JPWO2015199196A1 - アフィニティークロマトグラフィー用担体 - Google Patents
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Abstract
Description
一般に、タンパク精製用のアフィニティークロマトグラフィーに求められる性能としては、(1)標的タンパク質以外の不純物を非特異吸着しないこと、(2)長期間の保管により結合容量が低下せず、保存安定性に優れること、(3)カラム操作する上で充分な機械的強度があること、などが挙げられる。
また、スチレン−ジビニルベンゼンのような芳香族ビニル単量体の共重合体からなる多孔質粒子は、一般に耐アルカリ性に優れるが、親水性が低いために、リガンドの活性が低く、標的物質に対する動的結合容量が低いという欠点を有する。
さらに、メタクリレート系ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子は、高い親水性と機械的強度とを有しているものの、不純物の除去能については更なる改善が望まれていた。
(M−2)ポリビニル単量体に由来する構造単位:全構造単位に対し0.5〜80質量部を含む共重合体を含有する固相担体と、
エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基と、
前記固相担体に結合したリガンドと、を含むアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを2MのNaClを含むpH7.5の20mMリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、40℃で7日間静置したときのカラム内のpH上昇幅が2以下であることを特徴とする、
アフィニティークロマトグラフィー用担体を提供するものである。
したがって、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体によれば、非特異的に吸着する不純物、例えば宿主細胞タンパク質(HCP=Host Cell Protein)やDNAの除去能を改善することが可能となる。
また、リガンドの活性を高く保つことができるため、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を、例えばイムノグロブリンの精製に用いた後で、更に長期間繰り返し使用してもイムノグロブリン等の動的結合容量が低下しにくく、低コストでイムノグロブリン精製が可能となる。
<固相担体の構成>
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を構成する固相担体は、
(M−1)エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位:全構造単位に対し20質量部を超えて、99.5質量部以下、および
(M−2)ポリビニル単量体に由来する構造単位:全構造単位に対し0.5〜80質量部を含む共重合体を含有し、
且つ、エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を含むものである。固相担体の形態は、モノリス、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましい。また、固相担体は、表面積の向上の観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。なお、固相担体は、上記共重合体以外に、天然高分子や合成高分子などを含んでいてもよい。
エポキシ基含有モノビニル単量体は、1分子中に、1個の重合性ビニル基(エチレン性不飽和結合を有する基)と、1個以上のエポキシ基とを有する単量体である。エポキシ基含有ビニル単量体は、固相担体に適切な量のエポキシ基を導入し、適切なリガンド結合量や、開環エポキシ基量を得るために利用可能である。
これらの中でも、エポキシ基含有モノビニル単量体としては、防汚性や保存安定性等の観点から、エポキシ基含有(メタ)アクリル酸エステル類、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物が好ましく、エポキシ基含有(メタ)アクリル酸エステル類がより好ましく、グリシジル(メタ)アクリレート、4−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレートグリシジルエーテルがさらに好ましく、グリシジル(メタ)アクリレートが特に好ましい。なお、固相担体を順相懸濁重合により粒子状にする場合には、エポキシ基含有モノビニル単量体としては、開環エポキシ基量のコントロールが容易となることから水不溶性のものが好ましい。ここで水不溶性とは水100mLに対して室温(25℃)で10g以上は溶解しないことをいう。なお、エポキシ基含有モノビニル単量体は市販品を用いてもよく、公知の方法に従い合成して使用してもよい。
エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは25質量部以上、より好ましくは30質量部以上、さらに好ましくは40質量部以上、特に好ましくは50質量部以上であり、また、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは95質量部以下、より好ましくは90質量部以下、さらに好ましくは85質量部以下、特に好ましくは80質量部以下である。
ポリビニル単量体は、1分子中に、2個以上の重合性ビニル基(エチレン性不飽和結合を有する基)を有するビニル単量体である。以下、当該ポリビニル単量体を、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体と、ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体とに分けて説明する。なお、ポリビニル単量体は、1種を単独でまたは2種以上を組み合わせて使用できる。
また、上記ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体に含まれる重合性ビニル基の個数としては、1分子中に、2〜5個が好ましく、2または3個がより好ましい。
多価アルコールの(メタ)アクリル酸エステル類としては、グリセリンジ(メタ)アクリレート、トリメチロールエタンジ(メタ)アクリレート、トリメチロールプロパンジ(メタ)アクリレート、ブタントリオールジ(メタ)アクリレート、ペンタエリスリトールジ(メタ)アクリレート、ペンタエリスリトールトリ(メタ)アクリレート、ジペンタエリスリトールジ(メタ)アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ(メタ)アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ(メタ)アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ(メタ)アクリレート、イノシトールジ(メタ)アクリレート、イノシトールトリ(メタ)アクリレート、イノシトールテトラ(メタ)アクリレートなどが挙げられる。
