WO2015199196A1 - アフィニティークロマトグラフィー用担体 - Google Patents

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WO2015199196A1
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affinity chromatography
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protein
mass
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昌輝 籾山
幸子 津田
智哉 則信
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Jsr株式会社
Ｊｓｒライフサイエンス株式会社
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    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • the present invention relates to a carrier for affinity chromatography.
  • the present invention relates to a carrier for affinity chromatography useful for purification of proteins such as antibodies.
  • Affinity chromatography plays an important role in the research, development and production of proteins including monoclonal antibodies.
  • a carrier for affinity chromatography generally includes a solid phase carrier having a ligand that selectively binds to a target substance.
  • Affinity chromatography is superior to other chromatography methods such as ion chromatography, gel filtration chromatography, and reverse phase liquid chromatography because the ligand on the solid support has high selectivity for the target substance.
  • Economical purification can be achieved at a high yield with a high yield.
  • the performance required for affinity chromatography for protein purification includes (1) non-specific adsorption of impurities other than the target protein, and (2) binding capacity does not decrease due to long-term storage, resulting in storage stability. And (3) sufficient mechanical strength for column operation.
  • agarose particles Patent Documents 1 and 2
  • porous particles made of a copolymer of styrene-divinylbenzene Patent Documents 3 and 4
  • methacrylate vinyl monomer as a solid phase carrier for affinity chromatography support
  • Porous particles Patent Documents 5 and 6) made of a solid polymer
  • agarose particles since agarose particles generally have a low elastic modulus, they have the disadvantage that the column pressure increases when a medium is flowed at a high speed. Moreover, since agarose particles are generally produced from natural seaweed through a long and complicated process, it is difficult to obtain particles of a certain quality.
  • porous particles made of a copolymer of an aromatic vinyl monomer such as styrene-divinylbenzene are generally excellent in alkali resistance, but have low hydrophilicity, and therefore have low ligand activity, and are resistant to target substances. Has the disadvantage of low mechanical coupling capacity.
  • the porous particles made of a polymer of a methacrylate vinyl monomer have high hydrophilicity and mechanical strength, further improvement in the ability to remove impurities has been desired.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a carrier for affinity chromatography that is excellent in storage stability in which non-specific adsorption of impurities is suppressed and a decrease in dynamic binding capacity due to long-term storage is suppressed. .
  • a solid phase carrier containing a copolymer containing specific amounts of structural units derived from an epoxy group-containing monovinyl monomer and structural units derived from a polyvinyl monomer A specific affinity chromatography carrier having a ligand that binds to the solid phase carrier and a ring-opened epoxy group is found to have a high dynamic binding capacity of the target substance, and is excellent in impurity removal ability and storage stability, The present invention has been completed.
  • the present invention relates to ⁇ 1> (M-1) a structural unit derived from an epoxy group-containing monovinyl monomer: more than 20 parts by mass and not more than 99.5 parts by mass with respect to all structural units; 2) Structural unit derived from a polyvinyl monomer: a solid phase carrier containing a copolymer containing 0.5 to 80 parts by mass with respect to all structural units; A ring-opened epoxy group obtained by ring-opening an epoxy group; A ligand for affinity chromatography comprising a ligand bound to the solid phase carrier,
  • the above column for affinity chromatography is packed in an arbitrary column container, the column is replaced with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) containing 2 M NaCl, and the pH in the column is left at 40 ° C. for 7 days.
  • the rising width is 2 or less,
  • a carrier for affinity chromatography is provided.
  • the present invention also provides an affinity chromatography column in which a column container is filled with ⁇ 2> the carrier for affinity chromatography described in ⁇ 1> above.
  • the present invention provides a method for purifying a target substance, characterized by using ⁇ 3> the carrier for affinity chromatography described in ⁇ 1> above.
  • HCP Host Cell Protein
  • the solid phase carrier constituting the affinity chromatography carrier of the present invention is: (M-1) Structural unit derived from epoxy group-containing monovinyl monomer: more than 20 parts by mass and not more than 99.5 parts by mass with respect to all structural units, and (M-2) derived from polyvinyl monomer Structural unit: containing a copolymer containing 0.5 to 80 parts by mass with respect to all structural units, In addition, it includes a ring-opened epoxy group obtained by opening an epoxy group.
  • the form of the solid phase carrier may be any of monolith, membrane, hollow fiber, particle, cassette, chip and the like, but particle is preferred.
  • the solid phase carrier is preferably a porous material such as porous particles from the viewpoint of improving the surface area.
  • porous particles porous polymer particles are preferable.
  • the solid phase carrier may contain a natural polymer or a synthetic polymer in addition to the copolymer.
  • the epoxy group-containing monovinyl monomer is a monomer having one polymerizable vinyl group (a group having an ethylenically unsaturated bond) and one or more epoxy groups in one molecule.
  • the epoxy group-containing vinyl monomer can be used to introduce an appropriate amount of an epoxy group into a solid phase carrier to obtain an appropriate amount of ligand binding or an amount of ring-opened epoxy group.
  • epoxy group-containing monovinyl monomer examples include glycidyl (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate glycidyl ether, 3,4-epoxycyclohexylmethyl (meth) acrylate, ⁇ - (meth) acryl- ⁇ - Hydroxy group-free (meth) acrylic esters such as glycidyl polyethylene glycol; Hydroxy group-containing (meth) acrylic esters such as glycerin mono (meth) acrylate glycidyl ether; Aromatic monovinyl compounds such as vinylbenzyl glycidyl ether Allyl glycidyl ether, 3,4-epoxy-1-butene, 3,4-epoxy-3-methyl-1-butene, and the like.
  • the epoxy group-containing monovinyl monomer is preferably an epoxy group-containing (meth) acrylic acid ester or an epoxy group-containing aromatic monovinyl compound from the viewpoint of antifouling property or storage stability.
  • (Meth) acrylic acid esters are more preferred, glycidyl (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate glycidyl ether is more preferred, and glycidyl (meth) acrylate is particularly preferred.
  • the epoxy group-containing monovinyl monomer is preferably a water-insoluble one because the amount of ring-opened epoxy groups can be easily controlled.
  • water-insoluble means that 10 g or more does not dissolve in 100 mL of water at room temperature (25 ° C.).
  • the epoxy group-containing monovinyl monomer may be a commercially available product, or may be synthesized according to a known method.
  • the content of the structural unit derived from the epoxy group-containing monovinyl monomer is more than 20 parts by mass and 99.5 parts by mass or less with respect to all the structural units.
  • the content is 20 parts by mass or less, the amount of the ring-opened epoxy group is reduced, the hydrophilicity of the support for affinity chromatography after ligand binding is lowered, and the ability to remove impurities is lowered.
  • it exceeds 99.5 parts by mass the mechanical strength becomes low, and it becomes impossible to withstand handling as a carrier for affinity chromatography.
  • the content of the structural unit derived from the epoxy group-containing monovinyl monomer is preferably 25 parts by mass or more, more preferably 30 parts by mass or more, with respect to all the structural units, from the viewpoints of antifouling property and storage stability. More preferably, it is 40 parts by mass or more, particularly preferably 50 parts by mass or more, and from the viewpoint of antifouling property, storage stability, etc., preferably 95 parts by mass or less, more preferably 90 parts by mass with respect to all structural units. Part or less, more preferably 85 parts by weight or less, particularly preferably 80 parts by weight or less.
  • the polyvinyl monomer is a vinyl monomer having two or more polymerizable vinyl groups (groups having an ethylenically unsaturated bond) in one molecule.
  • the polyvinyl monomer will be described by being divided into a hydroxy group-free polyvinyl monomer and a hydroxy group-containing polyvinyl monomer.
  • a polyvinyl monomer can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • non-hydroxy group-containing polyvinyl monomer examples include ethylene glycol di (meth) acrylate, diethylene glycol di (meth) acrylate, triethylene glycol di (meth) acrylate, tetraethylene glycol di (meth) acrylate, propylene glycol di ( (Meth) acrylate, dipropylene glycol di (meth) acrylate, tripropylene glycol di (meth) acrylate, tetrapropylene glycol di (meth) acrylate, 1,4-butanediol di (meth) acrylate, 1,6-hexanediol di (Meth) acrylates such as (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, pentaerythritol tetra (meth) acrylate; divinylbenzene, tri Aromatic polyvinyl compounds such as Nirubenzen; butadiene, isocyanuric acid diallyl
  • hydroxy group-free polyvinyl monomer (meth) acrylic acid esters and aromatic polyvinyl compounds are preferable.
  • the number of polymerizable vinyl groups contained in the hydroxy group-free polyvinyl monomer is preferably 2 to 5 and more preferably 2 or 3 in one molecule.
  • hydroxy group-containing polyvinyl monomer (meth) acrylic acid esters of polyhydric alcohols, (meth) acrylic acid esters of two or more substituted saccharides, and (meth) acrylamides of polyhydric alcohols are preferable.
  • (Meth) acrylic acid esters of polyhydric alcohol include glycerin di (meth) acrylate, trimethylolethane di (meth) acrylate, trimethylolpropane di (meth) acrylate, butanetriol di (meth) acrylate, pentaerythritol di (Meth) acrylate, pentaerythritol tri (meth) acrylate, dipentaerythritol di (meth) acrylate, dipentaerythritol tri (meth) acrylate, dipentaerythritol tetra (meth) acrylate, dipentaerythritol penta (meth) acrylate, inositol Examples include di (meth) acrylate, inositol tri (meth) acrylate, and inositol tetra (meth) acrylate.
  • Examples of (meth) acrylic acid esters having two or more substitutions of various sugars include, for example, glucose di (meth) acrylate, glucose tri (meth) acrylate, glucose tetra (meth) acrylate, mannitol di (meth) acrylate, mannitol tri ( Examples include meth) acrylate, mannitol tetra (meth) acrylate, and mannitol penta (meth) acrylate.
  • examples of the hydroxy group-containing polyvinyl monomer include, in addition to those exemplified above, dehydration condensation reaction products of amino alcohols such as diaminopropanol, trishydroxymethylaminomethane, and glucosamine with (meth) acrylic acid. it can.
  • the number of polymerizable vinyl groups contained in the hydroxy group-containing polyvinyl monomer is preferably 2 to 5 and more preferably 2 or 3 in one molecule.
  • polyvinyl monomer good porosity and mechanical strength can be obtained with a relatively small amount of use, and from the viewpoint of limiting the use amount of an epoxy group-containing monovinyl monomer, Hydroxy group-free polyvinyl monomers are preferred.
  • non-hydroxy group-containing polyvinyl monomers from the viewpoint of antifouling properties and storage stability, (meth) acrylic acid esters having 3 polymerizable vinyl groups, 2 or 2 polymerizable vinyl groups Three aromatic polyvinyl compounds are particularly preferred. Particularly preferred specific examples include trimethylolpropane tri (meth) acrylate, divinylbenzene, and trivinylbenzene.
  • the content of the structural unit derived from the polyvinyl monomer is 0.5 to 80 parts by mass with respect to the total structural unit.
  • the content of the structural unit derived from the polyvinyl monomer is less than 0.5 parts by mass, the mechanical strength of the solid phase carrier becomes low, and it cannot be handled as a carrier for affinity chromatography.
  • the hydrophilicity is lowered, the effect of reducing HCP cannot be obtained, and the activity of the ligand is lowered.
  • the content of the structural unit derived from the polyvinyl monomer is preferably at least 5 parts by mass, more preferably at least 10 parts by mass, and even more preferably from the viewpoint of antifouling properties and storage stability.
  • (M-3) Structural unit derived from monovinyl monomer not containing epoxy group examples of the copolymer contained in the solid phase carrier used in the present invention include (M-3) a monovinyl monomer not containing an epoxy group in addition to the structural unit (M-1) and the structural unit (M-2).
