際に特に有用である。下流の臨床診断検査は、例えば、インビトロ培養または分子診断、例えば、ＰＣＲに基づく診断またはシーケンシングであってよい。しかし、本ＳＴＣ組成物を使って安定化された試料にその他の診断検査を採用してもよい。

本貯蔵方法は、生物試料を一定量のＳＴＣ組成物と混合するまたは接触させるステップを含む。得られた混合物は、室温または環境温度または約４℃〜約４０℃の範囲の温度で貯蔵することができる。試料と混合するＳＴＣの量は、使用者の必要性に適応させるように変えることができる。例えば、試料のタイプおよび／または量、下流分析の要求、利便性、などに応じて変えることができる。一実施形態では、試料の容量のＳＴＣ組成物の容量に対する比率は、約５：１〜約１：５の範囲である。特定の実施形態では、試料は等容量のＳＴＣ組成物と混合される。

分析前に試料を処理する必要性をなくすために、貯蔵方法は試料収集の時点で行うのが好ましい。このように、潜在的な汚染および／または特殊な試料処理設備の必要性が最小化される。これは、例えば、試料収集装置中にＳＴＣ組成物を供給することにより達成することができる。

本発明者らは、本貯蔵方法が試料中のマイクロバイオームの安定化に有用であるという結論に至った。特に、ＳＴＣ組成物は、試料中の微生物の増殖を抑制し、同時に、試料中の頑丈な細菌を後で行われる培養で生存可能な状態で保持するように機能する。このように、研究者または臨床医は試料収集の後で十分に試料を分析し、ＳＴＣ組成物を使って貯蔵された試料内の微生物成分および微生物の相対量を測定することができる。

したがって、本出願は、試料の安定化方法をさらに提供し、該方法は、試料を、上記で定義された、一定量のＳＴＣ組成物と混合するまたは接触させるステップを含む。

生物試料のＳＴＣ組成物による処理後、使用者の要求に応じて、標準的な技術を使って、試料を輸送、貯蔵、または分析することができる。一実施形態では、試料中の微生物核酸が試料から回収または単離される。これは、標準的な技術を使って行うことができ、または酸化剤および緩衝液を含む組成物を使って行うことができ、酸化剤は過ヨウ素酸、過ヨウ素酸塩または過硫酸塩である（同時係属の米国特許仮出願第６１／９７７，９５３号（この仮出願は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように）。

高粘稠試料の液化
本出願は、粘稠な粘液性生物試料を液化する方法をさらに提供する。多くの生物試料、または身体の試料は粘稠である。これにより、試料の処理が困難となり、また、分析物、細菌などはこのような粘稠な試料中に均一に分散することができないので、正確な診断検査に対し大きな課題が生じる場合がある。したがって、試料の粘度を低下させて、試料成分の試料内分布の均一性を改善することが可能な試料処理方法があれば特に有益である。

診断手順には、体液などの生物試料の分析が必要となる場合が多い。特に、核酸に基づく診断法がますます重要になってきている。しかし、このような方法は通常、生物試料の初期処理を必要とし、この処理は、時間がかかり、労力を要する場合があり、さらに、汚染の危険性を伴うことがある。例えば、結核の診断は、喀痰、膿、胸水、胃吸引物、気管内吸引物、経気管吸引物、管支肺胞洗浄液検査、喉頭スワブ、および鼻咽頭スワブなどの高粘稠液体生物試料の分析を必要とし、これらは通常、様々な化学的および物理的挙動を示す多くの異なる成分からなる不均一な混合物である。これにより、試料の処理が困難となり、また、分析物、細菌などをこのような試料中に均一に分散させることができないので、正確な診断検査に対し大きな課題が生じる場合がある。試料の粘度を低下させて、試料成分の試料内分布の均一性を改善することが可能な試料収集方法があれば有益であろう。

喀痰は、様々な量の糖タンパク質（ムチン）、唾液、免疫細胞、宿主組織粒子、放出ＤＮＡ、脂質、および溶解した宿主組織由来のタンパク質からなる。生化学的分析により、気道を覆っている細胞により分泌されたムチンＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂが、気道粘液の主要なゲル形成ポリマー成分であることが明らかとなった。これらのムチン上のシステインドメインは、ポリマー形成に関与し、おそらく、ジスルフィド結合により隣接ムチン鎖と相互作用するのであろう。喀痰は、混入物として様々な量の血液または残留食物粒子を含むことがある。これにより、一面では均一から多相性までおよび他面では液体から高粘稠物までの範囲に及ぶ、喀痰組成物の極めて広範囲にわたる試料間変動が生じる。個々の患者の病態に応じて、喀痰は炎症性の病原体をさらに含み、また、試料成分は、極端に顕著な、例えば、肺炎症により血液混入物がある、または嚢胞性繊維症または気管支炎患者の大量のＤＮＡ放出により高粘性である場合がある。

喀痰試料の大きい試料不均一性のために、診断目的の喀痰からのＤＮＡ単離などの喀痰試料の処理はかなり困難である。例えば、炎症性病原体が固相および粘稠な環境中に捕捉されている場合、それらへのアクセシビリティおよびそれらの溶解の効率が低下する可能性がある。

本明細書で記載のように、喀痰試料の分析は、結核が疑われる患者に対する標準的診断手順である。診断の古典的な方法には、顕微鏡下での抗酸性マイコバクテリアの喀痰スメア検査および喀痰から単離した培養マイコバクテリアの微生物学的分析が含まれ、該培養マイコバクテリアの微生物学的分析は、結核診断における病原体および耐性の特定のための現在の代表的スタンダードである。加えて、いくつかの分子検査が開発されている。一般に、喀痰試料中のマイコバクテリアの検出を目標とするこれら全ての診断法は、特に、プロテアーゼ、リパーゼ、ＤＮアーゼ、またはグリコシダーゼなどの酵素、洗剤、カオトロピック剤、キレート化剤、および還元剤などを使って、汚染除去および液化のための労力を要する試料処理を必要とする。高い感染リスクのために、結核を疑われる喀痰のいずれの処理も、生きている細菌への作業員の全ての暴露を排除するために、認可された層流および広範囲にわたる保護手段を備えたＳ３環境を必要とする。したがって、分子検査に対しては、喀痰を直接核酸診断に使用し、集約的な汚染除去および液化手順におよる処理を回避するのが有利であろう。

本発明者らは、意外にも、ＳＴＣ組成物が、ＮＡＬＣ／ＮａＯＨで使われるよりも遥かに低いｐＨで粘液性生物試料を液化し、それにより、診断検査の精度および／または容易さを改善し、また、多数の診断検査（例えば、スメア顕微鏡、培養および分子診断）用に複数の均一な試料の回収を可能とするように機能することを見出した。

一態様では、生物試料などの試料の液化方法を提供し、該方法は、試料を一定量のＳＴＣ組成物と混合するまたは接触させるステップを含む。得られた混合物は、室温または環境温度またはそれ未満の温度で貯蔵することができる。試料と混合するＳＴＣの量は、使用者の必要性に適応させるように変えることができる。例えば、試料のタイプおよび／または量、下流分析の要求、利便性、などに応じて変えることができる。一実施形態では、試料の容量のＳＴＣ組成物の容量に対する比率は、約５：１〜約１：５の範囲である。特定の実施形態では、試料は等容量のＳＴＣ組成物と混合される。

分析する前に試料の処理を行う必要性をなくすために、試料の液化方法は試料収集の時点で行うのが好ましい。このように、潜在的な汚染および／または特殊な試料処理設備の必要性が最小化される。これは、例えば、試料収集装置中にＳＴＣ組成物を供給することにより達成することができる。

核酸検出方法
上述のように、分子診断法は、潜在的病原体の存在または非存在を特定するために、研究者および臨床医により患者の試料の分析に使用される道具としてますます重要になってきている。これらの分子法は、病原性生物体が存在する場合に、感染の程度を定量化する際にさらに有用である。一方、分子診断法は通常、非常に繊細であり、存在する病原体が低レベルの試料では、病原体が頑丈な細菌である、かつ／または病原体由来の核酸が試料から十分に放出されていないかまたは十分に単離されていない場合は特に、正確に処理して存在する病原体を特定または定量することが困難な場合がある。

本発明者らは、意外にも、ＳＴＣ組成物が核酸を効率的に放出させることを見出した。発明者らは、ＳＴＣ組成物により処理された試料が、試験０日目に抗生物質耐性マーカーの試験に利用可能な十分な量のＤＮＡを有していたことを示した。対照的に、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法では、陽性の結果を得るために試料を培養して十分な細菌を生成することが必要であった。

したがって、本出願は生物試料中の細菌核酸のキャラクタリゼーション方法を提供し、該方法は、生物試料を安定化組成物と接触させること、および試料中の核酸を増幅することを含み、該安定化組成物はキレート化剤、洗剤、塩を含み、約６〜約１１のｐＨを有し、該増幅ステップを行うのが収集の直後であっても、またはさらに後であっても、増幅された核酸のレベルは実質的に不変のままであり、核酸を増幅する前に試料を培養する必要はない。

キット
本発明の方法は、このような方法に使用されるＳＴＣ組成物をキットの形で提供することにより、便利に実施される。このようなキットは、ＳＴＣ組成物を乾燥成分の混合物または水性混合物として含むのが好ましい。

任意選択で、キットは容器を含み、該容器は、本発明のＳＴＣ組成物を含み、試料収集に好適する。適切な容器の例は、国際公開第０３／１０４２５１号および同０７／０６８０９４号に記載されているものである。これら国際公開特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で記載の発明のより良好な理解を得るために、次の実施例が示される。これらの実施例は、単に例示目的であることを理解されたい。したがって、これらの実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。

実施例
実施例１：Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中の結核菌添加喀痰の環境温度安定性
ヒトのＴＢの世界的制圧の１つの大きな目標は、ＴＢの原因物質である結核菌の検査室診断とそれに続く適切な処置である。喀痰検体の収集、輸送、および処理に伴う困難は、現在の世界的ＴＢ制圧努力に対する主要な課題である。結核菌は喀痰検体中に存在し、その他の急速増殖微生物叢が混入していることが多い。特定の臨床的に意味の少ない種の周囲温度での急速増殖は、医学的に重要な病原体を死滅させるかまたは駆逐する場合がある。したがって、検査室への検体の輸送の遅延、または訓練された作業者の対応の遅れまたは処理を行うインフラの遅れは問題となる。

結核高負担国では、多くの保健医療施設で喀痰抗酸性桿菌（ＡＦＢ）顕微鏡サービスが利用できず、かなり大きな割合の肺結核患者が長距離を移動して診断施設を利用することを強いられる（Ｓｅｌｖａｍ ｅｔ ａｌ．，２００７）。このインフラの不足は、処置中の多くの患者の死亡をもたらし、感染性患者が彼らの共同体内外へ感染を広めることを意味する。これを防ぐために、例えば、インドのＤＯＴＳ（短期直接監視治療）に基づく改訂国家結核対策プログラム（Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ＝ＲＮＴＣＰ）は、喀痰検体の顕微鏡センターへの輸送を推奨している。しかし、このようなサービス組織は、高感染性の喀痰試料の輸送が必要となるという事実などのいくつかの理由から困難である。さらに、１つの集中化した検査室施設への検体の輸送は、不安定である危険性があり、また、微生物学的な収率と健全性に影響を及ぼす可能性がある。

検体の健全性の急速な低下はまた、国際的感染症の共同研究ならびに遠隔にある地域での病原体の試験の両方に大きな障害となる。遠隔にある地域から特殊性の高い検査室に診断検体を移動し、診断精度を確保することは非常に困難である。このことは、多国間輸送の場合に遅延と温度変動の可能性があること考慮すると、特に該当することである。臨床診断分野において、かなり長い貯蔵および移動の後であっても、病原体を特定、または定量化することができるような、喀痰およびその他の生物試料の貯蔵および輸送のための信頼できる方法の必要性が存在する。

先進国では、喀痰試料は４℃で検査室に輸送されており、これは全体のコストをかなり押し上げる。多くの発展途上国では、コストおよびインフラの不足という理由もあって、喀痰検体は通常、周囲温度で検査室に輸送される（すなわち、低温流通体系管理が行われない）。たとえ３日間を超える間の室温での喀痰検体の貯蔵であっても、培養生存能力の大きな低下および汚染物増加速度の上昇が生じることが知られている（Ｐａｒａｍａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。都合の悪いことに、予備的顕微鏡診断により生じた初期の間違いは、臨床的徴候がより明確になる数週間後になるまで知ることができない（偽陰性）。その結果として、いくつかのグループは、喀痰検体をより大きな処理センターに送らせるために、それを保存する方法を開発することを試みた。Ｈｏｌｚら（２００１）およびＰｏｐｏｖａら（２００４）は、処理の前に、試料を１０日間までうまく凍結貯蔵することができることを示した。Ｋｅｌｌｙら（２００３）およびＤｏｒｍａｎら（２０１０）は、それぞれ、ホルムアルデヒドおよびアルコール中での喀痰の固定を提案した。しかし、これら全ての保存方法は、マイコバクテリアの生存能力に影響を与え、それらのその後の培地中での増殖および検出に影響する可能性がある。

