CN106434776A - 一种吸附固定化发酵生产β‑聚苹果酸的工艺 - Google Patents

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赵廷彬
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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是一种吸附固定化发酵生产β‑聚苹果酸的工艺，包括如下步骤：（1）种子培养，将吸附固定化材料固定在发酵罐中，加入种子培养基，接入聚苹果酸生产菌株，培养80‑120 h，实现聚苹果酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附固定；（2）发酵培养，再将发酵罐内的种子培养基替换为发酵培养基，利用已固定化的聚苹果酸生产菌株单批次固定化发酵生产聚苹果酸；（3）聚苹果酸的测定；本发明避免了菌丝体大量附着于发酵罐罐壁上，有利于聚苹果酸的高效生产；聚苹果酸生产菌株无需包埋，依靠菌丝体自身吸附作用即可实现菌株在吸附固定化材料上的吸附。

Description

一种吸附固定化发酵生产β‐聚苹果酸的工艺
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是一种吸附固定化发酵生产β‐聚苹果酸的工艺。
背景技术
聚苹果酸(Poly malic acid或Poly malate,简称为PMLA)是以苹果酸为唯一单体的均聚高分子聚合物，属于聚酯类聚合物。由于苹果酸含有两个羧基和一个羟基，其相互酯化的产物主要有三种，即α型、β型、γ型PMLA，生物体内存在的只有β型PMLA。
聚苹果酸结构中悬挂有可修饰的羧基，使其可作为一种分子基质与天然配体或合成配体发生特异性作用，而制得聚苹果酸酯等衍生物，这为新材料研究提供了素材，并可得到大量具有特殊功能的新聚合物。研究发现聚苹果酸具有良好的水溶性、可化学衍生性、可降解性、可再生性和生物安全性等特点。在生物制药领域，聚苹果酸可作为微胶囊材料及药物载体。聚苹果酸具有较大的溶水性和吸水性，可以作为吸水材料使用，也可以用作化妆产品。聚苹果酸对一些生物物质(如豌豆、土豆、蛋清蛋白等)的蛋白酶和某些微生物的DNA聚合酶有抑制作用，可阻止某些生物的生长和繁殖。因此也可作为包装材料应用于食品生产加工。
目前，聚苹果酸的生产主要有化学合成法和微生物发酵法两种，化学法合成聚苹果酸，只有内酯开环法，该方法形成内酯的步骤较多、产率低、反应温度高、中间产物分离提纯繁琐，制约了该方法的发展。 生物途径制备的聚苹果酸主要是通过微生物发酵合成，生物合成聚苹果酸具有突出的优点，通过微生物发酵，产物均为β型，产物分子量高、生产条件温和、生成产物纯度较高。但微生物发酵生产聚苹果酸，文献中大多都是通过菌种诱变、培养基优化来提高聚苹果酸的产量，发酵工艺上也主要是控制溶氧、PH等手段，对于使用固定化技术进行发酵鲜有报道。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供一种吸附固定化发酵生产β‐聚苹果酸的工艺，能耗低、投资小，设备利用率高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种吸附固定化发酵生产β‐聚苹果酸的工艺，包括如下步骤：(1)种子培养，将吸附固定化材料固定在发酵罐中，加入种子培养基，接入聚苹果酸生产菌株，培养80‐120h，实现聚苹果酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附固定；(2)发酵培养，再将发酵罐内的种子培养基替换为发酵培养基，利用已固定化的聚苹果酸生产菌株单批次固定化发酵生产聚苹果酸；(3)聚苹果酸的测定。
进一步地，所述吸附固定化材料为网状固定化材料，包含网状结构的植物纤维(如纱布、丝瓜巾)、网状结构的人造纤维(如尼龙纤维)或金属网状材料(如不锈钢丝网)，吸附固定化材料表面布满孔隙已保证氧气的正常扩散与底物、产物的正常运输。
进一步地，所述聚苹果酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附是指聚苹果酸生产菌株依靠菌体自身吸附作用吸附于固定化材料上，聚 苹果酸生产菌株无需包埋。
进一步地，所述吸附固定化材料固定于发酵罐内但不影响搅拌。
进一步地，所述种子培养是将出芽短梗霉菌株活化2～3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液；按照10％的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为180‐200r/min，培养时间为36‐42h。
进一步地，所述种子培养基组成为：蔗糖120‐140g/L，酵母膏2.5‐3g/L，硫酸铵0.7‐1g/L，丁二酸1.6‐2g/L，玉米浆0.08‐0.1v/v，K2CO3 0.2‐0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.08‐0.1g/L，KH2PO4 0.8‐1g/L，ZnSO4·7H2O 0.03‐0.05g/L，其余为蒸馏水。
进一步地，所述发酵培养是接种口在火焰保护下，将所得种子液以10％(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；培养条件为转速300‐400r/min，通风比1:1‐1:1.5，罐压0.05‐0.1Mpa，发酵周期为80‐120h。
进一步地，所述发酵培养基组成为：蔗糖160‐180g/L，蛋白胨30‐35g/L，KH2PO40.08‐0.1g/L，NaNO3 1.7‐2g/L，MgSO4·7H2O0.2‐0.3g/L，KCl 0.3‐0.5g/L，MnSO4 0.03‐0.05g/L，其余为蒸馏水。
进一步地，所述聚苹果酸的测定是利用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量。
本发明所用菌种来源是天津北洋百川生物技术有限公司申请的 专利名称为一种惰性载体吸附固态发酵法生产β‐聚苹果酸的方法，申请号是200910071171.2；该专利中公开了本发明所用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC3337。
本发明的有益效果是，一种吸附固定化发酵生产β‐聚苹果酸的工艺，避免了菌丝体大量附着于发酵罐罐壁上，有利于聚苹果酸的高效生产；聚苹果酸生产菌株无需包埋，依靠菌丝体自身吸附作用即可实现菌株在吸附固定化材料上的吸附。
附图说明
图1是本发明说明书中背景技术的α、β、γ三种聚苹果酸的结构图。
具体实施方式
实施例1：游离细胞发酵生产聚苹果酸(对照例)
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株活化3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液；按照10％的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余为蒸馏水。
(2)发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10％(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；初始转速300r/min，通风比1:1‐1:1.3，罐压在0.1Mpa，培养温度为25℃，发酵周期为120h。
发酵培养基组成为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KCl 0.5g/L，MnSO4 0.05g/L，其余为蒸馏水。
(3)聚苹果酸的测定
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量为28.7g/L。
实施例2：固定化单批次制备聚苹果酸
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株活化3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液；按照10％的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余为蒸馏水。
(2)发酵培养
以网状植物纤维纱布为固定化载体，将长40cm、宽15cm的纱 布沿PH电极、温度电极、取样管绕成一圈，固定后不影响搅拌。其余发酵条件、发酵培养基同实施例1.
(3)聚苹果酸的测定
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为31.5g/L，相比空白提高9.7％。
实施例3：固定化单批次制备聚苹果酸
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株活化3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液；按照10％的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余为蒸馏水。
(2)发酵培养
以网状固定化材料不锈钢丝网为固定化载体，将不锈钢丝网沿PH电极、溶氧电极、温度电极、取样管绕圈，固定后不影响搅拌。其余发酵条件、发酵培养基同实施例1.
(3)聚苹果酸的测定
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为32.3g/L，相比空白提高12.5％。
实施例4：固定化单批次制备聚苹果酸
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株活化3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液；按照10％的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余为蒸馏水。
(2)发酵培养
以网状植物纤维丝瓜巾为固定化载体，将去皮、去仔后的丝瓜巾固定于温度电极、溶氧电极、取样管上各1个，固定后不影响搅拌。其余发酵条件、发酵培养基同实施例1.
(3)聚苹果酸的测定
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为33.6g/L，相比空白提高17％。