  • the structural unit derived from is preferably one further containing 40 parts by mass or less based on the total structural unit.
  • the monovinyl monomer not containing an epoxy group is a vinyl monomer having one polymerizable vinyl group (group having an ethylenically unsaturated bond) in one molecule and no epoxy group.
  • the monovinyl monomer monomer that does not contain an epoxy group will be described by being divided into a hydroxy group-free monovinyl monomer that does not contain an epoxy group and a hydroxy group-containing monovinyl monomer that does not contain an epoxy group.
  • a nonionic monomer is preferable from the viewpoint of preventing nonspecific adsorption of impurities during purification.
  • nonionic monomers include (meth) acrylic such as methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate, and methoxyethyl (meth) acrylate.
  • Acid esters such as (meth) acrylamide, dimethyl (meth) acrylamide, (meth) acryloylmorpholine, diacetone (meth) acrylamide, etc., may be used alone or in combination of two or more Can be used.
  • Nonionic monomers include hydrophobic (meth) acrylates such as 2-ethylhexyl (meth) acrylate and stearyl (meth) acrylate; aromatic vinyl such as styrene, ⁇ -methylstyrene and ethylvinylbenzene.
  • a compound may be used, but from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption of impurities during purification, it is not such a monomer, but among the monomers exemplified above, an alkyl group having 5 or less carbon atoms or alkoxyalkyl (Meth) acrylic acid alkyl esters having a group and the above (meth) acrylamides are preferred.
  • hydroxy group-containing monovinyl monomers that do not contain an epoxy group
  • examples of hydroxy group-containing monovinyl monomers that do not contain an epoxy group include glycerol mono (meth) acrylate, trimethylolethane mono (meth) acrylate, trimethylolpropane mono (meth) acrylate, butanetriol mono (meth) acrylate, (Meth) acrylics such as pentaerythritol mono (meth) acrylate, dipentaerythritol mono (meth) acrylate, inositol mono (meth) acrylate, hydroxyethyl (meth) acrylate, hydroxypropyl (meth) acrylate, and polyethylene glycol (meth) acrylate Acid esters; (meth) acrylamides such as hydroxyethyl (meth) acrylamide can be used, and one kind can be used alone or two or more kinds can be used in combination . Further, the number of hydroxy
  • a hydroxy group-containing monovinyl monomer not containing an epoxy group is preferable from the viewpoint of antifouling property, and glycerol mono (meth) acrylate, hydroxyethyl (metaethyl) ) Acrylate, hydroxypropyl (meth) acrylate, and hydroxyethyl (meth) acrylamide are more preferable, glycerol mono (meth) acrylate and hydroxyethyl (meth) acrylamide are more preferable, and hydroxyethyl (meth) acrylamide is particularly preferable.
  • the content of the structural unit derived from the monovinyl monomer not containing an epoxy group is preferably 40 parts by mass or less based on the total structural unit.
  • the content is 40 parts by mass or less, in the case of a hydroxy group-containing vinyl monomer, the hydrophilicity of the porous particles is improved, aggregation is suppressed, the activity of the ligand is increased, and the movement of the target substance is increased.
  • the amount of mechanical binding is improved.
  • the mechanical strength is improved.
  • the content of the structural unit is more preferably 35 parts by mass or less, further preferably 30 parts by mass or less, still more preferably 25 parts by mass or less, and particularly preferably 20 parts by mass or less with respect to the total structural units.
  • 0 mass part may be sufficient as content of the structural unit derived from the monovinyl monomer which does not contain an epoxy group.
  • 5 mass parts or more are preferable with respect to all the structural units.
  • Preferred combinations of the contents of the structural units (M-1) to (M-3) are: the structural unit (M-1): 40 to 90 parts by mass with respect to all the structural units, and the structural unit (M-2): all 10 to 60 parts by mass with respect to the structural unit, structural unit (M-3): 0 to 25 parts by mass with respect to all structural units, and a more preferred combination is structural unit (M-1): 40 with respect to all structural units.
  • structural unit (M-2) 15 to 60 parts by mass with respect to all structural units
  • structural unit (M-3) 0 to 25 parts by mass with respect to all structural units
  • Structural unit (M-1) 40 to 80 parts by mass for all structural units
  • Structural unit (M-2) 20 to 60 parts by mass for all structural units
  • Structural unit (M-3) for all structural units The amount is 0 to 20 parts by mass.
  • the epoxy group contained in the solid phase carrier before binding to the ligand is a functional group for binding the ligand, and further serves as a functional group for improving hydrophilicity as a carrier for affinity chromatography after ring opening.
  • the epoxy group content of the solid phase carrier before ligand binding is preferably 1 to 6 mmol / g, more preferably 2 to 5 mmol / g, and particularly preferably 2.5 to 4 mmol / g.
  • the epoxy group content of the solid phase carrier before ligand binding is 6 mmol / g or less, the residual amount of the epoxy group after ligand binding decreases, and the activity of the ligand decreases when stored as a carrier for affinity chromatography. It is suppressed, and the decrease in the dynamic binding capacity of the target substance when used repeatedly is also suppressed.
  • the epoxy group content of the solid phase carrier before ligand binding should be adjusted by the amount of the epoxy group-containing monovinyl monomer, the polymerization temperature, the polymerization time, the pH of the polymerization solution, and the ring-opening treatment after polymerization. I can do it.
  • a method for producing a solid phase carrier will be described by taking a case where the solid phase carrier is a porous particle as an example.
  • the porous particles can be produced by known seed polymerization, suspension polymerization or the like.
  • An example of the seed polymerization method is a two-stage swelling polymerization method described in JP-B-57-24369.
  • a polymerization initiator, a porous agent, an aqueous medium, a dispersion stabilizer, a surfactant, a polymerization regulator, a polymerization inhibitor, seed particles, and the like are used as necessary.
  • a preferred polymerization method in the production of porous particles is a suspension polymerization method of an aqueous mixture containing a monomer mixture and a porosifying agent as essential components.
  • a polymerization initiator is dissolved in a mixed solution (monomer solution) containing a monomer mixture and a porosifying agent, and suspended in an aqueous medium.
  • Examples thereof include a method, a method in which a mixed solution (monomer solution) containing a monomer mixture and a porous agent is suspended in an aqueous medium and heated to a predetermined temperature, and a polymerization initiator is added for polymerization. .
  • radical polymerization initiators include azo initiators, peroxide initiators, redox initiators, and the like. Specific examples include azobisisobutyronitrile, methyl azobisisobutyrate, azobis-2, Examples include 4-dimethylvaleronitrile, benzoyl peroxide, di-tert-butyl peroxide, benzoyl peroxide-dimethylaniline, and the like.
  • the total amount of the polymerization initiator used is usually about 0.01 to 10 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total amount of monomers.
  • the above porous agent is used to produce porous particles, and is present together with the monomer in the polymerization in the oil droplets, and has a role of forming pores as a non-polymerized component.
  • the porous agent is not particularly limited as long as it can be easily removed on the porous surface, and examples thereof include linear polymers that are soluble in various organic solvents and monomer mixtures. These may be used in combination.
  • the porosifying agent examples include aliphatic hydrocarbons such as hexane, heptane, octane, nonane, decane, and undecane; alicyclic hydrocarbons such as cyclohexane and cyclopentane; benzene, toluene, xylene, naphthalene, and ethylbenzene.
  • Aromatic hydrocarbons such as carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, tetrachloroethane, chlorobenzene and the like; butanol, pentanol, hexanol, heptanol, hexanol, 4-methyl-2-pentanol, Aliphatic alcohols such as 2-ethyl-1-hexanol; alicyclic alcohols such as cyclohexanol; aromatic alcohols such as 2-phenylethyl alcohol and benzyl alcohol; diethyl ketone, methyl isobutyl ketone, diisobutyl ketone, Ketones such as non, 2-octanone and cyclohexanone; ethers such as dibutyl ether, diisobutyl ether, anisole and ethoxybenzene; in addition to esters such as isopentyl acetate, butyl acetate, 3-meth
  • aqueous medium examples include aqueous water-soluble polymer aqueous solutions, and examples of the water-soluble polymer include hydroxyethyl cellulose, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, starch, and gelatin.
  • the total amount of the aqueous medium used is usually about 200 to 7000 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total amount of monomers.
  • a dispersion stabilizer such as sodium chloride, sodium sulfate, sodium carbonate, calcium carbonate, calcium phosphate may be used.
  • Various surfactants including anionic surfactants such as alkyl sulfate ester salts, alkylaryl sulfate ester salts, alkyl phosphate ester salts, and fatty acid salts may also be used.
  • a polymerization inhibitor such as nitrite such as sodium nitrite, iodide salt such as potassium iodide, tert-butylpyrocatechol, benzoquinone, picric acid, hydroquinone, copper chloride, ferric chloride and the like can be used.
  • polymerization preparation agents such as dodecyl mercaptan.
  • the polymerization temperature may be determined according to the polymerization initiator. For example, when azobisisobutyronitrile is used as the polymerization initiator, it is preferably 50 to 100 ° C., more preferably 60 to 90 ° C.
  • the polymerization time is usually 5 minutes to 48 hours, preferably 10 minutes to 24 hours.
  • washing with water and / or hot water in order to remove the water-soluble polymer attached to the obtained porous particles.
  • washing with a good solvent for seed particles and / or a porosifying agent is preferable from the viewpoint of easy binding of a ligand described later.
  • the washing solvent acetone, ethanol, isopropyl alcohol or the like can be preferably used.
  • the carrier for affinity chromatography of the present invention has a ring-opened epoxy group obtained by opening an epoxy group.
  • This ring-opened epoxy group opens a residual epoxy group other than the epoxy group contained in the copolymer, that is, the epoxy group bonded to the ligand, after binding the ligand to the solid phase carrier containing the copolymer. It can be obtained by ringing.
  • epoxy groups include epoxy groups introduced later by epichlorohydrin, diglycidyl ether compounds, etc., which stage in the production of the affinity chromatography carrier of the present invention It doesn't matter if it was introduced in
  • the affinity chromatography carrier of the present invention In the affinity chromatography carrier of the present invention, the epoxy group on the surface of the solid phase carrier is almost ring-opened, and the affinity chromatography carrier is brought into contact with a high concentration of chloride ions to open the remaining epoxy groups. The amount of hydroxide ions released when ringed is extremely small. Therefore, the affinity chromatography carrier of the present invention is packed in an arbitrary column container with the affinity chromatography carrier, and the column is replaced with 20 mM sodium phosphate buffer having a pH of 7.5 containing 2 M NaCl. The pH increase in the column when allowed to stand for 7 days is 2 or less. With such a configuration, the impurity removal capability and storage stability are excellent. The pH increase is preferably 1.9 or less, and more preferably 1.7 or less when further improving the ability to remove impurities. Moreover, the lower limit value of the pH increase range is not particularly limited, but is, for example, 0.01.
  • the pH increase range can be obtained from the following formula, and can be measured by the method described in the examples in more detail.
  • the pH increase is measured on a new affinity chromatography carrier.
  • the new carrier for affinity chromatography means a carrier that has not been used before. For example, if it is used for antibody purification, it means a carrier that has not been used for antibody purification.
  • (PH increase range) (Load pH) ⁇ (Initial pH)
  • initial pH means a pH value when a pH 7.5 20 mM sodium phosphate buffer containing 2 M NaCl is passed through the column and the pH in the column reaches equilibrium.
  • the “load pH” is determined by measuring the initial pH and allowing it to stand in a 40 ° C. incubator for 7 days, and then passing a 20 mM sodium phosphate buffer solution containing 2 M NaCl over pH 7.5 through the column again. It means the value of the pH at which the liquid is liquefied and the pH becomes the highest.