本発明者らは、収集または輸送用化学組成物を開発した。意外にも、該組成物は、輸送および貯蔵中の複雑な喀痰検体中の強靭な微生物を安定化し、同時に、スメア顕微鏡、培養、およびリアルタイムまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を利用する診断のために、マイコバクテリアの生存能力を維持する。好都合にも、本輸送組成物は、喀痰との接触時に、大部分のバックグラウンド微生物を死滅させる。この実施例では、弱毒結核菌添加喀痰試料をｓｐｕｔｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＳＴＣ）組成物と混合し、培養、ＤＮＡ抽出およびｑＰＣＲを行う前に、典型的な周囲温度（３５℃、室温、および４℃）で３０日間の長期貯蔵を行った。

実験方法
本実施例のために、健康なＴＢ陰性患者由来の凍結された未処理の喀痰試料をＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（革新的な新規診断薬に関する基金）（ＦＩＮＤ）結核検体バンクから提供を受けた。ＦＩＮＤは、培養およびスメア分析を使って、この患者試料を、「スメア陰性、培養陰性」として分類した。

結核菌添加生物試料の調製
ＴＢ陰性として確立された未処理の喀痰試料がＦＩＮＤから凍結輸送された。喀痰試料を氷上でゆっくり解凍し、プールして２つの８ｍＬ試料を形成した。安全に結核陽性喀痰をシミュレートするために、喀痰に５ｘ１０^６コロニー形成単位／ｍＬ（ｃｆｕ／ｍｌ）で中等度の濃度の弱毒結核菌Ｈ３７Ｒａ（ａＭＴＢ）を添加した。１つの８ｍＬの、プールされ、添加された試料を均等に３分割し、それぞれの画分を等容積のＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）すなわち、Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＳＴＣ）と混合し、その後、画分を４℃、３５℃または室温で３０日間まで保持した。２つ目の８ｍＬの、プールされ、添加された試料は処理せずに、すなわち、未添加のままとし、均等に３つに分割した後、４℃、３５℃または室温で３０日間まで保持した。

示した時点（Ｔ＝０、７日、１４日および３０日）で、種々の温度で貯蔵された画分から一定分量を取り出した。一定分量を使って培養液に接種するか、または一定分量から３種の異なる方法（過ヨウ素酸塩、グアニジンチオシアネート、ビーズビーティング）を使ってＤＮＡを抽出し、抽出ＤＮＡをｑＰＣＲおよびマイコバクテリウム特異的プライマーを使って定量した。培養およびｑＰＣＲの前に、全てのａＭＴＢ添加画分を３５℃、４℃および室温（ＲＴ）で７、１４、および３０日間、貯蔵した。

ＭＴＢ添加喀痰画分の培養条件
それぞれの時点で、それぞれの画分から一定分量（４００μＬ）を培養用として取り出した。

ＢＤ２緩衝液処理画分に対しては、４００μＬの分量を５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細菌をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを４００μＬの無菌ＰＢＳ中に再懸濁し、完全に混合されるまでボルテックスした。

非処理（ＮＴ）画分に対しては、４００μＬの分量を２００μＬの新しいＮａＯＨ（２％）−ＮＡＬＣ（０．５％）−クエン酸塩（１．４５％）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。それぞれのチューブに６００μＬの無菌ＰＢＳを加え、５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを４００μＬの無菌ＰＢＳ中に再懸濁し、完全に混合されるまでボルテックスした。

ＢＤ２緩衝液処理画分および非処理画分に対し、次に、１００μＬの再懸濁細菌を、塗抹法を使って、３つのＬＢプレートに直接播種し、３７℃でインキュベートした。約４日目に、コロニーの数を計数した。

過ヨウ素酸塩法を使ったａＭＴＢ添加ＢＤ２緩衝液処理喀痰からのＤＮＡの抽出
１．それぞれの示した時間と温度（３５℃、４℃およびＲＴで、０、７、１４および３０日）で、ＢＤ２緩衝液処理画分から４００μＬの分量を新しいチューブに移し、５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細菌をペレット化した。
２．上清を廃棄し、ペレットを４００μＬの無菌ＢＤ２緩衝液中に再懸濁した。
３．（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度の１５ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
４．混合物を水浴中７０℃で２０分間インキュベートした。
５．試料を室温で２分間冷却した。
６．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
７．混合物室温で１０分間インキュベートした。
８．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
９．混合物を氷上で１０分間インキュベート後、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
１０．上清を清浄な標識チューブに移し、ペレットを廃棄した。
１１．２倍量の室温の９５％エタノールをチューブ中の上清に加え、チューブを２０回反転させることにより混合した。
１２．混合物を室温で１０分間インキュベートして、ＤＮＡを沈殿させた後、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＤＮＡをペレット化した。
１３．上清を静かに取り出し、ペレットを掻き乱さないように注意して廃棄した。
１４．ペレットを２００μＬのＴＥに溶解した（混合物を短時間ボルテックスしてＤＮＡを完全に再懸濁させた）。

グアニジンチオシアネート法を使ったａＭＴＢ添加ＮＴ喀痰からのＤＮＡの抽出
１．水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の４％溶液を新しく調製し、オートクレーブで処理した。
２．２．９％クエン酸ナトリウム溶液を新しく調製し、オートクレーブで処理した。
３．等容積のＮａＯＨおよびクエン酸ナトリウム溶液を混合し、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）粉末を加えて、最終濃度の０．５％を得た。この溶液を良く混合し、同じに日に使用した。
４．それぞれの示した時間と温度（３５℃、４℃およびＲＴで、０、７、１４および３０日）で、ＮＴ画分から４００μＬの分量を新しいチューブに移し、２００μＬの新しいＮａＯＨ−ＮＡＬＣ−クエン酸塩を加えた。チューブを良くボルテックスして混合した。
５．混合物を室温で１５分間インキュベートした後、６００μＬの無菌ＰＢＳを加え、５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細菌をペレット化した。
６．上清を廃棄し、４００μＬの無菌ＰＢＳをペレットに加えた。チューブをボルテックスして混合した。
７．混合物を５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細菌を再ペレット化した。
８．上清を廃棄し、ペレットを４００μＬの無菌ＰＢＳ中に再懸濁した。
９．２００μＬの再懸濁ペレットに、１ｍＬのＤＮＡｚｏｌ試薬（グアニジンチオシアネート洗剤溶解溶液、カタログ番号１０５０３−０２７、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、混合物をピペッティングして細胞を溶解した後、０．５ｍＬの１００％エタノールを加え、チューブを１０回反転させて混合した。
１０．混合物を室温で３分間インキュベートした後、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＤＮＡをペレット化した。
１１．ＤＮＡペレットを７５％のエタノール１ｍＬで２回洗浄した。
１２．全ての微量のエタノールを除去し、ＤＮＡペレットを２００μＬの８ｍＭ ＮａＯＨに溶解した。

「ビーズビーティング」法（「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ」）を使ったａＭＴＢ添加ＮＴ喀痰からのＤＮＡの抽出
１．それぞれの示した時間と温度（３５℃、４℃およびＲＴで、０、７、１４および３０日）で、ＮＴ画分から４００μＬの分量を新しいチューブに移し、２００μＬの新しいＮａＯＨ−ＮＡＬＣ−クエン酸塩を加えた。チューブを良くボルテックスして混合した。
２．混合物を室温で１５分間インキュベートした後、６００μＬの無菌ＰＢＳを加え、５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細菌をペレット化した。
３．上清を廃棄し、４００μＬの無菌ＰＢＳをペレットに加えた。チューブをボルテックスして混合した。
４．混合物を５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細菌を再ペレット化した。
５．上清を廃棄し、ペレットを４００μＬの無菌ＰＢＳ中に再懸濁した。
６．２００μＬの再懸濁細菌を８０℃で１〜２時間加熱した。
７．２００ｍｇの１０５〜１５０μｍガラスビーズを加熱細菌混合物に加えた。
８．Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（商標）（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使って、ガラスビーズを含む混合物を１分間ずつ２サイクルにわたり激しく震盪させた。各サイクル毎に１分間氷上に置いた。
９．ＰＣＲに先立ち、試料を９５℃で２分間加熱した。

ｒｔＰＣＲ条件
この実施例では、ａＭＴＢ添加喀痰の一定分量から単離されたＤＮＡを、マイコバクテリウム特異的ｒｔＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）である、ＲＤ４ ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイに供した。ＲＤ４用のプライマーは次の通りである：ＲＤ４−順方向５’−ＣＣＡ ＣＧＡ ＣＴＡ ＴＧＡ ＣＴＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ＣＡＡ−３’およびＲＤ４−逆方向５’−ＡＡＧ ＡＡＣ ＴＡＴ ＣＡＡ ＴＣＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＴＣ−３’（Ｈａｌｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１））３７未満の閾値サイクル（Ｃ_ｔ）値を陽性と報告し、３７より大きいＣｔ値の試料を再試験して、結果が同じなら、陰性と報告し、結果が同じでない場合は、不確定として報告した。

結果および考察
通常、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ（ＳＯＣ）シナリオでは、喀痰検体は収集中に無処置（ＮＴ）のままで、検査室に輸送される。検査室で受け入れ時に、喀痰はＮＡＬＣ−ＮａＯＨ−クエン酸塩の添加により液化および汚染除去された後に、培養される。この実施例では、弱毒ＭＴＢは、室温および４℃で３０日まで維持された無処理喀痰中である程度まで生存可能な状態で残存したが、３５℃で維持された場合は、その後の培養により増殖が認められなかった（ＮＧ）（表１）ことから判断して、生存可能ではなかった。

本出願で記載の方法を実施する場合、喀痰検体は、理想的には、収集の時点でＳａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（例えば、ＢＤ２緩衝液）と混合され、検査室で処理されるまで、輸送および貯蔵全体を通してこの状態で維持されるであろう。どの時点でも、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ−クエン酸塩処理は採用されないであろう。ＮＴ喀痰と同様に、この実施例は、室温および４℃で、ａＭＴＢはＳＴＣ単独中で少なくとも３０日間生存可能な状態で残存したことを示した（表１）。ＳＴＣおよびＮＴの両方法とも、３５℃で７〜３０日間、ａＭＴＢの生存能力を持続させることができなかった。意外にも、収集の時点（Ｔ＝０）でＳＴＣを喀痰に添加して、直ちに検体を液化することにより、バックグラウンド細菌叢が検体を圧倒する機会を持つ前に、標的生物体であるマイコバクテリウム（存在する場合）の生存能力に悪い影響を与えることなく、少なくとも３０日間にわたり、バックグラウンド細菌叢の増殖を排除または最小化することができることを見出した。

収集され、３５℃、４℃および室温で３０日までＳＴＣ中に貯蔵されたａＭＴＢ添加喀痰検体のリアルタイムＰＣＲでは、その後に抽出されたａＭＴＢのＤＮＡ濃度は、貯蔵温度および時間に関係なく安定な状態のままであることが示された（表２参照）。弱毒マイコバクテリア結核菌からの機能性ｑＰＣＲ品質ＤＮＡを放出させる点で、過ヨウ素酸塩処理は、ビーズビーティングを使った場合のａＭＴＢの熱的、物理的破壊に匹敵する効果があることが明らかになった。対照的に、ＤＮＡｚｏｌ（グアニジンチオシアネート−洗剤）処理による抽出では、ＤＮＡ放出の点で、過ヨウ素酸塩またはビーズビーティング法に比べて非常に効果が少ないことが明らかになった。特に、ＳＴＣと過ヨウ素酸塩の組み合わせは、ＳＯＣとＤＮＡｚｏｌ処理の組み合わせと比較して、マイコバクテリウム特異的アッセイの感度を１ｌｏｇ（３＋Ｃ_ｔ値）だけ高めた。したがって、検査室での検体処理中における、標準的ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ−クエン酸塩検査室手順に続けて機械的なビーズビーティングを行う方法は、ＳＴＣとそれに続く過ヨウ素酸塩処理の方法により、うまく置き換えることができる。重要なのは、マイコバクテリウム生存能力に悪影響を与えることなくバックグラウンド細菌叢を制御するために、ＳＴＣを収集の時点で喀痰と混合することができることである。

実施例２：Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙは接触時に喀痰を液化する
ヒト由来の喀痰を使って嚢胞性繊維症患者の結核を診断し、感染を検出する。このような高粘稠検体中では、細菌は均一に分布しておらず、このことにより、通常マイコバクテリアの特定に使用される抗酸染色法において問題を生ずる。注目すべきことは、この結核診断技術は、約５０％の感度に過ぎないことがわかっており、すなわち、患者が実際に疾患を有する場合、ＴＢの存在を検出する確率と、検出しない確率が同じであることである。この感度の不足は、既存の試料調製プロトコルでは、検体のどの部分にも染色のためのマイコバクテリアを得る等しい確率が存在するように、細菌が均一に分布した試料を生成することができないことに起因する。したがって、正確で代表的な喀痰培養および分子診断を確実にするためには、喀痰検体の液化および均一化が不可欠である。

液化は、粘度の低下、試料を容易にピペッティング可能なこと、および密な凝集塊の完全な消失により判断される。従来、種々の粘液溶解薬を使用して喀痰検体が液化されてきたが、これらに粘液溶解薬には、例えば、パンクレアチン、パンクレアチン−トリプシン、ならびにナトリウム２−エチルヘキシルサルフェート（Ｔｅｒｇｅｍｉｓｔ）、アミラーゼ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、およびジチオトレイトール（ＤＴＴ、Ｓｐｕｔｏｌｙｓｉｎ）（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｌａｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０）が挙げられる。ＮＡＬＣは、よく使われている液化剤の１つであり、ほとんどの嚢胞性繊維症（ＣＦ）患者の喀痰中の主な病原体である緑膿菌に対しインビトロで顕著な阻害活性を有する。また、これらの粘液溶解薬により粘液から不十分に放出された細胞は、黒く着色する傾向があり、このために正確な特定が困難になる。