各種糖類の2置換以上の(メタ)アクリル酸エステル類としては、例えば、グルコースジ(メタ)アクリレート、グルコーストリ(メタ)アクリレート、グルコーステトラ(メタ)アクリレート、マンニトールジ(メタ)アクリレート、マンニトールトリ(メタ)アクリレート、マンニトールテトラ(メタ)アクリレート、マンニトールペンタ(メタ)アクリレートなどが挙げられる。
さらに、ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体としては、上記例示したものの他に、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミンなどのアミノアルコールと(メタ)アクリル酸との脱水縮合反応物なども挙げることができる。
また、上記ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体に含まれる重合性ビニル基の個数としては、1分子中に、2〜5個が好ましく、2または3個がより好ましい。
ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは5質量部以上、より好ましくは10質量部以上、さらに好ましくは15質量部以上、さらに好ましくは20質量部以上、特に好ましくは25質量部以上であり、また、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは70質量部以下、より好ましくは65質量部以下、さらに好ましくは60質量部以下、さらに好ましくは50質量部以下、特に好ましくは40質量部以下である。
本発明で用いる固相担体に含まれる共重合体としては、上記構造単位(M−1)及び構造単位(M−2)に加えて、(M−3)エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位:全構造単位に対し40質量部以下を更に含むものが好ましい。
また、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体に含まれるヒドロキシ基の個数としては、1分子中に、1〜5個が好ましく、1〜3個がより好ましい。
リガンド結合前の固相担体に含まれるエポキシ基は、リガンドを結合するための官能基であり、また、さらに開環後にアフィニティークロマトグラフィー用担体としての親水性向上の元となる官能基である。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量は、好ましくは1〜6mmol/gであり、さらに好ましくは2〜5mmol/gであり、特に好ましくは2.5〜4mmol/gである。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量が1mmol/g以上であると、リガンド結合後に得られる開環エポキシ基の量が適切な量となり、標的物質以外の不純物の除去能が向上する。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量が6mmol/g以下であると、リガンド結合後のエポキシ基の残留量が減少し、アフィニティークロマトグラフィー用担体として保存した場合のリガンドの活性の低下が抑制され、繰り返し使用した際の標的物質の動的結合容量の低下も抑制される。
リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量は、エポキシ基含有モノビニル単量体の量、重合温度、重合時間、重合液のpH、さらには、重合後の開環処理などによって、調整することが出来る。
固相担体の製造法を、固相担体が多孔質粒子である場合を例に挙げて説明する。
多孔質粒子は、公知のシード重合、懸濁重合などにより製造することができる。シード重合法として、特公昭57−24369号公報記載の二段膨潤重合法が挙げられる。重合に際しては、上記単量体に加えて、重合開始剤、多孔化剤、水系媒体、分散安定剤、界面活性剤、重合調整剤、重合禁止剤、シード粒子などを必要に応じて使用する。
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、単量体総量100質量部に対して40〜400質量部程度である。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、tert−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
また、ドデシルメルカプタン等の重合調製剤を用いてもよい。
また、重合時間は通常5分〜48時間、好ましくは10分〜24時間である。
また、シード粒子および/または多孔化剤の良溶媒を用いて洗浄することが、後述のリガンドの結合が容易となる点から、好ましい。洗浄溶媒としては、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールなどが好適に使用できる。また、必要に応じて、洗浄の前後に、超音波分散機などを用いて、多孔質粒子を分散してもよい。さらに、デカンテーション、ろ過、篩分級などの方法により、小粒子や粗大粒子を除去することが、圧力特性の向上や標的物質などの動的結合容量の向上の点から好ましい。
(開環エポキシ基)
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する。この開環エポキシ基は、上記共重合体を含有する固相担体にリガンドを結合した後に、該共重合体に含まれるエポキシ基、すなわち、リガンドと結合したエポキシ基以外の残余のエポキシ基を開環させて得ることができる。エポキシ基には上記の共重合体に含まれるものの他、エピクロロヒドリンやジグリシジルエーテル化合物等により、後から導入したエポキシ基も含まれ、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体の製造においてどの段階で導入されたかは問わない。
そのため、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを2MのNaClを含むpH7.5の20mMリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、40℃で7日間静置したときのカラム内のpH上昇幅が2以下となるものである。斯かる構成により、不純物の除去能と保存安定性に優れたものとなる。上記pH上昇幅は、好ましくは1.9以下であり、不純物の除去能を更に改善させる場合には、1.7以下がより好ましい。また、pH上昇幅の下限値は特に限定されないが、例えば0.01である。
(pH上昇幅)=(負荷pH)−(初期pH)
上記式において「負荷pH」は、初期pHを測定してから40℃の恒温器内で7日間静置した後、2MのNaClを含むpH7.5の20mMリン酸ナトリウム緩衝液をカラムに再度通液し、pHが最も高くなったときのpHの値を意味する。