  • the ring-opened epoxy group produced by ring-opening of the epoxy group is represented by the following formula (1) from the viewpoint of preventing nonspecific adsorption of impurities and preventing a decrease in the activity of the ligand during storage.
  • the group represented is preferred.
  • R 1 represents a divalent organic group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2 represents a hydrogen atom or a monovalent organic group having 1 to 10 carbon atoms
  • X represents a thio group (> S), a sulfinyl group (> S ⁇ O), a sulfonyl group (> S ( ⁇ O) 2 ), an imino group (> NH), or an oxy group (> O), * Indicates a binding position.
  • R 1 represents a divalent organic group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the number of carbon atoms of the organic group is preferably 1 to 4, more preferably 1 or 2.
  • the divalent organic group may be linear or branched.
  • Such a divalent organic group includes a group having at least one selected from an ether bond, an imino group and an ester bond between carbon-carbon atoms of a divalent hydrocarbon group and a divalent hydrocarbon group.
  • a divalent hydrocarbon group is preferable.
  • the divalent hydrocarbon group is preferably a divalent aliphatic hydrocarbon group, more preferably an alkanediyl group.
  • alkanediyl group examples include methane-1,1-diyl group, ethane-1,1-diyl group, ethane-1,2-diyl group, propane-1,1-diyl group, propane-1,2 -Diyl group, propane-1,3-diyl group, propane-2,2-diyl group, butane-1,4-diyl group, pentane-1,5-diyl group, hexane-1,6-diyl group, etc. Can be mentioned.
  • R 2 represents a hydrogen atom or a monovalent organic group having 1 to 10 carbon atoms, preferably a monovalent organic group having 1 to 10 carbon atoms.
  • Such an organic group is preferably an organic group represented by the following formula (2) or (3) from the viewpoint of dynamic binding capacity and antifouling property when a ligand is bound, The organic group represented is more preferred.
  • R 3 represents a divalent or trivalent organic group having 1 to 10 carbon atoms, n represents 1 or 2, ** represents a bonding position with X in the formula (1).
  • R 4 represents a divalent or trivalent organic group having 1 to 10 carbon atoms
  • Y represents an acidic group or an amino group
  • m represents 1 or 2
  • ** represents a bonding position with X in the formula (1).
  • the number of carbon atoms of the divalent or trivalent organic group represented by R 3 in formula (2) or R 4 in formula (3) is from the viewpoint of dynamic binding capacity when a ligand is bound, and the like. 1-8 are preferred, 1-6 are more preferred, and 2-4 are even more preferred.
  • examples of the divalent organic group include divalent hydrocarbon groups, which may be linear or branched.
  • the divalent hydrocarbon group is preferably a divalent aliphatic hydrocarbon group, more preferably an alkanediyl group.
  • the number of carbon atoms of such an alkanediyl group is preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6, and further preferably 2 to 4 from the viewpoint of dynamic binding capacity when a ligand is bound.
  • alkanediyl group examples include methane-1,1-diyl group, ethane-1,1-diyl group, ethane-1,2-diyl group, propane-1,1-diyl group, propane-1, Examples include 2-diyl group, propane-1,3-diyl group, propane-2,2-diyl group and the like.
  • examples of the trivalent organic group include a trivalent hydrocarbon group, which may be linear or branched.
  • the trivalent hydrocarbon group is preferably a trivalent aliphatic hydrocarbon group, and more preferably an alkanetriyl group.
  • the number of carbon atoms of such an alkanetriyl group is preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6, and further preferably 2 to 4 from the viewpoint of dynamic binding capacity and antifouling property when a ligand is bound. .
  • alkanetriyl group examples include methane-1,1,1-triyl group, ethane-1,1,2-triyl group, propane-1,2,3-triyl group, propane-1,2, And 2-triyl group.
  • n 1 or 2, but 2 is preferable.
  • Y represents an acidic group or an amino group, but an acidic group is preferred.
  • the acidic group include a carboxy group, a phosphate group, a sulfo group, and salts thereof.
  • the salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt; ammonium salt; organic ammonium salt and the like.
  • m represents 1 or 2, but 1 is preferred.
  • X represents a thio group (> S), a sulfinyl group (> S ⁇ O), a sulfonyl group (> S ( ⁇ O) 2 ), an imino group (> NH), or an oxy group (> O).
  • a group (> S), a sulfinyl group (> S ⁇ O), and an oxy group (> O) are preferred, a thio group (> S), a sulfinyl group (> S ⁇ O) are more preferred, and a sulfinyl group (> S ⁇ O). Is particularly preferred.
  • Examples of the ring opening method of the epoxy group in the solid phase carrier include a method of stirring in an aqueous solvent in the presence of an acid or an alkali. Stirring may be performed by heating or at room temperature.
  • hydrophilic groups such as hydroxy group; amino group; carboxy group, phosphoric acid group, sulfo group, these salts, etc. are mentioned.
  • the salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt; ammonium salt; organic ammonium salt and the like.
  • the amount of the acid, alkali or blocking agent used is usually 0.1 to 40 molar equivalents per 1 mol of the remaining epoxy group. Since the remaining epoxy groups are bonded to the ligand at multiple points to reduce the activity of the ligand during storage, blocking is preferably performed in an excess amount of 2 to 40 molar equivalents.
  • the reaction time for the ring-opening reaction is not particularly limited, but is usually about 0.5 to 72 hours, preferably 1 to 48 hours.
  • the reaction temperature may be appropriately selected below the boiling point of the solvent, but is usually about 2 to 100 ° C.
  • a basic catalyst include triethylamine, N, N-dimethyl-4-aminopyridine, diisopropylethylamine, and the like.
  • One kind can be used alone, or two or more kinds can be used in combination.
  • a preferred ring-opening epoxy group is a ring-opening epoxy group obtained by ring-opening an epoxy group contained in a solid phase carrier with a mercapto compound and / or a polyhydric alcohol, and is based on a ring-opening group by a blocking agent having an amino group.
  • a blocking agent having an amino group.
  • non-specific adsorption is reduced and the amount of dynamic binding is increased.
  • a thio group can be oxidized to a sulfinyl group using an oxidizing agent to further improve hydrophilicity.
  • the oxidizing agent is roughly classified into an organic oxidizing agent and an inorganic oxidizing agent, and examples of the organic oxidizing agent include peracetic acid, perbenzoic acid, and metachloroperbenzoic acid.
  • examples of the inorganic oxidizing agent include hydrogen peroxide, chromic acid, permanganate and the like.
  • these oxidizing agents can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • the total amount of the oxidizing agent used is usually about 0.1 to 10 molar equivalents, preferably 0.5 to 3 molar equivalents, per 1 mole of thio group.
  • the oxidation reaction is preferably performed in the presence of a solvent.
  • a solvent examples include water; amide solvents such as dimethylformamide and dimethylacetamide; alcohol solvents such as methanol and ethanol. These solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • the total amount of the solvent used is usually about 1 to 50 times by mass, preferably 5 to 15 times by mass with respect to the solid phase carrier used as a raw material.
  • the reaction time for the oxidation reaction is not particularly limited, but is usually about 1 to 72 hours, and the reaction temperature may be appropriately selected below the boiling point of the solvent, but is usually about 1 to 90 ° C.
  • the carrier for affinity chromatography of the present invention comprises a ligand bound to a solid phase carrier.
  • the type of ligand is not particularly limited as long as it has an appropriate affinity for a target substance.
  • protein such as protein A, protein G, protein L, Fc-binding protein, and avidin
  • peptide such as insulin Antibodies such as monoclonal antibodies
  • enzymes such as monoclonal antibodies
  • enzymes such as monoclonal antibodies
  • enzymes such as monoclonal antibodies
  • enzymes such as monoclonal antibodies
  • enzymes hormones
  • DNA DNA
  • RNA carbohydrates such as heparin, Lewis X and ganglioside
  • iminodiacetic acid synthetic dyes, 2-aminophenylboronic acid, 4-aminobenzamidine, glutathione, biotin and the like
  • Low molecular weight compounds such as derivatives can be used.
  • the ligand illustrated above may use the whole, the fragment obtained by a recombinant, an enzyme treatment
  • examples of ligands suitable for immunoglobulin separation or purification include immunoglobulin binding proteins.
  • the immunoglobulin binding protein is preferably at least one selected from the group consisting of protein A, protein G, protein L, Fc binding protein, and functional variants thereof. Among them, protein A, protein G, and functional variants thereof are preferable, and protein A, and functional variants thereof are more preferable.
  • the term “protein” refers to any molecule having a peptide structural unit, for example, a concept including a partial fragment of a natural protein or a variant obtained by artificially modifying the amino acid sequence of a natural protein. is there.
  • the “immunoglobulin binding domain” represents a functional unit of a polypeptide having immunoglobulin binding activity alone, and the “immunoglobulin binding protein” has a specific affinity for immunoglobulin, and , Which represents a protein comprising an “immunoglobulin binding domain”.
  • “Immunoglobulin binding” refers to binding to a region other than the complementarity determining region (CDR) of an immunoglobulin molecule, particularly to an Fc fragment.
  • the term “ligand” used in connection with affinity chromatography refers to a molecule that binds to a target substance for affinity chromatography.
  • the epoxy group contained in the solid phase carrier is directly used as a binding site for the ligand because the process is simple.
  • the alcoholic hydroxyl group generated by ring-opening the epoxy group contained in the solid phase carrier is activated with a tosyl group and the like, and then the ligand is bound, the epoxy group contained in the solid phase carrier or the epoxy group
  • the linker may be further extended from the group generated by ring opening of the group, and then the ligand may be bound to the solid phase carrier via the linker.
  • diglycidyl ether compounds such as diglycidyloxyalkane and polyalkylene glycol diglycidyl ether are preferable.
  • the ligand binding conditions vary depending on the epoxy group content of the solid phase carrier before ligand binding and the type of ligand, but methods known to those skilled in the art can be employed.
  • the ligand is a protein
  • the amino group at the N-terminal of the protein, lysine and cysteine contained in the protein can be the reaction site with the epoxy.
  • binding proteins for example, using an aqueous solution of buffers close to the isoelectric point of the protein, adding a salt such as sodium chloride or sodium sulfate as necessary, and mixing the protein and the solid support at 0 to 40 ° C.
  • the protein as a ligand can be bound by reacting for 1 to 48 hours.
  • the binding amount of the ligand is appropriately adjusted depending on the type of ligand, the type of target substance, etc., but when binding an immunoglobulin-binding protein such as protein A as a ligand, it is preferably 10 to 200 mg, more preferably 25 to 100 mg. When binding an immunoglobulin-binding protein such as protein A as a ligand, the binding capacity of the ligand per 1 g of the solid phase carrier is 10 mg or more, and the dynamic binding capacity is excellent. The amount of eluate used for elution of the prepared antibody is particularly suitable.
  • the particle size of the porous particle is usually 35 to 100 ⁇ m, preferably 40 to 85 ⁇ m. When the particle size is 35 ⁇ m or more, the pressure characteristics are excellent. When the thickness is 100 ⁇ m or less, a filler having a high dynamic binding capacity can be obtained.
  • the particle size of the porous particles can be adjusted according to the polymerization conditions.
  • the “particle diameter” in the present invention means a volume average particle diameter obtained by a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer (LS13 320 manufactured by Beckman Coulter, Inc.).
  • the specific surface area of the porous particle is a pore size of 10 nm when a pore corresponding to a pore diameter range of 10 to 5000 nm is measured.
  • the specific surface area at ⁇ 5000 nm is preferably 70 m 2 / g or more, more preferably 90 m 2 / g or more.