意外にも、粘液性喀痰試料の取扱中に、本発明者らは、ＳＴＣ単独（ＢＤ２緩衝液：２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）で喀痰液化に十分であることを認めた。ＮＡＬＣまたはＤＴＴなどの還元剤は必要でなく、液化の程度は、現在のＳｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅの３．５％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）処理法を使って得られたものと同等であった。１２〜２４時間毎に新しくする必要があるＮａＯＨ−ＮＡＬＣ−クエン酸塩と異なり、ＢＤ２緩衝液は室温で数ヶ月間安定である。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光染料および蛍光測定法、ならびに１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子特異的プライマーを使ったｑＰＣＲを使用したＤＮＡ収率の多数回技術的反復分析により液化の目視観測を行った。

材料および方法
この実施例では、健康なドナー由来の２ｍＬの喀痰をプールし、ボルテックスした。等容積のＢＤ２緩衝液を加え、反転により混合し、室温で１５分間インキュベートした。この時点で、喀痰は完全に流動化した。核酸を抽出するために、喀痰をプロテイナーゼＫ（１６０μｇ）で処理し、５０℃で２時間インキュベートした。このインキュベーション後、多数回技術的反復実験用として、１０ｘ２００μＬの分量を新しいチューブに取り出した。それぞれの２００μＬの分量に、１０μＬの３Ｍ酢酸カリウム（最終濃度１５０ｍＭ）を加え、チューブを氷上に１０分間保持した。１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。２倍量の室温の９５％エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。室温で１５分後、１３，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離ステップによりＤＮＡをペレット化した。ＤＮＡペレットを１００μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解した。

ＤＮＡ濃度の蛍光定量
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光染料（２００ｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ７５８１）を使って１０個の精製試料からＤＮＡを定量した。ラムダＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２５２５０−０１０）を使って、検量線を生成した（３通り；０〜５０ｎｇ／μＬ）。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）は、ナノグラム以下の量の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の高感度定量化を可能とする蛍光二本鎖ＤＮＡ結合染料（４８５ｎｍ励起／５３５ｎｍ発光）である。一定分量のそれぞれの精製試料およびラムダＤＮＡ基準を黒色平底９６ウエルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、カタログ番号６５５２０９）中で処理し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を使って蛍光を測定した。

ｒｔＰＣＲ条件
１０個の喀痰の一定分量から抽出されたＤＮＡを、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子特異的ｒｔＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）に供した。１６Ｓ ｒＲＮＡ用のプライマーは次の通りである：ＢａｃｒＲＮＡ１７３−Ｆ ５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’およびＢａｃｒＲＮＡ１７３−Ｒ ５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’。それぞれのＰＣＲ反応液には、２μＬテンプレート、２．５μＬの１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５μＬの１０ｘＰＣＲ緩衝液、１．２５μＬの５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＬの１０ｐＭ順方向プライマー、０．５μＬの１０ｐＭ逆方向プライマー、０．５μＬの０．５μＭ Ｓｙｔｏ９、０．２μＬの５Ｕ／μＬ Ｔａｑポリメラーゼ、１２．３μＬの水を含めた。大腸菌からの高度精製ＤＮＡがＰＣＲ分析用の基準としての役割を果たした。陰性対照には、鋳型ＤＮＡを加えない反応液を含めた。Ｃ_ｔ値は、増幅曲線が検出の閾値と交差する点のサイクル数を意味する。Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ装置ソフトウェアで閾値ラインを設定し、各試料についてＣ_ｔ値を計算した。Ｃ_ｔ値は試料中のＤＮＡの量に反比例する。１サイクルのＣｔ値の減少は、２倍の検出ＤＮＡ量に相当する。

結果および結論

喀痰の粘度の完全な低下は、サンプリング誤差を減らし、培養の精度を高めるために不可欠である。実験は、喀痰が、５：１〜１：５（喀痰：ＳＴＣ）の比率の本ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにより液化されたことを示した。

本実施例は、同容積のＳＴＣを使った室温で１５分間の１回の処理により高粘稠喀痰が完全に液化されたことを示す。ＳＴＣ処理喀痰から取り出され、分析されたそれぞれの一定分量は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光測定法により示されるように、全ＤＮＡ濃度が実質的に同一であった（表３）。このことは、試料全体に均一に分散されたＤＮＡ（任意の起源由来の）の均一分布が存在し、液化を示すことを意味する。また、細菌特異的プライマーを使ったｑＰＣＲは、それぞれの技術的反復測定が同じ量の細菌ＤＮＡを含んでいたことを示した。したがって、内在性細菌を検体全体に均一に分配するためには、短時間のＳＴＣへの暴露で十分であった。

本実施例は、通常、喀痰収集の時点でＳＴＣを検体と混合し、収集時に液化試料を生成することができることを示す。しかし、ＳＴＣは、処理（例えば、抗酸染色法）または培養の前に、検査室で検体に加えて、試験の時点で液化試料を得ることも可能である。

本明細書の結果は、ＳＴＣ組成物および本明細書で記載の方法は、試験の一貫性を損なうことはなく、また同時に、現場での実施に必要な速度と精度を実現したことをさらに示す。この単純で迅速、安価な喀痰試料処理方法は、人的資源の多いおよび少ない状況下で、種々の検出方法に対し、より多くのマイコバクテリア（存在する場合には）を利用可能／アクセス可能にし、疾患のさらなる伝播を防止する。

実施例３：スメア顕微鏡、培養および分子診断アッセイを使った結核診断におけるＳａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの適合性
世界中で、約２０億人が潜在的に高い感染性を有する結核菌（「ＭＴＢ」）に感染している。毎年、ほぼ９百万人が活動性疾患を発症し、２百万人がこの疾病で死亡する。ＭＴＢの感染性の性質を考慮すると、迅速で正確な診断はＭＴＢ処置および疾患制圧の重要な要素である。

抗結核療法で使用される４種の一般的な第一選択薬は、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピン（ＲＩＦ）、エタンブトール（ＥＭＢ）、およびピラジナミド（ＰＺＡ）である。しかし、ＭＴＢ株は１種または複数種の薬剤に対し耐性になり、治癒の達成を困難にする場合がある。ＲＩＦ耐性は、多剤耐性（ＭＤＲ−ＴＢ）株中で最も一般的に認められ、このような分離菌中で９５％を超える頻度であることが報告されている（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９５）。ＭＤＲ−ＴＢは、少なくともＩＮＨおよびＲＩＦに対して耐性である菌株により引き起こされる結核と定義される。ＲＩＦまたはその他の第一選択薬に対する耐性は通常、全感受性検査の必要性を示す。

この実施例では、ヒトＴＢ陽性喀痰検体が入手可能な、独立した診断検査室の、Ａｌｌ Ｉｎｄｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＩＩＭＳ，Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）により、喀痰から結核菌を診断する現在の代表的スタンダード法と、未処理の喀痰試料をＳａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＳＴＣ）中に収集する本発明とが並べて比較された。試験には、１）スメア顕微鏡、２）ＭＧＩＴ培養、３）Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）（結核菌およびリファンピン（ＲＩＦ）耐性のＰＣＲベース検出）、および４）マイコバクテリウム感染を診断するための、検査室開発マルチプレックスＰＣＲ（ＬＤＭＰ）アッセイ（Ｇｏｐｉｎａｔｈ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ，２００９）を含めた。

Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔシステムと共に使用するためのＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイは、１）喀痰試料または誘導されたもしくは吐き出された抗酸性桿菌（ＡＦＢ）スメア陽性もしくは陰性の喀痰から調製された濃縮沈殿物中の結核菌群ＤＮＡ、および２）リファンピン耐性のリスクのある患者由来の試料のｒｐｏＢ遺伝子のリファンピン耐性関連変異の検出のための半定量的なネストリアルタイムＰＣＲインビトロ診断試験である。

実験方法
未処理の喀痰検体の処理および４つの診断検査
確立されたＴＢまたはＭＴＢ活動性感染の高い確率を有する６人の患者から未処理の喀痰試料を収集した。検体（４ｍＬ以上）をピペットを使って手作業で２つの部分（各２ｍＬ）に分け、等容積の新たに調製した４％ＮａＯＨ／０．５％ＮＡＬＣ（代表的スタンダード）またはＳＴＣ（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭのグリシン、ｐＨ１０．５から構成されるＢＤ２緩衝液）で処理した後、培養、ＡＦＢスメアおよび２種の分子診断アッセイにより評価した。

ＮａＯＨ／ＮＡＬＣまたはＳＴＣの添加後、それぞれの分量を次のように処理した：
１．混合物を１０〜１５秒間ボルテックスした。
２．混合物を室温で１５分間、高粘液性試料の場合は２０〜２５分間、静置した。
３．チューブにリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を５０ｍＬの標識まで満たした後、数回反転して、完全に混合し、その後、３，０００〜３，５００ＲＣＦで１５分間遠心処理した。

４．上清を注意深く注ぎ出して、ペレットを１．２５ｍＬの無菌リン酸緩衝液中に再懸濁し、これを次のように一定分量を取り出した：
ａ．一定分量１：３００μＬ
ｉ．３００μＬの無菌リン酸緩衝液を加える（合計６００μＬ）。
ｉｉ．抗酸性桿菌（ＡＦＢ）スメア検査（１００μＬ）。
１．確立された検査室プロトコルに従ってスメアを実施した。スメアを喀痰の汚染除去の前に（Ｓｍｅａｒ Ｄｉｒｅｃｔ）およびＮａＯＨ／ＮＡＬＣまたはＳＴＣを使った汚染除去（ＤＣ）の後で（Ｓｍｅａｒ ＤＣ）行った。スメアスコアリング：１＋ 弱陽性の試料を意味する、２＋ 中陽性の試料を意味する、３＋ 強陽性の試料を意味する。
ｉｉｉ．ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＭＧＩＴ−９６０（５００μＬ）
１．バイオセーフティキャビネット２型中で、無菌条件下、ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＭＧＩＴチューブ中に接種した。
２．接種したＭＧＩＴ−９６０チューブをＢＡＣＴＥＣ（商標）ＭＧＩＴ−９６０システムに装着し、蛍光ユニット中で４２日まで増殖を連続的にモニターし、停止増殖量に達した後にチューブは陽性を示した。ＭＧＩＴ培養の状態は報告しなかった。

ｂ．一定分量２：２５０μＬ
ｉ．２５０μＬの無菌リン酸緩衝液を加える（合計５００μＬ）。
ｉｉ．検査室開発マルチプレックスＰＣＲ（ＬＤＭＰ）アッセイ
１．ＬＤＭＰアッセイによる分析のためのＤＮＡ精製ＡＩＩＭＳプロトコル（Ｇｏｐｉｎａｔｈ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ，２００９）に従った。
２．簡単に説明すると、細胞壁をリゾチームで溶解した後、タンパク質のプロテイナーゼＫ消化およびナトリウムドデシルサルフェート処理を行った。
３．ＮａＣｌおよび臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを使用して、タンパク質および高分子を沈殿させた。
４．クロロホルムおよびイソアミルアルコールで抽出後、水相から核酸を回収した。
５．−２０℃でイソプロパノールを使って一晩、ＤＮＡを沈殿させた。
６．ペレットをエタノールで洗浄し、５０μＬのＴＥ緩衝液で再構成し、１０μＬをマルチプレックスＰＣＲに使用した。
７．マルチプレックスＰＣＲ（Ｇｏｐｉｎａｔｈ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ，２００９）では、マイコバクテリウム属特異的プライマー（ｈｓｐ６５）（Ｔｅｌｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、非定型抗酸菌複合体（Ｍ．ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡＣ）特異的プライマー（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）および新規結核菌（ＭＴＢ）群特異的セットのｃｆｐ１０またはｅｓａｔを標的とするプライマー（Ｇｏｐｉｎａｔｈ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ，２００９）の３つのプライマーセットを使用した。

ｃ．一定分量３：３００μＬ
ｉ．３００μＬの無菌リン酸緩衝液を加える（合計６００μＬ）。
ｉｉ．Ｃｅｐｈｅｉｄ Ｘｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイ
１．１．８ｍＬのＣｅｐｈｅｉｄ ＳＲ緩衝液（比率１：３）を加えた。
２．喀痰沈殿物用のＣｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイに従って試験した。
３．ＧｅｎｅＸｐｅｒｔリアルタイムＰＣＲから次の２つの結果を得た：１）結核菌正の陽性／陰性、および２）リファンピン（ＲＩＦ）抗生物質感受性または耐性（Ｓｅｎｓ／Ｒｅｓ）（表４）。

