CN105586369A - 添加氧载体制备聚苹果酸的方法 - Google Patents

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边艳慧
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Abstract

一种添加氧载体制备聚苹果酸的方法中，利用出芽短梗霉菌株作为出发菌种，制备孢子悬浮液；将孢子悬液转接到种子培养基中进行培养，培养温度20-30℃，摇床转速为180-230r/min，培养时间为35-45h；在火焰保护下，将所得种子液以8-12%v/v的量接于发酵培养基中进行发酵培养；当发酵进行到35-50h的对数生长期时开始流加发酵液体积0.5-2%的10mol/L的H2O2溶液，发酵周期为140-150h，在对数生长期时流加的H2O2溶液促进溶氧速率，从而提高聚苹果酸的合成效率，较大地提高了底物的转化率，降低了生产成本，提高了效率。

Description

添加氧载体制备聚苹果酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵的技术领域，具体说是一种添加氧载体制备聚苹果酸的方法。
背景技术
高分子聚合物在当今世界乃至未来都充当着举足轻重的角色，尤其是在开发新型替代能源方面，在节约资源、能源和保护生态环境方面更是发挥着不可替代的作用。新时代的高分子聚合物更是与各行各业密不可分，科学家将在更多方面探究高分子聚合物，与时代低碳节能的生活相呼应，高分子聚合物与产品也会越来越适应这时代的主题。事实表明，高分子聚合物在近几年取得了飞速的发展，许多重要的高分子聚合物相继实现了工业化。
聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物，具有优良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等独特性质，其次，它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化学衍生性。聚苹果酸的这些性质，使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。生物法合成聚苹果酸具有成本低、合成条件温和、产物的分子量相对较高等优点，因此生物法合成聚苹果酸具有很好的开发前景。
氧载体是一种与水不互溶、对微生物无毒、具有较高溶氧能力的物质。氧载体由于具有氧传递速度快，能耗低，气泡生成少，剪切力小等优点。本文选用H2O2作为氧载体来促进聚苹果酸的合成，它通过促进氧传递来提高溶氧，从而有助于聚苹果酸的合成。
目前文献当中有关提高聚苹果酸产量的方法主要是通过菌种诱变以及培养基成分优化，往往效果不太明显，发酵周期长，且底物的转化率不高，导致聚苹果酸成本居高不下。还有一些专利是通过改变发酵方式和添加生长因子来提高产量。如申请号为201410830995.4的发明专利采用补料发酵的方法提高聚苹果酸的产量，产量提高了11-20%，但至今也没有通过添加氧载体来促进合成的技术方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种添加氧载体制备聚苹果酸的方法。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:
本发明的添加氧载体制备聚苹果酸的方法，使用菌种为出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC7055；
制备过程具体包括以下步骤：
（1）种子培养
将出芽短梗霉菌株活化2-3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液；按照体积比10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的挡板瓶中进行培养，培养温度20-30℃，摇床转速为180-230r/min，培养时间为35-45h；
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1%v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水；
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以8-12%v/v的量接于装有3L发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；培养条件为转速280-320r/min，通风比1:2，罐压0.1-0.3Mpa，发酵进行到35-50h的对数生长期时开始流加发酵体积0.5-2%的10mol/L的H2O2溶液，发酵周期为140-150h。
发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，其余为蒸馏水。
本发明还可以采用以下技术措施：
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量。
H2O2溶液的体积比浓度为0.5-4%。
本发明具有的优点和积极效果是:
本发明的添加氧载体制备聚苹果酸的方法中，包括利用出芽短梗霉菌株的种子培养和发酵培养两个步骤，在发酵进行到对数生长期时流加H2O2溶液促进溶氧速率，从而提高聚苹果酸的合成效率，较大地提高了底物的转化率，降低了生产成本，提高了效率。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明中的技术方案进行详细说明：
本发明的添加氧载体制备聚苹果酸的方法，使用菌种为出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans，该菌种已于2012年12月25日保藏于位于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC7055；
制备过程具体包括以下步骤：
（1）种子培养
将出芽短梗霉菌株活化2-3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液；按照体积比10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的挡板瓶中进行培养，培养温度20-30℃，摇床转速为180-230r/min，培养时间为35-45h；
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1%v/v，其中v/v指的是玉米浆与种子培养基的体积比，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水；
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以8-12%v/v的量接于装有3L发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；培养条件为转速280-320r/min，通风比1:2，罐压0.1-0.3Mpa，发酵进行到35-50h的对数生长期时开始流加发酵体积0.5-2%的10mol/L的H2O2溶液，发酵周期为140-150h。
发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，其余为蒸馏水。