  • the “specific surface area” in the present invention is a value obtained by dividing the surface area of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter (manufactured by Shimadzu Corporation Autopore IV9520) by the dry mass of the particles.
  • the carrier for affinity chromatography of the present invention has a high impurity removal ability and excellent storage stability, and is particularly useful for purification of proteins such as antibodies.
  • the affinity chromatography column of the present invention is a column container filled with the carrier for affinity chromatography of the present invention.
  • the target substance purification method of the present invention is characterized by using the carrier for affinity chromatography of the present invention. Purification is the same as in the conventional method except that the carrier for affinity chromatography of the present invention is used.
  • the preparation step for preparing the composition containing the target substance and the composition are passed through the chromatography column of the present invention. Examples of the method include a liquid passing step for liquid and an elution step for eluting the target substance adsorbed on the carrier by the liquid passing step.
  • the purification method of the present invention is suitable for protein purification and particularly suitable for immunoglobulin purification.
  • Example 1 (1) Add 3.58 g of polyvinyl alcohol (PVA-217 manufactured by Kuraray Co., Ltd.) to 360 g of pure water, dissolve the polyvinyl alcohol by heating and stirring, cool, and then add sodium dodecyl sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 0 .36 g, sodium sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 0.36 g, and sodium nitrite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 0.18 g were added and stirred to prepare an aqueous solution S.
  • PVA-217 manufactured by Kuraray Co., Ltd.
  • a monomer composition composed of 12.00 g of glycidyl methacrylate (manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.) and 1.33 g of divinylbenzene (manufactured by Nippon Steel Chemical Co., Ltd.) is dissolved in 24.43 g of diisobutyl ketone (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.).
  • a monomer solution was prepared.
  • the entire amount of the aqueous solution S was put into a 500 mL separable flask, a thermometer, a stirring blade and a cooling pipe were attached, set in a hot water bath, and stirring was started in a nitrogen atmosphere.
  • the whole amount of the monomer solution was put into a separable flask and heated by a hot water bath.
  • 2,2′-azoisobutyronitrile manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 0 .53 g was added and the temperature was maintained at 86 ° C.
  • stirring was performed for 3 hours.
  • the reaction solution was filtered and washed with pure water and ethanol. The washed particles were dispersed in pure water and decanted three times to remove small particles.
  • the particles were dispersed in pure water so that the concentration of the particles was 10% by mass, thereby obtaining a porous particle dispersion.
  • Example 2 In step (1) of Example 1, 9.20 g of glycidyl methacrylate (manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.), 0.58 g of 1-ethyl-4-vinylbenzene (manufactured by ChemSampCo) and divinylbenzene (manufactured by Nippon Steel Chemical Co., Ltd.) 1 A monomer composition consisting of .73 g was dissolved in a mixed solution of 19.59 g of diisobutyl ketone (Mitsui Chemicals) and 6.05 g of anisole (Wako Pure Chemical Industries) to prepare a monomer solution. The same operations as in steps (1) and (2) of Example 1 were performed to obtain a porous particle dispersion.
  • protein A was immobilized by the same operation as in step (3) of Example 1 to produce protein A-immobilized particles.
  • the produced protein A fixed particles are dispersed in 40 mL of 1.0 M 2-mercaptoethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) / 0.1 M sodium sulfate (pH 8.3), and are shaken and stirred at 25 ° C. for 17 hours. This opened the unreacted epoxy group.
  • the obtained protein A-fixed particles in which the unreacted epoxy group was opened were mixed with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.6), 0.1 M sodium hydroxide aqueous solution, 0.1 M sodium citrate buffer (pH 3). . 2) to obtain a packing material 2 for affinity chromatography.
  • Example 3 In step (1) of Example 1, 8.18 g of glycidyl methacrylate (manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.), 1.36 g of N- (2-hydroxyethyl) acrylamide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and trimethylolpropane trimethacrylate (Sartomer) The monomer composition consisting of 4.09 g was dissolved in a mixed solution of 21.97 g of 4-methyl-2-pentanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 2.95 g of diethyl carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
  • the same operations as in steps (1) and (2) of Example 1 were performed to obtain a porous particle dispersion.
  • protein A was immobilized by the same operation as in step (3) of Example 1 to produce protein A-immobilized particles.
  • the produced protein A fixed particles (PA-1) are dispersed in 40 mL of 1.0 M 1-thioglycerol (manufactured by Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) / 0.1 M sodium sulfate (pH 8.3), and the mixture is dispersed at 25 ° C. for 17 hours.
  • the unreacted epoxy group was opened by shaking and stirring.
  • the obtained protein A-fixed particles (PA-2) in which the unreacted epoxy group was opened were mixed with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.6), 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution, 0.1 M citric acid. Washing with sodium acid buffer (pH 3.2) gave a packing material 3 for affinity chromatography.
  • Example 4 Protein A fixed particles (PA-2) obtained by the same operation as in Example 3 and having an unreacted epoxy group ring-opened were dispersed in pure water so that the concentration of the particles was 10% by mass. To this, 0.48 g of 30% aqueous hydrogen peroxide was added, and the mixture was shaken and stirred at 25 ° C. for 24 hours. Furthermore, it was washed with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.6), 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution, and 0.1 M sodium citrate buffer (pH 3.2) to obtain a packing material 4 for affinity chromatography.
  • 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.6
  • 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution 0.1 M sodium citrate buffer
  • Example 5 Protein A fixed particles (PA-1) produced in the same manner as in Example 3 were dispersed in 40 mL of 1.0 M 1-thioglycerol / 0.1 M sodium sulfate (pH 8.3) and treated at 25 ° C. for 40 hours. The unreacted epoxy group was opened by shaking and stirring. Further, the obtained protein A-fixed particles in which the unreacted epoxy group was opened were mixed with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.6), 0.1 M sodium hydroxide aqueous solution, 0.1 M sodium citrate buffer (pH 3). . 2) to obtain a packing material 5 for affinity chromatography.
  • Example 6 In step (1) of Example 1, it consists of 5.26 g of glycidyl methacrylate (manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.), 2.63 g of glycerol monomethacrylate (manufactured by NOF Corporation) and 2.63 g of divinylbenzene (manufactured by Nippon Steel Chemical Co., Ltd.). The same procedure as in steps (1) and (2) of Example 1 was conducted, except that the monomer composition was dissolved in 25.00 g of 2-octanone (Toyo Gosei Co., Ltd.) to prepare a monomer solution. And a porous particle dispersion was obtained.
  • protein A was immobilized by the same operation as in step (3) of Example 1 to produce protein A-immobilized particles.
  • the produced protein A fixed particles are dispersed in 40 mL of 1.0 M sodium 2-mercaptopropanesulfonate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) / 0.1 M sodium sulfate (pH 8.3) and shaken at 25 ° C. for 17 hours.
  • the unreacted epoxy group was opened by stirring.
  • the obtained protein A-fixed particles in which the unreacted epoxy group was opened were mixed with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.6), 0.1 M sodium hydroxide aqueous solution, 0.1 M sodium citrate buffer (pH 3). . 2) to obtain a packing material 6 for affinity chromatography.
  • Example 7 In the step (1) of Example 1, a monomer composition consisting of 4.77 g of 4-hydroxybutyl acrylate glycidyl ether (Nippon Kasei Co., Ltd.) and 8.86 g of glycerin dimethacrylate (Shin Nakamura Chemical Co., Ltd.) Except for preparing a monomer solution by dissolving 21.52 g of acetophenone (manufactured by Inoue Fragrance Co., Ltd.) and 7.35 g of 2-octanone (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.), step (1) of Example 1 and The same operation as in (2) was performed to obtain a porous particle dispersion. Thereafter, protein A was immobilized, unreacted epoxy groups were opened, and washed in the same manner as in Example 3 to obtain a packing material 7 for affinity chromatography.
  • Example 8 In step (1) of Example 1, 3.43 g of vinyl benzyl glycidyl ether (manufactured by Toray Fine Chemical Co., Ltd.), 4.11 g of glycerol monomethacrylate (manufactured by NOF Corporation) and ethylene glycol dimethacrylate (manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) The monomer composition consisting of 6.17 g was dissolved in a mixed solution of 21.52 g of acetophenone (Inoue Fragrance Co., Ltd.) and 7.35 g of 2-octanone (Toyo Gosei Co., Ltd.) to prepare a monomer solution.
  • acetophenone Inoue Fragrance Co., Ltd.
  • 2-octanone Toyo Gosei Co., Ltd.
  • Example 3 (Comparative Example 1) In Example 3, a filler 9 for affinity chromatography was obtained in the same manner as in Example 3 except that the unreacted epoxy group was not opened after protein A was immobilized.
  • Example 2 In the step (1) of Example 1, 1.41 g of 3,4-epoxycyclohexylmethyl methacrylate (manufactured by Daicel), 8.45 g of glycerol monomethacrylate (manufactured by NOF Corporation) and trimethylolpropane trimethacrylate (manufactured by Sartomer) A monomer composition consisting of 4.23 g was dissolved in a mixed solution of 21.50 g of acetophenone (manufactured by Inoue Fragrance Co., Ltd.) and 7.34 g of 2-octanone (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.) to prepare a monomer solution.
  • acetophenone manufactured by Inoue Fragrance Co., Ltd.
  • 2-octanone manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.
  • Comparative Example 3 In Comparative Example 2, the shaking stirring time after dispersing Protein A fixed particles in 40 mL of 1.0 M 1-thioglycerol (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) / 0.1 M sodium sulfate (pH 8.3) was 4 hours.
  • the filler 11 for affinity chromatography was obtained in the same manner as in Comparative Example 2 except that the time was changed to 17 hours.
  • step (1) of Example 1 from 1.39 g of glycidyl methacrylate (manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.), 2.79 g of glycerol monomethacrylate (manufactured by NOF Corporation) and 9.76 g of glycerin dimethacrylate (manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) Except that the monomer composition was dissolved in a mixed solution of 21.50 g of acetophenone (manufactured by Inoue Fragrance Co., Ltd.) and 7.34 g of 2-octanone (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.) to prepare a monomer solution.
  • glycidyl methacrylate manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
  • glycerol monomethacrylate manufactured by NOF Corporation
  • glycerin dimethacrylate manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.
  • Test Example 1 Quantification of epoxy group content
  • the epoxy group content of the porous particles before ligand binding obtained in Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 4 was quantified. That is, after adding an excess of hydrochloric acid to porous particles suspended in an aqueous calcium chloride solution to cause addition reaction of hydrochloric acid, the epoxy group is opened, and the remaining hydrochloric acid is neutralized with an excessive amount of aqueous sodium hydroxide solution. The phenolphthalein solution was added, and the remaining sodium hydroxide was quantified by back titrating with hydrochloric acid. The end point of the titration was when the red color of phenolphthalein disappeared. The results are shown in Table 1.
  • Test Example 2 Evaluation of residual epoxy group amount (measurement of pH increase)
  • the packing material for affinity chromatography obtained in Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 4 was packed in a GE Healthcare Tricorn 5/50 column at a packing height of about 5 cm, and the column was manufactured by GE Healthcare.
  • a pH 7.5 20 mM sodium phosphate buffer solution containing 2 M NaCl was passed at a flow rate of 0.2 mL / min while monitoring pH by connecting to AKTAprime plus, and when the pH in the column reached equilibrium The pH value was recorded as the initial pH. Further, the column replaced with the buffer solution was removed from AKTAprime plus and allowed to stand in a thermostat at 40 ° C. for 7 days.
  • the column was again connected to AKTA prime plus and the buffer was passed at a flow rate of 0.2 mL / min while monitoring the pH, and the pH value when the pH reached the highest was recorded as the load pH. .