ｄ．一定分量４：２５０μＬ
ｉ．２５０μＬの試料を２ｍＬのスピンチューブに移した。
ｉｉ．２５０μＬのＳＴＣを加える（合計５００μＬ）。

ｉｉｉ．ＳＴＣ処理試料用のＤＮＡ抽出プロトコル：
１．（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度３０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
２．７０℃で２０分間インキュベートし、室温まで冷却した。
３．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
４．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
５．氷上で１０分間インキュベートした。
６．１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
７．上清を清浄な標識チューブに移した。ペレットを廃棄した。
８．２倍量の室温９５％エタノールを加えた。
９．２０回反転して混合した。
１０．室温で１５分間試料をインキュベートした。
１１．１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。
１２．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出し、廃棄した。
１３．ペレットを１００μＬのＴＥに溶解した。
１４．短時間ボルテックスし、室温で少なくとも３０分間静置した。
１５．精製ＤＮＡを室温または−２０℃で貯蔵した。

結果および結論
ＳＴＣに対する短時間の暴露により、喀痰検体の６人全ての試験患者由来の検体（表４）が、ＮａＯＨ／ＮＡＬＣ処理を使って得られたものとほぼ同じレベルでうまく液化および汚染除去された。ＮａＯＨ／ＮＡＬＣまたはＳＴＣで汚染除去後、接種培養液は汚染の兆候を示さず、臨床検体中のバックグラウンド微生物叢を死滅させる点で、ＳＴＣが同等に効果的であることを示した。

汚染除去方法に関係なく、スメア分析は、同じ診断結果（１＋対３＋）をもたらし（表４）、ＳＴＣはマイコバクテリアの抗酸性染色特性を変えなかったことを示した。したがって、顕微鏡によるマイコバクテリアを検出する標準的検査室実務を、ＳＴＣ中に直接収集された喀痰検体の使用に容易に適用可能である。

ＮａＯＨ／ＮＡＬＣまたはＳＴＣを使った喀痰の液化および汚染除去後に、６人の全患者の検体からマイコバクテリアを培養した。ＳＴＣは培養中にマイコバクテリアの生存能力に悪い影響を与えず、得られた結果は従来のＮａＯＨ／ＮＡＬＣ処理を使って得られたものと同等であった（表４）。

分子診断試験結果も同様に、ＮａＯＨ／ＮＡＬＣおよびＳＴＣ処理患者試料で同じであった。Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）システムを使ったネストリアルタイムＰＣＲ分析は、６人全ての患者が結核菌陽性であり、リファンピンに感受性があることを示した（表４）。ＡＩＩＭＳ検査室開発マルチプレックスＰＣＲアッセイは、実際に、６人の患者が属レベルでおよび種レベルで結核菌に陽性であり、さらに、非定型抗酸菌複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）に対し陰性であった（表４）。ＳＴＣ処理喀痰試料はまた、ＡＩＩＭＳ確立ＴＢ試験アルゴリズムによるＬＤＭＰアッセイにも適合した。このアッセイでは、核酸は、標準的クロロホルム／イソアミルアルコール精製法を使って検体から回収される。

本実施例は、培養、抗酸性桿菌（ＡＦＢ）の顕微鏡的特定および分子診断検査などの一連の現状の手法を使って、ＳＴＣで液化および除染除去された未処理の喀痰検体を、マイコバクテリア感染の検出およびキャラクタリゼーションのための標準的診断方法にうまく使用することができることを示す。これらのＳＴＣ処理試料はまた、適切な治療を投与するためにおよびより良好な患者管理のために、病原学的マイコバクテリア種に対するＰＣＲベース試験にも使用することができる。

実施例４：喀痰マイクロバイオームはＳａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中で安定である
本実施例では、Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＳＴＣ）組成物を未処理のプールした喀痰（ＴＢ不含）と混合し、喀痰の液化および汚染除去、ならびに、室温で長期間貯蔵した内在性マイクロバイオームの安定性を評価した。標準的喀痰汚染除去／液化手順における水酸化ナトリウムの産業での標準的使用のための対照として、水酸化ナトリウムで短時間処理後に、喀痰も長期間貯蔵した。

実験方法
喀痰検体の処理
３つのＴＢ陰性喀痰検体（ＦＩＮＤ結核検体バンクから提供された）をプールし、３つの１ｍＬの一定分量に均等に分割した。等容積のＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）、ＢＤ３緩衝液（４％ＳＤＳ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１４０ｍＭのＬｉＯＨ、ｐＨ６．８）、および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、３．５％）を３つの喀痰一定分量に加え、混合した。室温で１５分以内に、３つ全ての混合物が均等に液化され、液化は、粘度の低下、試料を容易にピペッティングできる能力、および密な凝集塊の完全な消失、により定量的に測定された。

ＮａＯＨ処理一定分量を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５分間）によりペレット化し、上清を廃棄し、ペレットをＰＢＳ中に添加し、４℃で２８日間まで貯蔵した。ＢＤ２およびＢＤ３処理喀痰試料をバイオセーフティキャビネット中、室温（１５℃〜２５℃）で２８日間まで維持した。

ＤＮＡ精製
１．処理（上記）の、０、１、７、２１および２８日後、ＤＮＡの精製のために、ぞれぞれの混合物から２００μＬの一定分量を抜き出した。
２．８１ｍｇのプロテイナーゼＫを、それぞれの一定分量に加え、５０℃で一晩インキュベートした。
３．それぞれのこれらの一定分量を２つの１００μＬの一定分量に分割し、１つを（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム（ＮＰＩ）を含む抽出用に、残りをＮＰＩを含まない抽出用とした。
４．＋ＮＰＩの一定分量に、ＮＰＩを１５ｍＭの最終濃度まで加え、７０℃で２０分間インキュベートし、室温で冷却した。
５．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．１）を全ての試料に加えて最終濃度１００ｍＭとし、室温で５分間インキュベートした。
６．全ての試料に、３Ｍの酢酸カリウムを最終濃度１５０ｍＭまで加えた。
７．氷上で１０分間インキュベートした。
８．１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄した。
９．２倍量の室温９５％エタノールを上清に加えた。
１０．室温で１５分間インキュベートした。
１１．１３，２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
１２．ＤＮＡペレットを５０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ７．１）に再懸濁した。

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法
本組成物中の喀痰マイクロバイオームの安定性を正確に、再現性よく評価するために、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）と呼ばれる比較的新しい方法を利用した。この方法は、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域（この場合では、Ｖ３領域）を採取し、それを、ＰＣＲおよび隣接保存領域に対するプライマーを使って増幅する場合、アンプリコンは細菌種に固有の融点を有するであろう（たとえ、単一のヌクレオチドの差異が融解物に影響を与え、それにより異なるプロファイルを与えるとしても）という考えに基づいている。

この方法が複数の細菌種を含む試料に適用される場合、保存プライマーを使った増幅は多くのアンプリコンを生じ、これらの全てはおおよそ同じ長さであるが、非保存領域では異なるヌクレオチド構成を有する。次に、これらのアンプリコンは、勾配を有する変性溶液（尿素およびフォルムアミド）を含むゲル上で泳動させる。アンプリコンはそれらのヌクレオチド構成に応じてゲル上の異なる場所で変性され、それにより、試料中に存在する全ての種が分離される。

ＤＮＡアンプリコンが一本鎖型に変性しないようにするために、可変部分が既に変性したゲル上のアンプリコンの移動を遅らせる約３０ヌクレオチドのＣＧクランプを順方向プライマーに加えた。一般に、ゲル上の４０％〜６０％の変性勾配がバンドの良好な分離を与え、同時に、喀痰種の大部分を捕捉する。アンプリコンの変性を容易にし、また、ゲルを駆動中を通して同じ温度に保持するために、ゲルは一定の５５℃で泳動される。

ＰＣＲ−ＤＧＧＥは下記の手順に従って実行された。
ＤＧＧＥのためのＰＣＲ増幅（順方向プライマー上に５’クランプを有する１６Ｓプライマーを使用）
ａ．２μＬの１０ｎｇ／μＬ精製ＤＮＡを１２連ＰＣＲチューブに加えた。
ｂ．マスターミックスを調製した（９８μＬ／反応）：７６．７μＬの水、１０μＬの１０ｘＰＣＲ緩衝液、４μＬの５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２μＬの１０ｐｍｏｌ逆方向プライマー（ＰＰＵＮ５１８Ｒ、５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’）、２μＬの１０ｐｍｏｌ順方向プライマー（ＰＲＢＡ３３８Ｆ、５’−ＣＧＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’）、および０．８μＬの５Ｕ／μＬ Ｔａｑ。
ｃ．９８μＬのマスターミックスをそれぞれのチューブに加えた。
ｄ．従来のＰＣＲ機械でＰＣＲを行った：９２℃で２分間を１サイクル；９２℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で６０秒間を２８サイクル；続けて、７２℃で６分間を１サイクル。

ＰＣＲアンプリコンのＤＧＧＥ
ａ．４０％および６０％変性溶液中の８％アクリルアミド／ビスゲルのストック溶液を調製した：

ｂ．Ｄｃｏｄｅシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）用のインストラクションパンフレットに従って、ガラスプレートおよびスペーサーを組み立てた。
ｃ．４０％および６０％変性溶液を使って、平行勾配を有する８％アクリルアミド／ビスゲルを調製し、注入するために、次の手順を使用した：
・２０ｍＬの４０％および６０％変性溶液を、「低密度」および「高密度」とそれぞれ標識された２つの別のビーカーに秤取した。
・２００μＬの１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を各溶液に加えた。
・２０μＬのＴＥＭＥＤを各溶液に加えた。
・溶液をかき回すことによりよく混合した。
・各溶液を別の２０ｍＬシリンジ中に満たした。
・シリンジをゲル充填装置に取り付けた。この装置では、「低密度」または「高密度」をトップフィリング部に明記した。
・注：１．０ｍｍスペーサーを有する１６ｘ１６ｃｍゲル用の容積調節設定を１８．５ｍＬとした。
・Ｙ配管をそれぞれのシリンジに取り付け、配管の他端にニードルを取り付けた。
・ニードルをガラスプレートの間に配置した。
・勾配が平らになるための時間を保持できるように、ホイールを回転させて、ゲルをゆっくり、一様に注入した。
・ゲルを数時間重合させた。

ｄ．ゲル泳動システムを１ｘＴＡＥ緩衝液を使って５５℃に予備加熱した。
ｅ．８μＬのＦｅｒｍｅｎｔａｓのｌ６ｘローディングダイを４２μＬのＰＣＲ産物に添加した。
ｆ．再循環ポンプのスイッチを入れる前に、試料を壁から追い出してゲル中に入れるために、ゲルを２００Ｖで５分間駆動した。
ｇ．再循環ポンプをオンにして、ゲルを７０Ｖで１４時間駆動した。
ｈ．ゲルを１ｘＳｙｂｒ Ｇｏｌｄで３０分間染色した（２５０ｍＬの１ｘＴＡＥ＋２５μＬの１０，０００ｘＳｙｂｒ Ｇｏｌｄ）。
ｉ．ゲルを１ｘＴＡＥ中で５分間脱染した。
ｊ．ＵＶ下で画像を取得した。

ユニバーサルプライマー（Ｖ３領域）を使って、１６Ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲを行い、続けて、ＤＣｏｄｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使ってＤＧＧＥを行った。

結果および結論
標準的ＮａＯＨ処理と同様に、本ＳＴＣ組成物（ＢＤ２およびＢＤ３緩衝液）と混合された喀痰は、室温で急速に液化された。目視検査および手技により、混合物は粘度が低下し、ピペッティングが容易になり、密な凝集塊が残らなかった。しかし、マイコバクテリアを死滅させるのを避けるために短い１５〜２０分に制限されているＮａＯＨ処理とは異なり、喀痰は収集され、ＳＴＣ組成物中に、マイコバクテリアを培養する能力に悪影響を与えることなく、室温で数日間および数週間貯蔵することができる（実施例１および５を参照）。

０日目には、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥ分析は、収集の時点でプールされたこの喀痰試料中に存在するマイクロバイオーム、または様々な細菌集団を示す（図１〜３）。２８日間にわたり、ＢＤ２処理（図１）／ＢＤ３処理（図２）またはＮａＯＨ（図３）処理喀痰から得られたバンドパターンは、実質的に安定なままであり、これらの混合物は室温および４℃でそれぞれ静菌性であったことを示した。ＢＤ２処理／ＢＤ３処理喀痰では、採用された精製法（＋／−ＮＰＩ）に関わらず、時間が経過しても新しいバンドは現れず、また、バンド強度は一定のままであった。

ＢＤ２およびＢＤ３処理喀痰由来の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子バンドの数は、非常に似ており、ＳＴＣ組成物の療法の実施例が、この時間の間に、細菌または細菌ＤＮＡを同じ程度に保存したことを示す（図１および２）。興味深いことに、ＮａＯＨ処理喀痰から得られたＤＧＧＥバンド形成パターン（図３）は、ＢＤ２処理／ＢＤ３処理喀痰のものとは同じでなかった。ＮａＯＨ処理喀痰から生じたより少ない１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子バンドは、細菌種の多様性の減少を示唆する。さらに、バンド強度における軽度の差異が、ＮａＯＨ処理後にＮＰＩを使ったＤＮＡ精製で認められた。ＮａＯＨ処理に関連する変性条件でおよびその後のＰＢＳ中の貯蔵中にＤＮＡが分解したまたはＤＮＡ精製条件が理想的でなかったように見える。