R1は、炭素数1〜6の2価の有機基を示し、
R2は、水素原子または炭素数1〜10の1価の有機基を示し、
Xは、チオ基(>S)、スルフィニル基(>S=O)、スルホニル基(>S(=O)2)、イミノ基(>NH)、またはオキシ基(>O)を示し、
*は、結合位置を示す。]
また、上記2価の有機基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、斯かる2価の有機基としては、2価の炭化水素基、2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基が挙げられ、2価の炭化水素基が好ましい。
上記2価の炭化水素基は、好ましくは2価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
アルカンジイル基の具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基等が挙げられる。
R3は、炭素数1〜10の2価または3価の有機基を示し、
nは、1または2を示し、
**は、式(1)中のXとの結合位置を示す。]
R4は、炭素数1〜10の2価または3価の有機基を示し、
Yは、酸性基またはアミノ基を示し、
mは、1または2を示し、
**は、式(1)中のXとの結合位置を示す。]
式(3)中、mは、1または2を示すが、1が好ましい。
また、メルカプトエタノール、チオグリセロール、メルカプト酢酸やその塩、メルカプトコハク酸やその塩、メルカプトエタンスルホン酸やその塩、メルカプトプロパンスルホン酸やその塩などの親水性基を有するメルカプト化合物;モノエタノールアミン、グルコサミンなどの親水性基を有するアミン化合物;ジエチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類をエポキシ基を開環させるブロッキング剤として使用してもよい。なお、ここでいう親水性基としては、ヒドロキシ基;アミノ基;カルボキシ基、リン酸基、スルホ基、これらの塩等の酸性基などが挙げられる。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩;マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩;アンモニウム塩;有機アンモニウム塩等が挙げられる。
また、必要に応じて塩基性触媒存在下でブロッキングを行ってもよい。斯かる塩基性触媒としては、トリエチルアミン、N,N−ジメチル−4−アミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミンなどが挙げられ、1種を単独でまたは2種以上を組み合わせて使用できる。
また、メルカプト化合物をブロッキング剤として使用した場合、酸化剤を用いてチオ基をスルフィニル基に酸化し、さらに親水性を向上させることができる。
また、酸化剤の合計使用量は、チオ基1モルに対し、通常0.1〜10モル当量程度であるが、好ましくは0.5〜3モル当量である。
上記溶媒の合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常1〜50質量倍程度であるが、好ましくは5〜15質量倍である。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、固相担体に結合したリガンドを含むものである。
リガンドは、標的物質に対して適度なアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインL、Fc結合タンパク、アビジン等のタンパク質;インシュリン等のペプチド;モノクローナル抗体等の抗体;酵素;ホルモン;DNA;RNA;ヘパリン、ルイスX、ガングリオシド等の糖質;イミノジ酢酸、合成色素、2−アミノフェニル硼素酸、4−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインA、プロテインG、プロテインL、Fc結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも1種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインA、プロテインG、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインA、その機能性変異体である。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を構成する固相担体が、多孔質粒子である場合、上記多孔質粒子の粒径は、通常、35〜100μmであり、好ましくは40〜85μmである。粒径が、35μm以上であると、圧力特性に優れる。100μm以下であると、動的結合容量が高い充填剤が得られる。
多孔質粒子の粒径は、重合する際の条件で調整することができる。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置(ベックマン・コールター社製LS13 320)により得られる体積平均粒子径を意味する。
本発明のアフィニティークロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填されたものである。
本発明の標的物質の精製方法は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とするものである。
精製は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いる以外は常法と同様であるが、例えば、標的物質を含む組成物を準備する準備工程と、本発明のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する通液工程と、該通液工程により担体に吸着された標的物質を溶出させる溶出工程を含む方法が挙げられる。
本発明の精製方法は、タンパク質の精製に適し、イムノグロブリンの精製に特に適する。
(1)360gの純水にポリビニルアルコール(クラレ社製 PVA−217)3.58gを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム(和光純薬工業製)0.36g、硫酸ナトリウム(和光純薬工業製)0.36g、亜硝酸ナトリウム(和光純薬工業製)0.18gを添加し、撹拌して水溶液Sを調製した。
一方、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)12.00g及びジビニルベンゼン(新日鐵化学社製)1.33gからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン(三井化学社製)24.43gに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Sを、500mLセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が85℃に到達したところで2,2'−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)0.53gを添加し、86℃に温度を維持した。