  • the difference between the initial pH and the load pH was determined as the pH increase range.
  • the initial pH and load pH were measured in a constant temperature room at 23 ⁇ 1 ° C. The results are shown in Table 1.
  • Test Example 3 Quantification of protein A binding amount
  • the amount of protein A, which is a ligand bound to the packing material for affinity chromatography obtained in Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 4 was quantified using a bicinchoninic acid (BCA) reagent. Specifically, 1 mg of the filler in terms of solid content was collected in a test tube, and this was quantified with a BCA Protein Assay Kit manufactured by ThermoFisher Scientific. The reaction was performed by inversion mixing at 37 ° C. for 30 minutes. A calibration curve was prepared using the same protein A bound to the carrier. The results are shown in Table 1.
  • BCA bicinchoninic acid
  • Test Example 4 DBC measurement and storage stability evaluation
  • DBC of each of the fillers of Examples and Comparative Examples was measured against a protein (human IgG antibody, HEG-1000 manufactured by Equitech Bio) at a linear flow rate of 300 cm / hr using GE Healthcare's AKTAprime plus.
  • a column with a capacity of 4 mL (5 mm ⁇ ⁇ 200 mm length), and a protein with 20 mM sodium phosphate / 150 mM sodium chloride aqueous solution (pH 7.5) dissolved in 5 mg / mL, and a 10% break at the elution tip.
  • DBC was determined from the amount of protein captured during the through and the column packing volume. The results are shown in Table 1.
  • Test Example 5 Quality of HCP
  • Columns (Tricorn 10/50 column manufactured by GE Healthcare) were filled with each of the fillers of Examples and Comparative Examples at a packing height of about 5 cm to prepare a column.
  • Each of the obtained columns was connected to GE Healthcare's AKTA Prime Plus, and 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) was passed through at 5 column volumes (5 times the column volume) at a flow rate of 1 mL / min. Equilibrated.
  • the CHO cell culture supernatant containing the monoclonal antibody Trastuzumab was passed through the column at a flow rate of 1 mL / min with a loading amount of about 23 mg antibody / mL carrier.
  • 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 20 mM sodium phosphate / 1 M sodium chloride buffer (pH 7.5), and 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) were each 5 column volumes, flow rate 1 mL / min. Were sequentially passed through the column. Thereafter, 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.2) was passed through the column at a flow rate of 1 mL / min to elute the monoclonal antibody captured in the column. An elution fraction of 280> 100 mAu was collected. And the antibody concentration (mg / mL) contained in the collect
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Abstract

　不純物の非特異吸着が抑制され、かつ、長期保管による動的結合容量の低下が抑制された保存安定性に優れるアフィニティークロマトグラフィー用担体を提供すること。　（Ｍ－１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および　（Ｍ－２）ポリビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し０．５～８０質量部を含む共重合体を含有する固相担体と、　エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基と、　前記固相担体に結合したリガンドと、を含むアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、　前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、４０℃で７日間静置したときのカラム内のｐＨ上昇幅が２以下であることを特徴とする、　アフィニティークロマトグラフィー用担体。

Description

アフィニティークロマトグラフィー用担体
　本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用担体に関する。特に、抗体などのタンパク質の精製に有用なアフィニティークロマトグラフィー用担体に関する。
　アフィニティークロマトグラフィーは、モノクローナル抗体を含めたタンパク質の研究、開発および製造において重要な役割を担っている。アフィニティークロマトグラフィー用担体は一般的に、標的物質と選択的に結合するリガンドを有する固相担体を含む。アフィニティークロマトグラフィーは、固相担体上のリガンドが標的物質に対して高い選択性を有するため、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーに比べて、優れた収率で且つ高速で経済的な精製が可能となる。
　一般に、タンパク精製用のアフィニティークロマトグラフィーに求められる性能としては、（１）標的タンパク質以外の不純物を非特異吸着しないこと、（２）長期間の保管により結合容量が低下せず、保存安定性に優れること、（３）カラム操作する上で充分な機械的強度があること、などが挙げられる。
　こうしたなか、アフィニティークロマトグラフィー用担体の固相担体として、アガロース粒子（特許文献１、２）、スチレン－ジビニルベンゼンの共重合体からなる多孔質粒子（特許文献３、４）、メタクリレート系ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子（特許文献５、６）が提案されている。
特表２００８－５２３１４０号公報 特表２００９－５２２５８０号公報 特開平０８－２７８２９９号公報 特表平１０－５０１１７３号公報 国際公開第２０１１／１２５６７４号公報 特開２０１２－１４１２１２号公報
　しかしながら、アガロース粒子は、一般に弾性率が低いため、高速で媒体を流したときにカラムの圧力が高くなるという欠点を有している。また、アガロース粒子は、一般に、天然の海草から長く複雑な工程を経て製造されるために、一定の品質のものが得られにくい。
　また、スチレン－ジビニルベンゼンのような芳香族ビニル単量体の共重合体からなる多孔質粒子は、一般に耐アルカリ性に優れるが、親水性が低いために、リガンドの活性が低く、標的物質に対する動的結合容量が低いという欠点を有する。
　さらに、メタクリレート系ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子は、高い親水性と機械的強度とを有しているものの、不純物の除去能については更なる改善が望まれていた。
　本発明が解決しようとする課題は、不純物の非特異吸着が抑制され、かつ、長期保管による動的結合容量の低下が抑制された保存安定性に優れるアフィニティークロマトグラフィー用担体を提供することにある。
　そこで、本発明者は、鋭意検討した結果、エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位とポリビニル単量体に由来する構造単位をそれぞれ特定量含む共重合体を含有する固相担体と、前記固相担体に結合するリガンドと、開環エポキシ基とを有する特定のアフィニティークロマトグラフィー用担体が、標的物質の動的結合容量が高く、しかも不純物の除去能および保存安定性に優れること見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、＜１＞（Ｍ－１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および
　（Ｍ－２）ポリビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し０．５～８０質量部を含む共重合体を含有する固相担体と、
　エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基と、
　前記固相担体に結合したリガンドと、を含むアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、
　前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、４０℃で７日間静置したときのカラム内のｐＨ上昇幅が２以下であることを特徴とする、
　アフィニティークロマトグラフィー用担体を提供するものである。
　また、本発明は、＜２＞上記＜１＞のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填された、アフィニティークロマトグラフィーカラムを提供するものである。
　さらに、本発明は、＜３＞上記＜１＞のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とする、標的物質の精製方法を提供するものである。
　本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、表面上のエポキシ基残存量が低減されており、しかも、開環エポキシ基によって高い親水性を備える。
　したがって、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体によれば、非特異的に吸着する不純物、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ＝Ｈｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）やＤＮＡの除去能を改善することが可能となる。
　また、リガンドの活性を高く保つことができるため、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を、例えばイムノグロブリンの精製に用いた後で、更に長期間繰り返し使用してもイムノグロブリン等の動的結合容量が低下しにくく、低コストでイムノグロブリン精製が可能となる。
　以下、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体について、詳細に説明する。
〔アフィニティークロマトグラフィー用担体〕
　＜固相担体の構成＞
　本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を構成する固相担体は、
　（Ｍ－１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および
　（Ｍ－２）ポリビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し０．５～８０質量部を含む共重合体を含有し、
　且つ、エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を含むものである。固相担体の形態は、モノリス、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましい。また、固相担体は、表面積の向上の観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。なお、固相担体は、上記共重合体以外に、天然高分子や合成高分子などを含んでいてもよい。
　（（Ｍ－１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位）
　エポキシ基含有モノビニル単量体は、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）と、１個以上のエポキシ基とを有する単量体である。エポキシ基含有ビニル単量体は、固相担体に適切な量のエポキシ基を導入し、適切なリガンド結合量や、開環エポキシ基量を得るために利用可能である。
　エポキシ基含有モノビニル単量体としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４－エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、α－（メタ）アクリル－ω－グリシジルポリエチレングリコール等のヒドロキシ基非含有（メタ）アクリル酸エステル類；グリセリンモノ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル等のヒドロキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類；ビニルベンジルグリシジルエーテル等の芳香族モノビニル化合物の他、アリルグリシジルエーテル、３，４－エポキシ－１－ブテン、３，４－エポキシ－３－メチル－１－ブテン等が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　これらの中でも、エポキシ基含有モノビニル単量体としては、防汚性や保存安定性等の観点から、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物が好ましく、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類がより好ましく、グリシジル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルがさらに好ましく、グリシジル（メタ）アクリレートが特に好ましい。なお、固相担体を順相懸濁重合により粒子状にする場合には、エポキシ基含有モノビニル単量体としては、開環エポキシ基量のコントロールが容易となることから水不溶性のものが好ましい。ここで水不溶性とは水１００ｍＬに対して室温（２５℃）で１０ｇ以上は溶解しないことをいう。なお、エポキシ基含有モノビニル単量体は市販品を用いてもよく、公知の方法に従い合成して使用してもよい。
　エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下である。当該含有量が２０質量部以下であると、開環エポキシ基の量が減ってリガンド結合後のアフィニティークロマトグラフィー用担体の親水性が低くなり、不純物の除去能が低くなる。一方、９９．５質量部を超えると、機械的強度が低くなり、アフィニティークロマトグラフィー用担体としての取り扱いに耐えられなくなる。
　エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは２５質量部以上、より好ましくは３０質量部以上、さらに好ましくは４０質量部以上、特に好ましくは５０質量部以上であり、また、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは９５質量部以下、より好ましくは９０質量部以下、さらに好ましくは８５質量部以下、特に好ましくは８０質量部以下である。
　（（Ｍ－２）ポリビニル単量体に由来する構造単位）
　ポリビニル単量体は、１分子中に、２個以上の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有するビニル単量体である。以下、当該ポリビニル単量体を、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体と、ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体とに分けて説明する。なお、ポリビニル単量体は、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
　ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼンなどの芳香族ポリビニル化合物；ブタジエン、イソシアヌル酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリルなどのアリル化合物などが挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体としては、（メタ）アクリル酸エステル類、芳香族ポリビニル化合物が好ましい。
　また、上記ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体に含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２～５個が好ましく、２または３個がより好ましい。
　ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体としては、多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類、各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリル酸エステル類、多価アルコールの（メタ）アクリルアミド類が好ましい。
　多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類としては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
　各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリル酸エステル類としては、例えば、グルコースジ（メタ）アクリレート、グルコーストリ（メタ）アクリレート、グルコーステトラ（メタ）アクリレート、マンニトールジ（メタ）アクリレート、マンニトールトリ（メタ）アクリレート、マンニトールテトラ（メタ）アクリレート、マンニトールペンタ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
　さらに、ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体としては、上記例示したものの他に、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミンなどのアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物なども挙げることができる。