実施例５：ＳＴＣで１週間まで処理された喀痰から回収された生存結核菌
Ｓｐｕｔｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＳＴＣ）組成物は、検体中に存在するマイコバクテリアを死滅させることなく、喀痰の液化、バックグラウンド細菌叢の汚染の除去および検体中の全核酸の安定化に成功したことが明らかになった。これらの本ＳＴＣ組成物の有益な性質および方法は、試験検査室に対し順応性を与える。ＳＴＣ組成物で処理された検体は、遠隔にある地域で収集し、周囲条件下で検査室に安価に輸送することができ、その時点でも、未処理の喀痰分析用として現在認められている方法、例えば、培養、スメア顕微鏡および分子診断アッセイなどにより、うまく、正確に評価することができる。本実施例は、室温のＳＴＣ組成物中でマイコバクテリアが生き残っている時間枠の実例を提供する。

実験方法
嚢胞性繊維症患者由来の喀痰の処理
嚢胞性繊維症（ＣＦ）患者由来の未処理の臨床喀痰試料（Ｄｒ．Ｍ Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ，Ｔｈｅ Ｏｔｔａｗａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ、から提供を受けた）を４℃で１週間まで保持した。喀痰（各３ｍＬ）に、３．３ｘ１０^６コロニー形成単位（ｃｆｕ）の毒性結核菌臨床株（確立された陽性ＴＢ患者から単離）を添加した。添加された喀痰を等容積のＢＤ２緩衝液と混合し、５〜１０回反転し、バイオセーフティキャビネット中に室温で７日までそのままにした。室温で２４時間および７日後、試料を１０秒間ボルテックスし、３，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、細菌ペレットを沈殿させた。上清を注いで除き、ペレットを滅菌水に再懸濁した。一定分量を複数のＭＧＩＴ培養チューブ（ＰＡＮＴＡ／増殖添加剤を含む）に接種し、３５℃で２３日間まで増殖させた。

結果および結論
ＭＧＩＴチューブ中に接種の前に、ＢＤ２緩衝液中で２４時間保持されたＴＢ添加喀痰は、７日以内に明確なＴＢ増殖を示し、バックグラウンド細菌叢によるこれらの培養の汚染の証拠は認められなかった。ＭＧＩＴチューブ中への接種の前に、ＢＤ２緩衝液中で７日間保持されたＴＢ添加喀痰は、２１〜２３日以内に明確なＴＢ増殖を示し、バックグラウンド細菌叢によるこれらの培養の汚染の証拠は認められなかった。この結果は、ＢＤ２緩衝液による臨床喀痰試料の処理が、バックグラウンド細菌叢の増殖を排除し、同時に、ＳＴＣ処理試料の１週間までの貯蔵後の毒性結核菌の生存能力を維持する点で、非常に効果的であったことを示す。ＢＤ２緩衝液に１週間暴露した試料の陽性培養結果までの時間が長くなったことにより、一部のマイコバクテリアが死滅したおよび／またはＳＴＣ組成物中、室温で長期間の貯蔵により増殖が抑制されたことが示唆された。それにもかかわらず、試料は、長期の貯蔵後であっても、陽性培養試験を可能とするのに十分な生存可能なマイコバクテリアを保持していた。

実施例６：結核菌の分子検出のための、Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ法と、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法の比較
ＣＤＣは、臨床検体を、培養、抗酸性バチルス（ＡＦＢ）染色、および核酸増幅プロトコルで同時に分析することを推奨している（ＣＤＣ，２００９）。培養はＴＢ陽性の最終判定のための「代表的スタンダード」であるが、これは時間がかかり、８週間も要する場合がある。ＡＦＢ染色は迅速であるが、結核菌群（ＭＴＢＣ）のメンバーと非結核マイコバクテリア（ＮＴＭ）を区別しないために、感度および特異性が低い。したがって、疾患の蔓延を管理するのに不可欠な迅速な特定は、ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの核酸増幅プロトコルおよびシーケンシングに依存している。

結核菌感染患者の抗生物質耐性の評価は、患者を管理し、疾患の蔓延を抑制するために極めて重要である。結核菌の薬剤感受性試験（ＤＳＴ）の標準的方法は、結果を得るのに数週間から数ヶ月を要する場合がある。多剤耐性結核（ＭＤＲ−ＴＢ）および広範囲型多剤耐性結核菌（ＸＤＲ−ＴＢ）の出現のために、迅速な分子的手法が開発されてきた。ｒｐｏＢ遺伝子内の変異がリファンピン（ＲＩＦ）耐性に関連し、ｉｎｈＡ遺伝子内の変異がイソニアジド耐性に関連している。Ｈａｌｓｅら（２０１０）は、２段階分子手法を開発した。この手法は、ＭＴＢＣ陽性の臨床検体をリアルタイムＰＣＲにより直接分析する抗生物質耐性遺伝子パイロシーケンス分析を利用している。

この実施例では、独立した公衆衛生診断研究所、Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより、２つの異なる方法により処理されたＴＢ陽性喀痰試料（革新的な新規診断薬に関する基金（ＦＩＮＤ）結核検体バンクから提供を受けた）の臨床評価の並列比較が行われた。特に、１）水酸化ナトリウム処理に続くビーズビーティングからなる「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ」法、および２）本方法を、ＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｒｔＰＣＲアッセイ（ＲＤ４ 結核菌群（ＭＴＢＣ）ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＤ）を標的とする）（Ｈａｌｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）および抗生物質耐性遺伝子パイロシーケンスアッセイ（Ｈａｌｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）における感度の観点から比較がなされた。本方法では、ＤＮＡの単離およびアッセイ試験の前に、ＴＢ陽性喀痰試料をＳＴＣ組成物で処理し、検体中の細胞の液化および化学的溶解を容易にした。

ＳＴＣ組成物の使用の場合とは対照的に、「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ」法は、喀痰試料中の細菌をこじ開けるための機械的な方法であるビーズビーティングを含む。機械的なビーズビーティングは生物をこじ開けるのに効果的な場合もあるが、この方法は、検査室環境中で危険なエアロゾルを生成する。したがって、診断試験の臨床的感度に悪い影響を与えることなく、結核菌から安全にＤＮＡを放出するために、効果的で非機械的の化学的方法を開発することが強く望まれている。

実験方法
結核菌陽性喀痰試料の生存能力の確認
本実施例のために、確立されたＴＢ陽性患者由来の未処理の喀痰試料を革新的な新規診断薬に関する基金（ＦＩＮＤ）結核検体バンクから提供を受けた。３０人の患者試料から２通りの分割量０．５ｍＬの提供を受け、凍結貯蔵した。ＦＩＮＤは、培養およびスメア分析を使って、これらの試料を、次のように分類した（表５）。

さらなる分析のために、一定分量をＷａｄｓｗｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証臨床検査室、に凍結輸送した。喀痰処理、ＤＮＡ抽出、ｒｔＰＣＲアッセイおよびパイロシーケンスをＷａｄｓｗｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで行った。Ｗａｄｓｗｏｒｔｈから到着時に、３０人のドナー由来の２通りの一定分量を氷上で解凍し、ＤＮＡの単離の前に、１セットの一定分量を「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ」法（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ法）を使って処理し、２つ目のセットをＳＴＣ組成物で処理した。

「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ」（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ）法を使ったＴＢ陽性喀痰の処理
１．０．５ｍＬの３．５％ＮａＯＨを加えて、各０．５ｍＬの喀痰一定分量（ｎ＝３０）を液化した。この分量をボルテックスしてＮａＯＨと混合した。
２．混合物を室温で１５分間インキュベートした。
３．混合物に、１０ｍＬになるまで無菌のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えた。
４．混合物を５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細菌をペレット化し、上清を廃棄した。
５．０．５ｍＬの無菌のＰＢＳ中にペレットを再懸濁した。
６．スメアおよび培養試験してマイコバクテリウムの生存能力を確認するために、３００μＬの再懸濁細菌を取っておいた（表７参照）。
７．細菌を溶解するために、２００ｍｇの１０５〜１５０ミクロンのガラスビーズを残存する２００μＬの再懸濁細菌に加え、続いて、Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使って、１分サイクルのビーズビーティング２回と、１分間の氷上静置を行った。

Ｓａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＳＴＣ）法を使ったＴＢ陽性喀痰の処理
１．各０．５ｍＬの喀痰一定分量（ｎ＝３０）に、０．５ｍＬのＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）を加え、ボルテックスして混合した。
２．プロテイナーゼＫ（４００μｇ）を加え、混合物を水浴中、５０℃で２時間インキュベートした。
３．４００μＬの混合物を新しいチューブに移し、３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加えた。
４．混合物を氷上で１０分間インキュベート後、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
５．上清を清浄な標識チューブに移し、ペレットを廃棄した。
６．２倍量の室温の９５％エタノールを収集した上清に加え、チューブを２０回反転させることにより混合した。
７．試料を室温で１５分間インキュベートして、ＤＮＡを沈殿させた後、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＤＮＡをペレット化した。
８．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出した。
９．ペレットを２００μＬのＴＥに溶解し、ＤＮＡを完全に再懸濁させるまで短時間ボルテックスし、室温で最低３０分間静置した。

結核菌のリアルタイムＰＣＲおよび抗生物質耐性のパイロシーケンス
５μＬの「未希釈」ＤＮＡおよび５μＬの希釈（１：１０）のそれぞれ精製喀痰試料（上記）由来のＤＮＡの２通りの反応液を、ＲＤ４結核菌群（ＭＴＢＣ）のｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＤ）（Ｈａｌｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を標的とするＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証リアルタイムＰＣＲアッセイを使って、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲ装置で増幅した。３７未満の閾値サイクル（Ｃ_ｔ）値を陽性と報告し、３７より大きいＣ_ｔ値の試料を再試験して、結果が同じなら、陰性と報告し、結果が同じでない場合は、不確定として報告した。

以前に報告されたリファンピン耐性用の標的（ｒｐｏＢ）（Ｈａｌｓｅ ｅｔ ａｌ，２０１０）およびイソニアジド耐性用の追加の標的（ｉｎｈＡ）に対するパイロシーケンス法を使って抗生物質耐性プロファイリングを行った。両法から得たＤＮＡを別々のＰＣＲ反応で使用して、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ遺伝子の特定の領域を増幅した。これらの領域の変異は、リファンピンおよび／またはイソニアジド抗生物質に対する耐性の可能性があることを示す。

結果および考察
今日では、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法は、水酸化ナトリウムによる喀痰の液化と、それに続く機械的ビーズビーティングを使った細菌からのＤＮＡの単離を含む。本実施例中の化学的方法は、ＢＤ２緩衝液（ＳＴＣ組成物）が喀痰を液化し、頑強さが低い細菌を一段階で溶解するように機能する点で完全に異なる。重要なのは、本組成物および方法が、その後の結核菌特異的ＤＮＡおよび抗生物質耐性マーカーの検出をもたらすという観点から、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法に比べて、より効果が大きいというほどでなくても、同様に効果的であるように見えたことである。

従来の方法（「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」法、表６および図４）に比べて、本［ＳＴＣ］法は、培養およびスメア顕微鏡により「弱」および「中」ＴＢ陽性として以前に分類されている２通りの喀痰試料のリアルタイムＰＣＲによる結核菌特異的検出の感度の向上をもたらした。この実施例では、「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ」法では、抽出されたＤＮＡが１０倍希釈されて初めて、「中」および「強」ＴＢ陽性喀痰試料の結核菌を検出できるが（表６および図４）、一方、「ＳＴＣ」方法を使うことにより、ＤＮＡ単離後、８７％の「弱」ＴＢ負荷喀痰試料が陽性として検出された（表２）。Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法を使ってＤＮＡを単離した場合には、リアルタイムＰＣＲにより、「弱」ＴＢ負荷喀痰試料の２５％のみが陽性として検出された（表６）。

図４は、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ法、１：１０）に比べて、ＳＴＣ法を使って処理した全てのＴＢ陽性喀痰試料中の結核菌検出限界の顕著な改善（ｒｔＰＣＲによるより低いＣ_ｔ値）を示す。例えば、「弱」ＴＢ陽性喀痰のＣ_ｔ値は、「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」法の３８．５〜４５．０に比較して、「ＳＴＣ」法では３１．４〜４５．０の範囲であった；「中」ＴＢ陽性喀痰のＣ_ｔ値は、「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」の２６．８〜４５．０に比較して、「ＳＴＣ」法では２０．９〜３２．３の範囲であった；「強」ＴＢ陽性喀痰のＣ_ｔ値は、「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」法の２７〜３９．３に比較して、「ＳＴＣ」法では１９．８〜２８．３の範囲であった。喀痰がＳＴＣで処理され、ＤＮＡが本方法を使って抽出された場合、全てのＴＢ負荷レベルに対し、Ｃ_ｔ値が一貫してより低い。このより低いレベルの検出下限は、患者の喀痰試料由来の結核菌の正確な診断を確実に行うのに役立つ。

同様に、本組成物および方法は、結核菌陽性検体中の抗生物質耐性を予測する工業標準試験に適合する。Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法およびＳＴＣ法で得られたパイロシーケンス分析結果は、試験した６つの臨床ＴＢ陽性喀痰検体に対して、１００％一致した。重要なのは、これらの６つの喀痰検体から、本ＳＴＣ法は抗生物質耐性マーカー（ｉｎｈＡおよびｒｐｏＢ遺伝子）を有する２人の患者（ＦＩＮＤ ０１ ０１ ２０７２およびＦＩＮＤ ０１ ０１ ２１３７）を検出したが、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法ではそれができなかったことである（表７）。この結果は、代表的スタンダード培養試験でも、これらの２人の患者の試料で５２日後にマイコバクテリアの増殖を示すことができなかった。