(2)その後、86℃に温度を維持し、3時間撹拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを3回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が10質量%となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子分散液を得た。
(3)改変プロテインA(Repligen製 rSPA)0.15gを、1.2M 硫酸ナトリウム/0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)40mLに分散させプロテインA分散液を得、このプロテインA分散液に実施例1の工程(2)で得られた多孔質粒子分散液(粒子乾燥質量換算で1g相当)を添加した。この分散液を25℃で5時間振とう撹拌し、プロテインAを粒子に固定した。
(4)生成したプロテインA固定粒子を、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)で洗浄した後、1.0M 硫酸水溶液(和光純薬工業社製)40mLに分散させ、40℃で4時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)、0.1M 水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤1を得た。
実施例1の工程(1)において、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)9.20g、1−エチル−4−ビニルベンゼン(ChemSampCo社製)0.58g及びジビニルベンゼン(新日鐵化学社製)1.73gからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン(三井化学社製)19.59g及びアニソール(和光純薬工業社製)6.05gの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例1の工程(1)及び(2)と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例1の工程(3)と同様の操作でプロテインAを固定し、プロテインA固定粒子を生成させた。
次いで、生成したプロテインA固定粒子を、1.0M 2−メルカプトエタノール(和光純薬工業社製)/0.1M 硫酸ナトリウム(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で17時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインA固定粒子を、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)、0.1M 水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤2を得た。
実施例1の工程(1)において、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)8.18g、N−(2−ヒドロキシエチル)アクリルアミド(東京化成工業社製)1.36g及びトリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)4.09gからなる単量体組成物を、4−メチル−2−ペンタノール(和光純薬工業製)21.97g及び炭酸ジエチル(和光純薬工業製)2.95gの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例1の工程(1)及び(2)と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例1の工程(3)と同様の操作でプロテインAを固定し、プロテインA固定粒子を生成させた。
次いで、生成したプロテインA固定粒子(PA−1)を、1.0M 1−チオグリセロール(旭化学工業社製)/0.1M 硫酸ナトリウム(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で17時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインA固定粒子(PA−2)を、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)、0.1M 水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤3を得た。
実施例3と同様の操作で得た、未反応のエポキシ基が開環したプロテインA固定粒子(PA−2)を、粒子の濃度が10質量%となるように純水に分散させた。これに、30%過酸化水素水0.48gを添加し、25℃で24時間振とう撹拌した。さらに、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)、0.1M 水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤4を得た。
実施例3と同様の操作で生成させたプロテインA固定粒子(PA−1)を、1.0M 1−チオグリセロール/0.1M 硫酸ナトリウム(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で40時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインA固定粒子を、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)、0.1M 水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤5を得た。
実施例1の工程(1)において、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)5.26g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)2.63g及びジビニルベンゼン(新日鐵化学社製)2.63gからなる単量体組成物を、2−オクタノン(東洋合成社製)25.00gに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例1の工程(1)及び(2)と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例1の工程(3)と同様の操作でプロテインAを固定し、プロテインA固定粒子を生成させた。