　また、上記ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体に含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２～５個が好ましく、２または３個がより好ましい。
　これらの中でも、ポリビニル単量体としては、比較的少量の使用で良好な多孔性と機械的強度が得られ、エポキシ基含有モノビニル単量体の使用量を制限することが少ないなどの観点から、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体が好ましい。ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体の中でも、防汚性や保存安定性等の観点から、重合性ビニル基の個数が３個の（メタ）アクリル酸エステル類、重合性ビニル基の個数が２または３個の芳香族ポリビニル化合物が特に好ましい。特に好適な具体例としては、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼンが挙げられる。
　ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、全構造単位に対し０．５～８０質量部である。ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量が０．５質量部未満であると、固相担体の機械的強度が低くなり、アフィニティークロマトグラフィー用担体としての取り扱いに耐えられなくなる。また、８０質量部を超えると、親水性が低下して、ＨＣＰの低減効果が得られず、また、リガンドの活性が低下する。
　ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは５質量部以上、より好ましくは１０質量部以上、さらに好ましくは１５質量部以上、さらに好ましくは２０質量部以上、特に好ましくは２５質量部以上であり、また、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは７０質量部以下、より好ましくは６５質量部以下、さらに好ましくは６０質量部以下、さらに好ましくは５０質量部以下、特に好ましくは４０質量部以下である。
　（（Ｍ－３）エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位）
　本発明で用いる固相担体に含まれる共重合体としては、上記構造単位（Ｍ－１）及び構造単位（Ｍ－２）に加えて、（Ｍ－３）エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し４０質量部以下を更に含むものが好ましい。
　エポキシ基を含有しないモノビニル単量体は、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有し、エポキシ基を含有しないビニル単量体である。以下、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体単量体を、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニル単量体と、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体とに分けて説明する。
　エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニル単量体としては、精製時の不純物の非特異吸着を防ぐ点から、非イオン性単量体が好ましい。このような非イオン性単量体としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミド類が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。なお、非イオン性単量体として、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレートのような疎水性（メタ）アクリレート類；スチレン、α－メチルスチレン、エチルビニルベンゼンのような芳香族ビニル化合物を用いてもよいが、精製時の不純物の非特異吸着を抑える観点から、このような単量体ではなく、上記で例示した単量体のうち、炭素数５以下のアルキル基またはアルコキシアルキル基を有するような（メタ）アクリル酸アルキルエステル類や、上記の（メタ）アクリルアミド類が好ましい。
　エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体としては、例えば、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミド類などが挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
　また、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体に含まれるヒドロキシ基の個数としては、１分子中に、１～５個が好ましく、１～３個がより好ましい。
　これらの中でも、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体としては、防汚性等の観点から、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体が好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドがより好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドがさらに好ましく、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドが特に好ましい。
　エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位の含有量としては、全構造単位に対し４０質量部以下が好ましい。当該含有量を４０質量部以下とすることにより、ヒドロキシ基含有物ビニル単量体の場合には多孔質粒子の親水性が向上し、凝集が抑制され、リガンドの活性が高くなり標的物質の動的結合量が改善される。また、機械的強度も改善される。上記構造単位の含有量としては、全構造単位に対し、より好ましくは３５質量部以下、さらに好ましくは３０質量部以下、さらに好ましくは２５質量部以下、特に好ましくは２０質量部以下である。また、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は０質量部でもよい。当該構造単位を含有する場合は、全構造単位に対し５質量部以上が好ましい。
　上記構造単位（Ｍ－１）～（Ｍ－３）の含有量の好ましい組み合わせは、構造単位（Ｍ－１）：全構造単位に対し４０～９０質量部、構造単位（Ｍ－２）：全構造単位に対し１０～６０質量部、構造単位（Ｍ－３）：全構造単位に対し０～２５質量部であり、より好ましい組み合わせは、構造単位（Ｍ－１）：全構造単位に対し４０～８０質量部、構造単位（Ｍ－２）：全構造単位に対し１５～６０質量部、構造単位（Ｍ－３）：全構造単位に対し０～２５質量部であり、特に好ましい組み合わせは、構造単位（Ｍ－１）：全構造単位に対し４０～８０質量部、構造単位（Ｍ－２）：全構造単位に対し２０～６０質量部、構造単位（Ｍ－３）：全構造単位に対し０～２０質量部である。
　（エポキシ基含有量）
　リガンド結合前の固相担体に含まれるエポキシ基は、リガンドを結合するための官能基であり、また、さらに開環後にアフィニティークロマトグラフィー用担体としての親水性向上の元となる官能基である。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量は、好ましくは１～６ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは２～５ｍｍｏｌ／ｇであり、特に好ましくは２．５～４ｍｍｏｌ／ｇである。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量が１ｍｍｏｌ／ｇ以上であると、リガンド結合後に得られる開環エポキシ基の量が適切な量となり、標的物質以外の不純物の除去能が向上する。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量が６ｍｍｏｌ／ｇ以下であると、リガンド結合後のエポキシ基の残留量が減少し、アフィニティークロマトグラフィー用担体として保存した場合のリガンドの活性の低下が抑制され、繰り返し使用した際の標的物質の動的結合容量の低下も抑制される。
　リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量は、エポキシ基含有モノビニル単量体の量、重合温度、重合時間、重合液のｐＨ、さらには、重合後の開環処理などによって、調整することが出来る。
　＜固相担体の製造＞
　固相担体の製造法を、固相担体が多孔質粒子である場合を例に挙げて説明する。
　多孔質粒子は、公知のシード重合、懸濁重合などにより製造することができる。シード重合法として、特公昭５７－２４３６９号公報記載の二段膨潤重合法が挙げられる。重合に際しては、上記単量体に加えて、重合開始剤、多孔化剤、水系媒体、分散安定剤、界面活性剤、重合調整剤、重合禁止剤、シード粒子などを必要に応じて使用する。
　多孔質粒子の製造における好ましい重合法は、単量体混合物と、多孔化剤とを必須成分とする水系混合物の懸濁重合法である。
　また、懸濁重合の具体的な方法としては、例えば、単量体混合物および多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合させる方法や、単量体混合物および多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、所定温度まで加熱した水系媒体中に添加して重合させる方法、単量体混合物および多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）を、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
　重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス－２，４－ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ－ｔｅｒｔ－ブチル、過酸化ベンゾイル－ジメチルアニリン等が挙げられる。重合開始剤の合計使用量は、通常、単量体総量１００質量部に対して０．０１～１０質量部程度である。
　上記多孔化剤は、多孔質粒子を製造するために使用され、油滴内の重合において、単量体と共に存在し、非重合成分として孔を形成する役割を有する。多孔化剤は、多孔質表面において容易に除去可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、各種の有機溶剤や単量体混合物に可溶な線状重合物等が挙げられ、これらを併用してもよい。
　上記多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、ヘキサノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチル－１－ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２－フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２－オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸－３－メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
　上記多孔化剤の合計使用量は、通常、単量体総量１００質量部に対して４０～４００質量部程度である。
　上記水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。水系媒体の合計使用量は、単量体総量１００質量部に対して、通常、２００～７０００質量部程度である。
　また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム等の分散安定剤を使用してもよい。
　また、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等のアニオン性界面活性剤をはじめとする各種界面活性剤を用いてもよい。
　また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、ｔｅｒｔ－ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
　また、ドデシルメルカプタン等の重合調製剤を用いてもよい。
　また、重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよいが、例えば、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、５０～１００℃が好ましく、６０～９０℃がより好ましい。
　また、重合時間は通常５分～４８時間、好ましくは１０分～２４時間である。
　重合完結後、得られた多孔質粒子に付着した水溶性高分子などを除くため、水および／または熱水を用いて洗浄することが好ましい。
　また、シード粒子および／または多孔化剤の良溶媒を用いて洗浄することが、後述のリガンドの結合が容易となる点から、好ましい。洗浄溶媒としては、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールなどが好適に使用できる。また、必要に応じて、洗浄の前後に、超音波分散機などを用いて、多孔質粒子を分散してもよい。さらに、デカンテーション、ろ過、篩分級などの方法により、小粒子や粗大粒子を除去することが、圧力特性の向上や標的物質などの動的結合容量の向上の点から好ましい。
　＜アフィニティークロマトグラフィー用担体の上記以外の構成＞
　（開環エポキシ基）
　本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する。この開環エポキシ基は、上記共重合体を含有する固相担体にリガンドを結合した後に、該共重合体に含まれるエポキシ基、すなわち、リガンドと結合したエポキシ基以外の残余のエポキシ基を開環させて得ることができる。エポキシ基には上記の共重合体に含まれるものの他、エピクロロヒドリンやジグリシジルエーテル化合物等により、後から導入したエポキシ基も含まれ、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体の製造においてどの段階で導入されたかは問わない。
　そして、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、固相担体の表面のエポキシ基がほとんど開環しており、アフィニティークロマトグラフィー用担体を高濃度の塩化物イオンと接触させ、残余のエポキシ基を開環させたときに放出される水酸化物イオンの量が著しく少ない。
　そのため、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、４０℃で７日間静置したときのカラム内のｐＨ上昇幅が２以下となるものである。斯かる構成により、不純物の除去能と保存安定性に優れたものとなる。上記ｐＨ上昇幅は、好ましくは１．９以下であり、不純物の除去能を更に改善させる場合には、１．７以下がより好ましい。また、ｐＨ上昇幅の下限値は特に限定されないが、例えば０．０１である。
　上記ｐＨ上昇幅は、具体的には、以下の式から求めることができるものであり、より詳細には実施例に記載の方法で測定できる。また、本発明において、ｐＨ上昇幅の測定は新しいアフィニティークロマトグラフィー用担体に対して行う。新しいアフィニティークロマトグラフィー用担体とは、以前に使用されていない状態の担体を意味し、例えば抗体精製に使用するのであれば、抗体精製に使用する前の状態のものをいう。
　（ｐＨ上昇幅）＝（負荷ｐＨ）－（初期ｐＨ）
　上記式において「初期ｐＨ」は、２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液をカラムに通液し、カラム内のｐＨが平衡に達したときのｐＨの値を意味する。
　上記式において「負荷ｐＨ」は、初期ｐＨを測定してから４０℃の恒温器内で７日間静置した後、２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液をカラムに再度通液し、ｐＨが最も高くなったときのｐＨの値を意味する。
　また、エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基としては、不純物の非特異吸着を防止すると共に、保存中にリガンドの活性が低下するのを防止する観点から、下記式（１）で表される基が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［式（１）中、
　Ｒ1は、炭素数１～６の２価の有機基を示し、
　Ｒ2は、水素原子または炭素数１～１０の１価の有機基を示し、
　Ｘは、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、スルホニル基（＞Ｓ（＝Ｏ）2）、イミノ基（＞ＮＨ）、またはオキシ基（＞Ｏ）を示し、
　＊は、結合位置を示す。］
　Ｒ1は、炭素数１～６の２価の有機基を示す。当該有機基の炭素数としては、好ましくは１～４であり、より好ましくは１または２である。
　また、上記２価の有機基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、斯かる２価の有機基としては、２価の炭化水素基、２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、イミノ基及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられ、２価の炭化水素基が好ましい。
　上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
　アルカンジイル基の具体例としては、メタン－１，１－ジイル基、エタン－１，１－ジイル基、エタン－１，２－ジイル基、プロパン－１，１－ジイル基、プロパン－１，２－ジイル基、プロパン－１，３－ジイル基、プロパン－２，２－ジイル基、ブタン－１，４－ジイル基、ペンタン－１，５－ジイル基、ヘキサン－１，６－ジイル基等が挙げられる。
　Ｒ2は、水素原子または炭素数１～１０の１価の有機基を示すが、炭素数１～１０の１価の有機基が好ましい。このような有機基としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量、防汚性の観点から、下記式（２）または（３）で表される有機基が好ましく、式（２）で表される有機基がより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式（２）中、
　Ｒ3は、炭素数１～１０の２価または３価の有機基を示し、
　ｎは、１または２を示し、
　＊＊は、式（１）中のＸとの結合位置を示す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［式（３）中、
　Ｒ4は、炭素数１～１０の２価または３価の有機基を示し、
　Ｙは、酸性基またはアミノ基を示し、
　ｍは、１または２を示し、
　＊＊は、式（１）中のＸとの結合位置を示す。］
　式（２）中のＲ3、式（３）中のＲ4で示される２価または３価の有機基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量等の観点から、１～８が好ましく、１～６がより好ましく、２～４が更に好ましい。
　また、上記２価の有機基としては、２価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量等の観点から、１～８が好ましく、１～６がより好ましく、２～４が更に好ましい。
　上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン－１，１－ジイル基、エタン－１，１－ジイル基、エタン－１，２－ジイル基、プロパン－１，１－ジイル基、プロパン－１，２－ジイル基、プロパン－１，３－ジイル基、プロパン－２，２－ジイル基等が挙げられる。
　また、上記３価の有機基としては、３価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。斯かるアルカントリイル基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１～８が好ましく、１～６がより好ましく、２～４が更に好ましい。
　上記アルカントリイル基の具体例としては、メタン－１，１，１－トリイル基、エタン－１，１，２－トリイル基、プロパン－１，２，３－トリイル基、プロパン－１，２，２－トリイル基等が挙げられる。
　式（２）中、ｎは、１または２を示すが、２が好ましい。
　式（３）中、Ｙは、酸性基またはアミノ基を示すが、酸性基が好ましい。酸性基としては、カルボキシ基、リン酸基、スルホ基、これらの塩などが挙げられる。なお、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；有機アンモニウム塩等が挙げられる。
　式（３）中、ｍは、１または２を示すが、１が好ましい。