試験時点でのマイコバクテリアＤＮＡの回収が増加した効果は、パイロシーケンスデータにより最高に強調される。ＳＴＣ組成物により処理された試料は、試験０日目に抗生物質耐性マーカーの試験に利用可能な十分な量のＤＮＡを有していた。対照的に、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ法は、０日目にはＰＣＲで陰性であった試料でパイロシーケンスを繰り返すことが可能になる前の、ＭＧＩＴ培養が陽性になるまでに平均１４日を要した。患者の抗生物質プロファイルは、症例管理に不可欠であり、また、適切な抗生物質療法によるより早期の介入は感染率を減らし、患者の回復の確率を高めるであろう。したがって、本発明は、培養によるマイコバクテリアの検出を待つことなく、リアルタイムＰＣＲによるＭＴＢＣの迅速な同日特定にとって価値のあるものであり、また、結核菌の抗生物質耐性マーカーの検出に十分な感度を有する。

実施例７：Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイを使った結核診断におけるＳａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの適合性
最近では、喀痰検体中の結核菌の先導的分子診断試験は、結核菌群ＤＮＡおよびリファンピン耐性のネストリアルタイムＰＣＲベース検出のＣｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイである。この実施例中では、同じ患者由来の非処理喀痰と比較して、ＳＴＣ組成物処理喀痰の、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイに対する適合性が評価された。２５人の患者由来の二通りのＴＢ陽性喀痰試料を革新的な新規診断薬に関する基金（ＦＩＮＤ）の結核検体バンクから提供を受けた。独立した診断検査室であるＮａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＪＨ）において、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔアッセイにおけるＳＴＣ組成物処理喀痰の診断に対する有効性の判定が、非処理喀痰と比較して行われた。

実験方法
ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイのための未処理喀痰検体の調製
本実施例は、二通りの０．５〜１．０ｍＬの一定分量の２５人の結核陽性患者由来の未処理凍結喀痰（ＦＩＮＤから提供された）を使用した。ＦＩＮＤは、培養およびスメア顕微鏡を使って、これらの試料を、次のように確立および分類した（表８参照）。

ＣｅｐｈｅｉｄシステムでＴＢを処理、試験するために、一定分量をＮａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｈｅａｌｔｈ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ，ＵＳ）に凍結輸送した。ＮＪＨ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに到着すると、２５人のドナー由来の二通りの一定分量を氷上で解凍した。１セットの一定分量を２倍量のＣｅｐｈｅｉｄ試料試薬（ＳＲ）緩衝液で処理し、２つめのセットを等容積のＳＴＣ組成物（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）で処理して検体を液化した。

Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳＲ緩衝液の添加後、それぞれの一定分量を次のように処理した：
ａ．混合物を１０〜１５秒ボルテックスし、室温で５分間静置した。
ｂ．混合物をさらに１０〜１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間静置した。
ｃ．それぞれの試料をＣｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦカートリッジに装填した。
ｄ．Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイ（プロトコルＨ．２）に従って試験を行った。

ＳＴＣの添加後、それぞれの一定分量を次のように処理した：
ａ．混合物を１０〜１５秒ボルテックスし、室温で１５分間静置した。
ｂ．前記混合物をボルテックスして良く混合した後、３０００ｘｇで２０分間遠心分離した。
ｃ．上清を注意深く注ぎ出した。
ｄ．ペレットを１ｍＬのＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦ ＳＲ緩衝液中に再懸濁し、少なくとも１０秒間ボルテックスした。
ｅ．混合物を室温で１０分間インキュベートし、少なくとも１０秒間ボルテックスする。
ｆ．試料を室温でさらに５分間インキュベートした。
ｇ．それぞれの１ｍＬの試料をＣｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦカートリッジ中に直接加えた。
ｈ．Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイ（プロトコルＨ．２）に従って試験を行った。

ＧｅｎｅＸｐｅｒｔリアルタイムＰＣＲにより次の２つの結果が得られた：１）結核菌正の陽性／陰性、および２）リファンピン（ＲＩＦ）抗生物質感受性または耐性（Ｓｅｎｓ／Ｒｅｓ）（表９）。

結果および結論
ＳＴＣ組成物処理喀痰から抽出された沈殿物は、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイシステムと完全に適合した。スメア陽性／培養陽性（両方とも強および中）として分類され、ＳＴＣで処理された検体は、Ｃｅｐｈｅｉｄ分子アッセイによる結核菌およびＲＩＦ耐性に対し、同じ患者由来の無処理喀痰と比較して、１００％一致した（表９）。

スメア陰性／培養陽性（弱）検体に対しては、リアルタイムＰＣＲによる結核菌の検出では、ＳＴＣ組成物処理と無処理喀痰試料との間で８８％の一致であった（表９）。特に、ＳＴＣで処理した１人のドナーの試料は、結核菌に対し陰性の結果を与えた。同じ患者由来の異なる一定分量間での生物学的変動がこの場合の原因であり、これにより、この「弱」検体におけるＭＴＢを検出不能にする可能性がある。

ＲＩＦ耐性の評価の場合には、スメア陰性／培養陽性（弱）検体に対し、１つの不一致判定が存在した。２人のドナーはＳＴＣ組成物処理喀痰を使って、ＲＩＦ耐性であると特定されたが、無処理喀痰をＣｅｐｈｅｉｄ ＳＲ緩衝液方法（プロトコルＨ．２）を使って処理した場合には、１人のドナーが耐性であると特定された。この不一致は、喀痰が分析の前にＳＴＣ組成物で前処理された場合のアッセイの感度の増加により説明可能であろう。

実施例８：炭疽菌の芽胞はＳａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに耐える
炭疽病は、通常は土壌中に内生胞子の形態で静止している、桿菌様グラム陽性好気性バクテリア炭疽菌により引き起こされる、急性の、多くの場合致死性の疾患である。クロストリジウム・ディフィシレのように、炭疽菌は休眠中の内生胞子を形成することができ、根絶が非常に難しく、数十年間あるいは数百年間過酷な条件を生き残る。炭疽病は１匹の感染動物または１人のヒトから別の動物やヒトに直接伝染するのではなく、芽胞により伝染する。芽胞が吸入、または摂取、または宿主の皮膚病変と接触すると、それらは再活性化し、急速に増殖することができる。炭疽病芽胞の耐久力およびそれらのインビトロでの製造の容易さが、それらを生物学的兵器としての使用（粉末形態またはエアロゾル形態で）に好適するものにしている。

前に行った実施例は、結核菌が本組成物中で生存可能であることを示したが、本実施例は、炭疽菌芽胞などのその他の頑丈な微生物が組成物で処理後に生き残ることを示す。

実験方法
調査は、ニューヨーク州保健省、Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡで行った。
炭疽菌芽胞の調製
炭疽菌Ｓｔｅｒｎｅ株の凍結ストック培養液を５％ヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天培地上で培養し、３５℃、５％ＣＯ_２下で２４時間インキュベートした。最初のインキュベーション後、この培養液を複数（最小１０個）のバチルス属芽胞形成寒天プレートに移し、３５℃、ＣＯ_２下で２週間まで嫌気的にインキュベートした。

３〜４日毎に、マラカイトグリーン芽胞染色を行って、炭疽菌のインビトロ芽胞形成をモニターした。マラカイトグリーン染色処理が生物のほぼ完全な芽胞形成を示すと、芽胞を５．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に採取し、使用するまで室温で貯蔵した。

芽胞濃度の測定
炭疽菌芽胞懸濁をＰＢＳ中で１０^−３まで希釈した。一定分量（１０μＬ）のこの最終希釈物を２チャンバー血球計数器スライドのそれぞれの清浄ウエル中に添加した。血球計数器チャンバーを芽胞計数のために、オイル使わずに４０ｘ倍率で観察した。芽胞を丸いまたは楕円形の黒色細胞として、血球計数器の明視野グリッド上で可視化した。

芽胞の処理
１．必要とする濃度の７００μＬの芽胞ストック懸濁液を調製した。
２．それぞれの試料を２ｘ３５０μＬ容積に分割し、１つの３５０μＬ分割量を無処理または「対照」として使用した。
ａ．５０μＬの一定分量を取り出し、５％血液を含むヒツジのトリプチケースソイ寒天培地上で平板培養することにより芽胞が生存可能であることを確認した（下記参照）。
４．２つ目の３５０μＬの分割量をＳＴＣ法用に使用した。
ａ．３５０μＬのＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）を３５０μＬの炭疽菌の芽胞ストック懸濁液に加え、ボルテックスして混合した。
ｃ．混合物を室温で１５分間インキュベートした後、１００μＬを培養（「ＳＴＣ」）用に取り出し、５％のヒツジの血液を含むトリプチケースソイ寒天培地上に播種した（下記参照）。

生存能力を測定するための芽胞の培養
炭疽菌の一定分量を５％のヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天培地に直接播種し、３５℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。２４時間後、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を記録した。

結果および考察
この実施例は、炭疽菌芽胞がＳＴＣ処理により死滅しなかったことを示した（図５）。無処理およびＳＴＣ処理芽胞の両方が、好ましい培養条件下で２４時間後、同じ数の増殖型細菌を生成した。

実施例９：マイコバクテリウムは、周囲温度のＳａｍｐｌｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中で１週間生存可能である
環境温度は、その日全体を通した変動と共に、領域間で広範に変化し得る。検査室への収集および輸送中に、対策が講じられない限り、生物試料はこの広範囲の温度に晒される。発展途上国では、高コストとインフラの不足のために、試料は周囲温度で検査室に輸送され、試料の品質および試験結果の妥当性が損なわれる。

実施例１では、喀痰中の添加された弱毒結核菌Ｈ３７Ｒａ（ａＭＴＢ）が、本組成物であるＳＴＣ中、室温（２０〜２５℃）および４℃で３０日まで生存可能なままであった。本実施例では、粘液性喀痰の非存在下で、ａＭＴＢをＳＴＣまたはＰＢＳと直接接触させて、４℃〜４０℃の範囲の温度に、１、２、３、４および７日間暴露した。ＳＴＣへの７日間までの暴露後、マイコバクテリアを培養して生存能力を評価し、陽性培養結果になるまでの時間をモニターした。対照として、この実験を、マイコバクテリアより頑丈さの少ない微生物である大腸菌を使って繰り返した。

実験方法
弱毒結核菌および大腸菌のＳＴＣまたはＰＢＳによる処理
Ａ．ａＭＴＢ（２ｘ１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）および大腸菌（２ｘ１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）を、多連５０ｍＬ無菌チューブ中の１０ｍＬのＳＴＣ（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）または燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に添加した。
Ｂ．それぞれのチューブを適切な温度（４℃、室温（２０〜２５℃）、または４０℃）で割り当てられた時間（１、２、３、４、または７日間）保持した。
Ｃ．ＳＴＣまたはＰＢＳ中の３ｍＬの添加された微生物を各チューブから取り出した。
Ｄ．３５００ｒｃｆで２０分間遠心分離し、インタクト細菌をペレット化した。
Ｅ．上清を廃棄し、０．５ｍＬの無菌ＰＢＳ中にペレットを再懸濁した。
Ｆ．１００μＬの再懸濁細菌を５ｘ５ｍＬの補充済みＭ７Ｈ９ブロス中に接種した。
Ｇ．３７℃でインキュベートし、毎日増殖を調べた。

Ｈ．培養管理：
ａ．ストック由来のａＭＴＢ（１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）を５ｍＬのＭ７Ｈ９ブロス中に毎日接種し、試験試料を培養した。
ｂ．ストック由来の大腸菌（１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）を５ｍＬのＭ７Ｈ９ブロス中に毎日接種し、試験試料を培養した。
ｃ．対照培養物を、試験試料と共に３７℃でインキュベートした。
Ｉ．全ての試料が陽性になるまで日数を記録した。
Ｊ．ａＭＴＢに対しては、０．５マックファーランド標準濁度に到達するまで、インキュベーションを継続した。
Ｋ．大腸菌に対しては、１．０マックファーランド標準濁度に到達するまで、インキュベーションを継続した。

ＳＴＣまたはＰＢＳを使って４℃および４０℃で３０日間処理したａＭＴＢからのＤＮＡの抽出
Ａ．２００μＬのａＭＴＢ（ＰＢＳを使って４℃および４０℃で３０日間処理）を新しいチューブに移し、２００μＬのＢＤ２緩衝液と混合した。
Ｂ．ＤＮＡ抽出のために、２００μＬのａＭＴＢ（ＳＴＣを使って４℃および４０℃で３０日間処理）を新しいチューブに移した。
Ｃ．（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムをそれぞれのチューブに最終濃度の３０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
Ｄ．混合物を、水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
Ｅ．試料を室温で２分間冷却した。
Ｆ．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
Ｇ．混合物を、室温で１０分間インキュベートした。
Ｈ．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
Ｉ．混合物を氷上で１０分間インキュベート後、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
Ｊ．上清を清浄な標識チューブに移し、ペレットを廃棄した。
Ｋ．２倍量の室温の９５％エタノールをチューブ中の上清に加え、チューブを２０回反転させることにより混合した。
Ｌ．混合物を室温で１０分間インキュベートして、ＤＮＡを沈殿させた後、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＤＮＡをペレット化した。
Ｍ．上清を静かに取り出し、ペレットを掻き乱さないように注意して廃棄した。
ペレットを２００μＬのＴＥに溶解した。