次いで、生成したプロテインA固定粒子を、1.0M 2−メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム(東京化成工業社製)/0.1M 硫酸ナトリウム(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で17時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインA固定粒子を、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)、0.1M 水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤6を得た。
実施例1の工程(1)において、4−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル(日本化成社製)4.77g及びグリセリンジメタクリレート(新中村化学工業社製)8.86gからなる単量体組成物を、アセトフェノン(井上香料製造所社製)21.52g及び2−オクタノン(東洋合成社製)7.35gの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例1の工程(1)及び(2)と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例3と同様の操作でプロテインAの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤7を得た。
実施例1の工程(1)において、ビニルベンジルグリシジルエーテル(東レ・ファインケミカル社製)3.43g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)4.11g及びエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)6.17gからなる単量体組成物を、アセトフェノン(井上香料製造所社製)21.52g及び2−オクタノン(東洋合成社製)7.35gの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例1の工程(1)及び(2)と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例3と同様の操作でプロテインAの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤8を得た。
実施例3において、プロテインA固定後に未反応のエポキシ基の開環を行わないこと以外は、実施例3と同様の操作でアフィニティークロマトグラフィー用充填剤9を得た。
実施例1の工程(1)において、3,4−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート(ダイセル社製)1.41g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)8.45g及びトリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)4.23gからなる単量体組成物を、アセトフェノン(井上香料製造所社製)21.50g及び2−オクタノン(東洋合成社製)7.34gの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例1の工程(1)及び(2)と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例1の工程(3)と同様の操作でプロテインAを固定し、プロテインA固定粒子を生成させた。
次いで、生成したプロテインA固定粒子を、1.0M 1−チオグリセロール(旭化学工業社製)/0.1M 硫酸ナトリウム(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で4時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)、0.1M 水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤10を得た。
比較例2において、1.0M 1−チオグリセロール(旭化学工業社製)/0.1M 硫酸ナトリウム(pH8.3)40mLにプロテインA固定粒子を分散させた後の振とう撹拌時間を、4時間から17時間に変更した以外は、比較例2と同様の操作でアフィニティークロマトグラフィー用充填剤11を得た。
実施例1の工程(1)において、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)1.39g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)2.79g及びグリセリンジメタクリレート(新中村化学工業社製)9.76gからなる単量体組成物を、アセトフェノン(井上香料製造所社製)21.50g及び2−オクタノン(東洋合成社製)7.34gの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例1の工程(1)及び(2)と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例3と同様の操作でプロテインAの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤12を得た。
実施例1〜8および比較例1〜4で得られたリガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量を定量した。
すなわち、塩化カルシウム水溶液に懸濁した多孔質粒子に塩酸を過剰に添加して塩酸を付加反応させることによりエポキシ基を開環し、残余の塩酸を過剰量の水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、フェノールフタレイン溶液を添加し、残余の水酸化ナトリウムを塩酸で逆滴定することにより定量した。なお、滴定の終点はフェノールフタレインの赤色が消えた時点とした。結果を表1に示す。
実施例1〜8および比較例1〜4で得られたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤をGEヘルスケア社製Tricorn 5/50カラムに充填高さ約5cmで充填し、前記カラムをGEヘルスケア社製AKTAprime plusに接続してpHをモニタリングしながら2MのNaClを含むpH7.5の20mMリン酸ナトリウム緩衝液を流速0.2mL/分にて通液し、カラム内のpHが平衡に達したときのpHの値を初期pHとして記録した。さらに、前記緩衝液に置換した前記カラムをAKTAprime plusから取り外し、40℃の恒温器内で7日間静置した。
その後、前記カラムを再びAKTAprime plusに接続してpHをモニタリングしながら前記緩衝液を流速0.2mL/分にて通液し、pHが最も高くなったときのpHの値を負荷pHとして記録した。初期pHと負荷pHとの差をpH上昇幅として求めた。なお、初期pH及び負荷pHの測定は23±1℃の恒温室内で実施した。結果を表1に示す。