　Ｘは、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、スルホニル基（＞Ｓ（＝Ｏ）2）、イミノ基（＞ＮＨ）、またはオキシ基（＞Ｏ）を示すが、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、オキシ基（＞Ｏ）が好ましく、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）がより好ましく、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）が特に好ましい。
　固相担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中、酸またはアルカリ存在下で攪拌する方法を挙げることができる。撹拌は、加熱して行ってもよく、室温で行ってもよい。
　また、メルカプトエタノール、チオグリセロール、メルカプト酢酸やその塩、メルカプトコハク酸やその塩、メルカプトエタンスルホン酸やその塩、メルカプトプロパンスルホン酸やその塩などの親水性基を有するメルカプト化合物；モノエタノールアミン、グルコサミンなどの親水性基を有するアミン化合物；ジエチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類をエポキシ基を開環させるブロッキング剤として使用してもよい。なお、ここでいう親水性基としては、ヒドロキシ基；アミノ基；カルボキシ基、リン酸基、スルホ基、これらの塩等の酸性基などが挙げられる。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；有機アンモニウム塩等が挙げられる。
　上記酸やアルカリ、ブロッキング剤の使用量は、残余のエポキシ基１モルに対し、通常０．１～４０モル当量である。残余のエポキシ基はリガンドと多点結合して、保存中にリガンドの活性を低下させるため、２～４０モル当量の過剰量にてブロッキングすることが好ましい。
　また、開環反応の反応時間は特に限定されないが、通常０．５～７２時間程度であり、好ましくは１～４８時間である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２～１００℃程度である。
　また、必要に応じて塩基性触媒存在下でブロッキングを行ってもよい。斯かる塩基性触媒としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミンなどが挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
　好ましい開環エポキシ基は、固相担体に含まれるエポキシ基をメルカプト化合物および／または多価アルコール類により開環させて得られる開環エポキシ基であり、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が少なくなる上に、動的結合量が高くなるといった利点を有する。
　また、メルカプト化合物をブロッキング剤として使用した場合、酸化剤を用いてチオ基をスルフィニル基に酸化し、さらに親水性を向上させることができる。
　上記酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
　また、酸化剤の合計使用量は、チオ基１モルに対し、通常０．１～１０モル当量程度であるが、好ましくは０．５～３モル当量である。
　また、上記酸化反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。斯かる溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
　上記溶媒の合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常１～５０質量倍程度であるが、好ましくは５～１５質量倍である。
　また、上記酸化反応の反応時間は特に限定されないが、通常１～７２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常１～９０℃程度である。
　（リガンド）
　本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、固相担体に結合したリガンドを含むものである。
　リガンドは、標的物質に対して適度なアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２－アミノフェニル硼素酸、４－アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
　上記リガンドの中でも、イムノグロブリンの分離または精製に好適なリガンドとしては、イムノグロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
　イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも１種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインＡ、プロテインＧ、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインＡ、その機能性変異体である。
　なお、本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を表し、「イムノグロブリン結合性タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質を表す。「イムノグロブリン結合」とはイムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域、特にＦｃフラグメントに結合することを表す。本発明において、アフィニティークロマトグラフィーに関連して使用される用語「リガンド」とは、アフィニティークロマトグラフィーの標的物質と結合する分子のことを表す。
　上記リガンドと固相担体の結合方法としては、固相担体に含まれるエポキシ基をそのままリガンドとの結合部位として利用することが、プロセスとして簡便であり、好ましい。その他に、固相担体に含まれるエポキシ基を開環して生成するアルコール性水酸基をトシル基などで活性化してから、リガンドを結合する方法や、固相担体に含まれるエポキシ基または、当該エポキシ基の開環により生成する基からさらにリンカーを伸ばしてから、当該リンカーを介して固相担体にリガンドを結合してもよい。リンカーとしては、ジグリシジルオキシアルカン、ポリアルキレングリコールジグリシジルエーテルなどのジグリシジルエーテル化合物が好ましい。
　リガンドの結合条件は、リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量、リガンドの種類により異なるが、当業者にとっての公知の方法を採用することができる。リガンドがタンパク質である場合は、タンパク質のＮ末端のアミノ基、タンパク質に含まれるリジン、システインがエポキシとの反応点になりうる。タンパク質を結合する場合、例えば、タンパク質の等電点に近いバッファー類の水溶液を用い、必要により塩化ナトリウムや硫酸ナトリウムなどの塩を添加し、タンパク質と固相担体を混合しながら、０～４０℃で１～４８時間反応させて、リガンドであるタンパク質を結合することができる。
　リガンドの結合量は、リガンドの種類、標的物質の種類などによって、適宜調節されるが、プロテインＡのようなイムノグロブリン結合性タンパク質をリガンドとして結合する場合、固相担体１ｇ当たり、好ましくは１０～２００ｍｇ、より好ましくは２５～１００ｍｇである。プロテインＡのようなイムノグロブリン結合性タンパク質をリガンドとして結合する場合、固相担体１ｇ当たりのリガンドの結合量が１０ｍｇ以上であると動的結合容量に優れたものとなり、２００ｍｇ以下であると、結合した抗体の溶出のために使用する溶出液の量が特に適切な量となる。
　（粒径、比表面積）
　本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を構成する固相担体が、多孔質粒子である場合、上記多孔質粒子の粒径は、通常、３５～１００μｍであり、好ましくは４０～８５μｍである。粒径が、３５μｍ以上であると、圧力特性に優れる。１００μｍ以下であると、動的結合容量が高い充填剤が得られる。
　多孔質粒子の粒径は、重合する際の条件で調整することができる。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製ＬＳ１３　３２０）により得られる体積平均粒子径を意味する。
　本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を構成する固相担体が、多孔質粒子である場合、上記多孔質粒子の比表面積は、孔径１０～５０００ｎｍの範囲に相当するポアを測定したときに、ポアサイズ１０ｎｍ～５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。比表面積が上記の範囲内であると、標的物質の動的結合容量が高いアフィニティークロマトグラフィー用担体が得られる。なお、本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメータ（株式会社島津製作所製オートポアIV９５２０）により得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥質量で除した値である。
　本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、不純物除去能が高く、しかも保存安定性に優れ、抗体などのタンパク質の精製に特に有用である。
〔アフィニティークロマトグラフィーカラム〕
　本発明のアフィニティークロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填されたものである。
〔標的物質の精製方法〕
　本発明の標的物質の精製方法は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とするものである。
　精製は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いる以外は常法と同様であるが、例えば、標的物質を含む組成物を準備する準備工程と、本発明のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する通液工程と、該通液工程により担体に吸着された標的物質を溶出させる溶出工程を含む方法が挙げられる。
　本発明の精製方法は、タンパク質の精製に適し、イムノグロブリンの精製に特に適する。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　（実施例１）
　（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製　ＰＶＡ－２１７）３．５８ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
　一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１２．００ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）１．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２４．４３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
　次いで、前記水溶液Ｓを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２'－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、８６℃に温度を維持した。
　（２）その後、８６℃に温度を維持し、３時間撹拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子分散液を得た。
　（３）改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製　ｒＳＰＡ）０．１５ｇを、１．２Ｍ　硫酸ナトリウム／０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得、このプロテインＡ分散液に実施例１の工程（２）で得られた多孔質粒子分散液（粒子乾燥質量換算で１ｇ相当）を添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
　（４）生成したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）で洗浄した後、１．０Ｍ　硫酸水溶液（和光純薬工業社製）４０ｍＬに分散させ、４０℃で４時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。
　その後、０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤１を得た。
　（実施例２）
　実施例１の工程（１）において、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）９．２０ｇ、１－エチル－４－ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．５８ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）１．７３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）１９．５９ｇ及びアニソール（和光純薬工業社製）６．０５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
　その後、実施例１の工程（３）と同様の操作でプロテインＡを固定し、プロテインＡ固定粒子を生成させた。
　次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ　２－メルカプトエタノール（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ　硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤２を得た。
　（実施例３）
　実施例１の工程（１）において、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．１８ｇ、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アクリルアミド（東京化成工業社製）１．３６ｇ及びトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．０９ｇからなる単量体組成物を、４－メチル－２－ペンタノール（和光純薬工業製）２１．９７ｇ及び炭酸ジエチル（和光純薬工業製）２．９５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
　その後、実施例１の工程（３）と同様の操作でプロテインＡを固定し、プロテインＡ固定粒子を生成させた。
　次いで、生成したプロテインＡ固定粒子（ＰＡ－１）を、１．０Ｍ　１－チオグリセロール（旭化学工業社製）／０．１Ｍ　硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子（ＰＡ－２）を、０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤３を得た。
　（実施例４）
　実施例３と同様の操作で得た、未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子（ＰＡ－２）を、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させた。これに、３０％過酸化水素水０．４８ｇを添加し、２５℃で２４時間振とう撹拌した。さらに、０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤４を得た。
　（実施例５）
　実施例３と同様の操作で生成させたプロテインＡ固定粒子（ＰＡ－１）を、１．０Ｍ　１－チオグリセロール／０．１Ｍ　硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で４０時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤５を得た。
　（実施例６）
　実施例１の工程（１）において、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）５．２６ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）２．６３ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）２．６３ｇからなる単量体組成物を、２－オクタノン（東洋合成社製）２５．００ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
　その後、実施例１の工程（３）と同様の操作でプロテインＡを固定し、プロテインＡ固定粒子を生成させた。
　次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ　２－メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム（東京化成工業社製）／０．１Ｍ　硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤６を得た。
　（実施例７）
　実施例１の工程（１）において、４－ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）４．７７ｇ及びグリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）８．８６ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５２ｇ及び２－オクタノン（東洋合成社製）７．３５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
　その後、実施例３と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤７を得た。
　（実施例８）
　実施例１の工程（１）において、ビニルベンジルグリシジルエーテル（東レ・ファインケミカル社製）３．４３ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）４．１１ｇ及びエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）６．１７ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５２ｇ及び２－オクタノン（東洋合成社製）７．３５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
　その後、実施例３と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤８を得た。
　（比較例１）
　実施例３において、プロテインＡ固定後に未反応のエポキシ基の開環を行わないこと以外は、実施例３と同様の操作でアフィニティークロマトグラフィー用充填剤９を得た。
　（比較例２）
　実施例１の工程（１）において、３，４－エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート（ダイセル社製）１．４１ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）８．４５ｇ及びトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．２３ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２－オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
　その後、実施例１の工程（３）と同様の操作でプロテインＡを固定し、プロテインＡ固定粒子を生成させた。
　次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ　１－チオグリセロール（旭化学工業社製）／０．１Ｍ　硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で４時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤１０を得た。
　（比較例３）
　比較例２において、１．０Ｍ　１－チオグリセロール（旭化学工業社製）／０．１Ｍ　硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬにプロテインＡ固定粒子を分散させた後の振とう撹拌時間を、４時間から１７時間に変更した以外は、比較例２と同様の操作でアフィニティークロマトグラフィー用充填剤１１を得た。
　（比較例４）