ｒｔＰＣＲ条件
ＳＴＣまたはＰＢＳを使って４℃および４０℃で３０日間処理したａＭＴＢから単離したＤＮＡを、マイコバクテリウム特異的ｑＰＣＲの、ＲＤ４ ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイ（実施例１とおなじプロトコル）に供した。

結果および考察
ａＭＴＢは、本組成物ＳＴＣ中で、輸送状態に特有の広い温度範囲（４〜４０℃）にわたり、７日間生存可能である。陽性ａＭＴＢ培養は、３５℃で標準的４２日間のインキュベーション中に０．５マックファーランド濁度増殖を示す（表１０）。ＳＴＣに暴露されたａＭＴＢは、０．５マックファーランド濁度増殖になるまでにより長い時間を要することにより示されるように（表１０）、４℃、室温および４０℃で７日まで保持される場合、ＰＢＳに暴露されたａＭＴＢに比べて、若干の生存能力を失う。興味深いことに、ＰＢＳ中のａＭＴＢもまた、４０℃で１日でも保持した場合に若干の生存能力の低下を示し、温度がａＭＴＢの生存能力に対し大きな影響を与えることを示唆している。

対照的に、大腸菌の場合は、ＳＴＣ中で、すべての試験温度で、１日目までに生存能力が完全に失われた（表１１）。ＰＢＳ中では、４℃、室温および４０℃で７日まで、大腸菌の生存能力が失われることはなかった。したがって、ＳＴＣは、４〜４０℃の範囲で少なくとも７日間、ａＭＴＢを生存可能状態に保つであろうが、同時に、大腸菌などの細菌を接触時に排除し、それによって生物試料のバックグラウンド細菌叢を減らすであろう。

重要なのは、ＭＴＢ ＤＮＡに特異的なｑＰＣＲ（表１２）により、４℃および４０℃のＳＴＣ中で３０日間までのａＭＴＢの量が一定のままで変わらないことが示されることである。類似の値は、これらの極端な温度で３０日間ＰＢＳにより処理されたａＭＴＢに対しても得られた（表１２）。したがって、この実施例は、ａＭＴＢはＳＴＣ中で安定であること、すなわち、これは、広範囲の温度にわたり、少なくとも１ヶ月間、増殖または分解することなく、遠方の検査室に到着する試料が患者のインビボの状態を厳密に表すのを保証することを示す。

実施例１０：結核菌の生存能力および結核菌からのＤＮＡ抽出に対する緩衝液組成の影響
実施例５からわかるように、結核菌はＳＴＣ組成物ＢＤ２中で７日間、室温で生存可能のままである。ＳＴＣ組成物の基本的な成分は、特定の試料タイプおよび用途のために、変えられても、または「調整されても」よい。弱毒結核菌の生存能力、ならびにその後の高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡの回収の両方に対するそれらの影響の観点から、キレート化剤、洗剤、ｐＨおよび緩衝剤の間の関係を調査した。

この実施例では、以下のＳＴＣ組成が試験された：

実験方法：
播種コロニーおよびＤＮＡ抽出
唾液試料を健康な個人から集め、以下の通りに処理した：
１．０．４ｍＬの唾液または水（ＤＮＡ抽出用の対照）を０．５ｍＬの上記ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（表１３）と混合し、チューブを３０分間インキュベートして液化を可能とした。
２．１００μＬのＰＢＳで洗浄した弱毒結核菌細胞（株ｈ３７ａ；ａＭＴＢ）の懸濁液を各試料に加えた（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ毎に１つのチューブ）。あるいは、１００μＬの滅菌水をｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中の唾液に加え、無添加対照試料を生成した。
３．試料を系列希釈し、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ寒天プレートで塗抹培養した場合、試料をボルテックスして混合し、室温で３０分、２、４および８日間、インキュベートした（詳細は下記を参照）。３５℃で３〜４週インキュベーション後、プレートのコロニーを手作業で数えた。
４．ステップ３で概要を述べた各時点で、全ＤＮＡを抽出するために、一定分量のそれぞれの試料にボルテックスビーズビーティングを行った。簡単に説明すると、２５０μＬの試料をペレット化し、ＰＢＳ中で洗浄し、３４０μＬの無菌ＲＮアーゼ不含水に加えた。３０μＬを系列希釈し、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋプレートに播種した。一方、３００μＬを、２５０ｍｇのＣｏｌｅ高屈折率シリカビーズを含むねじぶた付２ｍＬチューブ中の３００μＬのＢＤ１（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、４％ＳＤＳ、ｐＨ６．８）に加えた。その後、ＢＤ１試料混合物をバイオスペックビーズビーター中で１分間処理した。
５．微量遠心機を使って、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行うことにより、壊死組織片を除去した。
６．実施例１で概要を述べた方法（過ヨウ素酸塩法を使ったａＭＴＢ添加ＢＤ２緩衝液処理喀痰からのＤＮＡの抽出；特に、ステップ８〜１３を使用し、ステップ１２では、−２０℃で１時間のインキュベーションを使用した）の短縮バージョンを使って、ＤＮＡを試料から精製した。
７．試料を微量遠心機を使って、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ペレットを５０μＬのＲＮアーゼ不含水に加え、１２μＬを０．８％アガロースゲルによるアガロースゲル電気泳動により分析した（下記図６参照）。

結果および結論
表１４は、示したインキュベーション時間後の結核菌コロニーの計数結果をまとめたものである。ＮＤの記載は、汚染の存在により、コロニーの数が測定されなかったことを示す。他の全てのプレートでは、結核菌が唯一の存在する細菌であった。＜１０^２の記載は、コロニーがその希釈最低濃度でプレート上に観察されなかったことを示し、これがこの方法での検出限界である。

結果および結論
図６は、（一例として）ｔ＝２日の時点のアガロースゲルの結果を示す。唾液試料のＢＤ２または示した変形型ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで処理後に、インタクト高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡが回収されている。ａＭＴＢを含む全ての試料は、回収ＤＮＡの量の顕著な増加を示し、存在する全核酸に対するａＭＴＢの寄与を示している。ＤＮＡラダーの最上バンド（矢印）は約２３ｋＢに相当する。全ての回収したＤＮＡバンドは、この点より高く、ＨＭＷのＤＮＡの存在を示している。

この実施例では、ＳＴＣ成分の異なる組み合わせの基本的な有用性を示すために、ＢＤ２または変形型ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中でインキュベーション後の関連弱毒結核菌からのＤＮＡの抽出および弱毒結核菌の生存能力に対する影響が調査された。結核菌からのＤＮＡ抽出がアガロースゲル電気泳動により評価され、また、唾液ＤＮＡとマイコバクテリアＤＮＡとの間の区別をするために対照が含められた。結核菌由来のインタクト高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡは、全ての試験組成物中でのインキュベーションとそれに続くビーズビーティング後の全ての時点で得ることができるであろう（図６）。

ＢＤ２または関連ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中でのインキュベーション後の播種コロニーの計数により結核菌の生存能力が測定された。結核菌は、細胞凝集塊の形成のために広く知られており、このことが、試料中に存在する生存可能なＭＴＢ細胞の正確な定量を困難にしている。さらに、汚染が、トリトンＸ−１００を含むホウ酸塩緩衝ｃｈｅｍｉｓｔｒｙと混合された試料中で観察された。これらの困難にもかかわらず、これらのｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中での全体の結核菌の生存の傾向を決定することが可能である。経時的に生存能力の低下があるが、ＢＤ２および関連ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中で４日間のインキュベーション後であっても、結核菌は生存能力を維持している（表１４）。このことは、毒性結核菌がＳＴＣ組成物中で１週間までの貯蔵後に生存可能なままであった実施例５の結果と一致する。全てのｃｈｅｍｉｓｔｒｙが８日後に生存能力を劇的に低下させる一方で、早期の時点での生存能力に対する影響に関し、いくつかの差異が存在する（ＢＤ２と変形型＃２の比較）。全ての場合について、ＭＴＢを含む唾液試料は、全ての試験時点でＨＭＷ ＤＮＡを生成した（図６に、ｔ＝２の時点に関して示す）。最終的には、これらのデータは、種々のＳＴＣ組成物が、ＨＭＷ ＤＮＡの回収および頑丈な微生物の生存能力に関して、同様に良好に機能することを示す。現時点では、現状技術の分子診断検査の入力要件の１つは、高品質のＨＭＷ ＤＮＡである。本実施例は、ＳＴＣ組成物が、その後の分子診断検査のために、このようなＤＮＡを提供することができることを示す。

実施例１１：ＳＴＣ組成物は、喀痰中に存在する日和見主義的病原体の排除に効果的である。
多くのＴＢ高負担国では、安全で効率的なＴＢ陽性試料の輸送が問題となっている。周囲温度での長い輸送時間に起因する腐敗のために、試料は処理検査室で定期的に廃棄される。ＳＴＣ組成物は、結核菌などの頑丈な微生物の生存能力を保存し、同時に、喀痰のバックグラウンド微生物叢を排除し、それにより、分子および培養ＴＢ診断の前に腐敗するリスクを生ずることなく、喀痰試料の輸送を可能とすることを目的としている

緑膿菌およびカタル球菌は、しばしば、免疫力が低下したまたは慢性疾患患者に対し、気道感染症を引き起こす可能性のある日和見主義的病原体である。緑膿菌はグラム陰性細菌で、バイオフィルムを形成し、院内感染（ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（病院内感染（ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｃｑｕｉｒｅｄ））の人から最も多く単離される細菌の１つである。緑膿菌は、嚢胞性繊維症の人と関連するため、喀痰試料中で見つかることも多い。カタル球菌はグラム陰性細菌で、好気性増殖および嫌気性増殖の両方が可能である。カタル球菌は吐き出された喀痰中で少なくとも３週間は生存することができ、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理の後であっても、喀痰試料を汚染している可能性がある。ここで、緑膿菌およびカタル球菌のＳＴＣ組成物による処理に耐える能力を調査した。

ａ）ヒト喀痰試料中のバックグラウンド微生物に与えるＳＴＣ組成物の影響
材料および方法：
１．６００μＬのプールされた認証ＴＢ陰性ヒト喀痰（６人のドナー、Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ｓｏｕｒｃｅ ５３ Ｆｒａｎｃｅ由来）を７００μＬのＰＢＳ、ＢＤ２（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２％ＳＤＳ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）またはＢＤ３（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、４％ＳＤＳ、ｐＨ６．８）と混合した。
２．生存可能な細菌の数を測定するために系列希釈が調製される場合、試料を混合し、室温で１０分間、３時間または２４時間インキュベートした。
３．各時点で播種するために、１００μＬの一定分量をＰＢＳ中で洗浄した（例外：ＰＢＳ試料は播種前に洗浄しなかった）。系列希釈をＰＢＳ中で調製し、１００μＬの分割量の希釈物を、インキュベーション後ｔ＝０（１０分＝０．１７時間）時間、３時間および２４時間に、トリプチックソイ寒天培地に播種した。バックグラウンド細菌叢の細菌を３５℃でインキュベーション後にこれらのプレート上のＣＦＵｓを数えることにより計数した（表Ａ）。

結果：

ｂ）緑膿菌およびカタル球菌に与えるＳＴＣ組成物の影響
材料：
・カタル球菌ＡＴＣＣ２５２３８および緑膿菌ＡＴＣＣ１０１４５の一晩培養
・濾過滅菌ＳＴＣ組成物：ＢＤ２（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２％ＳＤＳ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）；ＢＤ３（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、４％ＳＤＳ、ｐＨ６．８）；ＢＤ４（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２％ＳＤＳ、５０ｍＭホウ酸塩、ｐＨ９．３）
・滅菌水、無菌ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）、トリプチックソイ寒天培地（ＴＳＡ）、脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロスおよび寒天
・微生物学用回転台

実験方法：
平板培養による生存能力測定
１．カタル球菌を４℃で貯蔵されたプレートからＢＨＩブロス中で増殖させた。緑膿菌を４℃で貯蔵されたプレートからＴＳＢ中で増殖させた。
２．３７℃で一晩増殖後、細菌を採取し、洗浄して、約１００細胞／１００μＬ ＰＢＳを１ｍＬのＳＴＣ組成物（水と１：１）またはＰＢＳ中でインキュベートした。
３．３００μＬの分量を、１５分、１時間および２４時間後に採取した。
４．各時点で、ペレットをＤＢＰで（緑膿菌）またはＢＨＩブロスで（カタル球菌）洗浄し、系列希釈をＰＢＳ中で（緑膿菌）またはＢＨＩブロス中で（カタル球菌）作製した。
５．希釈物をＴＳＡに（緑膿菌）またはＢＨＩ寒天に（カタル球菌）播種し、プレートを３５℃で一晩インキュベートした。プレート上のコロニーを手作業による計数により数えた（表１６）。

ブロス増殖による生存能力の測定
１．カタル球菌を４℃で貯蔵されたプレートからＢＨＩブロス中で増殖させた。緑膿菌を４℃で貯蔵されたプレートからＴＳＢ中で増殖させた。
２．３７℃で一晩増殖後、細菌を採取し、洗浄して、約１００細胞を１ｍＬのｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（水と１：１）またはＰＢＳ中でインキュベートした。最初の接種物は系列希釈および寒天プレート上での計数により測定された。
３．３００μＬの一定分量を、１５分および２時間後に採取した。
４．各時点でインタクト細菌をペレット化し、ＴＳＢまたはＢＨＩブロスで洗浄した。
５．その後、一定分量を使って２ｍＬのＴＳＢ（緑膿菌）またはＢＨＩブロス（カタル球菌）に接種した。
６．ブロスを１８０ｒｐｍの振盪を加えながら３７℃で一晩インキュベートし、全ての増殖を記録した（表１７）。