実施例1〜8および比較例1〜4で得られたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に結合したリガンドであるプロテインAの結合量を、ビシンコニン酸(BCA)試薬を用いて定量した。具体的には、固形分換算で1mgの充填剤をテストチューブに採取し、これをThermoFisher Scientific社のBCA Protein Assay Kitで定量した。反応は、37℃で30分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインAと同一のものを用いて作成した。結果を表1に示す。
GEヘルスケア社製AKTAprime plusを用いて、線流速300cm/hrにおけるタンパク質(ヒトIgG抗体、Equitech Bio社製 HGG−1000)に対する実施例および比較例の各充填剤のDBCを測定した。カラムは容量4mL(5mmφ×200mm長)のものを、タンパク質は20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)で5mg/mLにタンパク質を溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端10%ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からDBCを求めた。結果を表1に示す。
カラム容器(GEヘルスケア社製Tricorn10/50 column)に、実施例及び比較例の各充填剤を、充填高さ約5cmで充填してカラムを作製した。得られたカラムをGEヘルスケア社製AKTA Prime Plusにそれぞれ接続し、20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)を5カラム容量(カラム容積の5倍)、流速1mL/分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Trastuzumabを含有するCHO細胞培養上清を、約23mg抗体/mL担体の負荷量で、流速1mL/分にてカラムに通液した。
次いで、20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)、20mMリン酸ナトリウム/1M塩化ナトリウムバッファー(pH7.5)、及び20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)を、それぞれ5カラム容量、流速1mL/分にてカラムに順次通液した。
その後、50mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)を、流速1mL/分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Abs.280>100mAuの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度(mg/mL)を測定した。また、Cygnus Technologies社製 CHO HCP ELISA kit,3Gを用い、回収したフラクション中に含有されるHost Cell Protein(HCP)の濃度(ng/mL)を測定した。さらにHCPの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのHCP量を算出した。結果を表1に示す。
(M−1) GMA:グリシジルメタクリレート、HBAGE:4−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル、VBGE:(4−ビニルベンジル)グリシジルエーテル、METHB:3,4−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート
(M−2) DVB:ジビニルベンゼン、TMP:トリメチロールプロパントリメタクリレート、GLDM:グリセリンジメタクリレート、EDMA:エチレングリコールジメタクリレート
(M−3) EVB:1−エチル−4−ビニルベンゼン、HEAA:N−(2−ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、GLM:グリセロールモノメタクリレート
(開環に使用した化合物) ME:2−メルカプトエタノール、TG:1−チオグリセロール、MPSA:2−メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム
Claims (12)
- (M−1)エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位:全構造単位に対し20質量部を超えて、99.5質量部以下、および
(M−2)ポリビニル単量体に由来する構造単位:全構造単位に対し0.5〜80質量部を含む共重合体を含有する固相担体と、
エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基と、
前記固相担体に結合したリガンドと、を含むアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを2MのNaClを含むpH7.5の20mMリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、40℃で7日間静置したときのカラム内のpH上昇幅が2以下であることを特徴とする、
アフィニティークロマトグラフィー用担体。 - 前記共重合体が、(M−3)エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位:全構造単位に対し40質量部以下を更に含む、請求項1に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
- Xが、チオ基(>S)、スルフィニル基(>S=O)、またはオキシ基(>O)である、請求項3または4に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
- 前記リガンドが、イムノグロブリン結合性タンパク質である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
- 前記イムノグロブリン結合性タンパク質が、プロテインA、プロテインG、プロテインL、Fc結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも1種以上である、請求項6に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
- 前記固相担体が多孔質粒子である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