Claims (8)

1.一种吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，其特征在于，包括如下步骤：（1）种子培养，将吸附固定化材料固定在发酵罐中，加入种子培养基，接入聚苹果酸生产菌株，培养80-120 h，实现聚苹果酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附固定；（2）发酵培养，再将发酵罐内的种子培养基替换为发酵培养基，利用已固定化的聚苹果酸生产菌株单批次固定化发酵生产聚苹果酸；（3）聚苹果酸的测定。
2.根据权利要求1所述的吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，其特征在于，所述吸附固定化材料为网状固定化材料，包含网状结构的植物纤维、网状结构的人造纤维或金属网状材料，吸附固定化材料表面布满孔隙。
3.根据权利要求1所述的吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，其特征在于，所述聚苹果酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附是指聚苹果酸生产菌株依靠菌体自身吸附作用吸附于固定化材料上，聚苹果酸生产菌株无需包埋。
4.根据权利要求1所述的吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，其特征在于，所述种子培养是将出芽短梗霉菌株活化2~3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液；按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为180-200r/min，培养时间为36-42h。
5.根据权利要求1所述的吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，其特征在于，所述种子培养基组成为：蔗糖 120-140g/L，酵母膏 2.5-3g/L，硫酸铵 0.7-1g/L，丁二酸 1.6-2g/L，玉米浆 0.08-0.1v/v，K2CO3 0.2-0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.1g/L，KH2PO4 0.8-1g/L，ZnSO4·7H2O 0.03-0.05g/L，其余为蒸馏水。
6.根据权利要求1所述的吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，其特征在于，所述发酵培养是接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；培养条件为转速300-400r/min，通风比1:1-1:1.5，罐压0.05-0.1Mpa，发酵周期为80-120h。
7.根据权利要求1所述的吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，其特征在于，所述发酵培养基组成为：蔗糖 160-180g/L，蛋白胨 30-35g/L，KH2PO4 0.08-0.1g/L，NaNO3 1.7-2g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.3g/L，KCl 0.3-0.5g/L，MnSO4 0.03-0.05g/L，其余为蒸馏水。
8.根据权利要求1所述的吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，其特征在于，所述聚苹果酸的测定是利用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20170222

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