結果：

結論
本組成物は結核菌などの頑丈な微生物の生存能力を長期間にわたり保存する（実施例５および１０）が、その他のより急速に成長する微生物の増殖により引き起こされる汚染が可能な限り早く除去されることが重要である。ここで、我々は、ＳＴＣ組成物が、１５分から２４時間のインキュベーションの間の緑膿菌およびカタル球菌のプレート増殖を行わせなくするのに効果的であることを見出した（表１６）。組成物間で変動があり、ＢＤ２およびＢＤ４は、ＢＤ３より効果的に緑膿菌に対し作用する（表１６および１７）。

プレート計数実験の検出限界は１００細胞であったので、若干の細菌がＳＴＣ組成物による処理に対し生き残り、マイコバクテリウムブロス培養物の汚染をもたらす可能性があると考えられる。これに対処するために、ＳＴＣ組成物中でのインキュベーション後の生存能力についてもブロス培養により調査した。これにより、どの生き残っている細菌も、増殖して容易に観察可能なブロス中増殖をもたらすはずである。平板培養結果と一致して、ＰＢＳで処理した細胞を接種したまたはＢＤ３で処理した緑膿菌を接種した培養物のみが、一晩のインキュベーション後に細菌の増殖を生じた（表１７）。この実施例は、ＳＴＣ組成物は、喀痰などの生物試料中の潜在的汚染源である、頑丈さの程度の低い微生物を迅速に、効率的に除去することができ、本発明の組成物をＴＢ試料の理想的な輸送溶液にしていることを示す。

実施例１２：ＳＴＣ組成物はグラム陰性およびグラム陽性細菌種、ならびに酵母種の両方を迅速に除去するのに効果的である。
結核菌などの頑丈な微生物は、他の多くの細菌種、ならびに酵母などのその他の微生物と一緒に、種々の環境中で見つけることができる。本実施例は、種々の微生物の生存能力の急速除去の観点でのＳＴＣ組成物の広範な適用性を示す。土壌（バチルス・チューリンゲンシス、枯草菌）、ヒト皮膚（黄色ブドウ球菌）、および哺乳類消化管（エンテロコリチカ菌、カンジダ・アルビカンス）などの環境中でのそれらの存在の理由から、いくつかの細菌種が選択された。

材料：
・一晩培養
・濾過滅菌ＢＤ２（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２％ＳＤＳ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）、ＢＤ３（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、４％ＳＤＳ、ｐＨ６．８）およびＢＤ４（２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２％ＳＤＳ、５０ｍＭホウ酸塩、ｐＨ９．３）
・滅菌水、無菌ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）、トリプチックソイ寒天培地（ＴＳＡ）、脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロスおよび寒天、０．１％システイン補充ＴＳＢおよびＴＳＡ（それぞれ、ＴＳＢＣおよびＴＳＡＣ）、ＹＥＰＤプレートおよび酵母用ブロス
・微生物学用回転台

実験方法：
１．細菌および酵母を推奨成長培地中および推奨温度で増殖させた（詳細は下記ステップ＃５を参照）。
２．一晩増殖後、細菌を採取し、洗浄して、１００μＬのＰＢＳ中の約１０９細胞を１ｍＬのＳＴＣ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（水と１：１）またはＰＢＳ中でインキュベートした。
３．３００μＬの一定分量を、１５分、１時間および２４時間後に採取した。
４．各時点で、一定分量を洗浄し、溶媒中で系列希釈した。
５．希釈物をＹＥＰＤに（カンジダ・アルビカンス）、ＴＳＡＣに（フランシセラ・フィロミラジア）、ＢＨＩ寒天に（エンテロコリチカ菌）、またはＴＳＡに（他の全て）播種し、プレートを３０℃で（エンテロコリチカ菌、カンジダ・アルビカンス）、または３５℃で（他の全て）一晩インキュベートし、プレート上のコロニーを計数により数えた（表１８）。

結果：

結論
グラム陽性（バチルス・チューリンゲンシス、黄色ブドウ球菌、枯草菌）およびグラム陰性（エンテロコリチカ菌、フランシセラ・フィロミラジア、クレブシェラ肺炎杆菌）の両方の細菌および酵母（カンジダ・アルビカンス）のＳＴＣ組成物中でのインキュベーションの効果を調査した。試験細菌種に対するＢＤ３の効果の顕著な差異が存在した。グラム陽性およびカンジダ・アルビカンスは１５分以内に生存能力を完全に失ったが、グラム陰性細菌はインキュベーションの２４時間後でも、比較的多数生存した。組成物ＢＤ２は、酵母を含む全ての試験種で生存可能な細菌の急速な（１５分以内の）減少を引き起こした。試料のこの急速な「汚染除去」は、周囲温度での長期の試料輸送の状況で特に望ましい。より具体的には、広範囲の急速に成長するバックグラウンド細菌を急速に、効果的に除去することができれば、ＴＢ陽性喀痰試料が腐敗により廃棄される可能性が少なくなるであろう。本実施例は、ＳＴＣ組成物が、異なった物理的特徴を有し、多様な環境由来の広範囲の微生物の生存能力を取り除くのに効果的であることを示す。

実施例１３：結核菌由来のＤＮＡは、ＳＴＣ組成物中に、−８０℃で１週間凍結貯蔵されたヒト喀痰試料から抽出することができる
多くの発展途上国においては、保存方法として試料を凍結するコストは極めて高いが、この方法は、より豊かな国々でよく使われる方法である。環境温度安定化の重要な利益を提供するのみでなく、凍結ステップを組み込む分子診断ワークフロー中に統合することもできる組成物は、明らかな利点である。本実施例は、下流に適するＤＮＡを抽出する能力に対する凍結の影響を評価する。

材料
・ＰＢＳ中の１．５ｘ１０^９ＣＦＵ／ｍＬ弱毒結核菌（株ｈ３７ａ；ａＭＴＢ）（４℃で貯蔵）
・Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓの２〜３ｍＬの喀痰試料（−８０℃で貯蔵）
・濾過滅菌ＢＤ２（５０ｍＭグリシン、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２％ＳＤＳ、ｐＨ１０．５）
・（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム（ＮＰＩ）
・Ｍ７Ｈ９液体培地（２７１４ Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９ブロスと、ＯＡＤＣ濃縮物および４０ｍＭのピルビン酸ナトリウムから調製した）

実験方法
１．下記のように喀痰に添加し、クライオバイアル中で１週間−８０℃に凍結した後、抽出および培養を行った。

２．処理の日に、試料を解凍し、２００μＬの一定分量を１．５ｍＬのねじぶた付チューブ中で作製した。
３．それらを３，５００ｇで２０分間回転し、上清を廃棄し、ペレットを１００μＬのＰＢＳ中に加えた。
４．実施例１で概要を述べた方法（過ヨウ素酸塩法を使ったａＭＴＢ添加ＢＤ２緩衝液処理喀痰からＤＮＡを抽出し、特に、ステップ８〜１４を使用した）の短縮バージョンを使って、ＤＮＡを試料から精製した。
５．実施例１（ｒｔＰＣＲ条件参照）で記載のように、ａＭＴＢ添加喀痰から単離したＤＮＡをマイコバクテリウム特異的ＲＤ４ ＴａｑｍａｎアルタイムＰＣＲアッセイに使用した。

結果

結論
表１９からわかるように、ＲＤ４ ＰＣＲから得られたＣ_ｔ値は、ａＭＴＢ添加凍結および非凍結喀痰試料の両方で極めて類似している。この結果は、Ｈｏｌｚら（２００１）の、凍結（−２０℃）は喀痰形態または細胞数に影響を与えないという結果の記載と一致する。したがって、ＳＴＣ組成物は、冷蔵が高価であるかまたは入手困難である地域での使用に理想的に適するのみでなく、凍結貯蔵が標準である検査室ワークフローにも好適する。本実施例はＳＴＣ組成物の広範な有用性を示す。結核菌などの頑丈な微生物を含む試料をＳＴＣ組成物と混合する場合、微生物は種々の貯蔵条件で安定化され、微生物を収集後の数日間回収することができる。その後、分子診断アッセイでのさらなる使用のために、ＤＮＡを回収することができる。

本明細書で言及した全ての出版物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示し、あたかもそれぞれの全ての出版物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は前述のように記載されているが、その記載内容は様々な方法で変更可能であることは明らかであろう。このような変更は、本発明の趣旨および範囲からの乖離であると見なされるべきものではなく、また、当業者には明らかである全てのこのような修正は、次の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。

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ＵＳ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ，２００９）Ｕｐｄａｔｅｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ５８：７−１０．
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Claims (31)

1. 生存可能で頑丈な細菌を保存する方法であって、生物試料を安定化組成物と接触させることを含み、前記安定化組成物がキレート化剤、変性剤、塩を含み、約６〜約１１のｐＨを有する方法。
2. 前記頑丈な細菌がマイコバクテリア、炭疽菌、またはクロストリジウム・ディフィシレである、請求項１に記載の方法。
3. 前記マイコバクテリアが結核菌であり、前記炭疽菌が芽胞として安定化される、請求項２に記載の方法。
4. 前記生物試料が、喀痰または唾液などの粘液性体液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記変性剤が、アニオン洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ラウロイル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）など）、カチオン洗剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）など）または非イオン洗剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ１００、またはブリージ５８など）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記組成物が、（ｉ）２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシンを含み、ｐＨ１０．５を有する、または（ｉｉ）４％ＳＤＳ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１４０ｍＭのＬｉＯＨを含み、ｐＨ６．８を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記頑丈な細菌の全てまたは一部が、室温、または環境温度または約４℃〜約４０℃の範囲内の温度で、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上または７日以上または１か月以上の貯蔵後に安定なままである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 生物試料を液化する方法であって、前記生物試料を安定化組成物と接触させることを含み、前記安定化組成物が、キレート化剤、洗剤、塩を含み、６〜１１のｐＨを有する方法。
10. 前記生物試料が、喀痰または唾液などの粘液性体液である、請求項９に記載の方法。
11. 前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記変性剤が、アニオン洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ラウロイル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）など）、カチオン洗剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）など）または非イオン洗剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ１００、またはブリージ５８など）である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記組成物が、（ｉ）２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシンを含み、ｐＨ１０．５を有する、または（ｉｉ）４％ＳＤＳ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１４０ｍＭのＬｉＯＨを含み、ｐＨ６．８を有する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記安定化組成物が、生物試料中の頑丈な細菌を生存可能な状態で保存し、前記試料中のその他の微生物の増殖を減らすかまたはなくする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 生物試料中のマイクロバイオームを安定化する方法であって、前記生物試料を安定化組成物と接触させることを含み、前記安定化組成物が、キレート化剤、洗剤、塩を含み、６〜１１のｐＨを有する方法。
16. 前記生物試料が、喀痰または唾液などの粘液性生体液である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記変性剤が、アニオン洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ラウロイル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）など）、カチオン洗剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）など）または非イオン洗剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ１００、またはブリージ５８など）である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記組成物が、（ｉ）２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシンを含み、ｐＨ１０．５を有する、または（ｉｉ）４％ＳＤＳ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１４０ｍＭのＬｉＯＨを含み、ｐＨ６．８を有する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記安定化組成物が、生物試料中の頑丈な細菌を生存可能な状態で保存し、前記試料中のその他の微生物の増殖を減らすかまたはなくする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 生物試料中の細菌核酸のキャラクタリゼーション方法であって、
    前記生物試料を安定化組成物と接触させること、および前記試料中の核酸を増幅することを含み、
    前記安定化組成物がキレート化剤、洗剤、塩を含み、６〜１１のｐＨを有し、前記増幅ステップを行うのが収集の直後であっても、またはさらに後であっても、前記増幅された核酸のレベルが実質的に不変のままである方法。
22. 前記生物試料が、喀痰または唾液などの粘液性生体液である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 前記変性剤が、アニオン洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ラウロイル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）など）、カチオン洗剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）であるが、この洗剤はＤＮＡを処理する場合には理想的ではない）または非イオン洗剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ１００、またはブリージ５８など）である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記組成物が、（ｉ）２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシンを含み、ｐＨ１０．５を有する、または（ｉｉ）４％ＳＤＳ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１４０ｍＭのＬｉＯＨを含み、ｐＨ６．８を有する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. キレート化剤、
    洗剤、および
    生存可能で頑丈な微生物、を含む組成物。
27. 前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２６に記載の組成物。
28. 前記変性剤が、アニオン洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ラウロイル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）など）、カチオン洗剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）など）または非イオン洗剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ１００、またはブリージ５８など）である、請求項２６または２７に記載の組成物。
29. （ｉ）２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシンを含み、ｐＨ１０．５を有する、または（ｉｉ）４％ＳＤＳ、５０ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌを含み、１４０ｍＭのＬｉＯＨ、ｐＨ６．８を有する、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
30. 前記頑丈な細菌がマイコバクテリア、炭疽菌、またはクロストリジウム・ディフィシレである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
31. 前記マイコバクテリアが結核菌であり、前記炭疽菌が芽胞の形態である、請求項３０に記載の組成物。