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量。
H2O2溶液的体积比浓度为0.5-4%。
未流加H2O2溶液的空白对照例：
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化2h，用无菌生理盐水洗下孢子，制得孢子悬液；按照10%的接种量接到含有100ml种子培养基的500ml挡板瓶中，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h；
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1%v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水；
(2)发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；培养条件为转速300r/min，通风比1:2，罐压0.1Mpa，发酵周期为144h；
发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，其余为蒸馏水。
(3)聚苹果酸的测定
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量为35.7g/L。
实施例1：
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化，用无菌生理盐水洗下孢子，制得孢子悬液；按照10%的接种量接到含有100ml种子培养基的500ml挡板瓶中，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h；
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1%v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水；
(2)发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；培养条件为转速300r/min，通风比1:2，罐压0.1Mpa，发酵进行到40h时开始流加发酵体积0.5%的10mol/L的H2O2溶液，发酵周期为144h；
发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，其余为蒸馏水。
(3)聚苹果酸的测定
同样的方法测得聚苹果酸的产量为40.5g/L，相比空白提高了13.4%。
实施例2：
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化2.5h，用无菌生理盐水洗下孢子，制得孢子悬液。按照10%的接种量接到含有100ml种子培养基的500ml挡板瓶中，培养温度20℃，摇床转速为180r/min，培养时间为35h；
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1%v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水；
(2)发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以8%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。培养条件为转速280r/min，通风比1:2，罐压0.2Mpa，发酵进行到35h时开始流加发酵体积1%的10mol/L的H2O2溶液，发酵周期为140h。
发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，其余为蒸馏水。
(3)聚苹果酸的测定
同样的方法测得聚苹果酸的产量为44.3g/L，相比空白提高了24.1%。
实施例3：
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化3h，用无菌生理盐水洗下孢子，制得孢子悬液；按照10%的接种量接到含有100ml种子培养基的500ml挡板瓶中，培养温度30℃，摇床转速为230r/min，培养时间为45h；
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1%v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水；
(2)发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以12%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；培养条件为转速320r/min，通风比1:2，罐压0.3Mpa，发酵进行到50h时开始流加发酵体积2%的10mol/L的H2O2溶液，发酵周期为150h；
发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，其余为蒸馏水。
(3)聚苹果酸的测定
同样的方法测得聚苹果酸的产量为47.9g/L，相比空白提高了34.2%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种添加氧载体制备聚苹果酸的方法，使用菌种为出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC7055；
制备过程具体包括以下步骤：
（1）种子培养
将出芽短梗霉菌株活化2-3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液；按照体积比10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的挡板瓶中进行培养，培养温度20-30℃，摇床转速为180-230r/min，培养时间为35-45h；
种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1%v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水；
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以8-12%v/v的量接于装有3L发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；培养条件为转速280-320r/min，通风比1:2，罐压0.1-0.3Mpa，发酵进行到35-50h的对数生长期时开始流加发酵液体积0.5-2%的10mol/L的H2O2溶液，发酵周期为140-150h。
2.发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，其余为蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的添加氧载体制备聚苹果酸的方法，其特征在于：使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量。
4.根据权利要求1或2所述的添加氧载体制备聚苹果酸的方法，其特征在于：H2O2溶液的体积比浓度为0.5-4%。
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