　実施例１の工程（１）において、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１．３９ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）２．７９ｇ及びグリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）９．７６ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２－オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
　その後、実施例３と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤１２を得た。
　試験例１　（エポキシ基含有量の定量）
　実施例１～８および比較例１～４で得られたリガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量を定量した。
　すなわち、塩化カルシウム水溶液に懸濁した多孔質粒子に塩酸を過剰に添加して塩酸を付加反応させることによりエポキシ基を開環し、残余の塩酸を過剰量の水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、フェノールフタレイン溶液を添加し、残余の水酸化ナトリウムを塩酸で逆滴定することにより定量した。なお、滴定の終点はフェノールフタレインの赤色が消えた時点とした。結果を表１に示す。
　試験例２　（残余のエポキシ基量の評価（ｐＨ上昇幅の測定））
　実施例１～８および比較例１～４で得られたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤をＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０カラムに充填高さ約５ｃｍで充填し、前記カラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓに接続してｐＨをモニタリングしながら２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流速０．２ｍＬ／分にて通液し、カラム内のｐＨが平衡に達したときのｐＨの値を初期ｐＨとして記録した。さらに、前記緩衝液に置換した前記カラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓから取り外し、４０℃の恒温器内で７日間静置した。
　その後、前記カラムを再びＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓに接続してｐＨをモニタリングしながら前記緩衝液を流速０．２ｍＬ／分にて通液し、ｐＨが最も高くなったときのｐＨの値を負荷ｐＨとして記録した。初期ｐＨと負荷ｐＨとの差をｐＨ上昇幅として求めた。なお、初期ｐＨ及び負荷ｐＨの測定は２３±１℃の恒温室内で実施した。結果を表１に示す。
　試験例３　（プロテインＡ結合量の定量）
　実施例１～８および比較例１～４で得られたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に結合したリガンドであるプロテインＡの結合量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いて定量した。具体的には、固形分換算で１ｍｇの充填剤をテストチューブに採取し、これをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔで定量した。反応は、３７℃で３０分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインＡと同一のものを用いて作成した。結果を表１に示す。
　試験例４　（ＤＢＣの測定および保存安定性の評価）
　ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ　Ｂｉｏ社製　ＨＧＧ－１０００）に対する実施例および比較例の各充填剤のＤＢＣを測定した。カラムは容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬにタンパク質を溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求めた。結果を表１に示す。
　さらに、ＤＢＣ測定後のカラムを試験例２と同様に２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、そのまま４０℃で７日間静置した。その後、再び上記と同様の条件でＤＢＣの測定を実施し、負荷ＤＢＣを求めた。負荷ＤＢＣ／初期ＤＢＣ×１００をＤＢＣ維持率として、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤の保存安定性を評価した。なお、初期ＤＢＣ及び負荷ＤＢＣの測定は２３±１℃の恒温室内で実施した。結果を表１に示す。
　試験例５　（ＨＣＰの定量）
　カラム容器（ＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０　ｃｏｌｕｍｎ）に、実施例及び比較例の各充填剤を、充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅ　Ｐｌｕｓにそれぞれ接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
　次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｍｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
　次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、及び２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
　その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
　そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。また、Ｃｙｇｎｕｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製　ＣＨＯ　ＨＣＰ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した。さらにＨＣＰの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのＨＣＰ量を算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表１中の各記号は以下に示すとおりである。
　（Ｍ－１）　　ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート、ＨＢＡＧＥ：４－ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル、ＶＢＧＥ：（４－ビニルベンジル）グリシジルエーテル、ＭＥＴＨＢ：３，４－エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート
　（Ｍ－２）　　ＤＶＢ：ジビニルベンゼン、ＴＭＰ：トリメチロールプロパントリメタクリレート、ＧＬＤＭ：グリセリンジメタクリレート、ＥＤＭＡ：エチレングリコールジメタクリレート
　（Ｍ－３）　　ＥＶＢ：１－エチル－４－ビニルベンゼン、ＨＥＡＡ：Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）メタクリルアミド、ＧＬＭ：グリセロールモノメタクリレート
　（開環に使用した化合物）　　ＭＥ：２－メルカプトエタノール、ＴＧ：１－チオグリセロール、ＭＰＳＡ：２－メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム

Claims (12)

  1. 　（Ｍ－１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および
    　（Ｍ－２）ポリビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し０．５～８０質量部を含む共重合体を含有する固相担体と、
    　エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基と、
    　前記固相担体に結合したリガンドと、を含むアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、
    　前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、４０℃で７日間静置したときのカラム内のｐＨ上昇幅が２以下であることを特徴とする、
    　アフィニティークロマトグラフィー用担体。
  2. 　前記共重合体が、（Ｍ－３）エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し４０質量部以下を更に含む、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
  3. 　前記開環エポキシ基が、下記式（１）で表される基である、請求項１または２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、
    　Ｒ1は、炭素数１～６の２価の有機基を示し、
    　Ｒ2は、水素原子または炭素数１～１０の１価の有機基を示し、
    　Ｘは、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、スルホニル基（＞Ｓ（＝Ｏ）2）、イミノ基（＞ＮＨ）、またはオキシ基（＞Ｏ）を示し、
    　＊は、結合位置を示す。］
  4. 　Ｒ2が、下記式（２）で表されるものである、請求項３に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（２）中、
    　Ｒ3は、炭素数１～１０の２価または３価の有機基を示し、
    　ｎは、１または２を示し、
    　＊＊は、式（１）中のＸとの結合位置を示す。］
  5. 　Ｘが、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、またはオキシ基（＞Ｏ）である、請求項３または４に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
  6. 　前記リガンドが、イムノグロブリン結合性タンパク質である、請求項１～５のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
  7. 　前記イムノグロブリン結合性タンパク質が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも１種以上である、請求項６に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
  8. 　前記固相担体が多孔質粒子である、請求項１～７のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
  9. 　前記多孔質粒子の粒径が３５～１００μｍである、請求項８に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填された、アフィニティークロマトグラフィーカラム。
  11. 　請求項１～９のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とする、標的物質の精製方法。
  12. 　前記標的物質が、標的タンパク質である、請求項１１に記載の精製方法。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016044138A (ja) * 2014-08-22 2016-04-04 Jsr株式会社 担体、担体の製造方法、及び標的物の精製方法
WO2017146225A1 (ja) * 2016-02-26 2017-08-31 Jsr株式会社 アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、リガンド結合多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体
WO2018155241A1 (ja) * 2017-02-27 2018-08-30 昭和電工株式会社 サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法
WO2020004583A1 (ja) 2018-06-29 2020-01-02 三菱ケミカル株式会社 ポリペプチドの分離方法、ポリペプチドの製造方法及びポリペプチドの精製装置
WO2020045477A1 (ja) * 2018-08-29 2020-03-05 Jsr株式会社 ポリペプチドの精製方法
JPWO2019004440A1 (ja) * 2017-06-30 2020-04-30 昭和電工株式会社 液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラム
JPWO2019208672A1 (ja) * 2018-04-27 2021-05-27 キヤノン株式会社 粒子、粒子の製造方法、アフィニティー粒子、及び、これを含む試薬及びキット、並びに標的物質の検出方法
WO2023058409A1 (ja) 2021-10-05 2023-04-13 Jsr株式会社 クロマトグラフィー担体をカラムに充填する方法、スラリーの保存方法、及びスラリー

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015080174A1 (ja) * 2013-11-27 2015-06-04 Jsr株式会社 固相担体、固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤、クロマトグラフィーカラムおよび精製方法
US20220048010A1 (en) * 2018-12-17 2022-02-17 Chreto Aps Ligand linker substrate
CN110577878B (zh) * 2019-08-30 2022-11-04 安徽省金裕皖酒业有限公司 一种利用副产物黄水提高白酒抗氧化活性的方法
CN115463647A (zh) * 2021-06-11 2022-12-13 苏州瑞恒嘉航医疗科技有限公司 一种蛋白分离专用固定相及其制备与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007142331A1 (ja) * 2006-06-08 2007-12-13 Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. アフィニティ担体及びその製造方法
WO2011125674A1 (ja) * 2010-03-31 2011-10-13 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
WO2011125673A1 (ja) * 2010-03-31 2011-10-13 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1088861B (it) * 1976-10-28 1985-06-10 Asahi Chemical Ind Materiale assorbente per proteine
AU630427B2 (en) 1989-07-06 1992-10-29 Perseptive Biosystems, Inc. Perfusive chromatography
US5583162A (en) 1994-06-06 1996-12-10 Biopore Corporation Polymeric microbeads and method of preparation
US6841580B2 (en) * 2001-12-21 2005-01-11 Organo Corporation Organic porous material, process for manufacturing the same, and organic porous ion exchanger
EP1830947A4 (en) 2004-12-14 2012-04-18 Ge Healthcare Bio Sciences Ab CLEANING OF IMMUNOGLOBULINS
EP1974215B1 (en) 2006-01-06 2017-12-27 EMD Millipore Corporation Affinity chromatography matrices and methods of making and using the same
EP2339339A4 (en) * 2008-09-25 2016-10-12 Jsr Corp CHARGE FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY
CN102834415A (zh) * 2010-03-24 2012-12-19 Jsr株式会社 亲和色谱用填充剂以及离析免疫球蛋白的方法
US9040661B2 (en) * 2010-12-21 2015-05-26 Jsr Corporation Support for affinity chromatography and method for isolating immunoglobulin
JP2012141212A (ja) 2010-12-28 2012-07-26 Tosoh Corp 多孔質担体及びその製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007142331A1 (ja) * 2006-06-08 2007-12-13 Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. アフィニティ担体及びその製造方法
WO2011125674A1 (ja) * 2010-03-31 2011-10-13 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
WO2011125673A1 (ja) * 2010-03-31 2011-10-13 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016044138A (ja) * 2014-08-22 2016-04-04 Jsr株式会社 担体、担体の製造方法、及び標的物の精製方法
WO2017146225A1 (ja) * 2016-02-26 2017-08-31 Jsr株式会社 アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、リガンド結合多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体
WO2018155241A1 (ja) * 2017-02-27 2018-08-30 昭和電工株式会社 サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法
US11285404B2 (en) 2017-02-27 2022-03-29 Showa Denko K.K. Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same
JPWO2019004440A1 (ja) * 2017-06-30 2020-04-30 昭和電工株式会社 液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラム
JP7094958B2 (ja) 2017-06-30 2022-07-04 昭和電工株式会社 液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラム
JPWO2019208672A1 (ja) * 2018-04-27 2021-05-27 キヤノン株式会社 粒子、粒子の製造方法、アフィニティー粒子、及び、これを含む試薬及びキット、並びに標的物質の検出方法
JP7305623B2 (ja) 2018-04-27 2023-07-10 キヤノン株式会社 粒子、粒子の製造方法、アフィニティー粒子、及び、これを含む試薬及びキット、並びに標的物質の検出方法
WO2020004583A1 (ja) 2018-06-29 2020-01-02 三菱ケミカル株式会社 ポリペプチドの分離方法、ポリペプチドの製造方法及びポリペプチドの精製装置
WO2020045477A1 (ja) * 2018-08-29 2020-03-05 Jsr株式会社 ポリペプチドの精製方法
WO2023058409A1 (ja) 2021-10-05 2023-04-13 Jsr株式会社 クロマトグラフィー担体をカラムに充填する方法、スラリーの保存方法、及びスラリー

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