- 前記多孔質粒子の粒径が35〜100μmである、請求項8に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填された、アフィニティークロマトグラフィーカラム。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とする、標的物質の精製方法。
- 前記標的物質が、標的タンパク質である、請求項11に記載の精製方法。
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WO2015080174A1 (ja) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Jsr株式会社 | 固相担体、固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤、クロマトグラフィーカラムおよび精製方法 |
JP6634202B2 (ja) * | 2014-08-22 | 2020-01-22 | Jsr株式会社 | 担体、担体の製造方法、及び標的物の精製方法 |
JP2019070528A (ja) * | 2016-02-26 | 2019-05-09 | Jsr株式会社 | 多孔質担体、アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体 |
WO2018155241A1 (ja) * | 2017-02-27 | 2018-08-30 | 昭和電工株式会社 | サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法 |
US20200061580A1 (en) * | 2017-06-30 | 2020-02-27 | Showa Denko K.K. | Packing material for liquid chromatography and column for liquid chromatography |
JP7305623B2 (ja) * | 2018-04-27 | 2023-07-10 | キヤノン株式会社 | 粒子、粒子の製造方法、アフィニティー粒子、及び、これを含む試薬及びキット、並びに標的物質の検出方法 |
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JP2021181405A (ja) * | 2018-08-29 | 2021-11-25 | Jsr株式会社 | ポリペプチドの精製方法 |
US20220048010A1 (en) * | 2018-12-17 | 2022-02-17 | Chreto Aps | Ligand linker substrate |
CN110577878B (zh) * | 2019-08-30 | 2022-11-04 | 安徽省金裕皖酒业有限公司 | 一种利用副产物黄水提高白酒抗氧化活性的方法 |
CN115463647A (zh) * | 2021-06-11 | 2022-12-13 | 苏州瑞恒嘉航医疗科技有限公司 | 一种蛋白分离专用固定相及其制备与应用 |
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007142331A1 (ja) * | 2006-06-08 | 2007-12-13 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. | アフィニティ担体及びその製造方法 |
WO2010035757A1 (ja) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Jsr株式会社 | アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 |
WO2011118599A1 (ja) * | 2010-03-24 | 2011-09-29 | Jsr株式会社 | アフィニティークロマトグラフィー用充填剤およびイムノグロブリンを単離する方法 |
WO2011125674A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-13 | Jsr株式会社 | アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 |
WO2011125673A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-13 | Jsr株式会社 | アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 |
WO2012086660A1 (ja) * | 2010-12-21 | 2012-06-28 | Jsr株式会社 | アフィニティークロマトグラフィー用担体およびイムノグロブリンを単離する方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1088861B (it) * | 1976-10-28 | 1985-06-10 | Asahi Chemical Ind | Materiale assorbente per proteine |
AU630427B2 (en) | 1989-07-06 | 1992-10-29 | Perseptive Biosystems, Inc. | Perfusive chromatography |
US5583162A (en) | 1994-06-06 | 1996-12-10 | Biopore Corporation | Polymeric microbeads and method of preparation |
US6841580B2 (en) * | 2001-12-21 | 2005-01-11 | Organo Corporation | Organic porous material, process for manufacturing the same, and organic porous ion exchanger |
EP1830947A4 (en) | 2004-12-14 | 2012-04-18 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | CLEANING OF IMMUNOGLOBULINS |
EP1974215B1 (en) | 2006-01-06 | 2017-12-27 | EMD Millipore Corporation | Affinity chromatography matrices and methods of making and using the same |
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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